CN108359740A - 基于忽地笑转录组序列开发est-ssr分子标记及其应用 - Google Patents
基于忽地笑转录组序列开发est-ssr分子标记及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一套基于忽地笑转录组序列开发的EST‑SSR分子标记，包括20对引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1~40所示。本发明的20对EST‑SSR标记的引物根据转录组序列设计，并通过基因组DNA扩增测序验证为明确的SSR标记，具有多态性丰富、扩增稳定、重复性好、共显性和易于检测等优点，能够更好的区分忽地笑遗传种质的多样性。本组标记填补了忽地笑特异共显性标记的缺乏，可用于忽地笑种质资源遗传多样性、品种纯度鉴定、品种遗传系谱分析和辅助育种等领域，可以大大促进忽地笑种质资源的研究和应用开发。
Description
技术领域
本发明涉及分子标记技术，具体涉及20个忽地笑EST-SSR分子标记及其应用。
背景技术
忽地笑为石蒜科(Amaryllidaceae)石蒜属多年生草本植物，具有重要的药用价值和观赏价值。其不仅含有石蒜碱(lycorine)、加兰他敏(galanthamine)、水仙环素(narciclasine)等多种具有特定药理活性的石蒜科生物碱，还具有重要的观赏价值，夏可观花，秋可观叶。而不同来源的忽地笑种质资源存在极大的差异，不仅表现在外部形态和染色体核型方面存在极大的差异，而且在生物碱含量上也存在差异。利用分子标记开展忽地笑种质资源的指纹图谱分析，不仅能够调查忽地笑种质资源的多样性，而且对于今后忽地笑种质资源高效利用和开发具有重要的意义，比如高生物碱含量的忽地笑种质，或者抗逆性性强、适应性强的适用于园艺推广的忽地笑种质。而目前应用于忽地笑资源多样性分析的分子标记为：ISSR、RAPD等非特异性的标记，上述标记稳定性差、重复性差，而且为显性标记，不能识别杂合子位点，不适用于杂种鉴定。因此迫切需要开发忽地笑稳定、特异的共显性标记。
简单重复序列(Simple Sequence Repeat,SSR)，广泛存在于真核生物的基因组中，数量众多，具有重复性高、共显性和易于检测的优点，被广泛应用于种质资源亲缘关系鉴定、品系纯度鉴定和分子标记辅助育种等工作中。SSR标记不仅可以来源于基因组，还可从表达序列标签(Express Sequence Tag,EST)库或转录组测序数据中挖掘，称之为EST-SSR。与基因组来源SSR相比,EST-SSR开发相对容易。而随着越来越多植物转录组测序的完成，EST-SSR 的开发越来越便捷。目前，忽地笑尚无特异性的分子标记，因此，开发忽地笑EST-SSR标记，已成为忽地笑种质资源研究以及今后忽地笑品种改良上迫切需要解决的问题。
发明内容
本发明的一个目的在于提供20个基于忽地笑转录组序列设计并得到测序验证的EST-SSR标记。提供忽地笑特异的分子标记，可利用到忽地笑种质多样性分析和品种鉴别等工作中，填补了忽地笑中缺乏特异性分子标记的不足。本发明提供了20个忽地笑EST-SSR分子标记，所述忽地笑EST-SSR标记分别是20组引物对。
其序列依次如SEQ ID NO.:1至SEQ ID NO.:40。
表1忽地笑EST-SSR引物特征(SEQ ID NO.:1～40)
本发明的20个忽地笑EST-SSR标记是通过以下方法得到的：
(1)根据忽地笑转录组测序分析得到忽地笑EST序列，用MISA软件寻找SSR位点，合成引物；
(2)用CTAB(十六烷基三乙基嗅化铵，Hexadecyl trimethyl ammonium bromide)法提取忽地笑基因组DNA；
(3)采用SSR分子标记方法进行忽地笑分子标记的筛选：以忽地笑基因组DNA为模板进行PCR扩增：在20μL反应体系中分别加入10x Taq Buffer(含Mg2+)，1.6μL的2.5nMdNTP，5units/μL Taq DNA polymerase 0.1μL，正向引物4pmol，反向引物4pmol，10ng/μLDNA 模板lμL，ddH2O补充体系至20μL；使用Eppendorf Mastercycler进行DNA扩增，具体步骤为：94℃预变性3min，然后94℃(30S)/58℃(30s)/72℃(30S)循环35次，最后72℃延伸10min；产物检测：在含有0.5％pg/μL EB的2％的琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下观察并照相记录结果；
(4)挑选条带清晰与目的产物预期大小一致的条带回收，并与pclone007载体连接，转化top10感受态，筛选阳性克隆送生工测序，验证获得上述20个EST-SSR标记；
(5)将上述20对引物应用于忽地笑种质多样性分析，使用Popgene32软件分析结果。
本发明的另一个目在于上述EST-SSR标记用于忽地笑种质资源遗传多样性分析。
本发明通过忽地笑转录组测序得到EST序列，用MISA软件寻找SSR位点，设计并合成引物，以忽地笑为模板进行PCR扩增、测序，获得20个未被报道的具有高多态性的 EST-SSR标记。本发明的有益之处是：(1)本发明的20个分子标记，基于EST序列，并通过忽地笑基因组DNAPCR扩增和测序验证为明确的包含简单重复序列的SSR标记，是稳定存在的一组忽地笑特异性标记，利用上述标记在7个忽地笑群体材料中进行遗传多样性分析，聚类结果与种源地一致(图1)，可以直接将本发明所提供的20对引物应用于更多忽地笑材料上，进行种质资源遗传多样性分析。(2)本发明的20个分子标记是得到测序验证的，可应用于忽地笑品系纯度鉴定、遗传多样性分析、杂种鉴定以及分子辅助选育等工作。
附图说明
图1为基于20个EST-SSR标记构建的7个忽地笑种群(包含12个个体)的遗传相似系数的UPGMA聚类图。
图2为部分EST-SSR引物扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果，Marker为DL2000。
图3为部分EST-SSR引物在12个忽地笑材料中的扩增产物的PAGE电泳图。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
实例1：20个由忽地笑转录组开发的SSR标记是通过下述方法得到的：
(1)根据忽地笑转录组测序结果得到EST序列，使用软件Microsatellite(MISA)找出其中的SSR序列并设计引物，引物设计的原则为PCR产物长度100-350bp；GC含量40-70％，最适为50％；退火温度50-65℃；引物长度：19-22bp，引物委托上海生工生物工程有限公司合成；
(2)采忽地笑幼嫩叶片，忽地笑种质资源信息如表2所示，采用百泰克植物基因组DNA快速提取试剂盒提取待测样品的DNA，操作参照试剂盒说明书进行，获得的DNA，稀释50倍，用分光光度计法检测DNA浓度，用电泳法检测质量，调整DNA浓度为10ng/μL，作为工作液备用，其余DNA母液保存于-20℃；
表2忽地笑种质资源信息
(3)选取(2)中1号种子苗DNA工作液为模板，进行进行PCR扩增，在20μL反应体系中分别加入2.0μL的10x Taq Buffer(含Mg2+)，1.6μL的2.5nM dNTP,5units/μL Taq DNApolymerase 0.1μL，正向引物4pmol，反向引物4pmol，10ng/μL DNA模板lμL，ddH2O补充体系至20μL。使用Eppendorf Mastercycler进行DNA扩增，具体反应程序为：94℃预变性 3min，然后94℃(30S)/58℃(30s)/72℃(30S)循环35次，最后72℃延伸10min。
(4)步骤(3)中的PCR产物在含有0.5％pg/μL EB的2％的琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下观察并照相记录结果,挑选条带清晰与目的产物大小差不多的条带(部分引物扩增检测结果见图2)，在UV2下用刀片切取凝胶，采用Axygene的凝胶回收试剂盒回收，具体操作按照说明书进行，获得的回收产物，通过电泳检测浓度后备用；
(5)步骤(4)中的回收产物与pclone007simple Vector连接，连接反应按照说明书进行；
(6)将步骤(5)中的连接产物，与100μLtop10感受态细胞混匀，冰上静置30min，于42℃水浴热击45～90S，冰上静置2～5min，加入300μL液体LB培养基，37℃，120～150rpm/min复苏培养1h，后均匀涂布于氨苄浓度为：100mg/L的LB固体平板上，37℃培养16h；
(7)将步骤(6)中培养好的LB平板取出，挑取阳性克隆，接种于含有100mg/L氨苄的LB 液体培养基中，37℃，2000rpm/min培养5h，进行菌落PCR，PCR反应体系为：10x TaqBuffer(含 Mg2+)2μL，1.6μL的2.5nM dNTP,5units/μL Taq DNA polymerase 0.1μL，载体通用引物M13F 4pmol，M13R 4pmol，菌液1μL，ddH2O补充体系至20μL。使用EppendorfMastercycler进行 DNA扩增，具体反应程序为：95℃预变性5min，然后95℃(30S)/56℃(30s)/72℃(30S)循环30次，最后72℃延伸10min；
(8)将步骤(7)中的PCR产物在含有0.5％pg/μL EB的2％的琼脂糖凝胶上电泳，确定是否为阳性克隆，将阳性克隆的菌液送生工测序，测序结果利用Bioedit软件中ClustalW比对引物与测序结果，从而验证其中的简单重复序列，最终获得上述20个EST-SSR标记。
表3忽地笑EST-SSR标记特征
实例2：20个EST-SSR标记应用于表2中忽地笑材料的遗传多样性分析
(1)提取表2中忽地笑材料的基因组DNA，调整DNA浓度至10ng/μL；
(2)以上述DNA为模板，利用序列表1中SEQ ID NO.1～40所示引物进行PCR扩增，在20μL反应体系中分别加入2.0μL 的10x Taq Buffer(含Mg2+)，1.6μ的2.5nMdNTP,5units/μLTaq DNA polymerase 0.1μL，正向引物4pmol，反向引物4pmol，10ng/μL DNA模板lμL，ddH2O补充体系至20μL。使用Eppendorf Mastercycler进行DNA扩增，具体反应程序为：94℃预变性3min，然后94℃(30S)/58℃(30s)/72℃(30S)循环35次，最后72℃延伸10min；
(3)将步骤(2)中的PCR扩增产物采用8％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，电压180V，电泳4h～5h，通过银染显色见图3(部分引物PAGE电泳结果)，统计检测结果；
(4)将步骤(3)中统计的结果，按照Popgene32要求的格式导入软件，进行忽地笑种质资源遗传多样性分析。
(5)聚类分析见图1，结果显示，湖南省郴州市苏仙区种子苗与其来源群体聚为一支，进而与其他来源于湖南郴州市苏仙区的忽地笑聚为一大群，网购不详来源的材料与湖南省郴州市万华岩的材料聚为一支，亲缘关系较近，此6组材料聚为一大群。结果表明湖南省郴州市的材料聚为一支，而湖南省怀化市的独立一支，聚类结果与种质来源关系一致，说明这20 对引物可以用于忽地笑种质资源遗传多样性分析和亲缘关系的研究中。
需要特别说明的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏省中国科学院植物研究所
<120> 基于忽地笑转录组序列开发EST-SSR分子标记及其应用
<160> 40
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<400> 39
<210> 40
<211> 3
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(23)
<223> CGGGTGATTAAAACGGTAGTGTA
<400> 40
Claims (6)
1.一种忽地笑EST-SSR标记，其特征在于，该标记是一组引物对，其序列如SEQ ID NO:1~40所示。
2.根据权利要求1所述的基于忽地笑转录组序列开发的EST-SSR引物组在忽地笑种质资源遗传多样性分析中的应用。
3.根据权利要求1所述的基于忽地笑转录组序列开发的EST-SSR引物组在忽地笑品种遗传系谱中的应用。
4.根据权利要求1所述的基于忽地笑转录组序列开发的EST-SSR引物组在忽地笑品系纯度鉴定中的应用。
5.利用权利要求1所述基于忽地笑转录组序列开发的EST-SSR核心引物组进行忽地笑种质资源遗传多样性分析、忽地笑品种遗传系谱或忽地笑品系纯度鉴定的方法，包括如下步骤：
(1) 提取待测忽地笑样品基因组DNA；
(2) 以步骤(1)提取的待测样品DNA为模板，利用序列表SEQ ID NO.1~ 40所示引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
(3) 将步骤(2)的PCR扩增产物采用凝胶电泳检测，统计检测结果；
(4) 利用步骤(3)的统计结果进行忽地笑种质资源遗传多样性分析、忽地笑种质遗传系谱或忽地笑种质纯度鉴定。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述忽地笑种质资源遗传多样性分析、忽地笑品种遗传系谱或品系纯度分析方法为：使用使用Popgene软件基于UPGMA法的聚类分析。
Priority Applications (1)
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