CN1556222A

CN1556222A - 一种鉴定松毛虫赤眼蜂的方法及其专用引物与应用

Info

Publication number: CN1556222A
Application number: CNA2004100001871A
Authority: CN
Inventors: 沈佐锐; 李正西
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2004-01-07
Filing date: 2004-01-07
Publication date: 2004-12-22
Anticipated expiration: 2024-01-07
Also published as: CN1274844C

Abstract

本发明公开了一种鉴定松毛虫赤眼蜂的方法及其专用引物与应用。本发明所提供的鉴定松毛虫赤眼蜂的引物，是下述核苷酸序列：1)正向引物是序列表中的SEQ ID №：1；2)反向引物是序列表中的SEQ ID №：2。鉴定松毛虫赤眼蜂的方法，是用上述鉴定松毛虫赤眼蜂的引物PCR扩增昆虫样品的基因组DNA，检测扩增产物，确定所述昆虫样品是否为松毛虫赤眼蜂。本发明还提供了一种包括上述鉴定松毛虫赤眼蜂的引物的PCR试剂盒。本发明的方法及试剂盒不仅能提高松毛虫赤眼蜂鉴定的效率和准确性，还能解决松毛虫赤眼蜂田间释放应用中的种群监测和生防效能评价问题，具有重要的理论意义和实际意义。

Description

一种鉴定松毛虫赤眼蜂的方法及其专用引物与应用

技术领域

本发明涉及生物防治、分子诊断和昆虫学领域中一种鉴定松毛虫赤眼蜂的方法及其专用引物与应用，特别涉及一种鉴定松毛虫赤眼蜂的方法及其专用引物与包括该引物的鉴定松毛虫赤眼蜂的试剂盒。

背景技术

寄生蜂是作物害虫最重要的死亡因子之一。生物防治最重要的微小卵寄生蜂--赤眼蜂是世界上应用面积最广，防治对象最多的天敌昆虫，但赤眼蜂种一级的分类依据主要是雄蜂外生殖器，可是赤眼蜂许多种类在自然条件下仅能见到雌虫，同时该蜂个体微小(约0.2mm)、形态难辨，而且其形态和生理特征易受环境条件的影响，因此赤眼蜂的准确鉴定一般需要赤眼蜂分类专家才能胜任。

赤眼蜂分子鉴定可以通过构建赤眼蜂种稳定和具有分类鉴定意义的分子标记来实现。国外报道了利用RAPD技术鉴别微小寄生蜂(缨小蜂)的遗传变异性以及采用PCR技术探测寄主卵的被寄生情况，但都没能注重研究寄生蜂种特异分子标记的构建、筛选和开发，因此迄今对赤眼蜂种的鉴定只能通过采样、饲养、取雄峰以及进行传统分类学鉴定。

发明创造内容

本发明的目的是提供一种可鉴定松毛虫赤眼蜂的引物。

本发明所提供的鉴定松毛虫赤眼蜂引物，是下述核苷酸序列：

1)正向引物为序列表中的SEQ ID №：1，由18个碱基组成，Tm＝56℃，GC％＝55.6；

2)反向引物为序列表中的SEQ ID №：2，由18个碱基组成，Tm＝52℃，GC％＝44.4。

本发明的第二个目的是提供一种鉴定松毛虫赤眼蜂的方法。

一种鉴定松毛虫赤眼蜂的方法，是用鉴定松毛虫赤眼蜂的引物PCR扩增昆虫样品的基因组DNA，扩增产物中检测到320±5bp条带的为松毛虫赤眼蜂；所述鉴定松毛虫赤眼蜂的引物，是下述核苷酸序列：正向引物为序列表中的SEQ ID №：1，反向引物为序列表中的SEQ ID №：2。

所述昆虫样品可为成虫、卵、幼虫和蛹等其它虫态。

所述昆虫样品经裂解液处理、95℃-100℃热变性、离心，取上清，即得到所述昆虫样品的基因组DNA；所述裂解液可为80-120mmol/L Tris，0.1-0.5mol/L KCl或5-50mmol/L EDTA，pH9-10，优选为100mmol/L Tris，0.2mol/L KCl或10mmol/LEDTA，pH9.5。

所述PCR扩增的反应体系除含有所述昆虫样品的基因组DNA外，还含有PCR预混液：4.5mM[Mg²⁺]，0.2mM dNTP，上述鉴定松毛虫赤眼蜂的正、反向引物各2.5mM，DNA聚合酶1U；所述PCR循环程序为：第一循环：95℃3min，随后进行35个循环：94℃45sec、54℃45sec、72℃45sec；最后一个循环：72℃10min。

本发明还提供了一种鉴定松毛虫赤眼蜂的试剂盒。

本发明所提供的鉴定松毛虫赤眼蜂的试剂盒为包括上述鉴定松毛虫赤眼蜂的引物的PCR试剂盒。

所述鉴定松毛虫赤眼蜂的试剂盒还包括以下成分：Mg²⁺，dNTP，DNA聚合酶。

本发明针对现有微小昆虫传统分类鉴定上的困难以及赤眼蜂田间放蜂应用上种群监测和生防效果评估的现实需要，采用特异分子标记技术而研制开发出一种能快速、简易和准确地鉴定赤眼蜂成虫(包括雌雄蜂)和其它虫态(包括羽化前的卵、幼虫和蛹)的方法和试剂盒。本发明的方法及其专用引物和试剂盒不仅能提高松毛虫赤眼蜂鉴定的效率和准确性，还能解决松毛虫赤眼蜂田间释放应用中的种群监测和生防效能评价问题。应用本发明所开发的松毛虫赤眼蜂鉴定试剂盒，普通人(而非赤眼蜂专家)就能快速准确地鉴定该蜂种，而且不要求完整的虫体，也不要求雄峰，特别是在该蜂寄生20小时后就能诊断出是否寄生，从而计算出田间或室内寄生率。

本发明具有以下优点：A.能早期监测田间寄生蜂的种群动态，特别是能准确估计田间不同寄生蜂的比例。对寄生蜂的早期检测在生防上具有指导意义，因为早期监测能预知天敌基数和放蜂数量以防止浪费；B.时间短：PCR检测仅需2-4h就能对传统培养法难以处理的样品作出行之有效的检测，同时敏感性和特异性高；C.有利于蜂种鉴定：在这方面，PCR检测显得特别有效，因为它不但可以鉴定活蜂，还可以鉴定已死亡变形的死蜂，这给鉴定工作带来很大便利。传统方法一般要求完整的样本才能作出准确的鉴定。PCR检测不仅能鉴定成熟期虫体，还能鉴定其幼虫期和卵期；鉴定工作不一定需要专家的介入，普通人员即可有效解决；D.生防效果评价：对于生防效果的评价，以前的方法显得不够准确和迅速。PCR法则可以通过定期检测，随时掌握田间赤眼蜂种群动态；PCR法还可进行早期检测，及时作出判断，对进一步的生防措施具有极大指导意义；E.一般情况下，生物有机体死亡后，其体内的蛋白系统很快崩溃，而DNA则能相对较长时间地保存下来。这些DNA在某种情况下又会复活，所以细胞的死亡最可靠的评价指标是其基因(DNA)的完全降解。特别是在许多问题未搞清楚以前，更应该以DNA的降解来判定“死与活”。本发明的方法也为鉴定其它微小昆虫提供了新思路。

附图说明

图1为鉴定松毛虫赤眼蜂的引物扩增多头蜂、单头蜂及被寄生卵的电泳图谱

图2为鉴定松毛虫赤眼蜂的引物鉴定和检测田间样品的电泳图

具体实施方式

实施例1、鉴定松毛虫赤眼蜂

1、设计可鉴定松毛虫赤眼蜂的引物

基于松毛虫赤眼蜂T.dendrolimi ITS-2全序列(两端包含部分18S和5S序列)(序列表中的SEQ ID №：3，由596bp组成，GenBank注册号：AF453558；组成：23％A；28％C；26％G；23％T；)，设计合成了可鉴定松毛虫赤眼蜂的引物对：正向引物序列如序列表中的SEQ ID №：1所示；反向引物序列如序列表中的SEQ ID №：2所示。

2、松毛虫赤眼蜂的鉴定

(1)样品处理：分别将单头或多头(2-50头)待测样品A、B、C、D、E、F、G、H和I(A＝多头松毛虫赤眼蜂成虫；B＝单头松毛虫赤眼蜂成虫；C＝单粒被松毛虫赤眼蜂寄生的米蛾卵；D＝单粒未被寄生的米蛾卵；E＝单粒未被寄生的亚洲玉米螟(ACB)卵；F＝单头玉米螟赤眼蜂；G＝单头拟澳洲赤眼蜂；H＝单头广赤眼蜂；I＝单头甘蓝夜蛾赤眼蜂)转移到0.5mlPCR薄壁PCR管，加入10μl 100mmol/LTris裂解液，用微型研杵将样品彻底研碎，然后置PCR仪98℃热变性10分，5000g离心10秒，取上清，4℃保存待测；

(2)PCR反应：从步骤(1)处理液中移取2μl加入包含可鉴定松毛虫赤眼蜂的引物的PCR反应预混合液，其中含[Mg2+]4.5mM，dNTP 0.2mM，正、反向引物各2.5mM，DNA聚合酶1U，进入PCR循环程序：第一循环：95℃3min，随后进行35个循环：94℃45sec、54℃45sec、72℃45sec；最后一个循环：72℃10min，4℃保存。将获得的PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，并与标准Marker对比；结果如图1所示，表明在多头松毛虫赤眼蜂成虫；单头松毛虫赤眼蜂成虫；单粒被松毛虫赤眼蜂寄生的米蛾卵中检测到320bp的特异片段，而其它样品中未检测到此特异条带。

按照上述方法对样品A’-L’：从中国各地采集到的赤眼蜂样品：A’＝黑龙江土头沟；B’＝广东广州；C’＝吉林长春；D’＝湖北武汉1；E’＝陕西长安；F’＝江苏徐州；G’＝吉林仁和；H’＝河北衡水；I’＝北京延庆；J’＝黑龙江亚布力；K’＝河北武汉2；L’＝湖南长沙进行鉴定，结果如图2所示，表明样品A’、B’、C’、E’、F’、G’、H’、I’、J’和K’中检测到320bp的特异片段，说明它们为松毛虫赤眼蜂，这与传统分类鉴定的结果一致：传统分类鉴定A’、B’、C’、E’、F’、G’、H’、I’、J’和K’为松毛虫赤眼蜂，D’和L’分别为甘蓝夜蛾赤眼蜂(T.brassicae)和稻螟赤眼蜂(T.japonicum)。

序列表

<160>3

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

gcagcagtca agacgaca 18

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

ttaaattcag cgggtggt 18

<210>3

<211>596

<212>DNA

<213>松毛虫赤眼蜂(Trichogramma dendrolimi)

<400>3

ttctcgcatc gatgaagaac gcagctaatt gcgcgtcaac ttgtgaactg caggacacat 60

gaacatcgac atttcgaacg cacattgcgg tccacggatc tcgttcccgg accacgcctg 120

gctgagggtc gtttataaaa acgaacccga ctgctcactc gcaagagaga gcgttgatct 180

gggcgctcgt gtctctctgt ctgtctgtct gctgttgtat cctctcttcg agagtgtagc 240

agcagcagca gcagcagcag cagtcaagac gacacgtcgc ctcaaacgaa acgcaagaaa 300

aatgatgaat tcgttcgtct agctggcgcg cgcgcttacc gcttggagag tactcgttcg 360

tcgagtactt ccgatcgttc tgcgtcgagt cccggagctt ctcgcctcgt cgagcagcgg 420

accgacgtct agcacacgat caggctcgtc catgattcgg tcattgaacg cgcgcgcgcc 480

cctcttaatc gacggccggc tagctcgaaa tttgtgaatg aatctttttt ctcgatcgac 540

gacctcagag caggcgagac cacccgctga atttaagcat atcaataagc ggagga 596

Claims

1、一种鉴定松毛虫赤眼蜂的引物，是下述核苷酸序列：

正向引物为序列表中的SEQ ID №：1，反向引物为序列表中的SEQ ID №：2。

2、一种鉴定松毛虫赤眼蜂的方法，是用鉴定松毛虫赤眼蜂的引物PCR扩增昆虫样品的基因组DNA，扩增产物中检测到320±5bp条带的为松毛虫赤眼蜂；所述鉴定松毛虫赤眼蜂的引物，是下述核苷酸序列：正向引物为序列表中的SEQ ID №：1，反向引物为序列表中的SEQ ID №：2。

3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述昆虫样品为成虫、卵、幼虫和蛹。

4、根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述昆虫样品经裂解液处理、95℃-100℃热变性、离心，取上清，即得到所述昆虫样品的基因组DNA。

5、根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述裂解液为80-120mmol/L Tris，0.1-0.5mol/L KCl或5-50mmol/L EDTA，pH9-10。

6、根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应体系除含有所述昆虫样品的基因组DNA外，还含有PCR预混液：4.5mM[Mg²⁺]，0.2mM dNTP，鉴定松毛虫赤眼蜂的正、反向引物各2.5mM，DNA聚合酶1U；所述鉴定松毛虫赤眼蜂的正向引物为序列表中的SEQ ID №：1，反向引物为序列表中的SEQ ID №：2。

7、根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述PCR循环程序为：第一循环：95℃ 3min，随后进行35个循环：94℃ 45sec、54℃ 45sec、72℃ 45sec；最后一个循环：72℃ 10min。

8、一种鉴定松毛虫赤眼蜂的试剂盒，它为包括鉴定松毛虫赤眼蜂的引物的PCR试剂盒；所述鉴定松毛虫赤眼蜂的引物，是下述核苷酸序列：正向引物为序列表中的SEQ ID №：1，反向引物为序列表中的SEQ ID №：2。