CN117327829A - 一种用于鉴定大方线椒和黄平线椒的InDel分子标记引物及其开发方法 - Google Patents
一种用于鉴定大方线椒和黄平线椒的InDel分子标记引物及其开发方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于鉴定大方线椒和黄平线椒的InDel分子标记引物及其开发方法，涉及生物技术领域，为解决现有技术中的大方线椒与黄平线椒的产地均为贵州，且均是线椒类型，形态十分相近，需要从基因型层面上进行快速、准确鉴定区分，而目前没有专门针对鉴定大方线椒和黄平线椒的基因型鉴定方法的问题。包括chr1‑InDel‑15；chr2‑InDel‑10；chr3‑InDel‑11；chr4‑InDel‑19；chr5‑InDel‑29；chr10‑InDel‑40。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体为一种用于鉴定大方线椒和黄平线椒的InDel分子标记引物及其开发方法。
背景技术
辣椒(Capsicum annuum)，又名番椒、海椒、辣子和辣茄等，为茄科(Solanaceae)茄亚族(Solaninae Dunal)辣椒属植物，一年生或多年生，是我国种植面积最大的蔬菜作物之一。贵州是辣椒的主产区，近年种植面积稳定在500万亩以上，产业链成熟，市场需求量大。贵州辣椒栽培历史悠久，类型丰富，品种繁多。传统的辣椒种质资源鉴别主要依据株型、茎、叶、果形等形态学特征，但由于大部分辣椒品种在苗期及开花期形态相似，直到结果期才开始表现出品种的特性，且形态学的特征常常存在过渡和交叉，难以划定明确的界限，给辣椒的品种鉴定造成了极大的困难。
大方线椒是贵州省优良地方品种，长线椒类型，具有果形美观、颜色鲜红、果实细长、香味浓、辣度适中、营养丰富等特点。其果实长达40.8cm，鲜椒VC含量高达149.09mg/100g，干椒大量出口到东南亚国家，油辣椒、糟辣椒、豆豉素辣椒等辣椒制品大量销往国内的大中城市。黄平线椒是国家地理标志产品，长线椒类型，具有细长美观，顺直匀称，果尖微弯，果面皱，干椒皮薄油亮等特点。其果实长达39cm，粗蛋白含量高达20.96％，辣椒红素含量7.32mg/g，其干椒、糟辣椒、糊辣椒、辣椒面等辣椒制品，受到消费者的广泛青睐。它们在形态上十分相近，仅在叶形、叶色、株高及果形存在细微差别，因而易于混淆。因此，开发专一性分子标记对保护、鉴别大方线椒和黄平线椒具有重要科学意义和实践价值。
随着测序技术的发展，DNA分子标记技术日趋成熟，并在农作物品种鉴定上得到了广泛应用。DNA分子标记相对于传统的形态标记具有变异丰富、多态性高、特异性强；稳定性高，不受取材部位、生长阶段和环境因素影响；检测周期短、成本低等多项优势。目前常用的DNA分子标记主要有RFLP、RAPD、AFLP、SCAR、SSR、CAPS、InDel等。其中InDel(Insertion-Deletion)即插入缺失，是同一物种不同个体之间基因组同一位点的序列发生不同大小核苷酸片段的插入或缺失，是一种基于插入/缺失位点两侧的序列设计特异引物进行PCR扩增的标记技术。InDel标记一般表现为扩增片段的长度差异，是一种共显性标记，具有密度大、分型便捷、准确性高、稳定性好等优点，还能扩增混合DNA样品和高度降解的微量DNA样品，因而成为育种实践中应用的高效标记。
目前对于辣椒品种的分子鉴定研究大多利用AFLP、RAPD、SSR等方法，但这些方法操作繁琐、重复性差，并且在基因组上的密度较低，扩增结果直接受DNA质量的影响，因此不适合用于稳定、快速、准确的品种鉴别体系的开发。本发明是首次对贵州地方名优品种大方线椒和黄平线椒进行分子标记开发及鉴定，本发明提供的鉴定大方线椒和黄平线椒的InDel标记具有共显性、能够鉴别出纯合与杂合基因型、扩增产物带型简单清晰、对DNA质量要求较低等优点，无需酶切、克隆、探针制备、分子杂交等工作，能够实现对大方线椒和黄平线椒准确、高效鉴定，对于保护名优地方辣椒及地理标志产品具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于鉴定大方线椒和黄平线椒的InDel分子标记引物及其开发方法，以解决上述背景技术中提出的大方线椒与黄平线椒的产地均为贵州，且均是线椒类型，形态十分相近，需要从基因型层面上进行快速、准确鉴定区分，而目前没有专门针对鉴定大方线椒和黄平线椒的基因型鉴定方法的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种用于鉴定大方线椒和黄平线椒的InDel分子标记引物，包括：
chr1-InDel-15；正向引物序列：5′-TTTGGTGTTTTTTAGGTCGC-3′；正向引物序列：5′-AGACACACTAAAAACCCCAT-3′；
chr2-InDel-10；正向引物序列：5′-TGATGTTGAGACGAGGTGAA-3′；正向引物序列：5′-AGAGCAAAAGACAAAATGGG-3′；
chr3-InDel-11；正向引物序列：5′-CTTCTGGGAGGTATGATTTA-3′；正向引物序列：5′-TTGTATGGGTATGTAGAACG-3′；
chr4-InDel-19；正向引物序列：5′-AAATCTGAAAGCCCATAAAC-3′；正向引物序列：5′-TAAAATCTAAAGTGGAGGCT-3′；
chr5-InDel-29；正向引物序列：5′-TGAGGTGGGATAACAAAAGG-3′；正向引物序列：5′-CGTTCGCAAGTGCTCAATCA-3′；
chr10-InDel-40；正向引物序列：5′-GCATCTGTGGAAAACAATTT-3′；正向引物序列：5′-AACACAACAAATTCAGCGTA-3′。
所述InDel分子标记引物鉴定大方线椒和黄平线椒的步骤如下：
步骤一：使用天根植物DNA提取试剂盒提取大方线椒和黄平线椒的DNA；
步骤二：用InDel标记引物对，对大方线椒和黄平线椒的DNA进行PCR扩增；
PCR扩增的反应体系共12.5μL，包括DNA 0.5μL、10μmol/L的InDel正向引物0.5μL、10μmol/L的InDel反向引物0.5μL、2×PCR反应混合液6.25μL、DNA聚合酶0.15μL和超纯水4.6μL；PCR扩增的程序为：94℃5min；94℃30s，TM℃30s，72℃30s，共35个循环；72℃5min，4℃保存；
步骤三：将扩增好的PCR产物进行3％琼脂糖凝胶电泳，160V电压下1小时，经过凝胶成像获取鉴定胶图；
步骤四：将鉴定胶图转化为0，1数据矩阵，根据胶图上的特征化条带，将大方线椒和黄平线椒在同一位置上出现清晰、无拖带、易分辨的条带记为1,无带记为0，建立0，1数据矩阵；
chr1-InDel-15、chr2-InDel-10、chr3-InDel-11、chr4-InDel-19、chr5-InDel-29、chr10-InDel-40的0，1数据矩阵依次为(1，0)，(1，0)，(1，0)，(1，0)，(1，0)，(1，0)，则所检测的辣椒样本为大方线椒；
chr1-InDel-15、chr2-InDel-10、chr3-InDel-11、chr4-InDel-19、chr5-InDel-29、chr10-InDel-40的0，1数据矩阵依次为(0，1)，(0，1)，(0，1)，(0，1)，(0，1)，(0，1)，则所检测的辣椒样本为黄平线椒。
一种用于鉴定大方线椒和黄平线椒的InDel分子标记引物的开发方法，包括如下步骤：
S1：对牛场辣椒、黄平线椒、镇宁朝天椒和8819线椒4个辣椒品种进行全基因组重测序，经过质量控制、序列比对、变异检测后，初步筛选4个品种的InDel标记；
S2：对初筛获得的4个品种的InDel标记分别过滤，去除差异≤4bp以及杂合的InDel标记，剩余的分别作为4个品种的InDel标记库；
S3：比对4个InDel标记库，筛选共同的InDel标记，构成共有InDel标记库；
S4：在共有InDel标记库中，以在染色体上均匀分布为原则，选取足量的InDel标记；
S5：每个InDel标记设计2个InDel引物对，作为第一组InDel标记引物对；
S6：从第一组InDel标记引物对中，去除无扩增条带和无多态性的InDel标记引物对，剩余的作为第二组InDel标记引物对；
S7：利用第二组InDel标记引物对初步鉴别大方线椒和黄平线椒，去除无多态性、单个样品扩增条带数大于1的InDel标记引物对，只选取单个样品扩增条带数为1的InDel标记引物对作为第三组InDel标记引物对，为鉴定大方线椒和黄平线椒的InDel分子标记引物。
优选的，所述S1中，全基因组重测序生成的原始图像数据文件经碱基识别转化为原始测序序列，通过质量控制去除带文库构建接头的reads、未知碱基超过10％的reads以及低质量碱基超过50％的reads，且两端reads均去除；过滤变异位置的测序深度>4以及质量值>20的InDel标记。
优选的，所述S4中，在共有InDel标记库中，根据每条染色体大小，按每条染色体上均匀选取21个InDel标记计算，算出21个InDel标记的平均距离，再根据平均距离确定21个InDel标记在染色体上的物理位置选取。
优选的，所述S5中，引物设计原则为引物长度为20bp，GC含量40％-60％，产物长度200bp，产物的Rating>80，尽量不含发夹结构、引物二聚体或交叉二聚体。
优选的，所述S6的具体操作过程包括如下步骤：
S6-1：采集果形、果实朝向不同的遵辣1号和黄平线椒的辣椒样本；
S6-2：使用天根植物基因组DNA提取试剂盒提取辣椒样本的DNA；
S6-3：用InDel引物，对提取的辣椒样本DNA进行PCR扩增；
PCR扩增的反应体系共12.5μL，包括DNA 0.5μL、10μmol/L的InDel正向引物0.5μL、10μmol/L的InDel反向引物0.5μL、2×PCR反应混合液6.25μL、DNA聚合酶0.15μL和超纯水4.6μL；PCR扩增的程序为：94℃5min；94℃30s，TM℃30s，72℃30s，共35个循环；72℃5min，4℃保存；
S6-4：将扩增好的PCR产物进行3％琼脂糖凝胶电泳，160V电压下1小时，经过凝胶成像获取鉴定胶图，去除无扩增条带和无多态性的InDel标记引物对。
优选的，所述S7的具体操作过程包括如下步骤：
S7-1：使用天根植物DNA提取试剂盒提取大方线椒和黄平线椒的DNA；
S7-2：用第二组的InDel引物，对大方线椒和黄平线椒的DNA进行PCR扩增；
PCR扩增的反应体系共12.5μL，包括DNA 0.5μL、10μmol/L的InDel正向引物0.5μL、10μmol/L的InDel反向引物0.5μL、2×PCR反应混合液6.25μL、DNA聚合酶0.15μL和超纯水4.6μL；PCR扩增的程序为：94℃5min；94℃30s，TM℃30s，72℃30s，共35个循环；72℃5min，4℃保存；
S7-3：将扩增好的PCR产物进行3％琼脂糖凝胶电泳，160V电压下1小时，经过凝胶成像获取鉴定胶图，去除无多态性、单个样品扩增条带数大于1的InDel标记引物对。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明通过比较不同果形、不同产地辣椒基因组与参考基因组的序列差异，构建共有InDel标记库，开发了大方线椒和黄平线椒间的6个特异性InDel标记。利用这些标记可以检测不同辣椒品种的基因组中是否含有这些位点以及位点的纯合状态，可应用于快速准确鉴定大方线椒和黄平线椒。
1)本发明提供的分子标记是一种共显性标记，准确性高、重复性好，扩增产物带型简单清晰，并且能够区分出杂合体和纯合体，不仅能快速区分大方线椒和黄平线椒，而且能准确鉴定所检测的植株是否为纯合子。
2)本发明提供的分子标记覆盖辣椒的6条染色体，可提高检测准确性。前人报道的分子标记在染色体上分布不均，用于鉴定区分辣椒品种时存在一定的误差率。
3)应用本发明提供的分子标记鉴定大方线椒和黄平线椒时，具有检测效率高及节约成本的优势。在常规品种鉴定中，一般是根据品种的形态差异进行判断，其受环境影响较大，不同年份间差别也较大，且形态学特征常常存在过渡和交叉，难以划定明确的界限，筛选鉴定的可靠性低。基于本发明提供的分子标记，可以在苗期取样，提取辣椒植株DNA，通过PCR快速区分大方线椒和黄平线椒，能够有效缩短种植时间，减小种植规模，显著节约鉴定成本。本发明提供的分子标记还能应用于大方线椒和黄平线椒重要农艺性状的基因挖掘，促进名优地方辣椒及地理标志产品的综合利用。
附图说明
图1为本发明的InDel引物扩增大方线椒和黄平线椒的电泳图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
一、对4个辣椒品种进行全基因组重测序，经过质量控制、序列比对、变异检测后，初步筛选4个品种的InDel标记；
S1、4个辣椒品种的果形、产地、果实朝向、果实着生方式不同(表1)；
表1用于全基因组重测序的4个辣椒品种信息
| 品种 | 果形 | 产地 | 果实朝向 | 果实着生方式 |
| 牛场辣椒 | 牛角形 | 贵州 | 朝下 | 散生 |
| 黄平线椒 | 线形 | 贵州 | 朝下 | 散生 |
| 镇宁朝天椒 | 指形 | 贵州 | 朝上 | 散生 |
| 8819线椒 | 线形 | 陕西 | 朝下 | 簇生 |
S2、利用illumina HiSeq2000平台进行全基因组测序，测序生成的原始图像数据文件经碱基识别转化为原始测序序列；
S3、通过质量控制去除以下不能用的reads，且两端reads均去除；
(1)带文库构建接头的reads；
(2)未知碱基超过10％的reads；
(3)低质量碱基(测序质量值≤5)超过50％的reads。
S4、质控后的有效测序数据经BWA软件比对到参考基因组(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/10896)，比对结果经SAMTOOLS和PICARD软件(http://picard.sourceforge.net)去除重复。
S5、用samtools软件检测原始的InDel，然后用如下标准进行过滤：
(1)变异位置的测序深度>4；
(2)质量值>20。
S6、4个品种均初步筛选出大量InDel标记(表2)。
表2 4个辣椒品种全基因组重测序的数据产出
| 牛场辣椒 | 黄平线椒 | 镇宁朝天椒 | 8819线椒 | |
| 测序有效数据总长(Gb) | 117.50 | 130.36 | 129.53 | 168.68 |
| 基因组覆盖度(％) | 98.23 | 98.89 | 89.32 | 98.46 |
| 平均测序深度(×) | 36.35 | 40.87 | 42.96 | 51.32 |
| InDel标记总数(个) | 656900 | 564167 | 2228844 | 494818 |
二、对初筛获得的4个品种的InDel标记分别过滤，剩余的分别作为4个品种的InDel标记库；
过滤原则：去除差异≤4bp以及杂合的InDel标记。
三、比对4个InDel标记库，筛选共同的InDel标记，构成共有InDel标记库。
四、在共有InDel标记库中，以在染色体上均匀分布为原则，选取足量的InDel标记；
在共有InDel标记库中，根据每条染色体大小，按每条染色体上均匀选取21个InDel标记计算，算出21个InDel标记的平均距离(表3)；
表3每条染色体上InDel标记间的平均距离
再根据平均距离确定21个InDel标记在染色体上的物理位置(表4)，辣椒有12条染色体，共选取252个InDel标记。
表4每条染色体上21对InDel引物的物理位置
五、每个InDel标记设计2个InDel引物对(引物设计软件Primer Premier5)，作为第一组InDel标记引物对；
引物设计原则：引物长度为20bp左右，GC含量40％-60％，产物长度约200bp，产物的Rating>80，尽量不含发夹结构、引物二聚体或交叉二聚体；
252个InDel标记，每个InDel标记设计2个InDel引物对，共设计504个InDel引物对。
六、从第一组InDel标记引物对中，去除无扩增条带和无多态性的InDel标记引物对，剩余的作为第二组InDel标记引物对；
S1、辣椒样本采集；辣椒样本为果形、果实朝向不同的遵辣1号，黄平线椒，遵辣1号的果实为锥形朝天，黄平线椒为线形朝下；
S2、使用天根植物基因组DNA提取试剂盒提取辣椒样本的DNA；
S3、用504对InDel引物，对提取的辣椒样本DNA进行PCR扩增；
PCR扩增的反应体系共12.5μL，包括DNA 0.5μL、10μmol/L的InDel正向引物0.5μL、10μmol/L的InDel反向引物0.5μL、2×PCR反应混合液6.25μL、DNA聚合酶0.15μL和超纯水4.6μL；PCR扩增的程序为：94℃5min；94℃30s，TM℃30s，72℃30s，共35个循环；72℃5min，4℃保存；
S4、将扩增好的PCR产物进行3％琼脂糖凝胶电泳(3μL样品)，160V电压下1小时，经过凝胶成像获取鉴定胶图，去除无扩增条带和无多态性的InDel标记引物对，共获得47对稳定性高、多态性好的InDel引物(图1)，分布在11条染色体上，其中第9条染色体上未筛选到多态性好的InDel引物对(表5)。
表5 47对多态性好的InDel引物对在染色体上的分布情况
| 序号 | 染色体编号 | 多态性标记数量 |
| 1 | Chr1 | 2 |
| 2 | Chr2 | 7 |
| 3 | Chr3 | 6 |
| 4 | Chr4 | 6 |
| 5 | Chr5 | 9 |
| 6 | Chr6 | 1 |
| 7 | Chr7 | 7 |
| 8 | Chr8 | 1 |
| 9 | Chr9 | 0 |
| 10 | Chr10 | 4 |
| 11 | Chr11 | 3 |
| 12 | Chr12 | 1 |
| 总计 | 47 |
七、利用第二组InDel标记引物对初步鉴别大方线椒和黄平线椒，去除无多态性、单个样品扩增条带数大于1的InDel标记引物对，只选取单个样品扩增条带数为1的9个InDel标记引物对作为第三组InDel标记引物对；
S1、使用天根植物DNA提取试剂盒提取大方线椒和黄平线椒的DNA；
S2、用第二组的47对InDel引物，对大方线椒和黄平线椒的DNA进行PCR扩增；
PCR扩增的反应体系共12.5μL，包括DNA 0.5μL、10μmol/L的InDel正向引物0.5μL、10μmol/L的InDel反向引物0.5μL、2×PCR反应混合液6.25μL、DNA聚合酶0.15μL和超纯水4.6μL；
PCR扩增的程序为：94℃5min；94℃30s，TM℃30s，72℃30s，共35个循环；72℃5min，4℃保存；
S3、将扩增好的PCR产物进行3％琼脂糖凝胶电泳(3μL样品)，160V电压下1小时，经过凝胶成像获取鉴定胶图，将得到的数据进行分析，分析47对InDel引物在大方线椒和黄平线椒中的扩增条带数。
经检测，47对引物中有23对无多态性，18对在大方线椒或黄平线椒中的扩增条带数大于1，6对在大方线椒和黄平线椒中的扩增条带数均为1(表6)。
表6 47对引物在大方线椒和黄平线椒中的扩增条带数分析
八、第三组InDel标记引物对鉴定大方线椒和黄平线椒；
第三组InDel标记引物对均匀分布于6条染色体上(表7)；
表7鉴别大方线椒和黄平线椒的6对InDel分子标记引物
S1、使用天根植物DNA提取试剂盒提取大方线椒和黄平线椒的DNA；
S2、用第三组InDel标记引物对，对大方线椒和黄平线椒的DNA进行PCR扩增；
PCR扩增的反应体系共12.5μL，包括DNA 0.5μL、10μmol/L的InDel正向引物0.5μL、10μmol/L的InDel反向引物0.5μL、2×PCR反应混合液6.25μL、DNA聚合酶0.15μL和超纯水4.6μL；
PCR扩增的程序为：94℃5min；94℃30s，TM℃30s，72℃30s，共35个循环；72℃5min，4℃保存；
S3、将扩增好的PCR产物进行3％琼脂糖凝胶电泳(3μL样品)，160V电压下1小时，经过凝胶成像获取鉴定胶图；
S4、将鉴定胶图转化为0，1数据矩阵。
根据胶图上的特征化条带，将大方线椒和黄平线椒在同一位置上出现清晰、无拖带、易分辨的条带记为1,无带记为0，建立0，1数据矩阵。
如果chr1-InDel-15、chr2-InDel-10、chr3-InDel-11、chr4-InDel-19、chr5-InDel-29、chr10-InDel-40的0，1数据矩阵依次为(1，0)，(1，0)，(1，0)，(1，0)，(1，0)，(1，0)，则所检测的辣椒样本为大方线椒；
如果chr1-InDel-15、chr2-InDel-10、chr3-InDel-11、chr4-InDel-19、chr5-InDel-29、chr10-InDel-40的0，1数据矩阵依次为(0，1)，(0，1)，(0，1)，(0，1)，(0，1)，(0，1)，则所检测的辣椒样本为黄平线椒(表8)。
表8 9对InDel引物检测大方线椒和黄平线椒的0，1数据矩阵
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
Claims (8)
1.一种用于鉴定大方线椒和黄平线椒的InDel分子标记引物，包括：
chr1-InDel-15；正向引物序列：5′-TTTGGTGTTTTTTAGGTCGC-3′；正向引物序列：5′-AGACACACTAAAAACCCCAT-3′；
chr2-InDel-10；正向引物序列：5′-TGATGTTGAGACGAGGTGAA-3′；正向引物序列：5′-AGAGCAAAAGACAAAATGGG-3′；
chr3-InDel-11；正向引物序列：5′-CTTCTGGGAGGTATGATTTA-3′；正向引物序列：5′-TTGTATGGGTATGTAGAACG-3′；
chr4-InDel-19；正向引物序列：5′-AAATCTGAAAGCCCATAAAC-3′；正向引物序列：5′-TAAAATCTAAAGTGGAGGCT-3′；
chr5-InDel-29；正向引物序列：5′-TGAGGTGGGATAACAAAAGG-3′；正向引物序列：5′-CGTTCGCAAGTGCTCAATCA-3′；
chr10-InDel-40；正向引物序列：5′-GCATCTGTGGAAAACAATTT-3′；正向引物序列：5′-AACACAACAAATTCAGCGTA-3′。
2.根据权利要求1所述的一种用于鉴定大方线椒和黄平线椒的InDel分子标记引物，其特征在于，所述InDel分子标记引物鉴定大方线椒和黄平线椒的步骤如下：
步骤一：使用天根植物DNA提取试剂盒提取大方线椒和黄平线椒的DNA；
步骤二：用InDel标记引物对，对大方线椒和黄平线椒的DNA进行PCR扩增；
PCR扩增的反应体系共12.5μL，包括DNA 0.5μL、10μmol/L的InDel正向引物0.5μL、10μmol/L的InDel反向引物0.5μL、2×PCR反应混合液6.25μL、DNA聚合酶0.15μL和超纯水4.6μL；PCR扩增的程序为：94℃5min；94℃30s，TM℃30s，72℃30s，共35个循环；72℃5min，4℃保存；
步骤三：将扩增好的PCR产物进行3％琼脂糖凝胶电泳，160V电压下1小时，经过凝胶成像获取鉴定胶图；
步骤四：将鉴定胶图转化为0，1数据矩阵，根据胶图上的特征化条带，将大方线椒和黄平线椒在同一位置上出现清晰、无拖带、易分辨的条带记为1,无带记为0，建立0，1数据矩阵；
chr1-InDel-15、chr2-InDel-10、chr3-InDel-11、chr4-InDel-19、chr5-InDel-29、chr10-InDel-40的0，1数据矩阵依次为(1，0)，(1，0)，(1，0)，(1，0)，(1，0)，(1，0)，则所检测的辣椒样本为大方线椒；
chr1-InDel-15、chr2-InDel-10、chr3-InDel-11、chr4-InDel-19、chr5-InDel-29、chr10-InDel-40的0，1数据矩阵依次为(0，1)，(0，1)，(0，1)，(0，1)，(0，1)，(0，1)，则所检测的辣椒样本为黄平线椒。
3.一种用于鉴定大方线椒和黄平线椒的InDel分子标记引物的开发方法，基于权利要求1所述的一种用于鉴定大方线椒和黄平线椒的InDel分子标记引物实现，其特征在于，包括如下步骤：
S1：对牛场辣椒、黄平线椒、镇宁朝天椒和8819线椒4个辣椒品种进行全基因组重测序，经过质量控制、序列比对、变异检测后，初步筛选4个品种的InDel标记；
S2：对初筛获得的4个品种的InDel标记分别过滤，去除差异≤4bp以及杂合的InDel标记，剩余的分别作为4个品种的InDel标记库；
S3：比对4个InDel标记库，筛选共同的InDel标记，构成共有InDel标记库；
S4：在共有InDel标记库中，以在染色体上均匀分布为原则，选取足量的InDel标记；
S5：每个InDel标记设计2个InDel引物对，作为第一组InDel标记引物对；
S6：从第一组InDel标记引物对中，去除无扩增条带和无多态性的InDel标记引物对，剩余的作为第二组InDel标记引物对；
S7：利用第二组InDel标记引物对初步鉴别大方线椒和黄平线椒，去除无多态性、单个样品扩增条带数大于1的InDel标记引物对，只选取单个样品扩增条带数为1的InDel标记引物对作为第三组InDel标记引物对，为鉴定大方线椒和黄平线椒的InDel分子标记引物。
4.根据权利要求3所述的一种用于鉴定大方线椒和黄平线椒的InDel分子标记引物的开发方法，其特征在于：所述S1中，全基因组重测序生成的原始图像数据文件经碱基识别转化为原始测序序列，通过质量控制去除带文库构建接头的reads、未知碱基超过10％的reads以及低质量碱基超过50％的reads，且两端reads均去除；过滤变异位置的测序深度>4以及质量值>20的InDel标记。
5.根据权利要求3所述的一种用于鉴定大方线椒和黄平线椒的InDel分子标记引物的开发方法，其特征在于：所述S4中，在共有InDel标记库中，根据每条染色体大小，按每条染色体上均匀选取21个InDel标记计算，算出21个InDel标记的平均距离，再根据平均距离确定21个InDel标记在染色体上的物理位置选取。
6.根据权利要求3所述的一种用于鉴定大方线椒和黄平线椒的InDel分子标记引物的开发方法，其特征在于：所述S5中，引物设计原则为引物长度为20bp，GC含量40％-60％，产物长度200bp，产物的Rating>80，尽量不含发夹结构、引物二聚体或交叉二聚体。
7.根据权利要求3所述的一种用于鉴定大方线椒和黄平线椒的InDel分子标记引物的开发方法，其特征在于，所述S6的具体操作过程包括如下步骤：
S6-1：采集果形、果实朝向不同的遵辣1号和黄平线椒的辣椒样本；
S6-2：使用天根植物基因组DNA提取试剂盒提取辣椒样本的DNA；
S6-3：用InDel引物，对提取的辣椒样本DNA进行PCR扩增；
PCR扩增的反应体系共12.5μL，包括DNA 0.5μL、10μmol/L的InDel正向引物0.5μL、10μmol/L的InDel反向引物0.5μL、2×PCR反应混合液6.25μL、DNA聚合酶0.15μL和超纯水4.6μL；PCR扩增的程序为：94℃5min；94℃30s，TM℃30s，72℃30s，共35个循环；72℃5min，4℃保存；
S6-4：将扩增好的PCR产物进行3％琼脂糖凝胶电泳，160V电压下1小时，经过凝胶成像获取鉴定胶图，去除无扩增条带和无多态性的InDel标记引物对。
8.根据权利要求3所述的一种用于鉴定大方线椒和黄平线椒的InDel分子标记引物的开发方法，其特征在于，所述S7的具体操作过程包括如下步骤：
S7-1：使用天根植物DNA提取试剂盒提取大方线椒和黄平线椒的DNA；
S7-2：用第二组的InDel引物，对大方线椒和黄平线椒的DNA进行PCR扩增；
PCR扩增的反应体系共12.5μL，包括DNA 0.5μL、10μmol/L的InDel正向引物0.5μL、10μmol/L的InDel反向引物0.5μL、2×PCR反应混合液6.25μL、DNA聚合酶0.15μL和超纯水4.6μL；PCR扩增的程序为：94℃5min；94℃30s，TM℃30s，72℃30s，共35个循环；72℃5min，4℃保存；
S7-3：将扩增好的PCR产物进行3％琼脂糖凝胶电泳，160V电压下1小时，经过凝胶成像获取鉴定胶图，去除无多态性、单个样品扩增条带数大于1的InDel标记引物对。
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