CN111850159A - 一种ssr分子标记鉴定引物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种SSR分子标记鉴定引物及其应用。该SSR分子标记鉴定引物，包括引物对N，引物对N包括SEQ ID NO.2N‑1至SEQ ID NO.2N所示的序列，其中，N选自1至26之间的任意整数；和/或多个引物对N的组合，引物对N包括SEQ ID NO.2N‑1至SEQ ID NO.2N所示的序列，其中，N选自1至26之间的任意不同整数。利用该SSR分子标记可以构建杨树品种DNA指纹图谱，具有稳定可靠、结果准确、快速简便，不受生长季节限制和树龄差异的影响等优点，为杨树品种的鉴定提供了科学依据。

Description

一种SSR分子标记鉴定引物及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种SSR分子标记鉴定引物及其应用。
背景技术
SSR为简单重复序列(Simple Sequence repeats)的缩写，是一类以2-6个核苷酸串联重复的DNA序列，即微卫星DNA，广泛分布于真核生物基因组中，处于染色体的非编码区。SSR分子标记技术是建立在PCR基础上的一种遗传标记，能够反映动植物在遗传物质DNA水平上的差异，具有较高的多态性信息量、共显性分离、标记位点专化性、试验重复性好等特点。常见的微卫星如TGTG……TG＝(TG)n或AATAAT……AAT＝(AAT)n等，不同数目的核心序列呈串联重复排列，而呈现出长度多态性。在基因组中，因每个SSR序列的基本单元重复次数在不同基因型间差异很大，从而形成其座位的多态性。而且每个SSR座位两侧一般是相对保守的单拷贝序列，据此可设计引物，其关键是首先要了解SSR座位的侧翼序列(Flanking Region)，寻找其中的特异保守区。建立DNA文库，筛选鉴定微卫星DNA克隆，然后测定这些克隆的侧翼序列，设计特异性引物来扩增SSR序列。后经凝胶电泳，比较谱带的相对迁移距离，便可知不同个体在某个SSR座位上的多态性。SSR分子标记技术已在生物起源、进化、遗传多样性研究和品种资源鉴定中得到广泛应用。
杨树是世界上分布最广、适应性最强的树种，散生在北半球温带和寒温带的森林树种。在我国分布于北纬25°～53°，东经80°～134°之间，是北方主要用材林、防护林树种。我国杨树约有62种，品种较多。目前，生产中存在杨树品种混杂、病虫害严重、飞絮污染环境和经济效益低下等问题，亟需进行杨树遗传改良和新品种选育。由于杨树品种繁多，采用其他树种的SSR引物和使用聚丙烯酰胺凝胶检测进行杨树品种鉴别，常常会出现扩增产物多态性差和环境污染问题，因此，现有的方法很难能准确快速的鉴定出杨树品种。
发明内容
鉴于现有技术所存在的问题，本发明提供一种SSR分子标记鉴定引物及其应用，利用该SSR分子标记可以构建杨树品种DNA指纹图谱，具有稳定可靠、结果准确、快速简便，不受生长季节限制和树龄差异的影响等优点，为杨树品种的鉴定提供了科学依据。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种SSR分子标记鉴定引物，包括引物对N，引物对N包括SEQ ID NO.2N-1至SEQ IDNO.2N所示的序列，其中，N选自1至26之间的任意整数；
和/或多个引物对N的组合，引物对N包括SEQ ID NO.2N-1至SEQ ID NO.2N所示的序列，其中，N选自1至26之间的任意不同整数。
例如：当N为1时，引物对1的序列包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列；当N为2时，引物对2的序列包括SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的序列；当N为3时，引物对3的序列包括SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的序列；当N为4时，引物对4的序列包括SEQ IDNO.7和SEQ ID NO.8所示的序列；当N为5时，引物对5的序列包括SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.10所示的序列；当N为6时，引物对6的序列包括SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的序列；当N为7时，引物对7的序列包括SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的序列；当N为8时，引物对8的序列包括SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示的序列；当N为9时，引物对9的序列包括SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示的序列；当N为10时，引物对10的序列包括SEQ IDNO.19和SEQ ID NO.20所示的序列；当N为11时，引物对11的序列包括SEQ ID NO.21和SEQID NO.22所示的序列；当N为12时，引物对12的序列包括SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示的序列；当N为13时，引物对13的序列包括SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26所示的序列；当N为14时，引物对14的序列包括SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28所示的序列；当N为15时，引物对15的序列包括SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30所示的序列；当N为16时，引物对16的序列包括SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32所示的序列；当N为17时，引物对17的序列包括SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.34所示的序列；当N为18时，引物对18的序列包括SEQ ID NO.35和SEQ IDNO.36所示的序列；当N为19时，引物对19的序列包括SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38所示的序列；当N为20时，引物对20的序列包括SEQ ID NO.39和SEQ ID NO.40所示的序列；当N为21时，引物对21的序列包括SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42所示的序列；当N为22时，引物对22的序列包括SEQ ID NO.43和SEQ ID NO.44所示的序列；当N为23时，引物对23的序列包括SEQ ID NO.45和SEQ ID NO.46所示的序列；当N为24时，引物对24的序列包括SEQ ID NO.47和SEQ ID NO.48所示的序列；当N为25时，引物对25的序列包括SEQ ID NO.49和SEQ IDNO.50所示的序列；当N为26时，引物对26的序列包括SEQ ID NO.51和SEQ ID NO.52所示的序列。
优选的，一种SSR分子标记鉴定引物，包括引物对1至引物对26，引物对1至引物对26的序列如上述所示的序列。
本发明的有益效果是：发明人在研究中筛选了对16个杨树品种基因组扩增具有多态性的引物，综合考量了扩增产物稳定性、可靠性和检测结果清晰度等因素，选择了上述的引物，该引物可以作为SSR分子标记用于构建杨树品种DNA指纹图谱，具有稳定可靠、结果准确、快速简便，不受生长季节限制和树龄差异的影响等优点，为杨树品种的鉴定提供了科学依据。
本发明还提供上述SSR分子标记鉴定引物在杨树品种鉴定中的应用。采用上述SSR分子标记鉴定引物可以实现对杨树品种快速、准确的鉴定，不受生长季节限制和树龄差异的影响。
进一步，所述杨树品种包括青山杨、山新杨、银中杨、黑青杨、小青黑、中黑防2号、中雄4号、龙丰1号、龙丰2号、黑林1号、黑林2号、黑林3号、小黑杨、黑龙1号、小黑雄株、小黑雌株中的一种或几种的组合。
本发明提供一种利用上述SSR分子标记鉴定引物鉴定杨树品种的方法，包括以下步骤：利用上述SSR分子标记鉴定引物对杨树进行SSR扩增，根据扩增产物标记并分析杨树的品种。
采用上述方法可以实现对杨树品种快速、准确的鉴定，不受生长季节限制和树龄差异的影响。
杨树的品种可以包括青山杨、山新杨、银中杨、黑青杨、小青黑、中黑防2号、中雄4号、龙丰1号、龙丰2号、黑林1号、黑林2号、黑林3号、小黑杨、黑龙1号、小黑雄株、小黑雌株中的一种或几种的组合。
SSR扩增的条件可以包括：98℃2min，(98℃10s、57℃10s、68℃15s)×35个循环，72℃2min，4℃保存。
采用上述的扩增条件有利于扩增产物的稳定性、准确性。
本发明还提供一种用于杨树品种鉴定的试剂盒，包括上述SSR分子标记鉴定引物。
进一步，试剂盒还可以包括用于PCR扩增的酶、缓冲液、dNTP、基因组DNA、无菌水中的一种或几种。
采用上述试剂盒可以实现对杨树品种快速、准确的鉴定，不受生长季节限制和树龄差异的影响。
本发明提供一种上述SSR分子标记鉴定引物的建立方法，包括以下步骤：
(1)在拟鉴定杨树品种中取活叶片材料，提取基因组DNA；
(2)分析杨树品种全基因组的SSR位点，设计SSR引物；
(3)筛选SSR引物，用每一对SSR引物对不同杨树品种DNA模板进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，从扩增结果中筛选差异谱带，并进行重复验证，获得SSR分子标记鉴定引物。
杨树的品种可以包括青山杨、山新杨、银中杨、黑青杨、小青黑、中黑防2号、中雄4号、龙丰1号、龙丰2号、黑林1号、黑林2号、黑林3号、小黑杨、黑龙1号、小黑雄株、小黑雌株中的一种或几种的组合。
本发明提供一种构建杨树品种DNA指纹图谱的方法，包括以下步骤：利用上述SSR分子标记鉴定引物或上述方法获得的SSR分子标记鉴定引物对杨树进行SSR扩增，对位点进行识别，用数字读取谱带建立数据集，建立DNA指纹图谱。
进一步，SSR扩增的条件包括：98℃2min，(98℃10s、57℃10s、68℃15s)×35个循环，72℃2min，4℃保存。
进一步，用数字读取谱带建立数据集的方法包括以下步骤：采用人工读带法，根据条带的迁移率和有无记录二元数据，有条带记为1，无条带记0，排除模糊不清的带和无法准确标识的带。
采用上述进一步方案的有益效果是：提高数据的可靠性。
附图说明
图1为位点S26-2的PCR扩增凝胶电泳图谱，其中：M.mark；泳道1.青山杨；泳道2.山新杨；泳道3.银中杨；泳道4.黑青杨；泳道5.小青黑；泳道6.中黑防2号；泳道7.中雄4号；泳道8.龙丰1号；泳道9.龙丰2号；泳道10.黑林1号；泳道11.黑林2号；泳道12.黑林3号；泳道13.小黑杨；泳道14.黑龙1号；泳道15.小黑雄株；泳道16.小黑雌株。
图2为位点S68-2的PCR扩增凝胶电泳图谱，其中：M.mark；泳道1.青山杨；泳道2.山新杨；泳道3.银中杨；泳道4.黑青杨；泳道5.小青黑；泳道6.中黑防2号；泳道7.中雄4号；泳道8.龙丰1号；泳道9.龙丰2号；泳道10.黑林1号；泳道11.黑林2号；泳道12.黑林3号；泳道13.小黑杨；泳道14.黑龙1号；泳道15.小黑雄株；泳道16.小黑雌株。
图3为位点S35-1的PCR扩增凝胶电泳图谱，其中：M.mark；泳道1.青山杨；泳道2.山新杨；泳道3.银中杨；泳道4.黑青杨；泳道5.小青黑；泳道6.中黑防2号；泳道7.中雄4号；泳道8.龙丰1号；泳道9.龙丰2号；泳道10.黑林1号；泳道11.黑林2号；泳道12.黑林3号；泳道13.小黑杨；泳道14.黑龙1号；泳道15.小黑雄株；泳道16.小黑雌株。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本发明提供了一种利用SSR分子标记构建杨树品种DNA指纹图谱的方法，主要包括：取材杨树叶片样本，用Plant Genomic DNA Kit植物基因组DNA试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取。每一对SSR引物对不同杨树品种DNA模板进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，从扩增结果中筛选有差异的谱带，读取谱带并按识别顺序建立数据集，从而建立DNA指纹图谱。本发明提供的利用SSR分子标记构建杨树品种DNA指纹图谱的方法稳定可靠，不受生长季节限制和树龄差异的影响，为杨树品种的鉴定提供了科学依据。
一种杨树品种SSR分子标记鉴定方法，包括以下步骤：
(1)在拟鉴定杨树品种中取活叶片材料，用Plant Genomic DNA Kit植物基因组DNA试剂盒提取基因组DNA；
(2)利用MISA(MIcroSAtellite identification tool)软件分析已经建立文库的杨树品种全基因组的SSR位点，利用primer3软件设计引物；
(3)筛选SSR引物，用每一对SSR引物对不同杨树品种DNA模板进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，从扩增结果中筛选差异谱带，并进行重复验证；
(4)对这些位点进行识别，用数字读取谱带建立数据集，建立DNA指纹图谱。
上述的筛选SSR引物的要求是获得多态性位点，等位基因分子量的差异在4bp以上，扩增条带清晰可辨，可重复验证。
步骤(3)中，进行PCR扩增时，采用下述扩增体系：25ul扩增体系中包含1.1×T3Super PCR Mix(北京擎科新业生物技术有限公司)22ul，上游引物、下游引物各1.0ul，模板DNA50ng。
步骤(3)中，进行PCR扩增时，采用PCR扩增程序为：
98℃2min→(98℃10s,57℃10s,68℃15s)×35→72℃2min→4℃保存。
将上述的扩增产物进行电泳检测采用的是4％琼脂糖凝胶电泳。电泳条件为110v电泳下电泳40min。
通过上述条件的设置可以获得清晰稳定的电泳图，从而有利于根据电泳图对杨树品种进行品种鉴定。
步骤(4)中采用人工读带法，根据条带的迁移率和有无记录二元数据，有带记1，无带记0，排除模糊不清的带和无法准确标识的带。
上述的方法筛选得到的SSR特异性引物，分别包括下列表格(表1)中26对引物序列：
表1杨树品种间具有多态性的SSR引物序列及重复序列
Figure BDA0002648640460000051
Figure BDA0002648640460000061
通过上述方法可以构建杨树DNA指纹图谱，用于鉴别区分杨树品种，从而为杨树品种选育和改良提供依据。分析小黑杨全基因组的SSR位点，利用由SSR位点两翼的非重复核苷酸序列设计的引物，对杨树DNA进行PCR扩增，在特定条件下可扩增出相应位点的DNA片段，经过电泳分离，DNA带纹显现于凝胶上，即为杨树的SSR指纹。记录指纹的方法是，在凝胶某区段用1表示有SSR带纹，用0表示没有SSR。这些数据按照引物识别的特定顺序排列，即建立杨树DNA指纹图谱。根据DNA指纹图谱可在分子水平上区分杨树品种，不受表型特征影响、不受环境影响、不受树龄影响，是目前构建杨树品种DNA指纹图谱的高效方法之一。
具体的，可以采用下面的方法构建杨树品种DNA指纹图谱，包括以下步骤：
(1)提取DNA
取16个杨树品种活叶片材料，每样本分别采集叶片1-2片，用液氮冷冻后备用。冷冻的叶片经快速研磨成粉末后，立即采用植物DNA提取试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)提取DNA，提取步骤参照试剂盒产品说明的步骤。提取的DNA经过1％琼脂糖凝胶电泳检测，应无显著蛋白质、酚及其他核酸污染。DNA浓度的检测采用紫外分光光度法，应达到50ng·ul-1。
(2)设计引物
利用MISA(MIcroSAtellite identification tool)软件分析小黑杨全基因组，获得SSR位点(见表1中重复序列)，利用primer3软件设计引物，分别在每个SSR位点上、下游200bp左右内设计正向及反向引物，引物长度范围设置在20bp–25bp，退火温度设置为55℃-65℃。共设计了77182对引物。
(3)合成引物
从77182对引物中选取了其中38对引物进行合成。引物由上海生工技术公司合成，2OD/管分装，编号为“S”。引物为附在管壁上的粉末或膜状物，稀释前先12 000rpm 1min离心到底部，小心打开管盖，加入高压灭菌的超纯水溶解，涡旋。每条引物根据其nmol浓度加入相应体积的无菌水，引物最终浓度均稀释至5μmol·L-1。
(4)引物筛选
筛选SSR引物，用每一对SSR引物对不同杨树品种DNA模板进行PCR扩增，对扩增产物进行凝胶电泳检测，通过电泳检测的结果筛选引物，要求是谱带分子量的差异在4bp以上，且清晰可辨。筛选出了26对有多态性的引物对，分别为引物对1至引物对26，引物对的序列见表1，这些引物对在16个杨树品种间有多态性，这些引物对均符合谱带分子量的差异在4bp以上且清晰可辨的要求。
进行PCR扩增时，采用的扩增体系：25ul扩增体系中包含1.1×T3 Super PCR Mix(北京擎科新业生物技术有限公司)22ul，上游引物、下游引物各1.0ul，DNA模板1.0ul。进行PCR扩增时，采用的PCR仪器型号是BIO-RAD T100。上游引物、下游引物的序列分别如表1中所示的引物序列，DNA模板分别为16个树种提取的DNA，这16个树种分别为：青山杨、山新杨、银中杨、黑青杨、小青黑、中黑防2号、中雄4号、龙丰1号、龙丰2号、黑林1号、黑林2号、黑林3号、小黑杨、黑龙1号、小黑雄株、小黑雌株。将表1中列出的26对引物的每一对引物都分别对16个树种进行PCR扩增。
采用PCR扩增程序为：98℃2min→(98℃10s,57℃10s,68℃15s)×35→72℃2min→4℃保存。
扩增产物进行电泳检测采用的是改良的琼脂糖凝胶，即琼脂糖浓度为4％。电泳条件是110v电泳下电泳40min。电泳结束后，采用Tanon2500R凝胶成像系统对凝胶进行拍摄记录获得电泳图谱。
发明人在研究过程中，对PCR反应程序进行了反复摸索，最终获得了目标扩增产物；对琼脂糖凝胶的浓度、电泳的电压和电泳时间进行了多次调试，最终获得了清晰稳定的电泳图。
(5)谱带识别
采用人工读带法，对每一对引物所扩增的条带进行统计，根据条带的迁移率和有无记录二元数据，有带记1，无带记0，按照识别先后顺序(即按照识别引物条带的时候，读取结果的先后顺序，顺序可以参见下面实施例表4的备注)建立数据集，得到了每个杨树品种的DNA指纹图谱。
本发明与现有技术相比具有如下特点：稳定可靠，操作简单，无毒无污染，费用低，不受生长季节和树龄限制，为杨树品种的指纹图谱构建提供了高效的方法，为杨树的品种鉴定提供依据。
下面通过具体实施例进行介绍。
实施例1
构建中雄4号杨指纹图谱：根据黑龙江省品种审定要求，为中雄4号杨建立指纹图谱。采用SSR分子标记方法，通过引物扩增筛选，建立了中雄4号杨基因组区别于其他杨树品种的DNA指纹图谱。
背景材料：中雄4号杨(Populus deltoids'Shanhaiguan'×Populus suaveolens)是以美洲黑杨山海关杨(Populus deltoids Bary cv.'Shanhaiguan')为母本、以甜杨(Populus suaveolens)为父本，经人工水培杂交选育而成的F1代雄性无性系。中雄4号杨新品种选育于2017年12月8日由黑龙江省林业和草原局组织鉴定，2020年申请黑龙江林木品种审定。为此，开展中雄4号杨的指纹图谱构建，为品种审定提供依据。
(1)提取杨树品种DNA
植物样本为中雄4号杨及其它对照共16个杨树品种，详见表2。取参试树种的活叶片材料，每样本采集叶片1-2片，用液氮冷冻后备用。冷冻的叶片经快速研磨成粉末后，立即采用植物DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取总DNA，提取步骤应按照试剂盒产品说明的步骤。提取的DNA经过1％琼脂糖凝胶电泳检测，应无显著蛋白质、酚及其他核酸污染。DNA浓度的检测采用紫外分光光度法，应达到50ng·ul-1。
表2参试杨树品种及学名
Figure BDA0002648640460000081
(2)筛选引物
利用MISA(MIcroSAtellite identification tool)软件分析小黑杨全基因组的SSR位点，搜索2核苷酸重复次数6次以上、3-6核苷酸重复次数5次以上的SSR位点，共77183个SSR位点。根据SSR位点信息及小黑杨基因组信息，利用primer3软件对每个SSR位点都设计了引物，共设计了77183对引物。设计的方法包括：分别在每个SSR位点上、下游200bp左右内设计正向及反向引物，引物长度范围设置在20bp–25bp，退火温度设置为55℃-65℃。
选择其中38对引物进行合成，引物对的序列如表3所示。
表3 38对引物的序列
Figure BDA0002648640460000091
Figure BDA0002648640460000101
引物由上海生工技术公司合成，2OD/管分装，编号为“S”，命名规则是S+顺序号。引物为附在管壁上的粉末或膜状物，稀释前先12 000rpm 1min离心到底部，小心打开管盖，加入高压灭菌的超纯水溶解，涡旋。每条引物根据其nmol浓度加入相应体积的无菌水，引物最终浓度均稀释至5μmol·L-1。
筛选SSR引物，用每一对SSR引物对(见表3)分别对16个杨树品种(见表2)中的DNA模板进行PCR扩增，对扩增产物进行凝胶电泳检测，筛选出在品种间有多态性的引物，如果每个样本在同一个位点都有相同的条带，那么这条带就不是多态性条带，如果有的样本有，有的样本没有条带，或者分子量有差异，那么这条带就是多态条带，即所谓的差异条带。进行PCR扩增时，采用下述扩增体系：25ul扩增体系中包含1.1×T3 Super PCR Mix(北京擎科新业生物技术有限公司)22ul，上游引物、下游引物各1.0ul，模板DNA1.0ul。进行PCR扩增时，采用的PCR仪器型号是BIO-RAD T100，采用PCR扩增程序为：98℃2min→(98℃10s,57℃10s,68℃15s)×35→72℃2min→4℃保存。扩增产物进行电泳检测采用的是改良的琼脂糖凝胶，即琼脂糖浓度为4％。电泳条件是110v电泳下电泳40min。电泳结束后，采用Tanon2500R凝胶成像系统对凝胶进行拍摄记录获得电泳图谱。
筛选SSR引物的要求是获得多态性位点，即每个品种在同一个位点没有有相同的条带，或者分子量有差异，重复试验仍然如此。对16个杨树品种经过38对SSR引物筛选后，在26对引物中(即表1中引物对1至引物对26)找到37个多态性标记位点。
采用“引物名称+扩增产物条带位置”对位点进行命名。
位点的顺序分别为：S8、S9、S13、S17、S24、S25、S26-1、S26-2、S35-3、S35-2、S35-1、S36、S39-1、S39-2、S40-1、S40-2、S43-1、S57、S58、S60、S62、S64、S68-1、S68-2、S68-3、S66、S70-1、S70-2、S73-1、S73-2、S74-1、S74-2、S78、S81、S85-1、S85-2、S86。
上述位点中，S8代表引物对S8的扩增谱带，S9代表引物对S9的扩增谱带，S13代表引物对S13的扩增谱带，S17代表引物对S17的扩增谱带，S24代表引物对S24的扩增谱带，S25代表引物对S25的扩增谱带，S26-1代表引物对S26的第1条扩增谱带(自上而下)，S26-2代表引物对S26的第2条扩增谱带(自上而下)，S35-3代表引物对S35的第3条扩增谱带(自上而下)，S35-2代表引物对S35的第2条扩增谱带(自上而下)，S35-1代表引物对S35的第1条扩增谱带(自上而下)，S36代表引物对S36的扩增谱带，S39-1代表引物对S39的第1条扩增谱带(自上而下)，S39-2代表引物对S39的第2条扩增谱带(自上而下)，S40-1代表引物对S40的第1条扩增谱带(自上而下)，S40-2代表引物对S40的第2条扩增谱带(自上而下)，S43-1代表引物对S43的第1条扩增谱带(自上而下)，S57代表引物对S57的扩增谱带，S58代表引物对S58的扩增谱带，S60代表引物对S60的扩增谱带，S62代表引物对S62的扩增谱带，S64代表引物对S64的扩增谱带，S68-1代表引物对S68的第1条扩增谱带(自上而下)，S68-2代表引物对S68的第2条扩增谱带(自上而下)，S68-3代表引物对S68的第3条扩增谱带(自上而下)，S66代表引物对S66的扩增谱带，S70-1代表引物对S70的第1条扩增谱带(自上而下)，S70-2代表引物对S70的第2条扩增谱带(自上而下)，S73-1代表引物对S73的第1条扩增谱带(自上而下)，S73-2代表引物对S73的第2条扩增谱带(自上而下)，S74-1代表引物S74对的第1条扩增谱带(自上而下)，S74-2代表引物对S74的第2条扩增谱带(自上而下)，S78代表引物对S78的扩增谱带，S81代表引物对S81的扩增谱带，S85-1代表引物对S85的第1条扩增谱带(自上而下)，S85-2代表引物对S85的第2条扩增谱带(自上而下)，S86代表引物对S86的扩增谱带。
图1为位点S26-2的PCR扩增凝胶电泳图谱，其中：M.mark；泳道1.青山杨；泳道2.山新杨；泳道3.银中杨；泳道4.黑青杨；泳道5.小青黑；泳道6.中黑防2号；泳道7.中雄4号；泳道8.龙丰1号；泳道9.龙丰2号；泳道10.黑林1号；泳道11.黑林2号；泳道12.黑林3号；泳道13.小黑杨；泳道14.黑龙1号；泳道15.小黑雄株；泳道16.小黑雌株。扩增产物通过4％琼脂糖凝胶在110v电泳下电泳40min，采用Tanon2500R凝胶成像系统对凝胶拍摄以获得该图谱。位点S26-2指的是图谱中分子量为260bp的条带。从图1中可以看出16个杨树品种基因组有差别，中雄4号杨在位点S26-2有谱带。
图2为位点S68-2的PCR扩增凝胶电泳图谱，其中：M.mark；泳道1.青山杨；泳道2.山新杨；泳道3.银中杨；泳道4.黑青杨；泳道5.小青黑；泳道6.中黑防2号；泳道7.中雄4号；泳道8.龙丰1号；泳道9.龙丰2号；泳道10.黑林1号；泳道11.黑林2号；泳道12.黑林3号；泳道13.小黑杨；泳道14.黑龙1号；泳道15.小黑雄株；泳道16.小黑雌株。扩增产物通过4％琼脂糖凝胶在110v电泳下电泳40min，采用Tanon2500R凝胶成像系统对凝胶拍摄以获得该图谱。位点S68-2指的是图谱中分子量为320bp的条带。从图2中可以看出16个杨树品种基因组有差别，中雄4号杨在位点S68-2有谱带。
图3为位点S35-1的PCR扩增凝胶电泳图谱，其中：M.mark；泳道1.青山杨；泳道2.山新杨；泳道3.银中杨；泳道4.黑青杨；泳道5.小青黑；泳道6.中黑防2号；泳道7.中雄4号；泳道8.龙丰1号；泳道9.龙丰2号；泳道10.黑林1号；泳道11.黑林2号；泳道12.黑林3号；泳道13.小黑杨；泳道14.黑龙1号；泳道15.小黑雄株；泳道16.小黑雌株。扩增产物通过4％琼脂糖凝胶在110v电泳下电泳40min，采用Tanon2500R凝胶成像系统对凝胶拍摄以获得该图谱。位点S35-1指的是图谱中分子量为350bp的条带。从图3中可以看出，16个杨树品种基因组有差别，中雄4号杨在位点S35-1(即图谱中分子量为350bp的条带)有唯一的谱带，因此，利用S35-1位点可以区分中雄4号杨与其他杨树品种。
其他位点的PCR扩增凝胶电泳图谱由于篇幅有限并未列出。
(3)识别谱带
可以采用人工读带法，对每一对引物所扩增的条带进行统计，根据条带的迁移率和有无记录二元数据，有带记1，无带记0。根据读带结果建立指纹图谱，得到了每个品种的DNA指纹图谱数据库，见表4。按照SSR标记位点依次按照S8、S9、S13、S17、S24、S25、S26-1、S26-2、S35-3、S35-2、S35-1、S36、S39-1、S39-2、S40-1、S40-2、S43-1、S57、S58、S60、S62、S64、S68-1、S68-2、S68-3、S66、S70-1、S70-2、S73-1、S73-2、S74-1、S74-2、S78、S81、S85-1、S85-2、S86顺序，各品种杨树的DNA指纹图谱分别如下。
青山杨的DNA指纹图谱为：1001111000111010100011001110011011100。
山新杨的DNA指纹图谱为：1000010100100101000010011110001010100。
银中杨的DNA指纹图谱为：1111111100111010001111001110101001101。
黑青杨的DNA指纹图谱为：1000010100100101101010110110101000110。
小青黑的DNA指纹图谱为：0001101100110110001000011100100000100。
中黑防2的DNA指纹图谱为：1111111101110110011111011101100111101。
中雄4号的DNA指纹图谱为：0111111111010110011111011101100111101。
龙丰1号的DNA指纹图谱为：1001111000110010100011000010101010010。
龙丰2号的DNA指纹图谱为：1101111000110110100111001110101010010。
黑林1号的DNA指纹图谱为：0110111000110110011111011101100111101。
黑林2号的DNA指纹图谱为：0001111011110110101111001110101011010。
黑林3号的DNA指纹图谱为：1011111100111010101111011101101011100。
小黑杨的DNA指纹图谱为：0100111000110110101011010010101010110。
黑龙1号的DNA指纹图谱为：1111111100110110001111011110111011110。
小黑雄株的DNA指纹图谱为：1111111111110110001111011101100111011。
小黑雌株的DNA指纹图谱为：1011111100000110000000000000100000011。
上述建立的DNA指纹图谱，如同品种的身份证编码，每个品种编码都不同，易于识别。利用上述引物及指纹编码可将中雄4号杨区别于其他树种，具有稳定可靠、结果准确、快速简便、不受生长季节限制和树龄差异的影响等优点，为杨树品种的鉴定提供了科学依据。
表4各树种SSR指纹识别
Figure BDA0002648640460000131
表4中，A：青山杨，B：山新杨，C：银中杨，D：黑青杨，E：小青黑，F：中黑防2，G：中雄4号，H：龙丰1号，I：龙丰2号，J：黑林1号，K：黑林2号，L：黑林3号，M：小黑杨，N：黑龙1号，P：小黑雄，Q：小黑雌。
注：位点顺序为S8、S9、S13、S17、S24、S25、S26-1、S26-2、S35-3、S35-2、S35-1、S36、S39-1、S39-2、S40-1、S40-2、S43-1、S57、S58、S60、S62、S64、S68-1、S68-2、S68-3、S66、S70-1、S70-2、S73-1、S73-2、S74-1、S74-2、S78、S81、S85-1、S85-2、S86。
上述的对实施例的描述是便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以很容易地对这些实施例做出各种修改，并把此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于这里的实施例，本领域技术人员根据发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 齐齐哈尔大学
<120> 一种SSR分子标记鉴定引物及其应用
<160> 76
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgttcaatct atatttacgt ggct 24
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccgagactta ggtcaaccgt 20
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tttcgaaaac aggcttattt tatatc 26
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttggttcaaa aactgccaca 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
catggggtcg gagaaaagta 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
accttcctaa cccactaccg 20
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aaacatcaca aacccacaaa ca 22
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cctattaatg gctcctggca 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gcccttggtg gcttaaagag 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cccaatctct tccttttccc 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cacgatttga ggaccgtttt 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ttgaagagtg ttgtcgcctg 20
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cctcctttat gtgtggtttc c 21
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tcgaggttga accataggga 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ccttggctgc ataccacttt 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cctcgaccga cctctttcta 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cgagaggagg agaggttggt 20
<210> 18
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tgtgtaatgt catatattcc ttccttc 27
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ggcctattct gcttgtttgc 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ttaatttgca caacgcttgg 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tccaatccat gtgggatttt 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gcgcatgctt aactatcggt 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
cccttcttct tcttgttgcg 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tagggccaaa tgttggagag 20
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
tggatgattt tggtagagcc a 21
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tcggcgagaa agtatgttca 20
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ttctgatctt ttcccatcct tc 22
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
cgagatcaaa tcacgtccct 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gtcgatatca acgtccccac 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
tttgctgtat tcgaattgcc 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
tggccaaaag ttcatcaaaa 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gcaacaagga cgtagcgaat 20
<210> 33
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
tgctaattat gtatgtgtgg aggtt 25
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
cccttgtgag gaagcagaag 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
ataatggatc cgaactcccc 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
tatggcttcg ctatgcacac 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
ctcaacccaa caagcaaggt 20
<210> 38
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
gagagataga atggtcatgg ca 22
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
gcgacacaag ccaattaatc a 21
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
aaacgacgca tgtgtttgaa 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
taacatggca gttggatgga 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
gcaggggaaa gatacgatga 20
<210> 43
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
gcgacacaag ccaattaatc a 21
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
aaacgacgca tgtgtttgaa 20
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
tccaatctga gaagcaaccc 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
ttgcttgctg ctgttgtttt 20
<210> 47
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
gatcttcctt gaccaaggtt tt 22
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
gttctccaat ctttgctcgc 20
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
ggattggggc cattactttt 20
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
cacgttcact agcccaacct 20
<210> 51
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
ccctcaatct ggaaagtaaa tgtt 24
<210> 52
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
tcttaacatg catcgtctct tttt 24
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
atggtccttt cccgattttt 20
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
cttccaacac tcattgccct 20
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
cagatgcccc ctctttacaa 20
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
ggtttaatga ggtcgccaga 20
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
gccaatagct cccaagtcag 20
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
gtgggttgca cattggatta 20
<210> 59
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
ttcttgatat cgcttggcat t 21
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
gggttactcg cgaagatcaa 20
<210> 61
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
cgagaactca ctttgatggt tg 22
<210> 62
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
tcaggtatac ccgtacaagt gg 22
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
ggattgatcg gaagggatct 20
<210> 64
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
tgaaaggact tgaccaacca 20
<210> 65
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
caaaccatgg ccagacatta 20
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
aaagatcatg accgacaggc 20
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
cgtttcttcc tttgaggctg 20
<210> 68
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
ctgaggaaat gtccctgcat 20
<210> 69
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
catctgcctt agcaaccaga a 21
<210> 70
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
cctcacctcc acaagtccat 20
<210> 71
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
tcgccgtaga aggcttagaa 20
<210> 72
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
atgacacgct ctctgtccct 20
<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
gaccatctcc tccatagcca 20
<210> 74
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
attagaccaa gcgccaaatg 20
<210> 75
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
ccctttttct tctcctgcct 20
<210> 76
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
gtctttcttg cagggcactc 20

Claims (10)

1.一种SSR分子标记鉴定引物，其特征在于，包括引物对N，引物对N包括SEQ ID NO.2N-1至SEQ ID NO.2N所示的序列，其中，N选自1至26之间的任意整数；
和/或多个引物对N的组合，引物对N包括SEQ ID NO.2N-1至SEQ ID NO.2N所示的序列，其中，N选自1至26之间的任意不同整数。
2.权利要求1所述SSR分子标记鉴定引物在杨树品种鉴定中的应用。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述杨树品种包括青山杨、山新杨、银中杨、黑青杨、小青黑、中黑防2号、中雄4号、龙丰1号、龙丰2号、黑林1号、黑林2号、黑林3号、小黑杨、黑龙1号、小黑雄株、小黑雌株中的一种或几种的组合。
4.一种利用权利要求1所述SSR分子标记鉴定引物鉴定杨树品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：利用权利要求1所述SSR分子标记鉴定引物对杨树进行SSR扩增，根据扩增产物标记并分析杨树的品种。
5.一种用于杨树品种鉴定的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述SSR分子标记鉴定引物。
6.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，还包括用于PCR扩增的酶、缓冲液、dNTP、基因组DNA、无菌水中的一种或几种。
7.一种权利要求1所述SSR分子标记鉴定引物的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在拟鉴定杨树品种中取活叶片材料，提取基因组DNA；
(2)分析杨树品种全基因组的SSR位点，设计SSR引物；
(3)筛选SSR引物，用每一对SSR引物对不同品种的杨树DNA进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，从扩增结果中筛选差异谱带，并进行重复验证，获得SSR分子标记鉴定引物。
8.一种构建杨树品种DNA指纹图谱的方法，其特征在于，包括以下步骤：利用权利要求1所述SSR分子标记鉴定引物或权利要求7获得的SSR分子标记鉴定引物对杨树进行SSR扩增，对位点进行识别，用数字读取谱带建立数据集，建立DNA指纹图谱。
9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，SSR扩增的条件包括：98℃2min，(98℃10s、57℃10s、68℃15s)×35个循环，72℃2min，4℃保存。
10.根据权利要求8或9所述方法，其特征在于，用数字读取谱带建立数据集的方法包括以下步骤：采用人工读带法，根据条带的迁移率和有无记录二元数据，有条带记为1，无条带记0，排除模糊不清的带和无法准确标识的带。
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