CN101245391B - 鉴定西花蓟马的巢式pcr方法及特异引物 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物技术领域，特别是涉及到一种鉴定西花蓟马的巢式PCR方法及其特异引物。一种鉴定西花蓟马的巢式PCR方法，其特征是PCR反应分两步，第一步以rDNA为模板用通用引物扩增出18S至28S区段，第二步反应以第一步PCR产物为模板，再根据18S至28S区间变异区段序列设计的特异引物F1、F2，进行第二轮反应，扩增西花蓟马特有的片段，两轮PCR反应提高了鉴定的准确性，改进为单管巢式PCR后，提高了鉴定效率，经实验验证，本发明提供的特异引物能在亲缘关系很近的模板之间准确地鉴定出西花蓟马。

Description

鉴定西花蓟马的巢式PCR方法及特异引物

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，涉及一种能够特异鉴定西花蓟马的巢式PCR方法及特异引物。

技术背景

西花蓟马是一种世界性的危险性害虫，起源于北美洲西部山区，最早记载于1895年，曾是美国加州最常见的一种蓟马，近年来侵入中国部分地区，被国内有关专家确定为危险性外来入侵害虫。西花蓟马直接取食危害，造成蔬菜、花卉及水果等叶片、花器或果面上留下疤痕及斑点。此外，西花蓟马还能传播番茄斑点萎蔫病毒等在内的多种病毒，且在若虫取食植物30分钟后即可获毒，然后主要由成虫传播。目前已知其寄主植物多达500余种，包括重要的菊科、葫芦科、豆科、十字花科等蔬菜作物，尤其是温室种植的花卉、茄果类植物受害最重，因此采取措施防止西花蓟马对植物的危害非常迫切。但由于其卵、若虫、成虫都有很强的隐蔽性，对药剂容易产生抗药性，而常规的防治措施难以奏效，所以在防治及检疫工作中，早期鉴定出西花蓟马并提早防治非常有现实意义。

目前为止，蓟马种类的鉴定主要以雌成虫的形态特征为主，但是西花蓟马的成虫体色具多态性---黑色、褐色和黄色，同时蓟马的若虫、蛹无法通过形态鉴定到种，目前也有对未成熟时期的卵、若虫或蛹进行分类的研究，但仍在研究阶段，尚无明确定论。然而在植物检疫过程当中，发现标本为若虫时，通常须继续饲养至成虫才能够鉴定。这样，不仅耗时，且虫体微小，常常在饲养过程中可能死亡或不明原因消失。因此很有必要开发一种快速、简单且准确的鉴定技术。以PCR技术为基础分子标记技术，能很好地解决这些问题。近年来，利用分子标记技术鉴别昆虫种类的研究非常多，可利用的标记技术也非常多，但由于分析样品的特殊性，对于选择哪种分子标记技术却很重要。在DNA分子标记技术的应用过程中，若所研究的昆虫DNA资料未知的情况下，利用RAPD-PCR技术是最简便、最快速，且需要的DNA量少，可用于各种保存方式的标本，也可做特定害虫的快速鉴定(De Barro P J，Driver F.Use ofRAPD-PCR to distinguish the B biotype from other biotypes of Bemisia tabaci(Gennadius)(Hemiptera：Aleyrodidae).Austrilian Journal of Entomology.1997，36(2)：149-152；Garner K J，Slavicek J M.Identification and characterization of a RAPD-PCR marker for distinguishing Asianand North American gypsy moths.Journal of Insect Molecuar and Biology，1996，5(2)：81-91；Haymer D and McInnis D.Resolution of populations of the Mediterranean fruit fly，Ceratitiscapitata，at the DNA level using random primers for the polymerase chain reaction.Genome 1994，37：244-248)。然而这种鉴定技术的开发需要收集完整的鉴定样品作为对照，否则无法建立完整的分子标记技术；为弥补样品不足的缺陷，直接由已知序列设计引物进行PCR检测目的基因，不失为一有用的方法。根据文献18S和28S rDNA在所有生物中具有功能上和进化上的同源性，其整体结构和核酸序列在物种间非常保守，再加上中间包含保守区和变异区，适合于不同层次上的分类分析(Hillis D M and Dixon M T.Ribosomal DNA：molecular evolution andphylogenetic inference.Quarterly Review of Biology，1991，66，411-453；CruickshankRH.Molecular markers for the phylogenetics of mites and ticks.Systematic and Applied Acarology.2002，7：3-14)。然而在实际的分类鉴定实验中，由于我们得到的标本量少至单头虫体，而蓟马体形微小，单头提取的DNA浓度很低，即使运用上述分子鉴定方法，也经常因为模板量太少而使鉴定工作难以顺利进行。有研究者以线粒体DNA为分析模板，设计出特异鉴定出西花蓟马的特异引物，但由于线粒体DNA在细胞中含量较低，在实际鉴定实验中需要3-4头虫体才能完成鉴定(周力兵，刘忠善，李春艳，丁元明：PCR法鉴定西花蓟马，植物检疫，2007，21(2)：78-81)。

发明内容

针对上述领域中的空白及存在的问题，本发明提供一种能快速、精确鉴定出西花蓟马的巢式PGR方法以及一对能特异鉴定出西花蓟马的PCR引物。

一种鉴定西花蓟马的特异引物F1、F2，其序列为：

F1：5’-GTTCCCGAGTTCGTGATTGC-3’，

F2：5’-GGAAGCGGTGAAGCGACCAC-3。

一种鉴定西花蓟马的巢式PCR方法，其特征是PCR反应分两步，第一步以rDNA为模板用通用引物扩增出18S至28S区段，第二步反应以第一步PCR产物为模板，用特异引物F1、F2扩增西花蓟马特有的片段。

所述通用引物为CS249，CS250，其序列分别为：

CS249：5’-TCGTAACAAGGTTTCCG-3’。

CS250：5’-GTT(A/G)GTTTCTTTTCCT-3’。

所述巢式PCR方法是双管巢式PCR反应或单管巢式PCR反应。

所述巢式PCR方法是单管巢式PCR反应。

经过同源比对分析西花蓟马与花蓟马之间高度保守的18S和28S rDNA区间，搜寻到变异区段，根据变异区段的序列信息设计出一对能特异地扩增出西花蓟马的特异引物F1、F2，因此本发明应用通用引物通过巢式PCR第一步反应将18S部分+ITS1+5.8S+ITS2+28S部分从基因组中大量扩增出来，然后在此基础上应用特异引物F1、F2进行巢式PCR第二步反应，避免了特异引物F1、F2扩增基因组别的区段，使鉴定结果更为准确，提高了所设计引物的专一性。由于本发明所要鉴定的西花蓟马，非常难于获得大量的样本，很多时候少至单头，所以提出的DNA量极少，rDNA在细胞中含量高，容易获得，以rDNA作为分析的材料，以通用引物扩增出18S至28S区段作为次级模板，再利用特异引物特异性扩增西花蓟马，即使只有一只虫体也能顺利鉴定出西花蓟马，而不像利用线粒体DNA作模板时需要3-4头虫体才能完成检测。

另外在本发明中，巢式PCR由常规的双管反应演变出了单管反应，单管反应对于实际的鉴定操作的快速、准确性提供了进一步的保证，特别是在海关检疫或者植物病害诊断中，准确性和高效率常常很重要，单管巢式反应可以避免倒换样品时造成模板污染和时间浪费。

综上所述，本发明提供了一种巢式PCR方法和一对特异引物，以蓟马的rDNA为分析模板，能将少至一头的西花蓟马从与其亲缘关系极近的蓟马种类中，高效、准确地鉴定出来，为植物病害诊断、海关检疫、生物分类研究等工作提供了一种实用的技术。

附图说明

图1.双管巢式PCR第一步反应

FO1是西花蓟马的若虫、FO2是西花蓟马的成虫；FI1是花蓟马的若虫、FI2是花蓟马的成虫。

图2.双管巢式PCR第二步反应。

FO1是西花蓟马的若虫、FO2是西花蓟马的成虫；FI1是花蓟马的若虫、FI2是花蓟马的成虫。

图3.采用与双管巢式PCR相同的两套引物对西花蓟马成虫和若虫、花蓟马的成虫和若虫、黄胸蓟马的成和若虫、烟蓟马的成虫和若虫、塔六点蓟马成虫进行单管巢式PCR鉴定。C14、H6、Q2为西花蓟马的成虫，B11西花蓟马的若虫，E17、E2花蓟马的成虫，Q10花蓟马的若虫，R2、R18黄胸蓟马的成虫，R1黄胸蓟马的若虫，T21、S1、S2烟蓟马的成虫，SH3烟蓟马的若虫，O1是塔六点蓟马。

图4.设计特异引物的结构示意图。

图5.西花蓟马与花蓟马18S-28S rDNA序列比对分析。

1至44号区间为蓟马18S rDNA保守区域；45至891号区域为ITS1；892至1067为5.8S区域；编号1068至1421为ITS2区域；1422至1485为28S区域。

具体实施方式

实施例1双管巢式PCR

步骤1特异引物设计

搜索GENBANK中西花蓟马与其亲缘关系较近的花蓟马、黄胸蓟马、烟蓟马、塔六点蓟马的18S与28S区段，用DNAman进行同源比对，根据其变异区段序列信息设计一对特异引物F1、F2(图4)。

步骤2形态分类并饲养

从田间不同寄主上采集蓟马成虫，带回室内单头饲养收集各自的后代，一部分进行形态学鉴定以区分种类，一部分作为分子鉴定的材料。

经形态学鉴定有如下种类：西花蓟马F.occidentalis Pergande、花蓟马F.intonsa Trybom、黄胸蓟马T.hawaiiensis Morgan、烟蓟马T.tabaci Lindeman和塔六点蓟马Scolothrips takahashiiPrisener。

步骤3单头DNA提取方法

利用百泰克科技有限公司DNA提取试剂盒(CA#DP1201)说明书结合西花蓟马体小，组织量少的情况，将其步骤改成如下所述：

1)往1.5ml的离心管内加60uL的裂解液，将装有裂解液的离心管置于-20℃的冰箱内，迅速冷冻5分钟至裂解液呈坚硬冰块状；

2)挑取1头西花蓟马置于冰块上，用烧钝的黄枪头迅速研磨蓟马虫体，捣碎虫体成黏糊状；

3)往黏糊状液体中加入蛋白酶K 1.75uL，盖上管盖将管放到旋涡震荡器上震荡片刻，混匀裂解液，然后于55℃水浴过夜；

4)将离心管从水浴锅中取出室温冷却至室温，然后往里面加入RNA酶(10mg/mL)1.0uL并混匀，再在37℃中水浴30分钟；

5)再将离心管取出冷却至室温，加入蛋白沉淀液20ul，置于旋涡震荡器上震荡25秒钟后，放入冰盒中冰浴15分钟；

6)然后将离心管放到离心机中13000转/秒离心5分钟；

7)小心取上清于另一新离心管中，注意不要吸取到沉淀；

8)向装有上清的离心管中加入等体积的异丙醇，轻柔颠倒混匀30次，静止5分钟；

9)再12000转/秒离心10分钟，弃上清；

10)往离心管内加入1mL70％乙醇，漂洗DNA沉淀，再12000转/秒离心2分钟，弃上清；

11)再加11mL无水乙醇，漂洗DNA沉淀，再12000转/秒离心2分钟，弃上清。将离心管室温自然晾干；

12)加入15uLDNA溶解液并65℃水浴1小时溶解DNA；

13)-20℃冰箱内长期保存。

步骤4第一轮PCR反应

采用Moritz等2001年的文章(Moritz G，Delker C，Paulsen M，Mound L A andBurgermeister W.Modern methods for identification of Thysanoptera.OEPP/EPPO Bulletin.2000，30：591-591)中记载的通用引物CS249(5-TCGTAACAAGGTTTCCG-3)和CS250(5′-GTT(A/G)GTTTCTTTTCCT-3′)，以西花蓟马和花蓟马的基因组DNA为模板扩增rDNA的18S至28S区间，反应体系见表1-1：

                             表1-1

反应程序：95℃2分钟；94℃1分钟，55℃1分钟，72℃2分钟，共25个循环；72℃5分钟。

10μL上述产物直接跑1％琼脂糖，并回收直接送测序公司测序，验证第一轮扩增产物是18S至28S区段之间的序列。

如图1所示，西花蓟马和花蓟马都在1.4kb处有一条带，测序结果验证所扩产物为rDNA的18s至28s之间的序列(图5)。

步骤5第二轮PCR反应

在另一个pcr反应管中加入表1-2的反应混合液。

                             表1-2

反应程序：95℃2分钟；94℃1分钟，62℃40秒，72℃40秒，共25个循环；72℃5分钟。产物7μL跑1％琼脂糖电泳。

检测结果显示只在西花蓟马的模板中检测出条带(图2).

实施例2单管巢式PCR

所需试剂、引物、形态分类步骤等与实施例1相同，以西花蓟马的成虫和若虫、花蓟马的成虫和若虫，黄胸蓟马的成虫和若虫、烟蓟马的成虫和若虫、塔六点蓟马成虫的基因组DNA为模板，PCR反应体系和步骤改为表2-1至表2-2所述。

第一轮PCR反应体系如表2-1：

                            表2-1

反应程序：95℃2分钟；94℃1分钟，55℃1分钟，72℃2分钟，共10个循环；72℃5分钟。

第二轮PCR反应：向第一轮反应产物中直接加入如表2-2的反应混合液。

                            表2-2

反应程序：95℃2分钟；94℃1分钟，62℃40秒，72℃40秒，共22个循环；72℃5分钟。产物7μL跑1％琼脂糖电泳分析结果。

检测结果表示该引物只在西花蓟马的模板中扩展出条带，与其亲缘关系最近的花蓟马，以及其它亲缘关系较近的蓟马中都没有扩增出条带，说明该方法能灵敏，准确地鉴定出西花蓟马，发明提供的特异引物具有鉴定西花蓟马的专一性(图3)。

单管巢式反应节省了中间检测以及倒换反应管的步骤，使鉴定反应更为准确和快速。

附录：

序列表

Claims (5)

1.一种鉴定西花蓟马的特异引物F1、F2，其序列为：

F1：5’-GTTCCCGAGTTCGTGATTGC-3’，

F2：5’-GGAAGCGGTGAAGCGACCAC-3’。

2.一种鉴定西花蓟马的巢式PCR方法，其特征是PCR反应分两步，第一步以rDNA为模板用通用引物扩增出18S至28S区段，第二步反应以第一步PCR产物为模板，用权利要求1中的特异引物F1、F2扩增西花蓟马特有的片段。

3.权利要求2所述的一种鉴定西花蓟马的巢式PCR方法，所述通用引物为CS249，CS250，其序列分别为：

CS249：5’-TCGTAACAAGGTTTCCG-3’，

CS250：5’-GTT(A/G)GTTTCTTTTCCT-3’。

4.权利要求2所述的一种鉴定西花蓟马的巢式PCR方法，所述巢式PCR方法是双管巢式PCR反应或单管巢式PCR反应。

5.权利要求4所述的一种鉴定西花蓟马的巢式PCR方法，所述巢式PCR方法是单管巢式PCR反应。

Images