CN111118194B - 石蒜属植物荧光est-ssr分子标记及其应用 - Google Patents

石蒜属植物荧光est-ssr分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及石蒜属植物荧光EST‑SSR分子标记及其应用，属于分子标记技术领域。本发明所述分子标记包括QZ209、QZ155、QZ175和QZ171。本发明所述分子标记QZ209、QZ155、QQZ175、QZ171能够将16个石蒜种完全区分，其中，QZ209的引物的多态位点数达12个，PIC值为0.92，单独应用就可以区分12个石蒜不同种材料，可作为一个十分优良的SSR分子标记，应用于以后的石蒜种分类鉴定工作，为石蒜属资源的保护开发提供科学依据。

Description

石蒜属植物荧光EST-SSR分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及分子标记技术领域，具体涉及石蒜属植物荧光EST-SSR分子标记及其应用。
背景技术
石蒜属(Lycoris spp.)是原产我国的重要的药用和观赏植物，其花色、花型多变，观赏性强，且鳞茎中含有石蒜碱、加兰他敏等多种生物碱，具有治疗重症肌无力、老年痴呆症(阿尔茨海默症Alzheimer’s disease,AD)，抗肿瘤和抗癌等重要作用，经济价值极高。石蒜属植物的花和叶具有很高的观赏价值，易产生变异，种间杂交亲和性高，杂交后代表型多变，形态和色彩变异丰富，由于石蒜属植物种植后需3-5年的时间才能形成一个开花球，仅凭叶片，鳞茎和花的外观形状，颜色和大小进行品种鉴定及分类会出现误差，在销售和生产中易出现混淆现象。因此，需要对石蒜属植物的品种进行早期鉴定。
传统的标记如同工酶、RFLP、RAPD、AFLP等标记技术难以在石蒜属植物育种中提供大量有效的遗传信息，不利于石蒜属植物基因的发掘与利用。基因组SSR标记(gSSR)开发技术的费时费力且成本高等缺点，EST-SSR标记是基于转录组测序的标记，覆盖率高、分布随机、变异广泛、重复性好、不需大量的基因组测序，开发成本降低，引物在物种之间具有的通用性好，位点特异性高，EST作为基因转录本的一部分，更易获得基因表达的信息，可为功能基因的直接鉴定提供重要依据。
将荧光标记应用于EST-SSR分子标记系统，是对现有SSR系统的极大优化，基于毛细管电泳技术的自动荧光检测比银染检测法能更大量、快速、精确的区分相差微小的碱基的片段，数据处理的自动化程度高，更加适用于大规模不同种质的鉴定分类工作。毛细管电泳检测后，能区分小至2bp的差异，并提供准确的谱带信息，这是常规银染或者琼脂糖凝聚检测所不能达到的，EST-SSR荧光标记在大量样本、快速、准确鉴定分析方面具有很大优越性。
目前，已相继在葡萄、大豆、蓝莓和小麦等物种均已开展了EST-SSR标记的研究。与这些物种相比，石蒜属EST-SSR标记开发滞后，目前仅利用少量石蒜EST序列开发了个别SSR引物，标记数量不足，且引物的扩增结果多为染色跑胶获得，没有精确的谱带大小信息，不适用于大量准确的资源分析鉴定。限制了石蒜的资源鉴定和分子遗传学研究。因此，迫切需要获取更多的EST-SSR标记，并对石蒜属资源遗传多样性和系谱认证等方面的精准研究和应用。
发明内容
本发明的目的在于提供石蒜属植物荧光EST-SSR分子标记及其应用。本发明开发了石蒜属的荧光EST-SSR分子标记，提供多态性引物，建立石蒜EST-SSR标记开发和毛细管电泳检测的技术体系，构建指纹图谱数据库，为石蒜属的遗传背景分析和大量、精确鉴定提供更多新的标记，弥补目前石蒜属内EST-SSR标记缺乏的不足。
本发明提供了一种石蒜属植物荧光EST-SSR分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编号为QZ209。
本发明还提供了用于扩增上述技术方案所述的分子标记的引物，所述引物为如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列5’端标记HEX的正向引物QZ209 F和如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的反向引物QZ209 R。
本发明还提供了一组石蒜属植物荧光EST-SSR分子标记，所述分子标记包括QZ209、QZ155、QZ175和QZ171；所述QZ209的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述QZ155的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述QZ175的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述QZ171的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供了用于扩增上述技术方案所述的分子标记的引物，所述引物包括：
如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列5’端标记HEX的正向引物QZ209 F和如SEQ IDNO.6所示核苷酸序列的反向引物QZ209 R。
如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列5’端标记HEX的正向引物QZ155 F和如SEQ IDNO.8所示核苷酸序列的反向引物QZ155 R。
如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列5’端标记FAX的正向引物QZ175 F和如SEQ IDNO.10所示核苷酸序列的反向引物QZ175 R。
和如SEQ ID NO.11所示核苷酸序列5’端标记HEX的正向引物QZ171 F和如SEQ IDNO.12所示核苷酸序列的反向引物QZ171 R。
本发明还提供了上述技术方案所述分子标记或上述技术方案所述引物在鉴别石蒜种中的应用。
优选的是，所述石蒜种为12个，包括长筒石蒜、黄长筒石蒜、中国石蒜、石蒜、玫瑰石蒜、红蓝石蒜、湖北石蒜、乳白石蒜、陕西石蒜、换锦花、香石蒜和短蕊石蒜。
本发明还提供了上述技术方案所述分子标记或上述技术方案所述引物在鉴别石蒜种中的应用。
优选的是，所述石蒜种为16个，包括长筒石蒜、黄长筒石蒜、忽地笑、中国石蒜、石蒜、玫瑰石蒜、红蓝石蒜、湖北石蒜、稻草石蒜、粉稻草石蒜、乳白石蒜、陕西石蒜、换锦花、鹿葱、香石蒜和短蕊石蒜。
优选的是，所述鉴别的PCR反应体系每25μL包括：基因组DNA 1～5μL，3～4pmol正向引物和反向引物各0.5μL，10mM dNTP 0.5μL，10×PCR Buffer2.5μL，25mM MgCl22μL，5UμL-1Taq酶0.2μL，加ddH2O补足25μL；
PCR程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，55～60℃退火30s，72℃延伸30s，10个循环；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，10个循环；72℃延伸6min，4℃保存。
优选的是，所述PCR反应后，还包括采用毛细管电泳法进行荧光检测。
本发明提供了石蒜属植物荧光EST-SSR分子标记。本发明对换锦花，石蒜，中国石蒜，忽地笑，长筒石蒜和香石蒜进行转录测序拼接后得到404481条Unigene，利用perl脚本MISA软件对Unigene中的SSR位点进行分析，设计并合成了30对EST-SSR引物并进行荧光标记，经过PCR扩增、毛细管电泳检测，最终筛选出4个具有高多态性的荧光EST-SSR分子标记。1、经16个石蒜属不同种(变种)资源的筛选，验证了这4个具有多态性的通用型标记，构建了石蒜属核心指纹图谱数据库，为资源的分类鉴定和遗传研究奠定基础。2、本发明将荧光标记应用于EST-SSR分子标记系统，是对现有SSR系统的极大优化，基于毛细管电泳技术的自动荧光检测比银染检测法能更大量、快速、精确的区分相差微小的碱基的片段，数据处理的自动化程度高，更加适用于大规模不同种质的鉴定分类工作。毛细管电泳检测后，能区分小至2bp的差异，这是常规银染检测所不能达到的，EST-SSR荧光标记在大量样本、快速、准确鉴定分析方面的优越性。3、石蒜种质利用EST-SSR荧光标记分析系统，能够构建16个石蒜种的指纹图谱。QZ209、QZ155、QQZ175、QZ171这4对引物组合就可以将16份材料完全区分。引物QZ209的多态位点数达12个，PIC值为0.92，是供试引物中最大，单独应用就可以区分12个石蒜不同种材料，可作为一个十分优良的SSR分子标记，应用于以后的石蒜种分类鉴定工作，为石蒜属资源的保护开发提供科学依据。
附图说明
图1为本发明提供的3个石蒜种在Q209号引物中的毛细管电泳检测图。
具体实施方式
本发明提供了一种石蒜属植物荧光EST-SSR分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编号为QZ209。
本发明还提供了用于扩增上述技术方案所述的分子标记的引物，所述引物为如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列5’端标记HEX的正向引物QZ209 F和如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的反向引物QZ209 R。
本发明还提供了一组石蒜属植物荧光EST-SSR分子标记，所述分子标记包括QZ209、QZ155、QZ175和QZ171；所述QZ209的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述QZ155的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述QZ175的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述QZ171的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明优选用换锦花，石蒜，中国石蒜，忽地笑，长筒石蒜和香石蒜进行转录测序拼接后的404481条Unigene，利用perl脚本MISA软件对Unigene中的SSR位点进行分析。选取30对EST-SSR引物(生工生物工程上海股份有限公司)，用于引物的通用性和多态性筛选。对设计的EST-SSR引物进行荧光标记，经过PCR扩增、毛细管电泳筛选出4个具有高多态性的荧光EST-SSR分子标记。4个石蒜属分子标记的编号为：QZ209、QZ155、QQZ175和QZ171，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供了用于扩增上述技术方案所述的分子标记的引物，所述引物包括：
如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列5’端标记HEX的正向引物QZ209 F和如SEQ IDNO.6所示核苷酸序列的反向引物QZ209 R。
如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列5’端标记HEX的正向引物QZ155 F和如SEQ IDNO.8所示核苷酸序列的反向引物QZ155 R。
如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列5’端标记FAX的正向引物QZ175 F和如SEQ IDNO.10所示核苷酸序列的反向引物QZ175 R。
和如SEQ ID NO.11所示核苷酸序列5’端标记HEX的正向引物QZ171 F和如SEQ IDNO.12所示核苷酸序列的反向引物QZ171 R。
表1 4对SSR引物信息表
Figure BDA0002358064230000051
注：F，正向引物；R，反向引物
4个荧光EST-SSR分子标记QZ209、QZ155、QZ175、QZ171的引物序列如表1所示(引物由上海生工公司合成)，具体分别为：
QZ209
F:GAGGCGAGAGGAGATTGTTG(SEQ ID NO.5，HEX荧光标记)；
R:CCTCTCGTTCTCTTCCACCA(SEQ ID NO.6)；
QZ155
F:AGCGATCGTTTTCCTTTGAA(SEQ ID NO.7，HEX荧光标记)；
R:CGCATGATTTTATTTTGGGG(SEQ ID NO.8)；
QZ175
F:ACTGCAGATGGGCAGCTATT(SEQ ID NO.9，FAM荧光标记)；
R:GTTGAAGAGCTTGTTTCGCC(SEQ ID NO.10)；
QZ171
F:TCACTCACAGATAAAATTAAACACCA(SEQ ID NO.11，HEX荧光标记)；
R:TGATGAGGGGAGTTGGGTAG(SEQ ID NO.12)。
本发明还提供了上述技术方案所述分子标记或上述技术方案所述引物在鉴别石蒜种中的应用。即在石蒜属的资源鉴定和遗传变异水平等的研究中的应用。
在本发明中，所述石蒜种优选为12个，包括长筒石蒜、黄长筒石蒜、中国石蒜、石蒜、玫瑰石蒜、红蓝石蒜、湖北石蒜、乳白石蒜、陕西石蒜、换锦花、香石蒜和短蕊石蒜。在本发明中，所述石蒜种的来源优选为上海市农业科学院石蒜属种质资源圃采集额石蒜属12个种(变种)材料，选择幼嫩的叶片取样，取样后置于-70℃保存备用。
在本发明中，所述鉴别的PCR反应体系每25μL包括：基因组DNA 1～5μL，3～4pmol正向引物和反向引物各0.5μL，10mM dNTP 0.5μL，10×PCR Buffer 2.5μL，25mM MgCl22μL，5UμL-1Taq酶0.2μL，加ddH2O补足25μL；
PCR程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，55～60℃退火30s，72℃延伸30s，10个循环；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，10个循环；72℃延伸6min，4℃保存。
PCR反应结束后，本发明优选还包括采用毛细管电泳法进行荧光检测，即将PCR产物利用上海生工公司进行毛细管电泳仪检测(3730XL型仪器，美国ABI公司)，对样品数据用GENEMAPPER4.0分析，利用NTSYS 2.10软件计算SSR位点的多态性信息含量(polymorphisminformation content，PIC)，PopGen软件分析数据获得引物的扩增带型、多态性位点百分率、位点杂合多态性，根据毛细管电泳得到的数据结果，构建石蒜属的指纹图谱数据库。具体的，本发明采用毛细管电泳进行荧光检测优选包括以下步骤：取96孔反应板，使用记号笔标明板名、实验日期；制作电子版毛细管电泳检测表，并自动生成上机表；使用连续加样器，吸取990μL HIDI和10μL ROX500或LIZ500的混合物，加入到96孔反应板中，每孔10μL。将96孔板置于平板离心机中，离心500g即停；使用12排10μL排枪，对照毛细管电泳检测表，在96孔板对应的孔中加入50pg的样品；将96孔板置于平板离心机中，离心500g即停；使用封板膜密封96孔板，振荡，将96孔板置于平板离心机中，离心500g即停；置于PCR仪；变性程序为98℃，5min，不加热热盖，程序结束后立即将96孔板置于冰水混合物上急速冷却；将96孔板置于平板离心机中，离心2000g即停；使用毛细管电泳检测仪(3730XL型仪器，美国ABI公司)进行监测，对样品数据用GENEMAPPER4.0分析。
本发明还提供了上述技术方案所述分子标记或上述技术方案所述引物在鉴别石蒜种中的应用。即在石蒜属的资源鉴定和遗传变异水平等的研究中的应用。在本发明中，所述石蒜种的来源优选为上海市农业科学院石蒜属种质资源圃采集的石蒜属16个种(变种)材料，选择幼嫩的叶片取样，取样后置于-70℃保存备用。
在本发明中，所述石蒜种优选为16个，包括长筒石蒜、黄长筒石蒜、忽地笑、中国石蒜、石蒜、玫瑰石蒜、红蓝石蒜、湖北石蒜、稻草石蒜、粉稻草石蒜、乳白石蒜、陕西石蒜、换锦花、鹿葱、香石蒜和短蕊石蒜。
在本发明中，所述鉴别的PCR反应体系、程序以及后续的毛细管电泳法进行荧光检测操作同上文所述，在此不再赘述。
下面结合具体实施例对本发明所述的石蒜属植物荧光EST-SSR分子标记及其应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
石蒜EST-SSR标记引物的设计
开发引物所用的石蒜属EST-SSR序列来自前期用换锦花，石蒜，中国石蒜，忽地笑，长筒石蒜和香石蒜进行转录测序拼接后的404481条Unigene，利用perl脚本MISA软件对Unigene中的SSR位点进行分析。引物设计完成以后，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，共合成30对EST-SSR引物，其中，部分引物(表2提供实施例和比较例中具体涉及到的引物序列即可，包括QZ155,QZ171,QZ173,QZ175,QZ177,QZ203,QZ207,QZ209,QZ211)序列见表2：
表2石蒜属植物EST-SSR引物
Figure BDA0002358064230000081
实施例2
石蒜EST-SSR标记的筛选，遗传多样性分析和毛细管电泳检测
石蒜EST-SSR标记的筛选和毛细管电泳结果
利用MISA得出的SSR位点信息，结合Primer3.0批量设计SSR引物，从中挑选30对进行引物的有效性和多态性筛选。对其中扩增效果好，有清晰条带的引物，合成荧光标记EST-SSR引物，在不同种间进行多态性分析。
利用4对石蒜EST-SSR引物，对16个种的样品进行分析，经过优化后的退火温度和扩增片段大小见表3。合成荧光标记引物，用荧光标记引物进行PCR，反应体系为25μL，包括成分为：1μL基因组DNA，3.2pmol(各0.5μL)正向、反向引物，10mM(0.5μL)dNTP，2.5μL 10×PCRBuffer，2μL 25mM MgCl2，5UμL-1(0.2μL)Taq酶，加ddH2O补足25μL。
PCR程序如下：95℃预变性3min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，10个循环；95℃变性30s，58度退火30s，72℃延伸30s，10个循环；72℃延伸6min，4℃保存。
引物QZ209扩增片段大小变化范围最大，为199～234bp，引物QZ171扩增片段变化范围最小，为274～278bp(表3)。4对引物在16个种中共扩增出33个多态条带，各引物多态条带数量差异较大，变化范围为5-12，平均每对引物能扩增到8.25个多态性片段，引物QZ209的多态性最高，获得12个多态位点(表3)。
16个石蒜种的4个SSR位点的位点杂合度和多态性信息含量的变化范围分别为0.43～0.81和0.78～0.92，QZ209多态性信息含量最高(表4)。
图1为3个石蒜种用引物QZ209扩增检测图示例，其中，3个石蒜种在QZ209引物中的毛细管电泳检测图：A为短蕊石蒜，B为黄长筒石蒜，C为换锦花。短蕊石蒜在218，221，234bp处为三峰扩增片段，扩增DNA产物的相对数量为679，766，569；黄长筒石蒜在221bp和224bp处有双峰扩增片段，扩增DNA产物的相对数量分别为1504和1638；换锦花在215bp为单一扩增片段，扩增DNA产物的相对数量为3064。
表3 4对石蒜SSR引物的多态性检测
Figure BDA0002358064230000091
Figure BDA0002358064230000101
表4 16个石蒜种在4个SSR位点上的遗传多样性
Figure BDA0002358064230000102
实施例3
利用毛细管电泳建立16个石蒜种的指纹图谱库
用筛选出的4对荧光EST-SSR引物对16个石蒜种进行扩增，准确获得不同材料在不同位点的等位基因的片段大小(表5)。例如：石蒜在SSR位点QZ209处的扩增片段大小为206，212和218bp。每对引物的扩增带型为4-13个，平均为8.2个。根据4对核心引物扩增结果的峰图，准确读出条带的大小，可以将所有种区分开，4对引物组合(QZ209、QZ155、QQZ175、QZ171)就可以将16个种完全区分(表5)。其中引物QZ209的多态位点数达12个，可以区分：长筒石蒜，黄长筒石蒜，中国石蒜，石蒜，玫瑰石蒜，红蓝石蒜，湖北石蒜，乳白石蒜，陕西石蒜，换锦花，香石蒜，短蕊石蒜。16个石蒜种的SSR指纹图谱互不相同，可以作为各种特定的图谱，为种质资源鉴别提供依据。
表5 16个石蒜种的指纹图谱
Figure BDA0002358064230000103
Figure BDA0002358064230000111
对比例1
提供筛选过程中另外五对引物的案例作为对比(对比中包含了本发明保护的4对引物，一共9对引物)：
利用MISA得出的SSR位点信息，结合Primer3.0批量设计SSR引物，从中挑选30对进行引物的有效性和多态性筛选。对其中扩增效果好，有清晰条带的引物，合成荧光标记EST-SSR引物，在不同种间进行多态性分析。
利用9对石蒜SSR引物，对16个种的样品进行分析，经过优化后的退火温度和扩增片段大小见表6。引物QZ211扩增片段大小变化范围最大，为154～235bp，引物QZ171扩增片段变化范围最小，为274～278bp(表6)。9对引物在16个种中共扩增出57个多态条带，多态位点率为100％，各引物多态条带数量差异较大，变化范围为3-12，平均每对引物能扩增到6.33个多态性片段，引物QZ209的多态性最高，获得12个多态位点(表6)。
16个石蒜种的9个SSR位点的位点杂合度和多态性信息含量的变化范围分别为0.25～0.81和0.41～0.92，平均值分别为0.45和0.74。QZ209多态性信息含量最高，QZ173最低(表7)。
表6 9对石蒜SSR引物的多态性检测
Figure BDA0002358064230000121
表7 16个石蒜种在9个SSR位点上的遗传多样性
Figure BDA0002358064230000122
用筛选出的9对SSR荧光引物对16个石蒜种进行扩增，准确获得不同材料在不同位点的等位基因的片段大小(表8)。例如：石蒜在SSR位点QZ209处的扩增片段大小为206，212和218bp。每对引物的扩增带型为4-13个，平均为8.2个。根据9对核心引物扩增结果的峰图，准确读出条带的大小，可以将所有种区分开，最少只用4对引物组合(QZ209、QZ155、QQZ175、QZ171)就可以将16个种完全区分(表8)。其中引物QZ209的多态位点数达12个，可以区分：长筒石蒜，黄长筒石蒜，中国石蒜，石蒜，玫瑰石蒜，红蓝石蒜，湖北石蒜，乳白石蒜，陕西石蒜，换锦花，香石蒜，短蕊石蒜。16个石蒜种的SSR指纹图谱互不相同，可以作为各种特定的图谱，为种质资源鉴别提供依据。
相比QZ209、QZ155、QQZ175、QZ171这4对引物，其余五对引物扩增后多态性效果较差，对不同种类的区分度较小。例如引物177，多态性位点数只有4个，位点杂合度低，只有0.25，不同种质资源用毛细管电泳扩增后，谱带数据非常接近，如红蓝石蒜，湖北石蒜，稻草石蒜，粉稻草石蒜，乳白石蒜等种类的扩增条带一致，无法区分，因此本发明筛选出的高多态性引物具有良好的多态性和适用性。
表8 16个石蒜种的指纹图谱
Figure BDA0002358064230000131
Figure BDA0002358064230000141
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 上海市农业科学院
<120> 石蒜属植物荧光EST-SSR分子标记及其应用
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 215
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaggcgagag gagattgttg cgcgaaattc agcgccgaaa agtcactccg ccgccgccgc 60
cgccgccgat tccggtggcc attccggtgg cggttctggc aaatctctgc ggatcgccgt 120
cgaattcggg tgaagagcag ctcatctcat cgaactctcc gccgccgcca aatttggcgg 180
gaagctcatc ggatgtggtg gaagagaacg agagg 215
<210> 2
<211> 242
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agcgatcgtt ttcctttgaa tatagttccc catcatctca tctctctctc tctcacatac 60
attaatatat tgatttggtt attgactctg ttgcttgaca tttgcattta tttggaaaat 120
ttgtaccacc ccctcttcca cacaaaaaaa agaaaaaaga aaaaaagaaa aaaagaaaag 180
aaaagaaaaa tactggtcca ccaccaccac caccaccacc aaccccaaaa taaaatcatg 240
cg 242
<210> 3
<211> 222
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
actgcagatg ggcagctatt gcttcttacc tcccagagag aacagacaat gacatcaaga 60
actactggaa cactcatctc aaaagaaagc tccaaaatct tcaaggtaac aacaacaaca 120
acaacaacaa caaatcaagt gaatataatc aacaaacccc caaaggccaa tgggagagga 180
ggctacaaac tgatattaac atggcgaaac aagctcttca ac 222
<210> 4
<211> 276
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcactcacag ataaaattaa acaccaaaaa attacgagcc tctctctctc ttttctcctc 60
ttccaaaccc aaaaacattg caaatattgc ccaaaaaatt tcctagtctt catcatggct 120
tctatttctt cccctaaacc catcacaaat tatcactaaa cccttcaaaa tcaccatcta 180
aactatcaag aatacattgc tcatcgtctc cgaatccgct cctcgacctc ccaatccaat 240
acccaccatc ctgtaactac ccaactcccc tcatca 276
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaggcgagag gagattgttg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cctctcgttc tcttccacca 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agcgatcgtt ttcctttgaa 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cgcatgattt tattttgggg 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
actgcagatg ggcagctatt 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gttgaagagc ttgtttcgcc 20
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tcactcacag ataaaattaa acacca 26
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgatgagggg agttgggtag 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
catcccaatt ctcctagcca 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cgtgggtctt gaggaagaag 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tggtcactca tagcaggcag 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
agattaagat ccgggcgtct 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gatcggctat ccgaattgaa 20
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ttttatgaaa ctctgcttca cagc 24
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ttaacacctg ctaacgtgcg 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
atccgagaac ttcgactcca 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ttcctctctc cctccctctc 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
cacattcaca ccaccaccat 20

Claims (3)

1.一种检测石蒜属植物荧光EST-SSR分子标记来鉴别石蒜种的方法，所述方法包括进行PCR反应，PCR反应后，采用毛细管电泳法进行荧光检测；所述PCR的引物为如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列5’端标记HEX的正向引物QZ209 F和如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的反向引物QZ209 R；所述石蒜种为12个，包括长筒石蒜、黄长筒石蒜、中国石蒜、石蒜、玫瑰石蒜、红蓝石蒜、湖北石蒜、乳白石蒜、陕西石蒜、换锦花、香石蒜和短蕊石蒜。
2.一种检测一组石蒜属植物荧光EST-SSR分子标记来鉴别石蒜种的方法，所述方法包括进行PCR反应，PCR反应后，采用毛细管电泳法进行检测；所述PCR的引物由：
如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列5’端标记HEX的正向引物QZ209 F和如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的反向引物QZ209 R；
如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列5’端标记HEX的正向引物QZ155 F和如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的反向引物QZ155 R；
如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列5’端标记FAM的正向引物QZ175 F和如SEQ ID NO.10所示核苷酸序列的反向引物QZ175 R；
和如SEQ ID NO.11所示核苷酸序列5’端标记HEX的正向引物QZ171 F和如SEQ IDNO.12所示核苷酸序列的反向引物QZ171 R组成；
所述石蒜种为16个，包括长筒石蒜、黄长筒石蒜、忽地笑、中国石蒜、石蒜、玫瑰石蒜、红蓝石蒜、湖北石蒜、稻草石蒜、粉稻草石蒜、乳白石蒜、陕西石蒜、换锦花、鹿葱、香石蒜和短蕊石蒜。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述鉴别的PCR反应体系每25μL包括：基因组DNA 1~5μL，3~4 pmol正向引物和反向引物各0.5μL，10 mM dNTP 0.5μL，10×PCRBuffer 2.5μL，25 mM MgCl2 2μL，5UμL-1 Taq 酶0.2μL，加ddH2O补足25μL；
PCR程序为：95℃预变性3 min；95℃变性30 s，55~60℃退火30 s，72℃延伸30 s，10个循环；95℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，10个循环；72℃延伸6 min，4℃保存。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111705155B (zh) * 2020-07-13 2022-10-04 浙江农林大学 Est-ssr标记鉴定换锦花和中国石蒜杂交种方法和引物
CN112746119B (zh) * 2020-11-06 2022-02-15 江苏省中国科学院植物研究所 一套石蒜育性相关est-ssr标记的开发与应用
CN113265481B (zh) * 2021-04-26 2022-02-22 浙江农林大学 石蒜属荧光est-ssr分子标记引物和鉴定石蒜属种间杂交种f1代的方法及其应用
CN115631796B (zh) * 2022-10-13 2024-04-09 济宁市农业科学研究院 大蒜生物指纹图谱构建和识别方法、终端设备及存储介质
CN117947210A (zh) * 2024-03-27 2024-04-30 江西农业大学 一种石蒜基因组探针制备及其基因组原位杂交方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991006311A1 (en) * 1989-10-25 1991-05-16 Scottish Crop Research Institute Anti-viral material
CN101988063A (zh) * 2010-11-09 2011-03-23 安徽师范大学 石蒜微卫星分子标记
CN104894109A (zh) * 2015-04-21 2015-09-09 浙江省农业科学院 Est-ssr标记引物组合及筛选方法对菜用、粮用和野生大豆遗传多样性分析和鉴定
CN108359740A (zh) * 2018-04-28 2018-08-03 江苏省中国科学院植物研究所 基于忽地笑转录组序列开发est-ssr分子标记及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991006311A1 (en) * 1989-10-25 1991-05-16 Scottish Crop Research Institute Anti-viral material
CN101988063A (zh) * 2010-11-09 2011-03-23 安徽师范大学 石蒜微卫星分子标记
CN104894109A (zh) * 2015-04-21 2015-09-09 浙江省农业科学院 Est-ssr标记引物组合及筛选方法对菜用、粮用和野生大豆遗传多样性分析和鉴定
CN108359740A (zh) * 2018-04-28 2018-08-03 江苏省中国科学院植物研究所 基于忽地笑转录组序列开发est-ssr分子标记及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Development of 16 polymorphic simple sequence repeat markers for Lycoris longituba from expressed sequence tags";QIULING HE et al.;《Molecular Ecology Resources》;20080930;第9卷;第278-280页 *
"换锦花EST-SSR标记开发及遗传多样性分析";石艳等;《核农学报》;20180608;第32卷(第6期);摘要，第1090页左栏第2段至1093段左栏第1段 *
"长筒石蒜叶片发育生物学研究";李虹颖;《万方学位论文》;20080925;第1-97页 *

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