CN117925896A - 一种鉴定樱花品种湘妍和敬翁杂交后代的InDel标记引物组合及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种鉴定樱花品种湘妍(父本)和敬翁(母本)杂交后代的InDel标记引物组合及检测方法，属于分子生物学领域；本方案提供的InDel标记引物组合，包括IDA2标记引物组、IDA13标记引物组和IDB17标记引物组，以此为PCR扩增引物来扩增湘妍，敬翁及待测杂交F1代的总DNA，若待测杂交F1代樱花的扩增产物电泳后含有父代湘妍的特异性条带，则待测杂交F1代为真正的湘妍和敬翁杂交后代，本发明对12个湘妍和敬翁的杂交F1代进行了检测，通过PCR产物电泳分析，结果表明：结合IDA2、IDA13和IDB17标记可以鉴定9个杂交F1代，鉴定率为75％，通过实验重复，准确率可达到100％。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种鉴定樱花品种湘妍和敬翁杂交后代的InDel标记引物组合及检测方法。
背景技术
樱花是蔷薇科Rosaceae李属Prunus樱亚属subg.Cerasus植物的统称，因其具有极佳的观赏价值，在园林造景和城市美化方面得以广泛应用。樱属植物主要分布于北半球的温带与亚热带地区，全世界樱属植物150余种，中国有52种及变种，三分之一以上的樱属植物原产于中国。我国樱属植物不仅种类多，变异类型也十分丰富，具有广阔的开发利用前景。山樱花(Prunus serrulata)、高盆樱桃(P.cerasoides)、尾叶樱桃(P.dielsiana)和钟花樱桃(P.campanulata)等野生樱花资源观赏性好，适应性强，遗传多样性丰富，是优异樱花种质创制和新品种培育的珍贵材料。
近百年来，人们通过自然变异筛选和杂交培育的方式获得了800多个樱花园艺品种。针对这些园艺品种，分类学家根据树形、花、果、叶、冬芽等形态特性提出三级、五级分类标准及花期、花色分类标准。由于不同学者对形态性状的判断标准存在差异，品种间性状交叉、重叠及在不同环境中具有很强的可塑性等，造成形态学鉴定的困难，从而造成品种名混淆，同物异名、异物同名等现象时常发生；且多数樱花先花后叶，花叶不同期，易于杂交，形态变异丰富多样，生活史长、花期相对较短，缺乏快速准确的鉴定方法。
‘湘妍’是从钟花樱自然变异选育的樱花新品种，其花色艳丽，树体高大，具有较高的园林观赏价值和广阔的应用前景，同时也是杂交育种的重要亲本；‘敬翁’是日本樱花品种，亲本可能是中国樱桃(P.pseudocerasus)和钟花樱，有待考证。实践证明，以‘湘妍’为父本，‘敬翁’为母本杂交而来的后代遗传变异较为丰富，有些个体的叶片等营养器官兼有父母本的特征，而有些个体的形态特征和母本基本一致，无明显差异，无法通过形态学特征进行鉴定，加之周期长，且受生长发育和环境的影响，无法满足鉴定杂交后代的需要。因此，急需建立快速、准确、高效的樱花杂交后代分子鉴定技术体系，缩短育种周期，加快育种进程，促进我国樱花品种选育、推广以及种业高质量发展。
发明内容
为了解决上述技术问题，本方案基于基因组重测序技术，挖掘适用于樱花基因型分析和杂交F1代鉴定的插入缺失突变(Insert-Deletion,InDel)位点，筛选可用于鉴定湘妍和敬翁杂交后代的InDel标记，然后利用湘妍、敬翁及其杂交F1代的基因组DNA对候选标记进行验证，获得特异性好、分辨率高的标记，达到快速、准确、高效鉴定杂交F1代的目的。
为达到上述目的，本方案首先提供了一种鉴定樱花品种湘妍和敬翁杂交后代的InDel标记引物组合，其特征在于，所述InDel标记引物组合包括IDA2标记引物组、IDA13标记引物组和IDB17标记引物组；
所述IDA2标记引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2所示；
所述IDA13标记引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.4所示；
所述IDB17标记引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.6所示。
基于一个总的发明构思，本方案还提供了一种InDel标记引物组合在检测樱花品种湘妍和敬翁杂交F1代真实性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、采用改良CTAB法提取湘妍、敬翁和待测杂交F1代样本叶片的总DNA；
S2、以S1步骤的总DNA为扩增模板，分别以权利要求1所述的3个标记引物组作为扩增引物，进行PCR扩增；
S3、对S2步骤的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，如果待测F1代样本在IDA2或IDA13或IDB17标记的扩增产物中具有父本的特异性条带，则待测杂交F1代样本是真正的湘妍、敬翁杂交后代；
所述S1步骤中湘妍为父本，敬翁为母本。
作为优选，所述S2步骤中PCR扩增的反应体系为：2×Taq Master Mix 12.5μL，10μmol/L上、下游引物各1μL，ddH2O 9.5μL，50ng/μL的湘妍、敬翁或待测试F1代材料的DNA 1μL。
作为优选，所述S2步骤中PCR扩增的反应程序为：IDA2标记的PCR反应程序：98℃预变性3min；94℃变性15s，57℃退火15s，72℃延伸30s，35次循环；72℃延伸3min，4℃保存；IDA13标记的PCR反应程序：98℃预变性3min；94℃变性15s，52℃退火15s，72℃延伸30s，35次循环；72℃延伸3min，4℃保存；IDB17标记的PCR反应程序：98℃预变性3min；94℃变性15s，49℃退火15s，72℃延伸30s，35次循环；72℃延伸3min，4℃保存
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供的检测方法降低了对形态学鉴定的依赖，设计的InDel标记属于第三代分子标记，其稳定性好、特异性强、操作简便，且不受植物发育时期、生长阶段和环境影响，仅需微量新鲜组织或硅胶快速干燥组织样品便可准确、快速地鉴定待测样品，在仪器设备齐全的前提下，仅需3小时左右便可得到检测结果。
(2)本发明提供的3个InDel标记对12个湘妍和敬翁的杂交F1代进行了检测，通过PCR产物电泳分析，结果表明：结合IDA2、IDA13和IDB17标记可以鉴定9个杂交F1代，鉴定率为75％，通过实验重复，准确率可达到100％。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实验例1中IDA2标记鉴定杂交F1代的检测结果；
图2为实验例1中IDA13标记鉴定杂交F1代的检测结果；
图3为实验例1中IDB17标记鉴定杂交F1代的检测结果。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。
实施例1
InDel标记的筛选
1、钟花樱种质资源的基因组重测序分析
采集来自湖南、福建、台湾等地的钟花樱嫩叶样品17份，采用改良CTAB法提取其总DNA。DNA检测合格后，用机械打断的方法(超声波)将DNA片段化，然后对片段化的DNA进行片段纯化、末端修复、3′端加A、连接测序接头，再用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，进行PCR扩增形成测序文库，建好的文库先进行文库质检，质检合格的文库用IlluminaNovaSeq6000平台进行测序。测序深度为30×以上(数据大于10Gb)。将获得的测序reads重新定位到钟花樱参考基因组上，通过比对定位Clean reads在参考基因组上的位置，统计各样品的测序深度、基因组覆盖度等信息，便于下一步进行变异检测。
2、InDel标记开发
根据钟花樱基因组重测序Clean reads在钟花樱参考基因组的定位结果，应用GATK v4.1.4.1软件检测插入/缺失突变(Insertion/deletion mutation，InDel)，然后对获得的变异位点进行过滤，筛选可靠性高的变异结果，得到最终的InDel位点集，并进行InDel标记的统计。从InDel位点集里随机选择插入或缺失碱基30bp以上的位点200个，用于后续验证实验。
3、InDel标记PCR引物设计
以钟花樱基因组序列为模板，应用Primer Premier 6.0软件设计200个InDel位点的PCR扩增引物。引物设计主要参数：长度18～26bp；GC含量40％～60％，熔解温度(Meltingtemperature，Tm)54～61℃，扩增产物大小100～400bp；引物自身不能有连续4个碱基的互补，避免形成发卡结构；引物之间不能有连续4个碱基的互补，避免形成引物二聚体；确保引物的特异性和高扩增效率。
4、多态性InDel标记筛选
采用改良CTAB法提取樱花品种湘妍、湘韵的总DNA，并以之为模板进行PCR扩增，从200个候选InDel标记中筛选具有多态性的标记，即通过2％的琼脂糖凝胶电泳检测，PCR扩增产物大小存在明显差异，可以很好地区分湘妍和湘韵这两个樱花品种的标记。
实验例1
湘妍和敬翁杂交F1代的鉴定
1、实验材料
分别采集樱花品种‘湘妍’、‘敬翁’及待测F1代的嫩叶，共计14份材料，用于InDel标记的筛选和特异性验证。
2、InDel标记检测
2.1DNA提取
采用改良CTAB法提取湘妍、敬翁及待测F1代共14份样本的总DNA。
2.2PCR扩增
以步骤2.1提取的‘湘妍’、‘敬翁’及其杂交F1代的DNA为扩增模板，分别以3个InDel标记的特异性引物(见表1)进行PCR扩增。
表1特异性标记引物信息
2.3PCR反应体系
PCR反应体系为25μL，包括2×Taq Master Mix 12.5μL，10μmol/L的上、下游引物各1μL，ddH2O 9.5μL，50ng/μL湘妍、敬翁或待测试材料的DNA 1μL。
2.4PCR反应程序
IDA2标记的PCR反应程序：98℃预变性3min；94℃变性15s，57℃退火15s，72℃延伸30s，35次循环；72℃延伸3min，4℃保存。
IDA13标记的PCR反应程序：98℃预变性3min；94℃变性15s，52℃退火15s，72℃延伸30s，35次循环；72℃延伸3min，4℃保存。
IDB17标记的PCR反应程序：98℃预变性3min；94℃变性15s，49℃退火15s，72℃延伸30s，35次循环；72℃延伸3min，4℃保存。
2.5PCR扩增产物的电泳检测
PCR扩增产物在浓度为2％的琼脂糖凝胶(每50mL琼脂糖溶液中加入GelRed 10000×储液5μL)上进行电泳，电泳缓冲液为1×TAE缓冲液，电压设置为110V，电泳时长为40min。电泳结果在凝胶成像系统中拍照记录，若PCR产物大小与预期一致，且无非特异性条带，则视为目的核酸片段扩增成功。
3、湘妍、敬翁杂交F1代特异性InDel标记及检测分析
理论上，真实杂交F1代应扩增出父本特异性条带，IDA2标记的鉴定结果如图1所示，1、2、3、5、6、8和10号，共7个样本的PCR扩增产物具有父本(湘妍)的特异性条带，是真正的杂交F1代，鉴定率为58.33％。
IDA13标记的鉴定结果如图2所示，1、2、5、6、8和10号，共6个样本的PCR扩增产物具有父本的特异性条带，是真正的杂交F1代，鉴定率为50％。
IDB17标记的鉴定结果如图2所示，2、8、9和11号，共4个样本的PCR扩增产物具有父本的特异性条带，是真正的杂交F1代，鉴定率为33.33％。
综合IDA2、IDA13和IDB17标记的鉴定结果，1、2、3、5、6、8、9、10和11号，共9个样本是真正的杂交F1代，鉴定率为75％。
以上所述仅是本发明专利的优选实施方式，本发明专利的保护范围并不仅局限于上述实施例。对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明专利的技术构思前提下所得到的改进和变换也应视为本发明专利的保护范围。
Claims (4)
1.一种鉴定樱花品种湘妍和敬翁杂交后代的InDel标记引物组合，其特征在于，所述InDel标记引物组合包括IDA2标记引物组、IDA13标记引物组和IDB17标记引物组；
所述IDA2标记引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2所示；
所述IDA13标记引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.4所示；
所述IDB17标记引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.6所示。
2.一种如权利要求1所述的InDel标记引物组合在检测樱花品种湘妍和敬翁杂交F1代真实性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、采用改良CTAB法提取湘妍、敬翁和待测杂交F1代样本叶片的总DNA；
S2、以S1步骤的总DNA为扩增模板，分别以权利要求1所述的3个标记引物组作为扩增引物，进行PCR扩增；
S3、对S2步骤的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，如果待测F1代样本在IDA2或IDA13或IDB17标记的扩增产物中具有父本的特异性条带，则待测杂交F1代样本是真正的湘妍、敬翁杂交后代；
所述S1步骤中湘妍为父本，敬翁为母本。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述S2步骤中PCR扩增的反应体系为：2×Taq Master Mix 12.5μL，10μmol/L上、下游引物各1μL，ddH2O 9.5μL，50ng/μL的湘妍、敬翁或待测试F1代材料的DNA 1μL。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述S2步骤中PCR扩增的反应程序为：IDA2标记的PCR反应程序：98℃预变性3min；94℃变性15s，57℃退火15s，72℃延伸30s，35次循环；72℃延伸3min，4℃保存；
IDA13标记的PCR反应程序：98℃预变性3min；94℃变性15s，52℃退火15s，72℃延伸30s，35次循环；72℃延伸3min，4℃保存；
IDB17标记的PCR反应程序：98℃预变性3min；94℃变性15s，49℃退火15s，72℃延伸30s，35次循环；72℃延伸3min，4℃保存。
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