CN101086010B

CN101086010B - 应用于赤眼蜂分子鉴定的专用引物及鉴定赤眼蜂的方法

Info

Publication number: CN101086010B
Application number: CN2006100121919A
Authority: CN
Inventors: 李正西
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2006-06-09
Filing date: 2006-06-09
Publication date: 2010-12-08
Anticipated expiration: 2026-06-09
Also published as: CN101086010A

Abstract

本发明提供了一种应用于赤眼蜂分子鉴定的专用引物及方法。本发明所述引物的核苷酸序列为如序列表SEQ ID NO：1～4所示的序列。本发明的专用引物可用来鉴别玉米螟赤眼蜂、拟澳洲赤眼蜂和广赤眼蜂。本发明还提供了基于本发明引物开发的检测试剂盒。本发明的技术方案不仅能提高玉米螟赤眼蜂、拟澳洲赤眼蜂或广赤眼蜂鉴定的效率和准确性，而且操作简便快捷，并具有广泛的适用性，包括对繁蜂过程进行质量监控，对田间赤眼蜂的种群进行早期监测，还能对赤眼蜂的生防效果进行准确评估，具有重要的理论意义和应用价值。

Description

应用于赤眼蜂分子鉴定的专用引物及鉴定赤眼蜂的方法

技术领域

本发明属于应用生物技术领域，具体地说涉及应用于赤眼蜂(包括玉米螟赤眼蜂、拟澳洲赤眼蜂和广赤眼蜂)分子鉴定的专用引物及鉴定赤眼蜂的方法，本发明还涉及包含该专用引物的检测试剂盒。

背景技术

赤眼蜂是生物防治中应用最广的卵寄生蜂。然而，赤眼蜂个体微小(一般小于0.4mm)，近缘种间形态难辨，因此赤眼蜂传统分类与鉴定耗时费力。目前赤眼蜂种一级的鉴定依据主要是雄蜂外生殖器，但由于赤眼蜂存在孤雌生殖，在自然条件下可能仅能发现雌蜂，这样依据形态学特征将难以鉴定赤眼蜂。近年来，多种分子标记已运用于赤眼蜂的鉴定。例如，国外报道了利用限制性片段长度多态性(RFLP)和随机扩增的多态性DNA(RAPD)技术鉴别赤眼蜂的方法。但是，RFLP对模板DNA要求高并且操作较复杂，而RAPD可重复性差。因此迄今对赤眼蜂种的鉴定仍然是采用饲养后取雄峰并进行形态学鉴定的方法。该方法非赤眼蜂分类专家不能胜任。

发明内容

(一)要解决的技术问题

本发明的第一个目的是提供可鉴定玉米螟赤眼蜂、拟澳洲赤眼蜂和广赤眼蜂的专用引物；

本发明的第二个目的是提供鉴定玉米螟赤眼蜂、拟澳洲赤眼蜂和广赤眼蜂的方法；

本发明的第三个目的是提供可供检测玉米螟赤眼蜂、拟澳洲赤眼蜂和广赤眼蜂的试剂盒。

(二)技术方案

本发明依据赤眼蜂的核糖体核糖核酸基因第二内部可转录间隔区(ITS-2，Internal Transcribed Spacer 2)全序列(两端包含部分18S和5S序列)设计的专用引物对。引物设计遵循一般的规律，如GC％、Tm值和预期PCR产物适中以及引物序列内部避免出现二级结构(尤其避免两条引物间3′端的互补)，但特别注意引物序列的特异性。所设计的引物包括序列表SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4所示的序列。其中，SEQ ID NO：1(正向)及SEQ ID NO：2(反向)引物对可用于鉴定玉米螟赤眼蜂；SEQ ID NO：3(正向)及SEQ ID NO：2(反向)引物对可用于鉴定拟澳洲赤眼蜂；SEQ ID NO：4(正向)及SEQ ID NO：2(反向)引物对可用于鉴定广赤眼蜂。

应用上述的引物对分别对赤眼蜂基因组DNA进行PCR扩增，检测扩增产物，即可鉴定赤眼蜂的种类。若用玉米螟赤眼蜂专用引物对扩增，扩增产物中检测到416bp条带，说明所述昆虫样品为玉米螟赤眼蜂；若用拟澳洲赤眼蜂专用引物对扩增，扩增产物中检测到128bp条带，说明所述昆虫样品为拟澳洲赤眼蜂；若用广赤眼蜂专用引物对扩增，扩增产物中检测到390bp条带，说明所述昆虫样品为广赤眼蜂。

上述赤眼蜂样品可为成虫、卵、幼虫和蛹等虫态。

本发明还提供了用于检测玉米螟赤眼蜂、拟澳洲赤眼蜂和广赤眼蜂的PCR试剂盒。该试剂盒包含上述的引物，还包含裂解液和PCR反应预混液，其中PCR反应预混液含有Mg²⁺、dNTPs及缓冲液等，本试剂盒还可以包括DNA聚合酶。

(三)有益效果

本发明针对赤眼蜂应用中的现实需要，设计了我国常见的玉米螟赤眼蜂、拟澳洲赤眼蜂和广赤眼蜂的特异鉴定引物，并发明了一种能快速、简易和准确地鉴定上述三种赤眼蜂的方法。本发明的特点是：(1)特异、灵敏和准确。蜂种专用引物通过PCR能特异性地扩增出特定大小的产物，并具有高的检测灵敏度；(2)操作简便快捷。传统鉴定方法一般要求完整的样本，主要依据是雄蜂外生殖器的形态，耗时费力，而PCR检测仅需2-4h就能对传统方法难以处理的样品作高通量的检测；(3)广泛的适用性。该方法能对繁蜂过程进行质量监测，对田间赤眼蜂的种群进行早期监测，并能对赤眼蜂的生防效果进行准确评估。

附图说明

图1为利用本发明引物，扩增玉米螟赤眼蜂、拟澳洲赤眼蜂和广赤眼蜂基因组DNA产物的电泳图谱，M：分子量标准(100bp Ladder)；To：玉米螟赤眼蜂，PCR产物为416bp；Tc：拟澳洲赤眼蜂，PCR产物为128bp；Te：广赤眼蜂，PCR产物为390bp；

图2为使用本发明之试剂盒，扩增样品赤眼蜂基因组DNA产物的电泳图谱，M：分子量标准(100bp Ladder)；样品1～4为玉米螟赤眼蜂(To)，其PCR产物为416bp；样品6为拟澳洲赤眼蜂(Tc)，其PCR产物为128bp；样品5为广赤眼蜂(Te)，其PCR产物为390bp。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不用来限制本发明所要保护的范围。

实施例1 鉴定玉米螟赤眼蜂、拟澳洲赤眼蜂和广赤眼蜂

1、设计可鉴定玉米螟赤眼蜂、拟澳洲赤眼蜂和广赤眼蜂的专用引物

(1)设计可鉴定玉米螟赤眼蜂的专用引物

基于玉米螟赤眼蜂T.ostriniae ITS-2全序列(两端包含部分18S和5S序列)(序列表中的SEQ ID NO：5，GenBank登录号为AF250559，由641bp组成：23％A；28％C；26％G；23％T)，设计合成了可鉴定玉米螟赤眼蜂的引物对：正向引物序列如序列表中的SEQ ID NO：1所示；反向引物序列如序列表中的SEQ ID NO：2所示。

(2)设计可鉴定拟澳洲赤眼蜂的专用引物

基于拟澳洲赤眼蜂T.confusum ITS-2全序列(两端包含部分18S和5S序列)(序列表中的SEQ ID NO：6，GenBank登录号为AF422845，由595bp组成：24％A；28％C；26％G；22％T)，设计合成了可鉴定拟澳洲赤眼蜂的引物对：正向引物序列如序列表中的SEQ ID NO：3所示；反向引物序列如序列表中的SEQ ID NO：2所示。

(3)设计可鉴定广赤眼蜂的专用引物

基于广赤眼蜂T.evanescens ITS-2全序列(两端包含部分18S和5S序列)(序列表中的SEQ ID NO：6，GenBank登录号为AF453563，由621bp组成：22％A；27％C；27％G；23％T)，设计合成了可鉴定广赤眼蜂的引物对：正向引物序列如序列表中的SEQ ID NO：4所示；反向引物序列如序列表中的SEQ ID NO：2所示。

2、玉米螟赤眼蜂、拟澳洲赤眼蜂和广赤眼蜂基因组DNA的特异PCR扩增

(1)样品处理：分别将玉米螟赤眼蜂、拟澳洲赤眼蜂和广赤眼蜂样品置0.2mL离心管，加裂解液(10mmol/L Tris-HCl，pH 8.4，50mmol/L KCl，0.45％Tween20，0.45％NP-40以及100μg/ml proteinaseK)20μL，将样品磨碎，在65℃水浴30min，然后置PCR仪热处理(98℃)10min，简单(5000rpm，5sec)离心后取上清即得到赤眼蜂个体的基因组DNA。

(2)PCR反应：从步骤(1)提取液中各移取1.5μL混合，分成三份，分别加入含有可鉴定玉米螟赤眼蜂引物的PCR反应混合液、可鉴定拟澳洲赤眼蜂引物的PCR反应混合液以及可鉴定广赤眼蜂的引物的PCR反应混合液中，共设3个PCR反应，每一反应体系中含[Mg²⁺]4.5mmol/L，dNTPs 0.2mmol/L，正、反向引物各2.5mmol/L，DNA聚合酶1U，首先在95℃预变性3min，随后进行35个PCR循环：94℃30sec、52-56℃30sec、72℃30sec；最后一个循环：72℃ 10min，4℃保存。将获得的PCR产物进行1-2％琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图1所示：玉米螟赤眼蜂(To)PCR产物为416bp；拟澳洲赤眼蜂(Tc)PCR产物为128bp；广赤眼蜂(Te)PCR产物为390bp。

上述结果表明：玉米螟赤眼蜂、拟澳洲赤眼蜂和广赤眼蜂的专用引物能从混合DNA模板中扩增出特定分子量的PCR产物，结果明确，易于分辨。

实施例2 试剂盒实施例

1、试剂盒的构成

试剂盒分20次和50次反应2种规格，基本构成相同：

(1)裂解液(10mmol/L Tris-HCl，pH 8.4，50mmol/L KCl，0.45％Tween20，0.45％NP-40以及100μg/ml proteinase K)；

(2)玉米螟赤眼蜂、拟澳洲赤眼蜂和广赤眼蜂的专用引物；

(3)PCR反应预混液，包括PCR缓冲液(200mmol/L Tris-HCl，pH 8.4，200mmol/L KCl，100mmol/L(NH4)₂SO4)、MgCl₂(45mmol/L)，dNTPs(每种2.5mmol/L混合液)；DNA聚合酶由用户自备；

(4)赤眼蜂分子鉴定操作说明书。

2、应用试剂盒鉴定赤眼蜂的操作步骤实施例

(1)将从田间采集的待测单头赤眼蜂样品(共6个样品)分别置0.2mL离心管，加入所提供的裂解液20μL，将样品研碎，在65℃水浴30min，然后置PCR仪热处理(98℃)10min，简单离心(5000rpm，5sec)后取上清即得到赤眼蜂个体的基因组DNA。

(2)构建PCR反应体系(15μL)：

PCR反应预混液 13μL

赤眼蜂专用引物(正、反向混合) 0.6μL

样品基因组DNA(步骤(1)) 1μL

Taq酶(自备) 1U

ddH₂O 补充至15μL

(3)设定PCR热循环程序并扩增：

95℃预变性 3min

72℃ 10min

4℃保存

(4)1-2％琼脂糖凝胶电泳检测：PCR产物各3μL点样；

(5)结果如图2所示：未知赤眼蜂样品1～4为玉米螟赤眼蜂(To)，因为其PCR产物为416bp；样品6为拟澳洲赤眼蜂(Tc)，因为其PCR产物为128bp；样品5为广赤眼蜂(Te)，因为其PCR产物为390bp。

序列表

<110>中国农业大学

<120>应用于赤眼蜂分子鉴定的专用引物及鉴定赤眼蜂的方法

<130>

<160>7

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

tccgagagga gggtagtg 18

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

tcctccgctt attgatatgc 20

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

ggttgtatca acaacagcag c 21

<210>4

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

cgtagagaga gagtgcgc 18

<210>5

<211>641

<212>DNA

<213>Trichogramma ostriniae

<400>5

ttctcgcatc gatgaagaac gcagctaatt gcgcgtcaac ttgtgaactg caggacacat 60

gaacatcgac atttcgaacg cacattgcgg tccacggatc tcgttcccgg accacgcctg 120

gctgagggtc gtttataaaa acgaacccga ctgctctctc gcaagagaga gcgttgctct 180

gggcgctcgt gtctctatct ctgcgcgccg ctctcttctt ctattcgaag tttagagaga 240

gtgtagcaga gtgtgatgta tacgtcgcct caaacgaaac gcaagaaaaa agatgaattc 300

gttcgtctag ctggcgcgcg cgcttaccgc ttggagagta cgcgagtact tccgatcgtt 360

ctgcgtcgag tcccggagct ttctcgacgt tcactcgtcg agccagcgga ccgacgtcta 420

gcacacgatc aggcttgtcc atgcatcggt cattgaacgc gcgcgtgccc ttttacgcac 480

acacacgcac agacacgcac acactcgttg tgtcgtgctg ctgctgctgt agcgtatcaa 540

aatggctagc tcgaagctgt gaacgagtct tttttctcga tcgacgacct cagagcaggc 600

gagaccaccc gctgaattta agcatatcaa taagcggagg a 641

<210>6

<211>595

<212>DNA

<213>Trichogramma confusum

<400>6

ttctcgcatc gatgaagaac gcagctaatt gcgcgtcaac ttgtgaactg caggacacat 60

gaacatcgac atttcgaacg cacattgcgg tccacggatc tcgttcccgg accacgcctg 120

gctgagggtc gtttataaaa acgaacccga ctgctctctc gcaagagaga gcgttgatct 180

gggcgctcgt ctctatctcc tacgcgctct ttcgagagtg tcgcaggcag tgtgatacgt 240

cgcctcaaac gaaacgcaag aaaattgatg aattcgttcg tctagctggc gcgcgcgctt 300

accgcttgga gagtacgcga gtacttccga tcgttctgcg tcgagtcccg gagctttctc 360

gcacacgact actcgtcgcg tcgagcacag cggaccgacg tctagcacac gatcaggctc 420

gtccatgcat cggtcattga atgcgcgcgt gccttgttgt tgttggggtt gtatcaacaa 480

cagcagcagc agcaaaatgg ctagctcgaa gcaagaacga gtctcttttc tcgatcgacg 540

acctcagagc aggcgagacc acccgctgaa tttaagcata tcaataagcg gagga 595

<210>7

<211>621

<212>DNA

<213>Trichogramma evanescens

<400>7

ttctcgcatc gatgaagaac gcagctaatt gcgcgtcaac ttgtgaactg caggacacat 60

gaacatcgac atttcgaacg cacattgcgg tccacggatc tcgttcccgg accacgcctg 120

gctgagggtc gtttataaaa acgaacccga ctgctctctc gcaagagaga gcgttgatct 180

gggcgctcgt ctctatctct atgcgcgcgc gcgcgcgctc tttcttctat tcgtagagag 240

agagtgcgcg agagtgtgcg tagcagtgtg acacgtcgcc tcaaacgaaa cgcaagaaaa 300

aagatgaatt cgttcgtctg gctggcgcgc gcgcttaccg cttggagagt acgtcagtac 360

ttccgatcgt tctgcgtcga gtcccggagc tttctcgact cgtcgagcag cggaccgacg 420

tctagcacac gatcaggctc gtccatgcat cggtcattga acgcgcgcgc gcgctcgtgc 480

tctcttttgt tttaacgaac gaaagtaggt aacgacggct agctcgaagc ttttttggct 540

gaacgagtct tttttctcga tcgacgacct cagagcaggc gagaccaccc gctgaattta 600

agcatatcaa taagcggagg a 621

Claims

1.用于鉴定赤眼蜂的专用引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1～4所示。

2.一种用于鉴定赤眼蜂的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如权利要求1所述的引物。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其还包含裂解液和PCR反应预混液。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其中所述的PCR反应预混液含有Mg²⁺、dNTPs以及缓冲液。

5.一种鉴定赤眼蜂的方法，其特征在于，使用如权利要求1所述的引物或权利要求2-3任一所述的试剂盒扩增赤眼蜂基因组DNA并检测扩增产物，其中用SEQ ID NO：1和2所示的引物进行扩增，扩增产物序列为416bp时表明是玉米螟赤眼蜂；用SEQ ID NO：3和2所示的引物进行扩增，产物序列为128bp时表明是拟澳洲赤眼蜂；用SEQ ID NO：4和2所示的引物进行扩增，产物序列为390bp时表明是广赤眼蜂。