CN101956016A - 一种适于水稻品种真实性鉴定的issr指纹图谱构建方法 - Google Patents

一种适于水稻品种真实性鉴定的issr指纹图谱构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种适于水稻品种真实性鉴定的ISSR指纹图谱构建方法，提供一种快速、准确的水稻品种的ISSR指纹图谱构建方法及其应用。该方法包括以下步骤：用改进的CTAB法提取水稻幼苗DNA；以幼苗DNA为模板进行ISSR-PCR扩增；对PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测并在紫外光下拍照；构建水稻品种的DNA指纹图谱，用于水稻品种真实性鉴定。本发明DNA指纹图谱是以水稻品种编号、扩增谱带带型、每条谱带的位点编号及“0”“1”阵列为基本信息，该方法具有操作简单、直观实用等特点，可以促进ISSR分子标记技术在准确、快速、简便的水稻品种真实性鉴定中更广泛地应用。

Description

一种适于水稻品种真实性鉴定的ISSR指纹图谱构建方法
技术领域
本发明涉及种质资源品种真实性鉴定技术，是一种适于水稻品种真实性鉴定的ISSR指纹图谱构建方法。
背景技术
水稻是重要的粮食作物，我国是世界上最大的杂交水稻种子生产国和消费国，具有庞大的杂交水稻种子市场。水稻种子的真实性和纯度是衡量种子质量的重要指标，直接影响农作物的产量、品质和农民的利益。生产上如何快速、准确、简便、经济地鉴定杂交水稻种子真实性是一个突出的问题。传统的形态鉴定法依赖于品种表型差异，而形态性状的表现受环境影响较大，且形态鉴定法工作量大、鉴定周期长、成本高、受季节限制，对种子营销工作造成不利影响。同工酶和种子贮藏蛋白多态性不够丰富，且同工酶有组织和器官特异性、稳定性差。
分子标记技术具有多态性好、遗传稳定、不受环境条件影响等优点，已开始广泛应用于作物品种鉴定与纯度检测中。目前，应用较多的是SSR、RAPD、RFLP和AFLP等分子标记。ISSR(Inter-Simple Sequence Repeat)即简单序列重复间扩增，是由加拿大蒙特利尔大学Zietkiewicz等于1994年创建的一种分子标记技术，其基本原理就是在SSR的3’或5’端锚定1-4个碱基作引物，对两侧具有反向排列SSR的一段序列进行扩增，而不是扩增SSR本身。锚定碱基避免了SSR在基因组上的滑动，因而大大提高了PCR扩增的稳定性和可重复性。ISSR分子标记技术兼具SSR、RAPD、RFLP、AFLP等分子标记的优点，与SSR相比，ISSR不需要预先获知序列信息而使成本降低，且多态性更丰富；与RAPD相比，ISSR重复性高，稳定性好，同时具备RAPD的简便、易操作等特点；与RFLP、AFLP相比，ISSR更快捷、成本较低、DNA用量小、安全性较高。目前，ISSR标记技术在植物种质资源收集和鉴定、遗传多样性和亲缘关系、基因定位、遗传图谱构建及分子标记辅助选择等研究中已有广泛的应用。在水稻中，应用ISSR分子标记分析杂交水稻的遗传多样性已见有报道(王金花等，2005；黄光文等，2006；陈兆贵等，2009)，但应用ISSR分子标记技术进行水稻品种真实性鉴定的DNA指纹图谱构建方法尚未见报道。
常规的DNA指纹图谱构建方法大都选择多条引物扩增谱带中有代表性的部分条带，以“0”“1”矩阵来构建品种或种质资源的指纹图谱，不适于生产上农作物品种真实性简便、快速分子标记鉴定。本发明以单一引物的扩增谱带构建指纹图谱表，并引入带型编号和扩增谱带位点编号信息，是一种开放性的，可以随品种数目增加和更新换代而不断扩充和更新的，由一系列若干个指纹图谱表构成的DNA指纹图谱构建方法。该方法使品种鉴定过程中DNA指纹图谱检索更简便快速，更适合在农业生产中推广应用。
本发明研究利用ISSR分子标记成功构建水稻品种的ISSR指纹图谱，为ISSR分子标记技术更广泛地用于农业生产中水稻品种真实性鉴定打下良好的基础。该方法不仅适合于水稻品种真实性的ISSR分子标记鉴定中DNA指纹图谱的构建，也适合于其他农作物和其他分子标记的指纹图谱构建。
发明内容
本发明的目的是为了推进DNA分子标记技术在农业生产过程中作物种子真实性鉴定上的广泛应用与推广，提供一种鉴定操作简便快捷、重复性和稳定性较好的适于水稻品种真实性鉴定的ISSR指纹图谱构建方法。
适于水稻品种真实性鉴定的ISSR指纹图谱构建方法包括DNA提取、ISSR-PCR扩增及电泳检测、DNA指纹图谱构建等内容。
具体包括以下步骤：
(1)DNA提取
以不同水稻品种种子为材料，于苗期取幼嫩叶片采用改进的CTAB法提取DNA，取部分DNA溶液测其浓度，稀释至20ng/μL，于-20℃保存备用；
(2)ISSR-PCR扩增及电泳检测
采用25μL反应体系，Mg2+浓度为2.5mmol/L，引物浓度为0.2μmol/L，dNTPs的浓度为0.2mmol/L，DNA用量为40ng，Taq DNA聚合酶的用量为1U；
PCR扩增程序条件为：94℃预变性5min，94℃变性45s，50-56℃退火45s，72℃延伸90s，40个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存；
用1.5％琼脂糖凝胶电泳，Gel-Red染色，检测ISSR-PCR扩增产物，在紫外灯下拍照；
(3)DNA指纹图谱构建
根据每条引物呈现的条带信息建立指纹图谱：以水稻品种编号和扩增谱带带型为纵列，以每条谱带的位点编号为横行，在每一纵横交结处，有扩增谱带用“1”表示，没有扩增谱带用“0”表示，分别制得每条引物对不同品种的DNA指纹图谱表，以24个水稻品种为例，引物UBC 815对24个水稻品种构建的指纹图谱表为：
Figure BSA00000299604600031
引物UBC 900对24个水稻品种构建的指纹图谱表为：
Figure BSA00000299604600032
Figure BSA00000299604600041
(4)利用构建的DNA指纹图谱进行品种真实性鉴定
将待鉴定的水稻品种样品在上述条件下所建立的指纹图谱与已构建的DNA指纹图谱相比较，与所建DNA指纹图谱不同的即为假种子。
所述ISSR-PCR扩增中采用的引物是UBC 815和UBC 900。
所述DNA指纹图谱是以水稻品种编号、扩增谱带带型编号、每条谱带位点编号及“1”“0”阵列为基本信息，便于检索和鉴定。
每个DNA指纹图谱表是以单条ISSR引物的扩增谱带信息构建的。
DNA指纹图谱中，每个水稻品种都有其特异的DNA指纹，能将供试品种逐个鉴别开来。
本发明的有益技术效果体现在下述几个方面：
(1)本发明利用ISSR分子标记技术来构建不同水稻品种的DNA指纹图谱，有利于水稻品种真实性的快速、准确鉴定，与常规的种植检验和生化检验相比，不受作物生长环境和季节的影响，结果更稳定、可靠，且省时省力；构建DNA指纹图谱和鉴定技术使ISSR分子标记技术在作物品种真实性鉴定中广泛的推广应用打下良好的基础。
(2)采用本发明构建的水稻DNA指纹图谱，可以根据水稻品种数量增加及品种的更新换代等需要不断增加和更新，以满足农业生产中水稻品种真实性鉴定的需要。
(3)本发明所采用的DNA指纹图谱构建及鉴定方法，除了可以应用于水稻的品种真实性鉴定外，还可以应用于其他物种的种质鉴定。
(4)本发明所提供的指纹图谱构建及鉴定方法，除了可以应用于ISSR指纹图谱构建，还可以应用于其他分子标记技术指纹图谱构建。
附图说明
图1UBC 815对24个水稻品种的扩增结果电泳图(M：marker DL2000；1-24：表1中所列的24个水稻品种)；
图2UBC 900对24个水稻品种的扩增结果电泳图(M：marker DL2000；1-24：表1中所列的24个水稻品种)。
具体实施方式
适于水稻品种真实性鉴定的ISSR指纹图谱构建方法包括DNA提取、ISSR-PCR扩增及电泳检测、DNA指纹图谱构建等内容。
具体包括以下步骤：
(1)DNA提取
以不同水稻品种种子为材料，于苗期取幼嫩叶片采用改进的CTAB法提取DNA，取部分DNA溶液测其浓度，稀释至20ng/μL，于-20℃保存备用；
(2)ISSR-PCR扩增及电泳检测
采用25μL反应体系，Mg2+浓度为2.5mmol/L，引物浓度为0.2μmol/L，dNTPs的浓度为0.2mmol/L，DNA用量为40ng，Taq DNA聚合酶的用量为1U；
PCR扩增程序条件为：94℃预变性5min，94℃变性45s，50-56℃退火45s，72℃延伸90s，40个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存；
用1.5％琼脂糖凝胶电泳，Gel-Red染色，检测ISSR-PCR扩增产物，在紫外灯下拍照；
(3)DNA指纹图谱构建
根据每条引物呈现的条带信息建立指纹图谱：以水稻品种编号和扩增谱带带型为纵列，以每条谱带的位点编号为横行，在每一纵横交结处，有扩增谱带用“1”表示，没有扩增谱带用“0”表示，分别制得每条引物对不同品种的DNA指纹图谱表，以24个水稻品种为例，如表1，表2所示；
表1引物UBC 815对24个水稻品种构建的指纹图谱表
Figure BSA00000299604600051
Figure BSA00000299604600061
表2引物UBC 900对24个水稻品种构建的指纹图谱表
Figure BSA00000299604600062
(4)利用构建的DNA指纹图谱进行品种真实性鉴定
将待鉴定的水稻品种样品在上述条件下所建立的指纹图谱与已构建的DNA指纹图谱相比较，与所建DNA指纹图谱不同的即为假种子。
所述ISSR-PCR扩增中采用的引物是UBC 815和UBC 900。
所述DNA指纹图谱是以水稻品种编号、扩增谱带带型编号、每条谱带位点编号及“1”“0”阵列为基本信息，便于检索和鉴定。
每个DNA指纹图谱表是以单条ISSR引物的扩增谱带信息构建的。
DNA指纹图谱中，每个水稻品种都有其特异的DNA指纹，能将供试品种逐个鉴别开来。
下面结合附图，通过实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1
本实施例采用浙江省主栽的24个水稻品种种子为供试材料，提取幼苗基因组总DNA做模板，进行指定引物的ISSR-PCR扩增，对ISSR-PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测并拍照，根据电泳谱带建立各供试样品的ISSR分子标记指纹图谱，将所构建的ISSR指纹图谱用于水稻品种的真实性鉴定。
具体操作步骤如下：
(1)DNA提取
以浙江省主栽24个水稻品种种子为材料，于苗期取幼嫩叶片采用改进的CTAB法提取DNA，取部分DNA溶液测其浓度，稀释至20ng/μL，于-20℃保存备用；
(2)ISSR-PCR扩增及电泳检测
采用25μL反应体系，Mg2+浓度为2.5mmol/L，引物浓度为0.2μmol/L，dNTP的浓度为0.2mmol/L，DNA用量为40ng，Taq DNA聚合酶的用量为1U。
PCR扩增程序条件为：94℃预变性5min，94℃变性45s，50-56℃退火45s，72℃延伸90s，40个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。
用1.5％琼脂糖凝胶电泳，Gel-Red染色，检测ISSR-PCR扩增产物，在紫外灯下拍照，电泳结果见图1和图2。
(3)浙江省24个主栽水稻品种DNA指纹图谱构建
图1是UBC 815对24个水稻品种的扩增结果电泳图，泳道M为DL 2000DNAMarker，1～24分别为24个品种的编号。
图2是UBC 900对24个水稻品种的扩增结果电泳图，泳道M为DL 2000DNAMarker，1～24分别为24个品种的编号。
根据每条引物呈现的条带信息建立指纹图谱：以水稻品种编号和扩增谱带带型为纵列，以每条谱带的位点编号为横行，在每一纵横交结处，有扩增谱带用“1”表示，没有扩增谱带用“0”表示，分别制得每条引物对24个品种的DNA指纹图谱表，如上述表1，表2所示；
(4)利用构建的24个品种的DNA指纹图谱进行品种真实性鉴定：
将待鉴定的样品在上述条件下所建立的指纹图谱与已得的DNA指纹图谱相比较，与所建DNA指纹图谱不同的即为假种子。

Claims (5)

1.一种适于水稻品种真实性鉴定的ISSR指纹图谱构建方法，该方法包括DNA提取、ISSR-PCR扩增及电泳检测、DNA指纹图谱构建等内容。
具体包括以下步骤：
(1)DNA提取
以不同水稻品种种子为材料，于苗期取幼嫩叶片采用改进的CTAB法提取DNA，取部分DNA溶液测其浓度，稀释至20ng/μL，于-20℃保存备用；
(2)ISSR-PCR扩增及电泳检测
采用25μL反应体系，Mg2+浓度为2.5mmol/L，引物浓度为0.2μmol/L，dNTPs的浓度为0.2mmol/L，DNA用量为40ng，Taq DNA聚合酶的用量为1U；
PCR扩增程序条件为：94℃预变性5min，94℃变性45s，50-56℃退火45s，72℃延伸90s，40个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存；
用1.5％琼脂糖凝胶电泳，Gel-Red染色，检测ISSR-PCR扩增产物，在紫外灯下拍照；
(3)DNA指纹图谱构建
根据每条引物呈现的条带信息建立指纹图谱：以水稻品种编号和扩增谱带带型为纵列，以每条谱带的位点编号为横行，在每一纵横交结处，有扩增谱带用“1”表示，没有扩增谱带用“0”表示，分别制得每条引物对不同品种的DNA指纹图谱表，以24个水稻品种为例，引物UBC 815对24个水稻品种构建的指纹图谱表为：
Figure FSA00000299604500011
引物UBC 900对24个水稻品种构建的指纹图谱表为：
Figure FSA00000299604500022
(4)利用构建的DNA指纹图谱进行品种真实性鉴定
将待鉴定的水稻品种样品在上述条件下所建立的指纹图谱与已构建的DNA指纹图谱相比较，与所建DNA指纹图谱不同的即为假种子。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述ISSR-PCR扩增中采用的引物是UBC 815和UBC 900。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述DNA指纹图谱是以水稻品种编号、扩增谱带带型编号、每条谱带位点编号及“1”“0”阵列为基本信息，便于检索和鉴定。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：每个DNA指纹图谱表是以单条ISSR引物的扩增谱带信息构建的。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：DNA指纹图谱中，每个水稻品种都有其特异的DNA指纹，能将供试品种逐个鉴别开来。
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