CN103266171B - 一种多伞阿魏及同属相似种分子指纹鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种多伞阿魏及同属相似种分子指纹鉴定方法,包括多伞阿魏ISSR分子标记优化体系的建立、ISSR指纹图谱构建和鉴定方法。具体包括以下步骤:1.多伞阿魏及同属其它品种样品的收集;2.各样品基因组DNA提取方法的比较;3.ISSR-PCR扩增反应条件的优化及电泳检测;4.ISSR分子标记指纹图谱的构建;5.利用构建的一种DNA指纹图谱进行多伞阿魏及同属相似种鉴定。本发明有利于对植株外部形态不易区分的阿魏属品种进行快速、准确的鉴定,且节约了时间和成本,对于保证多伞阿魏药材基源的准确分类鉴别具有重要意义。

Description

一种多伞阿魏及同属相似种分子指纹鉴定方法
技术领域
本发明涉及一种多伞阿魏及同属相似种分子指纹鉴定方法,包括多伞阿魏分子标记指纹图谱构建方法,多伞阿魏ISSR分子标记优化体系的建立,ISSR指纹图谱构建。还涉及一种多伞阿魏及同属相似品种药材分子鉴定方法,属药材品种鉴定领域。
背景技术
伞形科阿魏属(Ferula L.)植物全世界约有150余种,主要分布在欧洲南部地中海地区和非洲北部,还有伊朗、阿富汗、苏联的中亚部分和西伯利亚地区以及印度、巴基斯坦等地。我国有26种1变种,产于新疆的有21种。其中,药用阿魏种类较多,新疆阿魏Ferula sinkiangensis K.M.shen和阜康阿魏F.fukanensis K.M.Shen收录在《中华人民共和国药典》历届版本中。其根和茎渗出的油胶树脂,作为中药阿魏在全国使用。性温、味苦辛,归脾、胃经,主要用于治疗肉食积滞,瘀血痞块,虫积腹痛等症,具有极高的药用价值。维吾尔医还用来驱虫、治疗白癜风,是维吾尔医常用药物之一,为国家二级重点保护野生植物,目前这两种植物均已成为一种濒临灭绝的野生药材资源。
多伞阿魏(Ferula ferulaeoides(Steud.)Korov.)在新疆民间广泛用作中药阿魏的代用品,是新疆维吾尔族人民常用的重要药材。普遍分布于新疆北疆沙丘、沙地和砾石质的蒿属荒漠中,苏联哈萨克斯坦和蒙古也有分布。阿魏中还有一些药用植物,如准噶尔阿魏(F.songorica Pall.ex Schult.)在苏联哈萨克斯坦民间用来治疗头疼、感冒、胃病等症;里海阿魏(F.caspica M.Bitb.)用来治神经失常;我国云南产的榄绿阿魏(F.olivacea(Diels)Walff ex Hand.-Maaz.)根能发散风热,降气祛 痰,止咳。
目前有关多伞阿魏及同属药用植物品种鉴定方面的研究报道中,只有少数学者采用传统性状、显微与理化鉴别方法对多伞阿魏等药材开展了研究。而阿魏属药用植物植株外部形态较相似,仅靠植物外部形态、性状、显微、理化等传统鉴别方法都不足以解决种的分类鉴别问题,急需要引入一种更先进、科学、稳定的分子标记技术来开展阿魏属品种分类研究。
DNA指纹图谱技术是在分子水平上,以药材基因型特征为鉴定指标的一种新技术,它不受外界环境因素和生物体发育阶段及器官组织差异的影响,即每一个体的任一细胞都具有相同的遗传信息,在同种内具有高度的遗传稳定性。尤其ISSR具有准确性高、重复性好、特异性强等特点,非常适合于近缘种、易混淆品种、珍稀品种、道地性药材等品种的鉴定。
目前阿魏属药用植物DNA分子标记技术在国内外尚未见相关报道。
发明内容
本发明需要解决的技术问题就在于克服现有技术的缺陷,提供一种多伞阿魏及同属相似种分子指纹鉴定方法,它解决了现有技术仅靠植物外部形态、传统性状鉴别和显微鉴别方法都不易解决的多伞阿魏及同属相似品种分类学上的问题。
为解决上述问题,本发明采用如下技术方案:
本发明提供了一种多伞阿魏及同属相似种分子指纹鉴定方法,包括多伞阿魏ISSR分子标记优化体系的建立、ISSR指纹图谱构建及鉴定方法;其具体步骤为:
(1)DNA提取:
取多伞阿魏及同属三种药用植株上幼嫩叶片,利用试剂盒法提取上述四种药用植物的总DNA;
用核酸蛋白检测仪和琼脂糖凝胶电泳方法检测所得总DNA的浓度和纯度;
用ISSR分子标记的方法检测所得总DNA的质量;
(2)ISSR-PCR扩增反应及电泳检测:
50μl多伞阿魏ISSR反应体系中PCR组分组合为:模板10.5ng、Taq酶1.55U、dNTP0.2mM、引物0.4μM、Mg2+1.0mM;
扩增程序为95℃预变性1min,依据引物Tm值-3℃原则、50-56℃退火35s,72℃延伸80min,共45个循环;72℃延伸10min;4℃保存;
琼脂糖凝胶在1×TAE缓冲液中电泳,放入TAE中染色,然后在凝胶成像仪上观察、拍照并记录;
(3)ISSR分子标记指纹图谱的构建:
对提取样品的基因组DNA进行100条ISSR引物扩增实验,选择扩增稳定、条带清晰、多态性较高的15条引物的扩增产物进行条带统计;
根据照片上各材料各引物扩增情况作记录,有带记为1,无带记为0,按Nei的方法计算多伞阿魏及同属相似种间的相似系数;
利用Popgene32软件分析遗传结构和遗传多样性指数,并根据遗传距离,用NTSYS-PC软件的对不同居群进行聚类分析,构建多伞阿魏及同属相似种ISSR指纹图谱库;
(4)利用构建的一种DNA指纹图谱进行多伞阿魏鉴定:
将待鉴定的多伞阿魏样品在上述条件下所建立的ISSR指纹图谱与已构建的多伞阿魏ISSR指纹图谱相比较,与所建立ISSR指纹图谱不同的,即为其它品种;相同的即为多伞阿魏。
本发明的效果为:
本发明有利于对植株外部形态不易区分的阿魏属药用植物品种进行快速、准确的鉴定,且节约了时间和成本,对于保证多伞阿魏药 材基源的准确分类鉴别具有重要意义。
附图说明
图1为本发明一种多伞阿魏及同属相似种分子指纹鉴定方法实施例流程图。
具体实施方式
图1为本发明一种多伞阿魏及同属相似种分子指纹鉴定方法实施例流程图,如图1所示,本实施例的多伞阿魏及同属相似种分子指纹鉴定方法包括以下步骤:
一、样品的采集:
从新疆不同产地采集多伞阿魏及同属其它品种样品的幼嫩叶片,叶片置硅胶中迅速干燥,并置于-80℃保存,备用。
二、三种不同总DNA提取方法: 
取多伞阿魏及同属三种药用植株上幼嫩叶片,利用试剂盒法、改良的CTAB法与SDS法提取上述四种药用植物的总DNA;用核酸蛋白检测仪和琼脂糖凝胶电泳方法检测所得总DNA的浓度和纯度;用ISSR分子标记的方法检测所得总DNA的质量。
结果表明试剂盒法提取的总DNA纯度最高,质量最好,能够将所有样品扩增出丰富而清晰的条带。所需时间短,操作简单。
因此,试剂盒法为提取多伞阿魏及同属相似种药用植物总DNA的最佳方法,能够直接用于下游分子生物学实验。
试剂盒法提取样品基因组DNA的具体方法:采用北京天根生化科技有限公司生产的DP305植物基因组提取试剂盒,提取样品基因组DNA。取部分的基因组DNA,1%的琼脂糖凝胶电泳质检,通过微量核酸蛋白定量仪进行定量。
三、ISSR反应体系和扩增程序优化:
通过对模板DNA浓度、Mg2+、dNTPs、Taq酶、引物浓度的单因素和正交优化实验,以及退火温度等试验,得到了一种标记最佳反 应体系和扩增程序。
ISSR反应体系中(50μl)的最佳PCR各主要组分组合为:模板10.5ng、Taq酶1.55U、dNTP0.2mM、引物0.4μM、Mg2+1.0mM;最佳扩增程序为95℃预变性1min,50-56℃退火35s(依据引物Tm值-3℃原则),72℃延伸80min,共45个循环;72℃延伸10min;4℃保存。
扩增反应产物5μl与1μl的6×Loading buffer混匀,将样品按顺序依次轻缓点入琼脂糖凝胶点样孔中,然后再点入5μl DL2000DNA marker和阴性对照。琼脂糖凝胶在1×TAE缓冲液中电泳,设定起始电压60V,待样品从点样孔跑出后,将电压调为120V恒压,电泳时间为50min。电泳结束后,将琼脂糖放入5μg/ml EB的TAE中染色25min,然后取出放入双蒸水中漂洗40min后,在凝胶成像仪上拍照。
四、引物筛选、数据统计与分析:
对提取的样品的基因组DNA进行100条ISSR引物扩增实验,体系为50μL,选择扩增稳定、清晰条带的15条引物的扩增产物进行条带统计。
在琼脂糖凝胶上具有相同迁移率的位置上,有带记作“1”(强带弱带均统计),无带记作“0”,构成1、0数据矩阵;统计每个引物扩增出的总带数和多态性带数,计算多态性带的百分比。并依据1、0数据矩阵在NTSYS-PC Version2.1统计分析软件系统中按Nei and Li相似系数法求得品种i和j之间的相似系数GSij,构成遗传相似系数矩阵。利用Popgene32软件分析遗传结构和遗传多样性指数,并根据遗传距离,用NTSYS-PC软件对不同居群进行聚类分析,构建聚类图。
五、ISSR分子标记指纹图谱的构建:
下表演示了多伞阿魏及同属相似种的ISSR引物881扩增产物分子标记指纹图谱:
最后应说明的是:显然,上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例,而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

Claims (1)

1.一种多伞阿魏及同属相似种分子指纹鉴定方法,包括多伞阿魏ISSR分子标记优化体系的建立、ISSR指纹图谱构建及鉴定方法;其特征在于,其具体步骤为:
(1)DNA提取:
取多伞阿魏及同属三种药用植株上幼嫩叶片,利用试剂盒法提取上述四种药用植物的总DNA;
用核酸蛋白检测仪和琼脂糖凝胶电泳方法检测所得总DNA的浓度和纯度;
用ISSR分子标记的方法检测所得总DNA的质量;
(2)ISSR-PCR扩增反应及电泳检测:
50μl多伞阿魏ISSR反应体系中PCR组分组合为:模板10.5ng、Taq酶1.55U、dNTP0.2mM、引物0.4μM、Mg2+1.0mM;
扩增程序为95℃预变性1min,依据引物Tm值-3℃原则、50-56℃退火35s,72℃延伸80min,共45个循环;72℃延伸10min;4℃保存;
琼脂糖凝胶在1×TAE缓冲液中电泳,放入TAE中染色,然后在凝胶成像仪上观察、拍照并记录;
(3)ISSR分子标记指纹图谱的构建:
对提取样品的基因组DNA进行100条ISSR引物扩增实验,选择扩增稳定、条带清晰、多态性较高的15条引物的扩增产物进行条带统计;
根据照片上各材料各引物扩增情况作记录,有带记为1,无带记为0,按Nei的方法计算多伞阿魏及同属相似种间的相似系数;
利用Popgene32软件分析遗传结构和遗传多样性指数,并根据遗传距离,用NTSYS-PC软件的对不同居群进行聚类分析,构建多伞阿魏及同属相似种ISSR指纹图谱库;
(4)利用构建的一种DNA指纹图谱进行多伞阿魏鉴定:
将待鉴定的多伞阿魏样品在上述条件下所建立的ISSR指纹图谱与已构建的多伞阿魏ISSR指纹图谱相比较,与所建立ISSR指纹图谱不同的,即为其它品种;相同的即为多伞阿魏。
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濒危药用植物新疆阿魏遗传多样性的ISSR分析;徐海燕等;《中国民族民间医药》;20101031;第19卷(第20期);第148页摘要,左栏倒数第1-5段,右栏第1-5段 *

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