CN102605061A - 一种适于榆属品种区分和鉴定的issr指纹图谱构建方法 - Google Patents

Abstract

一种适于榆属品种区分和鉴定的ISSR指纹图谱构建方法，它涉及一种ISSR指纹图谱构建方法。方法：一、DNA提取；二、ISSR-PCR扩增及电泳检测；三、DNA指纹图谱构建；四、利用构建的DNA指纹图谱进行榆属品种鉴定，即完成。本发明有利于对榆属品种进行快速、准确的鉴定，与常规的种植检验和生化检验相比，不受作物生长环境和季节的影响，结果更稳定、可靠，且省时省力；构建DNA指纹图谱和鉴定技术使ISSR分子标记技术在植物品种鉴定、亲缘关系分析、植物种质资源创新和分子标记辅助育种中的广泛推广应用打下良好的基础；操作简单、直观实用等特点。

Description

一种适于榆属品种区分和鉴定的ISSR指纹图谱构建方法

技术领域

本发明涉及一种ISSR指纹图谱构建方法。

背景技术

榆树为榆科(Ulmaceae)榆族(Ulmeae)的榆属(Ulmus)植物的总称。全世界约40余种，分布于北半球。我国榆属资源非常丰富，遍及全国，共有25种。榆属植物耐旱，耐盐碱，适应性强，木材坚韧，具有较高的生态适应性和经济价值，多数榆属品种可塑性强，即可作为孤植树、行道树，也可剪型成为绿篱、盆景，具有很高的观赏价值和应用价值，因此，具有其他树种不可替代的优势，一直是我国北方尤其是盐碱地园林绿化中的主要树种。因此对榆属新品种的培育一直是育种人员的研究热点。目前，中国分布的有代表性榆属种、品种及类型，以及选出的优良无性系品种大概在88份左右，但对于这些品种的鉴定仍只是基于传统的形态鉴定法依赖于品种表型差异，而形态的表现受环境影响较大，且形态鉴定法工作量大、鉴定周期长、成本高、受季节限制。而同工酶和种子贮藏蛋白多态性不够丰富，且同工酶有组织和器官特异性、稳定性差，这就给榆属品种鉴定、榆属种质资源创新带来了困难。

分子标记技术具有多态性好、遗传稳定、不受环境条件影响等优点，已开始广泛应用于作物品种鉴定与纯度检测中。目前，应用较多的是ISSR、SSR、RAPD、RFLP和AFLP等分子标记。简单重复序列多态性(Inter-simple sequence Repeat Polymorphism，ISSR)是由Zietkiewicz于1994年提出的。ISSR通常为显性标记，呈Mendel式遗传，具有很好的稳定性和多态性，因而是非常理想的分子标记，可用于构建PCR为基础的分子图谱。ISSR分子标记已用于遗传多样性分析、绘制DNA指纹图谱、品种鉴定等许多研究领域，潜力很大。ISSR技术利用基因组中有关SSR序列的信息，结合RAPD技术优点，克服了SSR和RAPD标记技术的某些缺点；与RFLP、AFLP相比，ISSR更快捷、成本较低、DNA用量小、安全性较高。对榆属植物的遗传多样性的研究、染色体的研究、ISSR、RAPD及AFLP等分子标记技术在榆树中的应用研究等尚处于起步甚至空白阶段。除了白榆之外的其它榆属树种，则基本上没有开展指纹图谱等遗传研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种适于榆属品种区分和鉴定的ISSR指纹图谱构建方法。

适于榆属品种区分和鉴定的ISSR指纹图谱构建方法按以下步骤进行：

一、DNA提取：

以不同榆树品种成年植株为材料，取新生叶片采用适合提取榆树DNA的改良CTAB法提取DNA，取部分DNA溶液测其浓度，稀释至20ng/uL，于-20℃保存备用；

二、ISSR-PCR扩增及电泳检测：

采用25μL反应体系中，10×Buffer(Mg²⁺free)2.5μL，dNTPs 0.25mmol/L，引物800pmol/L，DNA模板30ng，Taq酶1.5U，MgCl₂ 2.5mmol/L；

PCR扩增程序条件为：94℃预变性5min，35个循环，每个循环包括，94℃变性45s，退火1min，72℃延伸1.5min，结束循环后72℃延伸6min，4℃保存；

用含0.5μl/mlEB的1.0％琼脂糖凝胶，在1×TBE缓冲液中，以2.5V/cm²的电场强度电泳，在紫外凝胶成像系统上观察并照相、记录；

三、DNA指纹图谱构建：

根据每条引物呈现的条带信息建立指纹图谱：以榆树品种编号和扩增谱带带型为纵列，以每条谱带的位点编号为横行，在每一横纵交结处，有扩增谱带用“1”表示，没有扩增谱带用“0”表示，分别制得每条引物对不同品种的DNA指纹图谱表，以引物FI-55对35个榆树品种构建的指纹图谱为：

引物FI-50对35个榆树品种构建的指纹图谱为：

四、利用构建的DNA指纹图谱进行榆属品种鉴定：

将待鉴定的榆属品种样品在步骤三中所述条件下建立的指纹图谱与已构建的DNA指纹图谱相比较，与所建DNA指纹图谱不同的即为其他物种或者是榆属中的新品种，即完成适于榆属品种区分和鉴定的ISSR指纹图谱构建方法。

本发明适于榆属品种区分和鉴定的ISSR指纹图谱构建方法，有益技术效果体现在下述几个方面：

(1)本发明利用ISSR分子标记技术来构建不同榆属品种和栽培变种的DNA指纹图谱，有利于对榆属品种进行快速、准确的鉴定，与常规的种植检验和生化检验相比，不受作物生长环境和季节的影响，结果更稳定、可靠，且省时省力；构建DNA指纹图谱和鉴定技术使ISSR分子标记技术在植物品种鉴定、亲缘关系分析、植物种质资源创新和分子标记辅助育种中的广泛推广应用打下良好的基础；

(2)采用本发明构建的榆属DNA指纹图谱，涵盖了我国北方大部分榆属资源，具有一定的权威性，同时，对于鉴定出的新品种，可以进一步补充完善榆属的指纹图谱，以满足榆属植物育种的需要；

(3)本发明具有操作简单、直观实用等特点，可以促进ISSR分子标记技术在准确、快速、简便的榆属品种鉴定中更广泛地应用，同时应用该鉴定方法，对榆属的无性系变异品种进行鉴定，从而实现对榆属无性系变异的早期筛选。

附图说明

图1是FI-55引物对18个榆属作图品种的扩增结果电泳图，泳道M为DL2000DNAMarker，1～18分别为18个榆属作图品种的编号；

图2是FI-55引物对17个榆属鉴定品种的扩增结果电泳图，泳道M为DL2000DNAMarker，1～17分别为17个榆属鉴定品种的编号；

图3是FI-50引物对18个榆属作图品种的扩增结果电泳图，泳道M为DL2000DNAMarker，1～18分别为18个榆属作图品种的编号；

图4是是FI-50引物对17个榆属鉴定品种的扩增结果电泳图，泳道M为DL2000DNAMarker，1～17分别为17个榆属鉴定品种的编号。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：适于榆属品种区分和鉴定的ISSR指纹图谱构建方法按以下步骤进行：

一、DNA提取：

以不同榆树品种成年植株为材料，取新生叶片采用适合提取榆树DNA的改良CTAB法提取DNA，取部分DNA溶液测其浓度，稀释至20ng/uL，于-20℃保存备用；

二、ISSR-PCR扩增及电泳检测：

采用25μL反应体系中，10×Buffer(Mg²⁺free)2.5μL，dNTPs 0.25mmol/L，引物800pmol/L，DNA模板30ng，Taq酶1.5U，MgCl₂ 2.5mmol/L；

PCR扩增程序条件为：94℃预变性5min，35个循环，每个循环包括，94℃变性45s，退火1min，72℃延伸1.5min，结束循环后72℃延伸6min，4℃保存；

用含0.5μl/mlEB的1.0％琼脂糖凝胶，在1×TBE缓冲液中，以2.5V/cm²的电场强度电泳，在紫外凝胶成像系统上观察并照相、记录；

三、DNA指纹图谱构建：

根据每条引物呈现的条带信息建立指纹图谱：以榆树品种编号和扩增普带带型为纵列，以每条谱带的位点编号为横行，在每一横纵交结处，有扩增谱带用“1”表示，没有扩增谱带用“0”表示，分别制得每条引物对不同品种的DNA指纹图谱表，以引物FI-55对35个榆树品种构建的指纹图谱为：

引物FI-50对35个榆树品种构建的指纹图谱为：

四、利用构建的DNA指纹图谱进行榆属品种鉴定：

将待鉴定的榆属品种样品在步骤三中所述条件下建立的指纹图谱与已构建的DNA指纹图谱相比较，与所建DNA指纹图谱不同的即为其他物种或者是榆属中的新品种，即完成适于榆属品种区分和鉴定的ISSR指纹图谱构建方法。

本实施方式步骤一中适合提取榆树DNA的改良CTAB法，和公知改良CTAB方法不同的地方就是加高盐和异丙醇沉淀的过程，并在无水乙醇析出DNA时同时加入醋酸钠促进DNA的沉淀，最后得到纯度较高的DNA，电泳图谱清晰。

本实施方式中完成榆属品种鉴定，可应用榆属ISSR指纹图谱进行亲缘关系分析：使用软件NTsys2.1，根据Nei-Li相似系法，根据品种形成的“0”，“1”原始矩阵，计算供试材料之间的遗传相似系数，并用类平均法(UPGMA)对其进行系统聚类分析，构建分子进化系统树。

本实施方式中所用的各种引物的序列，见表1

本实施方式中所述ISSR-PCR扩增中采用的引物是FI-55和FI-50。

本实施方式中所述DNA指纹图谱是以榆属品种编号、扩增谱带带型编号、每条谱带位点编号及“0”，“1”阵列为基本信息，便于检索和鉴定。

本实施方式中每个DNA指纹图谱表是以单条ISSR引物的扩增谱带信息构建的。

本实施方式中DNA指纹图谱中，每个榆属品种都有其特异的DNA指纹，能将供试品种逐个鉴别开来。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤三中所用榆树的具体品种如下：

其中作图品种1～9采自黑龙江省帽儿山和黑龙江森林植物园；作图品种10～18和鉴定品种1～17均采自山东省金乡县白洼林场。其它与具体实施方式一相同。

本实施方式中的榆树均可通过购买获得。

实施例：

一种适于榆属品种区分和鉴定的ISSR指纹图谱构建方法按以下步骤进行：

一、DNA提取：

采用黑龙江省和山东省采集的榆属品种，共35个榆树品种成年植株为材料，取新生叶片采用适合提取榆树DNA的改良CTAB法提取DNA，取部分DNA溶液测其浓度，稀释至20ng/uL，于-20℃保存备用；

二、ISSR-PCR扩增及电泳检测：

采用25μL反应体系中，10×Buffer(Mg²⁺free)2.5μL，dNTPs 0.25mmol/L，引物800pmol/L，DNA模板30ng，Taq酶1.5U，MgCl₂ 2.5mmol/L；

PCR扩增程序条件为：94℃预变性5min，35个循环，每个循环包括，94℃变性45s，退火1min，72℃延伸1.5min，结束循环后72℃延伸6min，4℃保存；

用含0.5μl/mlEB的1.0％琼脂糖凝胶，在1×TBE缓冲液中，以2.5V/cm²的电场强度电泳，在紫外凝胶成像系统上观察并照相、记录；

三、DNA指纹图谱构建：

根据每条引物呈现的条带信息建立指纹图谱：以榆树品种编号和扩增普带带型为纵列，以每条谱带的位点编号为横行，在每一横纵交结处，有扩增谱带用“1”表示，没有扩增谱带用“0”表示，分别制得每条引物对不同品种的DNA指纹图谱表，以引物FI-55对35个榆树品种构建的指纹图谱为：

引物FI-50对35个榆树品种构建的指纹图谱为：

四、利用构建的DNA指纹图谱进行榆属品种鉴定：

将待鉴定的榆属品种样品在步骤三中所述条件下建立的指纹图谱与已构建的DNA指纹图谱相比较，与所建DNA指纹图谱不同的即为其他物种或者是榆属中的新品种，即完成适于榆属品种区分和鉴定的ISSR指纹图谱构建方法。

本实施例步骤三中榆属35个榆树品种的DNA指纹图谱构建(见图1-4)；

本实施例中所得指纹图谱，可进一步分析利用，得到其亲缘关系较近的品种，可了解其遗传背景。

Claims (2)

1.一种适于榆属品种区分和鉴定的ISSR指纹图谱构建方法，其特征在于适于榆属品种区分和鉴定的ISSR指纹图谱构建方法按以下步骤进行：

一、DNA提取：

以不同榆树品种成年植株为材料，取新生叶片采用适合提取榆树DNA的改良CTAB法提取DNA，取部分DNA溶液测其浓度，稀释至20ng/uL，于-20℃保存备用；

二、ISSR-PCR扩增及电泳检测：

采用25μL反应体系中，10×Buffer(Mg²⁺free)2.5μL，dNTPs0.25mmol/L，引物800pmol/L，DNA模板30ng，Taq酶1.5U，MgCl₂ 2.5mmol/L；

PCR扩增程序条件为：94℃预变性5min，35个循环，每个循环包括，94℃变性45s，退火1min，72℃延伸1.5min，结束循环后72℃延伸6min，4℃保存；

用含0.5μl/mlEB的1.0％琼脂糖凝胶，在1×TBE缓冲液中，以2.5V/cm²的电场强度电泳，在紫外凝胶成像系统上观察并照相、记录；

三、DNA指纹图谱构建：

根据每条引物呈现的条带信息建立指纹图谱：以榆树品种编号和扩增普带带型为纵列，以每条谱带的位点编号为横行，在每一横纵交结处，有扩增谱带用“1”表示，没有扩增谱带用“0”表示，分别制得每条引物对不同品种的DNA指纹图谱表，以引物FI-55对35个榆树品种构建的指纹图谱为：

引物FI-50对35个榆树品种构建的指纹图谱为：

四、利用构建的DNA指纹图谱进行榆属品种鉴定：

将待鉴定的榆属品种样品在步骤三中所述条件下建立的指纹图谱与已构建的DNA指纹图谱相比较，与所建DNA指纹图谱不同的即为其他物种或者是榆属中的新品种，即完成适于榆属品种区分和鉴定的ISSR指纹图谱构建方法。

2.根据权利要求1所述的一种适于榆属品种区分和鉴定的ISSR指纹图谱构建方法，其特征在于步骤三中所用榆属的具体品种如下：

其中作图品种1～9采自黑龙江省帽儿山和黑龙江森林植物园；作图品种10～18和鉴定品种1～17均采自山东省金乡县白洼林场。

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