CN103966361A - 鉴定烟草花叶病毒种属的方法及其专用条形码引物 - Google Patents
鉴定烟草花叶病毒种属的方法及其专用条形码引物 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103966361A CN103966361A CN201410193595.7A CN201410193595A CN103966361A CN 103966361 A CN103966361 A CN 103966361A CN 201410193595 A CN201410193595 A CN 201410193595A CN 103966361 A CN103966361 A CN 103966361A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mosaic virus
- virus
- sequence
- pcr
- tobacco mosaic
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 title claims abstract description 71
- 241000894007 species Species 0.000 title claims abstract description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 43
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 17
- 235000002566 Capsicum Nutrition 0.000 claims description 27
- 241000723848 Tobamovirus Species 0.000 claims description 22
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 20
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 20
- 241000723845 Cucumber green mottle mosaic virus Species 0.000 claims description 16
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 claims description 15
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 claims description 15
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 claims description 13
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 12
- 235000000832 Ayote Nutrition 0.000 claims description 11
- 240000008067 Cucumis sativus Species 0.000 claims description 11
- 235000010799 Cucumis sativus var sativus Nutrition 0.000 claims description 11
- 235000009854 Cucurbita moschata Nutrition 0.000 claims description 11
- 235000009804 Cucurbita pepo subsp pepo Nutrition 0.000 claims description 11
- 235000015136 pumpkin Nutrition 0.000 claims description 11
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 claims description 8
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 claims description 8
- 235000012828 Citrullus lanatus var citroides Nutrition 0.000 claims description 7
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 claims description 7
- 240000008574 Capsicum frutescens Species 0.000 claims description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 5
- 239000001390 capsicum minimum Substances 0.000 claims description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 5
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 claims description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims description 2
- 238000012797 qualification Methods 0.000 claims 5
- 244000241235 Citrullus lanatus Species 0.000 claims 1
- 240000004244 Cucurbita moschata Species 0.000 claims 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 claims 1
- 238000013016 damping Methods 0.000 claims 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 8
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 abstract description 4
- 238000012271 agricultural production Methods 0.000 abstract description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 abstract description 2
- 239000006002 Pepper Substances 0.000 description 22
- 235000016761 Piper aduncum Nutrition 0.000 description 22
- 240000003889 Piper guineense Species 0.000 description 22
- 235000017804 Piper guineense Nutrition 0.000 description 22
- 235000008184 Piper nigrum Nutrition 0.000 description 22
- 240000001980 Cucurbita pepo Species 0.000 description 10
- 241000723824 Pepper mild mottle virus Species 0.000 description 7
- 241000219109 Citrullus Species 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 241000160656 Kyuri green mottle mosaic virus Species 0.000 description 3
- 241001147459 Turnip vein-clearing virus Species 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 241000715987 Abutilon yellow mosaic virus Species 0.000 description 2
- 241001502739 Bell pepper mottle virus Species 0.000 description 2
- 241000603668 Brugmansia mild mottle virus Species 0.000 description 2
- 241000334219 Cactus mild mottle virus Species 0.000 description 2
- 241001310482 Cucumber fruit mottle mosaic virus Species 0.000 description 2
- 241000561002 Cucumber mottle virus Species 0.000 description 2
- 241000407230 Frangipani mosaic virus Species 0.000 description 2
- 241000632607 Hibiscus latent Fort Pierce virus Species 0.000 description 2
- 241001099111 Hibiscus latent Singapore virus Species 0.000 description 2
- 241001502738 Maracuja mosaic virus Species 0.000 description 2
- 241001429290 Obuda pepper virus Species 0.000 description 2
- 241000723826 Odontoglossum ringspot virus Species 0.000 description 2
- 241001492330 Paprika mild mottle virus Species 0.000 description 2
- 241001370615 Rehmannia mosaic virus Species 0.000 description 2
- 241000500290 Ribgrass mosaic virus Species 0.000 description 2
- 241000372915 Streptocarpus flower break virus Species 0.000 description 2
- 241000723881 Sunn-hemp mosaic virus Species 0.000 description 2
- 241000723877 Tobacco mild green mosaic virus Species 0.000 description 2
- 241000723613 Tomato mosaic virus Species 0.000 description 2
- 241000017722 Tropical soda apple mosaic virus Species 0.000 description 2
- 241000173535 Wasabi mottle virus Species 0.000 description 2
- 241000162015 Zucchini green mottle mosaic virus Species 0.000 description 2
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108050004212 Cytochrome c oxidase subunit I Proteins 0.000 description 1
- 102000015884 Cytochrome c oxidase subunit I Human genes 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 235000003805 Musa ABB Group Nutrition 0.000 description 1
- 240000005561 Musa balbisiana Species 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 240000001439 Opuntia Species 0.000 description 1
- 235000015266 Plantago major Nutrition 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 241000702305 Tomato mottle virus Species 0.000 description 1
- 241000961632 Tymovirales Species 0.000 description 1
- 235000003548 Ullucus Nutrition 0.000 description 1
- 241001545529 Ullucus Species 0.000 description 1
- 241000961586 Virgaviridae Species 0.000 description 1
- 241000331094 Youcai mosaic virus Species 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 235000021332 kidney beans Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 101150088250 matK gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了鉴定烟草花叶病毒种属的方法及其专用条形码引物。本发明所提供的条形码引物组,由Tobamo F6和Tobamo R6组成。实验证明,使用本发明所提供的引物组,在表现症状的样品中可100%扩增到烟草花叶病毒属病毒,测序成功率为100%;能够有效对该属内的病毒进行物种鉴定。可在进境植物及其产品检疫中应用,防止病毒的传入;也可在国内的植保植检站、科研院所、农业生产企业及农户中大范围推广应用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,尤其涉及一种鉴定烟草花叶病毒种属的方法及其专用条形码引物。
背景技术
烟草花叶病毒属(Tobamovirus)为芜菁黄花叶病毒目(Tymovirales)帚状病毒科(Virgaviridae)成员;根据国际病毒分类委员会(International CommitteeonTaxonomy of Viruses,ICTV)于2012年发布的最新病毒分类第九次报告,该病毒属包含了曼陀罗轻斑驳病毒(Brugmansia mild mottle virus,BrMMV)、黄瓜果实斑驳花叶病毒(Cucumber fruit mottle mosaic virus,CFMMV)、黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)、鸡蛋花花叶病毒(Frangipani mosaicvirus,FrMV)、木槿潜伏皮尔斯堡病毒(Hibiscus latent Fort Pierce virus,HLFPV)、木槿潜伏新加坡病毒(Hibiscus latent Singapore virus,HLSV)、Kyuri绿斑驳花叶病毒(Kyuri green mottle mosaic virus,KGMMV)、老布达辣椒病毒(Obuda peppervirus,ObPV)、齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)、菜椒轻斑驳病毒(Paprika mild mottle virus,PaMMV)、辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottlevirus,PMMoV)、地黄花叶病毒(Rehmannia mosaic virus,RheMV)、长叶车前草花叶病毒(Ribgrass mosaic virus,RMV)、萨蒙氏仙人掌病毒(Sammons's Opuntia virus,SOV)、堇兰花裂病毒(Streptocarpus flower break virus,SFBV)、菽麻花叶病毒(Sunn-hemp mosaic virus,SHMV)、烟草轻型绿花叶病毒(Tobacco mild green mosaicvirus,TMGMV)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、番茄花叶病毒(Tomatomosaic virus,ToMV)、芜菁脉明病毒(Turnip vein-clearing virus,TVCV)块根落葵轻型斑驳病毒(Ullucus mild mottle virus,UMMV)、山葵斑驳病毒(Wasabi mottlevirus,WMoV)、油菜花叶病毒(Youcai mosaic virus,YMoV)、小西葫芦绿斑驳花叶(Zucchini green mottle mosaic virus,ZGMMV)等25个确定病毒种以及苘麻黄花叶病毒(Abutilon yellow mosaic virus,AbYMV)、甜椒斑驳病毒(Bell pepper mottlevirus,BPMoV)、仙人掌轻斑驳病毒(Cactus mild mottle virus,CMMoV)、黄瓜斑驳病毒(Cucumber mottle virus,CuMoV)、鸡蛋果花叶病毒(Maracuja mosaic virus,MarMV)及Tropical soda apple mosaic virus(TSAMV)等6个暂定种。同时,该属内新的病毒种类还有增加的趋势;而且该属病毒的寄主范围相当广泛,给农业生产带来重大损失;因此,加强对该属病毒的检测鉴定具有重要意义。国内外研究人员采用了多种方法如直接观测法、电镜法、生物学测定法、血清学检测和分子生物学检测法等对该属病毒的检测鉴定做了大量的研究。随着各地植物种质资源的引进交流和栽培条件的改变,对该属病毒的检测鉴定方法也提出了更高的要求。
生物条形码技术是近年来出现的一种新的生物物种检测鉴定技术,由加拿大Guelph大学的分类学家Paul Hebert在2003年首次提出,其在物种标准化鉴定方面的优势已备受关注。线粒体细胞色素C氧化酶亚基I(COI)基因作为动物的DNA条形码已广泛应用于物种鉴定中;在植物上已选定叶绿体rbcl和matK基因作为基本的DNA条形码;真菌学家正对真菌类群进行不同基因片段的筛选与评价,以ITS作为真菌的首选DNA条形码。条形码技术是分类学中辅助物种鉴定的新技术,它代表了生物分类学研究的一个新方向,为进出境检验检疫提供了一种简单而有效的方法。在植物病毒方面,尚未有开展生物条形码技术的研究。
发明内容
本发明的一个目的是提供鉴定烟草花叶病毒种属的条形码引物组。
本发明提供的鉴定烟草花叶病毒种属的条形码引物组,其由引物Tobamo F6和引物Tobamo R6组成;所述引物Tobamo F6的核苷酸序列为序列表中序列1,所述引物Tobamo R6的核苷酸序列为序列表中序列2。
本发明的另一个目的是提供鉴定烟草花叶病毒种属的PCR试剂。
本发明提供的PCR试剂,由上述的条形码引物组、PCR扩增缓冲液和水组成,所述条形码引物组中的引物Tobamo F6和引物Tobamo R6在所述PCR试剂中的终浓度均为0.5μM。
本发明的第3个目的是提供鉴定烟草花叶病毒种属的PCR试剂盒。
本发明提供的试剂盒,包括上述的条形码引物组或上述的PCR试剂。
上述的引物组或PCR试剂或PCR试剂盒中,所述烟草花叶病毒属病毒为辣椒轻斑驳病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、烟草花叶病毒或番茄花叶病毒。
上述的引物组或PCR试剂或PCR试剂盒在鉴定待测烟草花叶病毒种属中的应用也是本发明保护的范围。
上述的引物组或PCR试剂或PCR试剂盒在制备鉴定待测烟草花叶病毒种属产品中的应用也是本发明保护的范围。
本发明第4个目的是提供鉴定或辅助鉴定待测烟草花叶病毒的种属的方法。
本发明提供的方法,包括如下步骤:
1)提取感染待测烟草花叶病毒属病毒的样本的总RNA,反转录得到cDNA作为模板,用上述的引物组进行PCR扩增,得到190-210bp PCR扩增产物;
2)将所述190-210bp PCR扩增产物测序,得到产物序列,将其与Genbank数据库记载的所有烟草花叶病毒属代表种的核苷酸序列构建系统进化树,不同种的序列聚为一簇,观察PCR产物对应的序列与该属哪些种的序列聚为一簇,则待测烟草花叶病毒属病毒为或候选为烟草花叶病毒属病毒的对应种。
上述方法中,所述PCR扩增的退火温度为50℃。
上述方法中,所述样本为植物,所述植物具体为西瓜、辣椒、南瓜、番茄、芸豆、烟草或黄瓜。
在上述应用或方法中,所述待测样品可为植物样品或微生物样品。在本发明的一个实施例中,所述待测样品具体为感染了辣椒轻斑驳病毒的辣椒和南瓜叶片、感染了烟草花叶病毒的烟草和黄瓜叶片、感染了番茄花叶病毒的番茄和芸豆叶片、感染了黄瓜绿斑驳花叶病毒的西瓜叶片。
在上述应用或方法中,所述烟草花叶病毒属病毒为辣椒轻斑驳病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、烟草花叶病毒或番茄花叶病毒。
本发明的实验证明,使用本发明所提供的引物组Tobamo F6和Tobamo R6,在表现症状的样品中可100%扩增到烟草花叶病毒属病毒,测序成功率为100%;能够有效对该属内的病毒进行物种鉴定。可在进境植物及其产品检疫中应用,防止病毒的传入;也可在国内的植保植检站、科研院所、农业生产企业及农户中大范围推广应用。
附图说明
图1为烟草花叶病毒属条形码引物组扩增产物电泳结果
图2为烟草花叶病毒属条形码序列构建的系统进化树
图3为烟草花叶病毒属条形码引物组扩增灵敏度电泳结果
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1、用于鉴定烟草花叶病毒属中病毒种的条形码引物组的合成
以Genbank中烟草花叶病毒属22种病毒的代表种作为病毒的凭证标本,分析其序列保守区域,根据条形码引物设计的条件即扩增片段长度、扩增片段种内的保守性和种间的变异性设计并人工合成引物组Tobamo F6和Tobamo R6,用于鉴定烟草花叶病毒属病毒种属,条形码引物组扩增产物长度为200bp。
Tobamo F6的核苷酸序列为序列表中的序列1,Tobamo R6的核苷酸序列为序列表中国的序列2。
实施例2、条形码引物组鉴定烟草花叶病毒属的病毒种
一、条形码引物组鉴定烟草花叶病毒属的病毒种
为了验证实施例1制备的用于鉴定烟草花叶病毒属病毒的条形码引物组的通用性,本实施例选择来自花叶症状明显的西瓜、辣椒、南瓜、番茄、芸豆、烟草及黄瓜样品中的4种烟草花叶病毒属病毒(辣椒轻斑驳病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、烟草花叶病毒和番茄花叶病毒)进行评价。
辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus):记载在“辣椒种子中辣椒轻斑驳病毒的检测.安徽农业科学,2007,35(14):4228-4229.”一文上,公众可从中国检验检疫科学研究院获得。
黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus):记载在“Occurrenceof Cucumber green mottle mosaic virus on Cucurbitaceous Plants in China.Plantdisease,2009,93(2):200.”一文上,公众可从中国检验检疫科学研究院获得。
烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus):记载在“Oligonucleotide microarraywith a minimal number of probes for the detection and identification of thirteengenera of plant viruses.Journal of Virological Methods.2010,167:53-60.”一文上,公众可从中国检验检疫科学研究院获得。
番茄花叶病毒(Tomato mosaic virus):记载在“进境番茄种子中番茄花叶病毒的检测与鉴定.植物保护,2011,37(5):124-128.”一文上,公众可从中国检验检疫科学研究院获得。
1、RT-PCR扩增
按照总RNA提取试剂盒(原平皓生物公司产品,货号:HF103-01)步骤分别提取番茄3号(感染番茄花叶病毒)、番茄11号(感染番茄花叶病毒)、番茄12号(感染番茄花叶病毒),芸豆3号(感染番茄花叶病毒),南瓜1号(感染辣椒轻斑驳病毒),南瓜2号(感染辣椒轻斑驳病毒),辣椒1号(感染辣椒轻斑驳病毒),辣椒3号(感染辣椒轻斑驳病毒),烟草3号(感染烟草花叶病毒),黄瓜1号(感染烟草花叶病毒),黄瓜2号(感染烟草花叶病毒),西瓜1号(感染黄瓜绿斑驳花叶病毒)叶片的总RNA。测定浓度后,以总RNA为模板,按照Transcriptor cDNA Synth.试剂盒(罗氏公司产品,货号:4896866001)说明进行第一链cDNA合成。以合成的cDNA为模板,分别使用实施例1的Tobamo F6和Tobamo R6引物,根据PCR master mix试剂盒(MBI公司产品,货号:K0171)说明进行PCR扩增。
上述每20μL的PCR扩增体系由Tobamo F6、Tobamo R6引物、PCR master mix和水组成,其中,Tobamo F6在PCR扩增体系中的终浓度为0.5μM,Tobamo R6在PCR扩增体系中的终浓度为0.5μM。
反应条件为94℃ 5min;94℃ 30s,50℃ 30s,72℃ 1min,35循环;72℃ 10min。扩增产物经1%琼脂糖电泳检测后进行测序。
结果如图1所示,其中,M为DL2000;泳道1-12分别为:番茄3号,番茄11号,番茄12号,芸豆3号,南瓜1号,南瓜2号,辣椒1号,辣椒3号,烟草3号,黄瓜1号,黄瓜2号,西瓜1号,可以看出,条形码引物组可在所有测试样品中均扩增出一条清晰的200bp左右的条带,扩增效率为100%。
将所有条带均进行测序,均可获得有效的序列(序列3-序列14),测序成功率为100%:
感染番茄花叶病毒的番茄3号扩增得到PCR产物的核苷酸序列为序列表中序列10;
感染番茄花叶病毒的番茄11号扩增得到PCR产物的核苷酸序列为序列表中序列11;
感染番茄花叶病毒的番茄12号扩增得到PCR产物的核苷酸序列为序列表中序列12;
感染番茄花叶病毒的芸豆3号扩增得到PCR产物的核苷酸序列为序列表中序列13;
感染辣椒轻斑驳病毒的南瓜1号扩增得到PCR产物的核苷酸序列为序列表中序列3;
感染辣椒轻斑驳病毒的南瓜2号扩增得到PCR产物的核苷酸序列为序列表中序列4;
感染辣椒轻斑驳病毒的辣椒1号扩增得到PCR产物的核苷酸序列为序列表中序列5;
感染辣椒轻斑驳病毒的辣椒3号扩增得到PCR产物的核苷酸序列为序列表中序列6;
感染烟草花叶病毒的烟草3号扩增得到PCR产物的核苷酸序列为序列表中序列7;
感染烟草花叶病毒的黄瓜1号扩增得到PCR产物的核苷酸序列为序列表中序列8;
感染烟草花叶病毒的黄瓜2号扩增得到PCR产物的核苷酸序列为序列表中序列9;
感染黄瓜绿斑驳花叶病毒的西瓜1号扩增得到PCR产物的核苷酸序列为序列表中序列14。
2、序列分析
采用Kimura-2-parameter distance(K2P)模型计算序列3-14的种内和种间遗传距离,评价其物种分辨率。
用DNAMAN(version4.0)软件将Genbank数据库中的烟草花叶病毒属22个病毒代表种的基因序列(2014.4.11的Genbank数据库)与序列3-14构建系统进化树,不同种的序列聚为一簇。
结果如图2所示,可以看出,条形码引物组在辣椒和南瓜样品中扩增到的4个辣椒轻斑驳病毒分离物(PMMoV-SD1(序列3)-SD3(序列4)-SD8(序列5)-SD9(序列6))与代表分离物-S(Genbank号为NC_003630)聚为PMMoV簇,为辣椒轻斑驳病毒;在西瓜中扩增到的黄瓜绿斑驳花叶病毒分离物(CGMMV-SD,序列14)与其代表分离物-SH(Genbank号为NC_001801)聚为CGMMV簇,为黄瓜绿斑驳花叶病毒;在烟草和黄瓜上检测到的三个烟草花叶病毒分离物(TMV-SD3(序列7),-SD4(序列8),-SD5(序列9))与其代表分离物-1(Genbank号为NC_001367)聚为TMV簇,为烟草花叶病毒;而番茄和芸豆上的4个番茄花叶病毒分离物(ToMV-SD1(序列10),-SD2(序列11),-SD3(序列12),-SD4(序列13))与其代表分离物-QLD(Genbank号为NC_002692)聚为ToMV簇,为番茄花叶病毒;同时这四个簇与其它病毒种都明显区分开。
上述结果表明,Tobamo6引物组可以通过聚类鉴定待测烟草花叶病毒属病毒是否为同一个病毒种;说明该对条码引物在烟草花叶病毒属中具有良好的物种分辨率。
二、用于鉴定烟草花叶病毒属病毒的条形码引物组的灵敏度评价
本实施例对实施例1制备的用于鉴定烟草花叶病毒属病毒的条形码引物组的灵敏度进行了分析。具体如下:将总RNA进行10倍比稀释,分别以101~106共六个稀释度的总RNA为模板,按照实施例2的步骤进行RT-PCR扩增,扩增产物进行电泳。
结果如图3所示,M:Marker DL2000;1~6:分别为101~106稀释。可以看出,101~104稀释模板均得到200bp的产物,表明该引物组可检测到待检对象104稀释倍数;表明实施例1制备的用于鉴定烟草花叶病毒属病毒的条形码引物组具有良好的灵敏度。
Claims (10)
1.鉴定烟草花叶病毒种属的条形码引物组,其由引物Tobamo F6和引物Tobamo R6组成;所述引物Tobamo F6的核苷酸序列为序列表中序列1,所述引物Tobamo R6的核苷酸序列为序列表中序列2。
2.鉴定烟草花叶病毒种属的PCR试剂,由权利要求1所述的条形码引物组、PCR扩增缓冲液和水组成,所述条形码引物组中的引物Tobamo F6和引物Tobamo R6在所述PCR试剂中的终浓度均为0.5μM。
3.鉴定烟草花叶病毒种属的PCR试剂盒,包括权利要求1所述的条形码引物组或权利要求2所述的PCR试剂。
4.根据权利要求1-3中任一所述的引物组或PCR试剂或PCR试剂盒,其特征在于:所述烟草花叶病毒属病毒为辣椒轻斑驳病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、烟草花叶病毒或番茄花叶病毒。
5.权利要求1-3中任一所述的引物组或PCR试剂或PCR试剂盒在鉴定待测烟草花叶病毒种属中的应用。
6.权利要求1-3中任一所述的引物组或PCR试剂或PCR试剂盒在制备鉴定待测烟草花叶病毒种属产品中的应用。
7.鉴定或辅助鉴定待测烟草花叶病毒的种属的方法,包括如下步骤:
1)提取感染待测烟草花叶病毒的样本的总RNA,反转录得到cDNA作为模板,用权利要求1-3中任一所述的引物组进行RT-PCR扩增,得到190-210bp PCR扩增产物;
2)将所述190-210bp PCR扩增产物测序,得到产物序列,将其与Genbank数据库记载的所有烟草花叶病毒属代表种的核苷酸序列构建系统进化树,不同种的序列聚为一簇,观察PCR产物对应的序列与该属哪些种的序列聚为一簇,则待测烟草花叶病毒属病毒为或候选为烟草花叶病毒属病毒的对应种。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于:所述RT-PCR扩增的退火温度为50℃。
9.根据权利要求7或8所述的方法,其特征在于:所述样本为植物,所述植物具体为西瓜、辣椒、南瓜、番茄、芸豆、烟草或黄瓜。
10.根据权利要求7-9中任一所述的方法,其特征在于:
所述烟草花叶病毒属病毒为辣椒轻斑驳病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、烟草花叶病毒或番茄花叶病毒。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201410193595.7A CN103966361B (zh) | 2014-05-08 | 2014-05-08 | 鉴定烟草花叶病毒种属的方法及其专用条形码引物 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201410193595.7A CN103966361B (zh) | 2014-05-08 | 2014-05-08 | 鉴定烟草花叶病毒种属的方法及其专用条形码引物 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN103966361A true CN103966361A (zh) | 2014-08-06 |
CN103966361B CN103966361B (zh) | 2016-01-13 |
Family
ID=51236361
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201410193595.7A Active CN103966361B (zh) | 2014-05-08 | 2014-05-08 | 鉴定烟草花叶病毒种属的方法及其专用条形码引物 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN103966361B (zh) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105441594A (zh) * | 2016-01-25 | 2016-03-30 | 湖南农业大学 | 检测烟草轻型绿花叶病毒的rt-pcr引物及其方法 |
CN107058611A (zh) * | 2016-12-19 | 2017-08-18 | 云南农业大学 | 一种烟草花叶病毒属病毒通用检测引物及其方法 |
CN108315497A (zh) * | 2018-04-27 | 2018-07-24 | 刘康康 | 一种用于烟草脉斑病中烟草花叶病毒属鉴别诊断的试剂盒及其检测方法 |
CN114058730A (zh) * | 2021-11-26 | 2022-02-18 | 山西大学 | 一种精确鉴定草麻黄的方法 |
-
2014
- 2014-05-08 CN CN201410193595.7A patent/CN103966361B/zh active Active
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
姚含笑 等: "核酸检测在植物检疫性病害诊断中的应用", 《种子》, vol. 32, no. 7, 31 July 2013 (2013-07-31), pages 83 - 86 * |
罗朝鹏 等: "烟草花叶病毒病的分子鉴定", 《烟草科技》, no. 7, 31 December 2010 (2010-12-31), pages 58 - 61 * |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105441594A (zh) * | 2016-01-25 | 2016-03-30 | 湖南农业大学 | 检测烟草轻型绿花叶病毒的rt-pcr引物及其方法 |
CN107058611A (zh) * | 2016-12-19 | 2017-08-18 | 云南农业大学 | 一种烟草花叶病毒属病毒通用检测引物及其方法 |
CN107058611B (zh) * | 2016-12-19 | 2020-02-04 | 云南农业大学 | 一种烟草花叶病毒属病毒通用检测引物及其方法 |
CN108315497A (zh) * | 2018-04-27 | 2018-07-24 | 刘康康 | 一种用于烟草脉斑病中烟草花叶病毒属鉴别诊断的试剂盒及其检测方法 |
CN114058730A (zh) * | 2021-11-26 | 2022-02-18 | 山西大学 | 一种精确鉴定草麻黄的方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN103966361B (zh) | 2016-01-13 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Tsai et al. | Seasonal dynamics and virus translocation of Grapevine leafroll‐associated virus 3 in grapevine cultivars | |
Ali et al. | Combination of RNAseq and SNP nanofluidic array reveals the center of genetic diversity of cacao pathogen Moniliophthora roreri in the upper Magdalena Valley of Colombia and its clonality | |
CN103966361B (zh) | 鉴定烟草花叶病毒种属的方法及其专用条形码引物 | |
CN101956016A (zh) | 一种适于水稻品种真实性鉴定的issr指纹图谱构建方法 | |
CN107177667B (zh) | 小麦穗密度qtl连锁的hrm分子标记及其应用 | |
Kim et al. | Identification of plant viruses infecting pear using RNA sequencing | |
Punja et al. | Challenges to Cannabis sativa Production from Pathogens and Microbes—The Role of Molecular Diagnostics and Bioinformatics | |
CN101864476B (zh) | 一种用pcr鉴定刀鲚和凤鲚的方法 | |
CN108384885B (zh) | 一种香樟ssr引物组合及其品种鉴定方法 | |
CN114990249A (zh) | 用于鉴定薄壳山核桃品种的ssr分子标记、分子身份证及其应用 | |
CN106480224A (zh) | 快速鉴定不同白化茶树品种的分子标记组合、方法及应用 | |
CN107400723B (zh) | 种子植物物种的鉴定方法和用途 | |
CN102719561B (zh) | 筛查马铃薯纺锤形块茎类病毒属类病毒的芯片及其应用 | |
CN105543393B (zh) | 用于甘薯块根淀粉含量性状标记的ssr标记引物及其应用和方法 | |
CN102787115A (zh) | 百合属est-ssr标记及应用 | |
CN115976251B (zh) | 一种用于木薯遗传多样性分析的InDel标记及其应用 | |
CN104073561B (zh) | 一套适于不结球白菜核酸指纹库构建的ssr引物组合及其应用 | |
CN105200130A (zh) | 密执安棒形杆菌不同亚种的条形码鉴定方法及其专用引物 | |
CN108018339B (zh) | 高度降解样本中植物性dna的检测引物 | |
CN102719562B (zh) | 筛查椰子死亡类病毒属类病毒的芯片及其应用 | |
CN102719560B (zh) | 筛查苹果锈果类病毒属类病毒的芯片及其应用 | |
CN104513866A (zh) | 检测苹果茎沟病毒或李属坏死环斑病毒的特异性引物、探针及基因芯片 | |
CN104498593A (zh) | 鉴定或辅助鉴定仓储豆象的引物对及其试剂盒 | |
CN111378780B (zh) | 柱锈菌科多基因谱系筛查方法 | |
CN113652495A (zh) | 一组基于荧光毛细管电泳的猕猴桃性别分子标记引物及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant |