CN103060458A

CN103060458A - 检测转基因水稻品系T1c-19的引物和探针、试剂盒和方法

Info

Publication number: CN103060458A
Application number: CN2013100171161A
Authority: CN
Inventors: 黄文胜; 陈颖; 邓婷婷; 付凯
Original assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Current assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority date: 2013-01-17
Filing date: 2013-01-17
Publication date: 2013-04-24

Abstract

本发明涉及用于通过实时PCR法检测转基因水稻品系T1c-19或其组分的引物和探针，包含所述引物和探针的试剂盒，以及利用所述引物和探针检测转基因水稻品系T1c-19成分或其组分的实时PCR检测方法。

Description

检测转基因水稻品系T1c-19的引物和探针、试剂盒和方法

技术领域

本发明属于生物技术领域。更具体地，本发明涉及用于通过实时PCR法检测转基因水稻品系T1c-19或其组分的引物和探针，包含所述引物和探针的试剂盒，以及利用所述引物和探针检测转基因水稻品系T1c-19成分或其组分的实时PCR检测方法。

背景技术

转基因生物是指利用生物技术，将外源基因转移到其它物种中以改造其遗传特性，从而获得人类所需的性状、营养品质而产生的生物新品种。以转基因生物或以其为原料加工而来的食品就是转基因食品。从1994年第一例转基因食品(转基因番茄)在美国诞生至今，转基因生物已广泛进入食品领域。

转基因抗虫水稻的培育

水稻(Oryza sativa L.)是中国最大宗粮食作物，年产量在2亿吨左右，约占中国粮食总产量的40%。水稻的主要鳞翅目害虫包括二化螟(Chilosuppressalis)、三化螟(Tryporyzaincertulas)、稻纵卷叶螟(Chaphalocrocismedina)和大螟(Sesamiainferens)等，严重影响中国大米生产，培育转基因抗虫水稻是防治的主要途径。

苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白(Bacillus thringiensis insecticidal crystalprotein；Bt蛋白)，是苏云金杆菌芽孢形成过程中产生的伴胞晶体，该蛋白对鳞翅目和部分鞘翅目昆虫具高度特异的杀虫活性，在靶昆虫碱性肠道内溶解并经中肠蛋白酶的消化后，成为具有活性的毒性肽，与昆虫中肠的膜受体特异结合，形成跨膜离子通道，破坏消化道细胞的渗透压，最终致死昆虫。由于Bt蛋白在哺乳动物中无结合位点，且在人体内可被快速消化，因此对人和家畜无毒，在有机农业中已使用了50多年。

华中农业大学林拥军等采用农杆菌转化法将密码子优化的Cry1C基因转入水稻品种明恢63中（林拥军、张启发，改造合成的苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因Cry1C*；中国专利ZL02139081.9），经自交选育获得转基因自交系T1c-19，经农业部批准进行了中间试验、环境释放和生产性试验，有望在不久的将来在农业生产上应用（转Cry1C基因抗虫水稻T1c-19在湖北省的环境释放安全审批书；农基安审字（2006）第006号）（转cry1C基因抗虫水稻T1c-19在湖北省的生产性试验安全审批书；农基安审字（2009）第006号）。

转基因食品的管理要求

已完成的安全试验和环境释放试验结果显示，转基因水稻具有食用安全和生态安全、抗虫效果优良等特点。作为食品，转基因作物与常规品种没有实质差别。但转基因食品作为一种新技术产品，消费者仍忧虑其安全性。

世界上主要国家立法对转基因产品进行管理，美加、欧盟、日本、韩国、澳新的法律明确规定，转基因动植物品种需经政府批准，并经严格的生物安全、环境安全测试才可以田间种植、环境释放及作为食品、饲料，欧盟、日本、韩国、澳新等要求转基因食品进行标识，并规定了相应阈值水平。我国于2001年5月23日颁布《农业转基因生物安全管理条例》也有相应的安全管理规定。2002年3月20日开始实行的《农业转基因生物标识管理办法》也规定了转基因食品的标识制度。转基因产品检测是执法的关键措施之一，需要通过定性检测确定转基因的种类，鉴别其是否为已批准的或已获准用于食品饲料，以防止具有风险的未知转基因产品的任意扩散，对社会产生危害；还需要通过定量检测确定转基因产品的含量，明确是否已达到所在国家规定的阈值水平，因为每个国家转基因标识的阈值水平都不相同。

转基因食品的检测方法

与蛋白表达具有组织特异性相比，核酸检测不受到材料种类的限制，且核酸比蛋白稳定，在加工食品中仍可检出，因此，食品转基因检测中主要检测转基因核酸。

核酸的检测方法包括常规PCR方法和实时PCR方法(Real-time PCR)，其中，实时荧光定量PCR是在常规PCR方法的基础上建立起来的。

在实时PCR体系中，除了两条普通的引物外，还有一条在5'-和3'-端分别标记了报告荧光染料基团(R)、淬灭荧光染料基团(Q)、并与PCR产物特异结合的寡核苷酸探针。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'-外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭基团分离，从而荧光监测系统可以接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光报告分子被释放，从而实现了荧光信号的积累与PCR产物形成的完全同步。以标准品制备内源基因和外源基因标准曲线，获得PCR模板的起始拷贝数，计算待检产品中的转基因含量。因此，具有常规PCR不能无法比拟的优点。

转基因的标识需求和一些法规对转基因成分含量的限制，要求对食品中转基因成分进行定量检测。实时PCR方法已被欧盟、日本等作为食品转基因检测的标准方法。当外源基因插入到受体细胞染色体时，同时携有启动子、终止子、选择标记基因和报告基因，如花椰菜花叶病毒(CaMV)35s启动子，胭脂碱合酶NOS终止子等，核酸检测的靶标是插入的外源基因，包括外源基因的整合位点、启动子、终止子、选择基因的序列。

实时PCR方法的关键是引物和探针设计，引物长度在17-30nt之间，严格限制上下游引物的配对和引物自身配对；探针长度在20-30nt之间，且Tm值在65-75度之间，并高于引物Tm值10度以上。

目前，国内外少见报道能快速、简单、特异且灵敏地检测转基因水稻品系T1c-19或其组分的方法。

因此，本领域需要一种操作简单、快速、特异性好、灵敏度高的转基因水稻品系T1c-19或其组分检测方法。

发明内容

本发明的一个目的在于，提供用于通过实时PCR方法检测转基因水稻品系T1c-19或其组分的特异性寡核苷酸引物及探针。

本发明的另一个目的在于，提供转基因水稻品系T1c-19或其组分的实时荧光PCR检测方法。

本发明的再一个目的在于，提供用于通过实时PCR方法检测转基因水稻品系T1c-19或其组分的试剂盒。

本发明的再一个目的在于，提供本发明的特异性寡核苷酸引物和探针或试剂盒在检测转基因水稻品系T1c-19或其组分中的应用。

针对上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

根据本发明的第一方面，本发明提供了用于通过实时PCR方法检测转基因水稻品系T1c-19或其组分的特异性寡核苷酸引物对及探针。

所述引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物为Ory1C-F:5'-AATTCGGCGTTAATTCAGTACATTA-3'(SEQ ID NO:1)，所述下游引物为Ory1C-R:5'-CCCAATCATGGAGCAACAAACC-3'(SEQ ID NO:2)；所述探针为Ory1C-P:5'-CCGCAATGTGTTATTCACACAGTGTGCAA-3'(SEQ ID NO:3)，在探针的3'端连接有荧光淬灭基团BHQ1，5'端连接有荧光报告基团FAM。

第二方面，本发明提供转基因水稻品系T1c-19或其组分的实时PCR检测方法，所述方法包括使用本发明第一方面所述的特异性寡核苷酸引物对和探针。

在一个实施方式中，本发明的转基因水稻品系T1c-19或其组分的实时PCR检测方法包括如下步骤：

(a)从待测产品中提取DNA样品；和

(b)使用本发明第一方面所述的特异性寡核苷酸引物对及探针通过实时PCR方法进行核酸PCR扩增反应和检测扩增产物。

在一个优选的实施方案中，所述PCR扩增的反应参数为：95℃，10min的起始变性；和95℃15s；60℃，1min的45个扩增循环。

在本发明方法的优选实施方案中，所使用的本发明的特异性寡核苷酸引物对及探针包含以下特异性寡核苷酸引物对和探针：碱基序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的寡核苷酸引物对以及碱基序列为SEQ ID NO:3的探针，在探针的3’端连接有荧光淬灭基团BHQ1，5’端连接有荧光报告基团FAM。

第三方面，本发明提供用于检测转基因水稻品系T1c-19或其组分的试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的特异性寡核苷酸引物对以及探针。

在本发明的试剂盒的优选实施方案中，所述试剂盒包含以下特异性寡核苷酸引物对和探针：碱基序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的寡核苷酸引物对以及碱基序列为SEQ ID NO:3的探针，在探针的3’端连接有荧光淬灭基团BHQ1，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。

在优选的实施方案中，所述试剂盒还包括用于样品DNA提取的试剂和用于PCR反应的试剂以及使用说明书。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒中的使用说明书包括对用于快速检测转基因水稻品系T1c-19或其组分的PCR扩增条件的描述。

第四方面，本发明提供本发明第一方面所述的特异性寡核苷酸引物对和探针在检测转基因水稻品系T1c-19或其组分中的应用。

第五方面，本发明还提供本发明的试剂盒在检测转基因水稻品系T1c-19或其组分中的应用。

本发明以转基因水稻品系T1c-19的DNA为检测基础，提供了用于通过实时PCR方法检测转基因水稻品系T1c-19或其组分的特异性寡核苷酸引物及探针、试剂盒和检测方法。

本发明的实时荧光PCR检测方法由于使用荧光染料实时显示PCR产物的动态积累，在整个检测过程中闭管操作，没有PCR后处理过程，有效地解决了PCR后污染问题。使用本发明的实时荧光PCR检测方法，能够简单、快速、特异且灵敏地检测出含有转基因水稻品系T1c-19的农产品、食品。

附图说明

图1：显示本发明寡核苷酸引物及探针的检测特异性的实时PCR检测结果，其中使用特异性寡核苷酸引物对Ory1C-F(SEQ ID NO:1)和Ory1C-R(SEQ IDNO:2)和探针Ory1C-P(SEQ ID NO:3)进行检测。荧光曲线编号与样品对应如下：基线以上的荧光曲线为转基因水稻品系T1c-19样品(2次重复)，基线位置为抗优97、科丰6号、科丰8号、华恢1号、克螟稻KMD1、LL62、LL601、T2a-1、巴吞米、K105、明恢63、培杂35、津稻9618、皖稻181、春优59及空白对照。这些水稻品种由国家农业部门命名，为本领域所公知。图1的横坐标为PCR循环数，纵坐标为荧光值。

图2：显示转基因水稻品系T1c-19组分的实时PCR定量检测限，其中使用特异性寡核苷酸引物对Ory1C-F(SEQ ID NO:1)和Ory1C-R(SEQ ID NO:2)和探针Ory1C-P(SEQ ID NO:3)进行检测。荧光曲线从左向右依次为相对质量分数为2%、0.2%、0.01%(W/W)的转基因水稻品系T1c-19组分的扩增图(各2次重复)。图2的横坐标为PCR循环数，纵坐标为荧光值。

具体实施方式

通过实施例的方式对本发明作进一步的说明，但是本发明并不仅仅局限于以下实施例。

实施例1：特异性测试

本实施例测试了本发明寡核苷酸引物及探针的特异性，其中使用特异性引物Ory1C-F/R，即所使用的寡核苷酸引物的碱基序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，探针的碱基序列为Ory1C-P(SEQ ID NO:3)，在探针的3'-端连接有一个荧光淬灭基团BHQ1，5'-端连接有一个荧光报告基团FAM。

在本实施例中，检测了转基因水稻品系T1c-19样品，以及亲缘相近的常见水稻品系的样品，包括：抗优97、科丰6号、科丰8号、华恢1号、克螟稻KMD1、LL62、LL601、T2a-1、巴吞米、K105、明恢63、培杂35、津稻9618、皖稻181和春优59。此外，使用不含DNA的样品作为空白对照。

主要检测仪器：

微量移液器(1000uL、100uL、10uL或20uL、2.5uL；Eppendorf)；荧光定量PCR仪(ABI7700)；高速台式离心机(Pico17Thermo；12000r/min)；高速粉碎机(IKA-WEARKE GERMANY)；凝胶成像系统；电泳仪(DYY22C型)；核酸蛋白分析仪(DYY-6C北京六一仪器厂)；高压灭菌锅；制冰机等。

移液器Tips：务必使用带滤芯的型号，否则在混匀和分样时非常容易污染；同时10uL和2.5uL的移液器务必使用长Tips，普通短Tips在工作时，移液器杆部可能会与离心管内壁接触，造成污染。

主要试剂：

Taq酶、dNTPs、10×PCR Buffer、溴化乙锭、DNA Ladder Marker(Takara)；TaqMan Universal PCR Master Mix(ABI)；

上游引物Ory1C-F:5'-AATTCGGCGTTAATTCAGTACATTA-3'；

下游引物Ory1C-R:5'-CCCAATCATGGAGCAACAAACC-3'；

探针Ory1C-P:5'-CCGCAATGTGTTATTCACACAGTGTGCAA-3′；在探针的3'端连接有一个荧光淬灭基团BHQ1，5'端连接有一个荧光报告基团FAM。上述引物和探针通过本领域公知的常规多核苷酸合成技术制备。

主要检测步骤：

1.DNA提取

可以采用CTAB分步离心法进行DNA纯化。也可以使用商购的植物基因组DNA纯化试剂盒，如植物基因组DNA提取试剂盒(离心柱型；可购自Qiagen公司或天根生化科技有限公司)等进行DNA纯化。

待测品系样品为：T1c-19、抗优97、科丰6号、科丰8号、华恢1号、克螟稻KMD1、LL62、LL601、T2a-1、巴吞米、K105、明恢63、培杂35、津稻9618、皖稻181和春优59。

CTAB分步离心法描述于Wang,W et al.,Simultaneous Detection of EightFood Allergens Using Optical Thin-Film Biosensor Chips,Journal of AgriculturalAnd Food Chemistry,2011,59,6889-6894。简要而言，包括以下步骤：

称取50.0mg样品粉末，加入1.0ml CTAB提取缓冲液及4.0μL蛋白酶K(10mg/ml)，65℃温浴孵化1h；

以12000rpm离心15min，取几近清澈的上清700μl；加入500μL氯仿，高速涡旋混合30秒；

以12000rpm离心10min，收集500μL上清，转移到新的1.5ml反应管中；加入两倍体积的CTAB沉淀缓冲液，室温，孵育1h；

以12000rpm离心5min弃上清，将沉淀溶于350μL的1.2mol/L的氯化钠溶液中，充分溶解；加入350μL三氯甲烷，小心高速涡旋混合30秒；

以12000rpm离心10min，将上清转移到新的反应管中；加入0.8倍的异丙醇，室温孵育至少20min；

以12000rpm离心10min，弃上清；在沉淀中加入500μL70%乙醇，高速涡旋30秒；

以12000rpm离心10min，弃上清，60℃干燥15-25min，并溶于50μLTE（pH8.0）。

取3μl提取的DNA样品，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，根据其亮度和扩散程度判断DNA的质量。获得的基因组DNA样品-20℃保存备用。

每次提取均设立相应的空白对照（以双蒸水代替样品）。

2.样品总DNA浓度的测定

纯化的样品基因组DNA可以利用紫外分光光度法测定浓度。分别测定DNA在260nm和280nm波长下的吸收光值，并根据测定的吸收光值计算测定的DNA浓度。

3.实时PCR操作流程

1).实时PCR体系：

表1：水稻品系T1c-19特异性PCR体系

试剂	终浓度	体积
			Taqman Universal Mastermix(2×)	1×	12.5μL
正向引物Ory1C-F(10μM)	200μM	0.5μL
			反向引物Ory1C-F(10μM)	200μM	0.5μL
荧光标记探针溶液Ory1C-F(10μM)	200μM	0.5μL
			DNA模板	4ng/ul	5.0μL
ddH₂O(灭菌蒸馏水)		6.0μL
			总体积		25.0μL

2).实时PCR反应参数：

3).对照设置：设置阴性对照、空白对照和阳性对照：

阴性对照反应管中以20ng的非转基因大米的DNA为模板，空白对照反应管中以纯水为模板，阳性对照反应管中以20ng的转基因大米T1c-19的DNA为模板。对照组检测体系的其余成分与表1相同。

4).实时PCR运行及数据分析。

所有曲线均为软件7500Software V2.0.6（ABI公司，美国）自动生成。实验结果显示在图1中。

如图1所示，使用引物Ory1C-F/R扩增待测样品的DNA，测试转化事件特异性，仅转基因水稻品系T1c-19样品能在基线以上出现荧光扩增曲线。抗优97、科丰6号、科丰8号、华恢1号、克螟稻KMD1、LL62、LL601、T2a-1、巴吞米、K105、明恢63、培杂35、津稻9618、皖稻181和春优59及空白对照的荧光曲线在基线位置。

试验结果证实了本发明寡核苷酸引物及探针对转基因水稻品系T1c-19的高特异性。

实施例2：灵敏度测试

本发明寡核苷酸引物及探针的灵敏度，其中使用特异性引物Ory1C-F/R，即所使用的寡核苷酸引物的碱基序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，探针的碱基序列为Ory1C-P(SEQ ID NO:3)，在探针的3'-端连接有一个荧光淬灭基团BHQ1，5'-端连接有一个荧光报告基团FAM。

本实施例中使用的主要检测仪器、试剂如实施例1中所示，但在测试中使用了不同相对质量分数(2%、0.2%、0.01%，w/w)的转基因水稻品系T1c-19样品的DNA，各浓度分别进行一式两份，以此检测对转基因水稻品系T1c-19样品的灵敏度和检测限。实验结果显示在图2中。

由图2可以看出，本发明寡核苷酸引物及探针体系的灵敏度达到0.01%w/w以上。可见，使用本发明的引物对和探针的组合，在样品量极少的情况下，仍能特异、灵敏地扩增出目的片段。

虽然已经对本发明的具体实施方案进行了描述，但是本领域技术人员应认识到，在不偏离本发明的范围或精神的前提下可以对本发明进行多种改变与修饰。因而，本发明意欲涵盖落在权利要求书及其同等物范围内的所有这些改变与修饰。

Claims

1.用于通过实时PCR方法检测转基因水稻品系T1c-19或其组分的寡核苷酸引物对及探针，其中所述引物对和探针为：碱基序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的寡核苷酸引物对以及碱基序列为SEQ ID No.3的探针，在探针的3’端连接有荧光淬灭基团BHQ1，5’端连接有荧光报告基团FAM。

2.用于通过实时PCR方法检测转基因水稻品系T1c-19或其组分的试剂盒，其包括碱基序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的寡核苷酸引物对以及碱基序列为SEQ ID No.3的探针，在探针的3’端连接有荧光淬灭基团BHQ1，5’端连接有荧光报告基团FAM。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其还包括用于提取DNA的试剂、用于实时PCR的试剂、空白对照以及使用说明书。

4.用于检测检测转基因水稻品系T1c-19或其组分的实时PCR方法，所述方法包括使用权利要求1所述的寡核苷酸引物对及探针，或权利要求2或3所述的试剂盒。

5.根据权利要求4所述的实时PCR方法，其为Taqman荧光探针法。

6.根据权利要求4或5所述的实时PCR方法，所述方法包括如下步骤：

(a)从待测产品中提取DNA样品；和

(b)使用权利要求1所述的寡核苷酸引物对及探针，或权利要求2或3所述的试剂盒，通过实时PCR方法进行核酸扩增反应和检测扩增产物。

7.根据权利要求4-6中任一项所述的实时PCR方法，其中所述实时PCR方法进行核酸扩增的反应参数为：95℃，10min的起始变性；和95℃15s；60℃，1min的45个扩增循环。

8.权利要求1所述的特异性寡核苷酸引物对及探针在检测转基因水稻品系T1c-19或其组分中的应用。

9.权利要求2或3所述的试剂盒在检测转基因水稻品系T1c-19或其组分中的应用。