CN105274198A - 一种基于转录组测序开发鸟巢蕨est-ssr引物的方法 - Google Patents

一种基于转录组测序开发鸟巢蕨est-ssr引物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种基于转录组测序开发鸟巢蕨EST-SSR引物的方法，其包括如下步骤：1)构建转录组文库；2)转录组数据的获得，利用Trinity软件对测序数据进行拼接，将序列拼接成一个完整的转录组；3)SSR位点查找：结合Perl编程语言方法，对大量序列信息进行批量处理，进行SSR位点查找；4)批量设计EST-SSR引物。选择不同的蕨菜材料对设计的SSR引物进行验证，若有条带检测出，即为成功的SSR引物。应用本方法成功地设计了4063对SSR引物，为鸟巢蕨EST-SSR引物开发进而实现分子标记辅助选择育种提供了新的方法和思路。

Description

一种基于转录组测序开发鸟巢蕨EST-SSR引物的方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种基于转录组测序开发鸟巢蕨EST-SSR引物的方法。
背景技术
蕨类植物(Fern)又称羊齿植物，在形态结构和环境的适应能力方面，介于苔藓植物和种子植物之间的一大过渡植物类群，在植物进化系统中占有重要的地位。鸟巢蕨(AspleniumnidusL.)属真蕨目(Eufilicales)铁角蕨科(Aspleniaceae)巢蕨属(Asplenium)，不仅是居室观叶植物的重要组成部分和作为地被植物被用于构建多样化的园林景观，还具有较高的食用价值和药用价值。鸟巢蕨在热带森林生态系统中也发挥着重要作用，体现在对森林生态系统的水分与养分循环的调节、丰富并维持森林生物多样性等方面。虽然鸟巢蕨具有一定的经济价值和生态价值，但其分子生物学研究进展缓慢。
分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，在DNA水平上反映植物遗传基础的差异，是植物遗传育种领域内的一项新技术。简单重复序列(Simplesequencerepeat，SSR)是一类由1～6个核苷酸为基本单位的串联重复DNA序列，分布于真核生物基因组的编码区和非编码区。与其它分子标记技术相比，SSR标记具有多态性高、重复性好、信息量大、共显性遗传等特点，且成本低、检测容易、操作简单，被广泛应用于植物遗传育种研究。然而使用该技术的前提是要有相应的SSR标记，首先要从研究材料中获取重复序列两侧的序列信息，设计引物后才能被利用。根据序列性质不同，SSR标记可分为基因组SSR(GenomicSSR，gSSR)和表达序列标签SSR(ExpressedsequencetagSSR，EST-SSR)。EST-SSR是基于EST序列开发的SSR标记，避免了SSR引物开发过程中的克隆和测序步骤，充分利用现有转录组测序数据开发标记，具有成本低、效率高等优点。EST-SSR标记来源于基因组中的表达序列，直接反映基因的表达信息，在不同物种间具有良好的通用性。
近年来，快速增长的EST数据为开发EST-SSR标记提供了快速、有效和廉价的途径。随着第二代高通量测序技术的成熟，转录组测序产生的EST序列数量与日俱增，这为SSR标记的开发提供了更丰富的可利用数据资源。由于高通量测序产生的数据量极其巨大，需要对大量EST序列进行格式处理、剔除冗余序列等仍是一个很大的工作量。Perl是一种自由且功能强大的编程语言，被用作Web编程、数据库处理、XML处理以及系统管理等。随着生物信息学的发展，Perl被应用到了生物数据的操作和检索中，使得对大批量数据统一处理成为了可能。在此基础上进行EST-SSR引物开发更能提高查找效率，节约时间和减少资金。
目前，鸟巢蕨尚无全基因组序列信息，关于其SSR引物数量非常有限。对于无参考基因组的物种来说，采用高通量测序技术对其转录组进行分析，将测序所得的序列拼接成转录本，以转录本作为参考序列，进行后续分析。因此，利用第二代高通量测序技术获得鸟巢蕨转录组序列信息，批量开发EST-SSR引物，将会对蕨类种质资源鉴定、遗传多样性、重要性状基因定位及分子标记辅助选择育种等起重要推动作用。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种基于转录组测序开发鸟巢蕨EST-SSR引物的方法。
为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种基于转录组测序开发鸟巢蕨EST-SSR引物的方法，其包括以下步骤：
1)构建转录组文库：提取鸟巢蕨叶片总RNA，分离mRNA，反转录合成并纯化cDNA，末端修复、加腺嘌呤核苷连接测序接头，通过琼脂糖凝胶电泳回收大小为200～700bp的片段，将回收片段进行PCR扩增，即构建得到转录组文库；
2)转录组数据的获得：将步骤1)得到的转录组文库用IlluminaHiSeqTM2000平台进行测序，采用Illumina双末端测序方法，获得转录组测序数据；利用Trinity软件对测序数据进行拼接，将序列拼接成一个完整的转录组；
3)SSR位点查找：
安装Perl语言，从http://pgrc.1pk-gatersleben.de/misa下载est_trimmer.pl并运行以去除所述转录组序列中小于100bp的短序列和大于2000bp的长序列；
从http://www.bioinformatics,org/cd-hit/中下载CD_HIT软件，利用其去除冗余序列；
从http://pgrc.1pk-gatersleben.de/misa下载使用MISA软件以查找和定位序列中SSR位点，参数设置如下：单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸的重复次数至少为10、8、5、4、3和3；
4)设计EST-SSR引物：
使用软件primer3.0
http://sourceforge.net/projects/primer3/files/primer3/l.1.4/primer3-1.1.4-WINXP.zip/download批量设计SSR引物，设定标准为：引物长度为18～23bp，GC含量为40％～60％，Tm值55℃～65℃，并且上下游引物Tm值相差不超过5℃，产物大小为150～400bp。
步骤1)中所述的测序接头为：
5′RNAAdapter:5′-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-3′；
3′RNAAdapter:5′-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3′。
上述方法中还包括以下步骤：
5)EST-SSR引物对的有效性和通用性鉴定：
提取蕨类材料的基因组DNA，利用开发的SSR引物进行PCR扩增，采用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测；利用引物开发所用材料的鸟巢蕨基因组DNA进行设计引物有效性PCR鉴定，若能检测到150～400bp扩增片段，说明该引物为有效引物；利用成功扩增的引物对蕨类材料的基因组DNA进行PCR扩增，用于聚类分析验证整个体系的有效性和通用性。
具体地，步骤5)中所述PCR鉴定的反应体系总体积为20μL，其中包括10×PCR缓冲液、25mmol/LMg2+、2.5mmol/LdNTPs、10μmol/LSSR引物、60ng基因组DNA、TaqDNA聚合酶及ddH2O；PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，50-60℃退火45s，72℃延伸1min，32个循环；72℃延伸10min；4℃保存；反应结束后，PCR产物加入2μLLoadingbuffer，采用8％聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，电泳缓冲液为1×TBE，160V稳压电泳1h，至Loadingbuffer移到凝胶底部时电泳结束；采用银染法染色，最后将凝胶置于凝胶成像系统上拍照；对电泳图谱上有差异且易识别的多态性条带，在同一迁移位置上观察扩增条带的有无：实验数据的统计采用“0”，“1”矩阵的统计方法，即在胶板上有清晰条带记为“1”，在胶板上没有清晰条带则记为“0”，缺失的记为“2”；统计结果生成矩阵后，使用NTSYS-pc2.10e软件进行数据处理，计算品种对之间的遗传相似系数，并获得相似系数矩阵。用SHAN程序中的UPGMA方法进行聚类分析，得到遗传聚类图。
具体地，步骤5)中所述的蕨类材料选自鸟巢蕨、狼尾蕨、铁线蕨、铁角蕨、凤尾蕨、富贵蕨、波士顿蕨、肾蕨、扇蕨、鹿角蕨中的任意一种。
本发明的目的之二在于提供基于转录组测序开发的鸟巢蕨EST-SSR引物，其包括以下的任一对引物：
引物1：正向引物：AGCCACCATCAGCAACAATT(SEQIDN0.1)；反向引物：ACATGAGCAGTTTGGCAC(SEQIDN0.2)；
引物2：正向引物：ATTCGGTCGGTTGGCTAAG(SEQIDN0.3)；反向引物：TTGTGGTGGGTGGATTGC(SEQIDN0.4)；
引物3：正向引物：GCGTCGTTGGTGCTGGATTC(SEQIDN0.5)；反向引物：CGTCGGTGTCGTGCGGTAG(SEQIDN0.6)；
引物4：正向引物：ACTCTCCCCCTCGTTGCTAT(SEQIDN0.7)；反向引物：ATTTAAGGGAGACATCGGGC(SEQIDN0.8)；
引物5：正向引物：GAATTTTTGGTGGCCTGTGT(SEQIDN0.9)；反向引物：ATCACTGCACCGACTTTTGG(SEQIDN0.10)；
引物6：正向引物：CTCGACGAGGAGGCATGATG(SEQIDN0.11)；反向引物：CTCGTTGTGCCGCTTCAATATC(SEQIDN0.12)；
引物7：正向引物：CGCTTCTGCCCGTTCCAG(SEQIDN0.13)；反向引物：CAGCAGCTTTCTTGCCATAGC(SEQIDN0.14)；
引物8：正向引物：AGCTTCCTCTGCTGCAATGAC(SEQIDN0.15)；反向引物：CTTCCAAACTGCACGTCAACAC(SEQIDN0.16)；
引物9：正向引物：ATCGCATGATGCACGTAGAG(SEQIDN0.17)；反向引物：ACATGCATGCCTACCTAATGG(SEQIDN0.18)；
引物10：正向引物：ACACCGCTGCTCAAGAGGATG(SEQIDN0.19)；反向引物：TGCCGCCGCCTGCTATTGC(SEQIDN0.20)；
引物11：正向引物：ATGCCGCCACGACGAAGG(SEQIDN0.21)；反向引物：CGGTGGGCTACTCTCCTATGTC(SEQIDN0.22)；
引物12：正向引物：GTGACGAAGGACGAAGGACAAG(SEQIDN0.23)；反向引物：TGGTGAAGCAGCAAAGAGGAAG(SEQIDN0.24)；
引物13：正向引物：ACTCTCCCCCTCGTTGCTAT(SEQIDN0.25)；反向引物：ATTTAAGGGAGACATCGGGC(SEQIDN0.26)；
引物14：正向引物：CTGGCGGGAAGCGGACTC(SEQIDN0.27)；反向引物：AATGGCGAGACTGTTGGCAATC(SEQIDN0.28)；
引物15：正向引物：TGCTCCATCGCCTGCTCTTG(SEQIDN0.29)；反向引物：CTCCACGACATTCTCCGCCTAG(SEQIDN0.30)；
引物16：正向引物：GCGAATTGAGAGCCATTCAGTAAA(SEQIDN0.31)；反向引物：CACTTCCACCAAATTCAGCTTCAA(SEQIDN0.32)；
引物17：正向引物：CGACAATGGGGTCTTAGCAT(SEQIDN0.33)；反向引物：TGCACACTTAAATTACATCCGC(SEQIDN0.34)。
本发明的目的之三在于提供如上所述的基于转录组测序开发的鸟巢蕨EST-SSR引物在鸟巢蕨分子标记辅助育种中的应用。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1)本发明利用第二代高通量测序技术，获得了大量鸟巢蕨EST序列，极大地增加了引物开发所用的原始数据。
2)本发明利用生物信息学方法进行鸟巢蕨EST-SSR引物的开发，克服了鸟巢蕨SSR引物获取困难的问题，拓宽了鸟巢蕨分子标记辅助育种的思路和领域。
3)在Perl语言的基础上，使用MISA和primer3软件分别批量处理序列数据和开发EST-SSR引物，提高了开发效率，节约了时间和资金。
4)使用不同蕨类材料对设计的EST-SSR引物进行PCR鉴定，结果真实可靠。
5)在本发明基础上，利用EST-SSR分子标记技术进一步开展蕨类植物遗传学研究成为可能，同时还可结合现代分子生物学等手段对蕨类植物进行起源演化、遗传多样性、分子标记辅助选择育种研究等，具有重要的理论意义和现实意义。
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
附图说明
图1为本发明实施例1中建库测序流程示意图；
图2为本发明实施例2中EST-SSR重复基元种类；
图3为本发明实施例3中部分多态性EST-SSR引物在不同蕨类材料中的PCR扩增；
图4为本发明实施例3中利用EST-SSR引物构建的UPGMA聚类图谱。
序列说明：SEQIDN0.1～34为基于转录组测序开发的鸟巢蕨EST-SSR引物；SEQIDN0.35～36为实施例1中所述的接头序列。
具体实施方式
一种基于转录组测序开发鸟巢蕨EST-SSR引物的方法，其包括以下步骤：
1)构建转录组文库：提取鸟巢蕨叶片总RNA，分离mRNA，反转录合成并纯化cDNA，末端修复、加腺嘌呤核苷连接测序接头，通过琼脂糖凝胶电泳回收大小为200～700bp的片段，将回收片段进行PCR扩增，即构建得到转录组文库；
2)转录组数据的获得：将步骤1)得到的转录组文库用IlluminaHiSeqTM2000平台进行测序，采用Illumina双末端测序方法，获得转录组测序数据；利用Trinity软件对测序数据进行拼接，将序列拼接成一个完整的转录组；
3)SSR位点查找：
安装Perl语言，从http://pgrc.1pk-gatersleben.de/misa下载est_trimmer.pl并运行以去除所述转录组序列中小于100bp的短序列和大于2000bp的长序列；
从http://www.bioinformatics,org/cd-hit/中下载CD_HIT软件，利用其去除冗余序列；
从http://pgrc.1pk-gatersleben.de/misa下载使用MISA软件以查找和定位序列中SSR位点，参数设置如下：单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸的重复次数至少为10、8、5、4、3和3；
4)设计EST-SSR引物：
使用软件primer3.0
http://sourceforge.net/projects/primer3/files/primer3/l.1.4/primer3-1.1.4-WINXP.zip/download批量设计SSR引物，设定标准为：引物长度为18～23bp，GC含量为40％～60％，Tm值55℃～65℃，并且上下游引物Tm值相差不超过5℃，产物大小为150～400bp。
上述方法中还包括以下步骤：
5)EST-SSR引物对的有效性和通用性鉴定：
提取蕨类材料的基因组DNA，利用开发的SSR引物进行PCR扩增，采用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测；利用引物开发所用材料的鸟巢蕨基因组DNA进行设计引物有效性PCR鉴定，若能检测到150～400bp扩增片段，说明该引物为有效引物；利用成功扩增的引物对蕨类材料的基因组DNA进行PCR扩增，用于聚类分析验证整个体系的有效性和通用性。
具体地，步骤5)中所述PCR鉴定的反应体系总体积为20μL，其中包括10×PCR缓冲液、25mmol/LMg2+、2.5mmol/LdNTPs、10μmol/LSSR引物、60ng基因组DNA、TaqDNA聚合酶及ddH2O；PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，50-60℃退火45s，72℃延伸1min，32个循环；72℃延伸10min；4℃保存；反应结束后，PCR产物加入2μLLoadingbuffer，采用8％聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，电泳缓冲液为1×TBE，160V稳压电泳1h，至Loadingbuffer移到凝胶底部时电泳结束；采用银染法染色，最后将凝胶置于凝胶成像系统上拍照；对电泳图谱上有差异且易识别的多态性条带，在同一迁移位置上观察扩增条带的有无：实验数据的统计采用“0”，“1”矩阵的统计方法，即在胶板上有清晰条带记为
“1”，在胶板上没有清晰条带则记为“0”，缺失的记为
“2”；统计结果生成矩阵后，使用NTSYS-pc2.10e软件进行数据处理，计算品种对之间的遗传相似系数，并获得相似系数矩阵。用SHAN程序中的UPGMA方法进行聚类分析，得到遗传聚类图。
具体地，步骤5)中所述的蕨类材料选自鸟巢蕨、狼尾蕨、铁线蕨、铁角蕨、凤尾蕨、富贵蕨、波士顿蕨、肾蕨、扇蕨、鹿角蕨中的任意一种。
本发明的目的之二在于提供基于转录组测序开发的鸟巢蕨EST-SSR引物，其包括以下的任一对引物：
引物1：正向引物：AGCCACCATCAGCAACAATT(SEQIDN0.1)；反向引物：ACATGAGCAGTTTGGCAC(SEQIDN0.2)；
引物2：正向引物：ATTCGGTCGGTTGGCTAAG(SEQIDN0.3)；反向引物：TTGTGGTGGGTGGATTGC(SEQIDN0.4)；
引物3：正向引物：GCGTCGTTGGTGCTGGATTC(SEQIDN0.5)；反向引物：CGTCGGTGTCGTGCGGTAG(SEQIDN0.6)；
引物4：正向引物：ACTCTCCCCCTCGTTGCTAT(SEQIDN0.7)；反向引物：ATTTAAGGGAGACATCGGGC(SEQIDN0.8)；
引物5：正向引物：GAATTTTTGGTGGCCTGTGT(SEQIDN0.9)；反向引物：ATCACTGCACCGACTTTTGG(SEQIDN0.10)；
引物6：正向引物：CTCGACGAGGAGGCATGATG(SEQIDN0.11)；反向引物：CTCGTTGTGCCGCTTCAATATC(SEQIDN0.12)；
引物7：正向引物：CGCTTCTGCCCGTTCCAG(SEQIDN0.13)；反向引物：CAGCAGCTTTCTTGCCATAGC(SEQIDN0.14)；
引物8：正向引物：AGCTTCCTCTGCTGCAATGAC(SEQIDN0.15)；反向引物：CTTCCAAACTGCACGTCAACAC(SEQIDN0.16)；
引物9：正向引物：ATCGCATGATGCACGTAGAG(SEQIDN0.17)；反向引物：ACATGCATGCCTACCTAATGG(SEQIDN0.18)；
引物10：正向引物：ACACCGCTGCTCAAGAGGATG(SEQIDN0.19)；反向引物：TGCCGCCGCCTGCTATTGC(SEQIDN0.20)；
引物11：正向引物：ATGCCGCCACGACGAAGG(SEQIDN0.21)；反向引物：CGGTGGGCTACTCTCCTATGTC(SEQIDN0.22)；
引物12：正向引物：GTGACGAAGGACGAAGGACAAG(SEQIDN0.23)；反向引物：TGGTGAAGCAGCAAAGAGGAAG(SEQIDN0.24)；
引物13：正向引物：ACTCTCCCCCTCGTTGCTAT(SEQIDN0.25)；反向引物：ATTTAAGGGAGACATCGGGC(SEQIDN0.26)；
引物14：正向引物：CTGGCGGGAAGCGGACTC(SEQIDN0.27)；反向引物：AATGGCGAGACTGTTGGCAATC(SEQIDN0.28)；
引物15：正向引物：TGCTCCATCGCCTGCTCTTG(SEQIDN0.29)；反向引物：CTCCACGACATTCTCCGCCTAG(SEQIDN0.30)；
引物16：正向引物：GCGAATTGAGAGCCATTCAGTAAA(SEQIDN0.31)；反向引物：CACTTCCACCAAATTCAGCTTCAA(SEQIDN0.32)；
引物17：正向引物：CGACAATGGGGTCTTAGCAT(SEQIDN0.33)；反向引物：TGCACACTTAAATTACATCCGC(SEQIDN0.34)。
本发明的目的之三在于提供如上所述的基于转录组测序开发的鸟巢蕨EST-SSR引物在鸟巢蕨分子标记辅助育种中的应用。
除另有说明外，本申请中所有的科技术语都具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。下列实施例旨在进一步举例说明实现本发明的具体方式，而不应理解为对本发明的限制。在不违背本发明的精神和原则的前提下，对发明进行改动得到的技术方案都将落入本发明的权利要求范围之内。
以下实施例中所用到的实验材料，如无特殊说明，均通过商业渠道购买得到。
实施例1：转录组序列数据的获得及设计EST-SSR引物
一、转录组数据的获得：
利用TRIzoL方法提鸟巢蕨叶片总RNA，纯化，DNA酶处理，获得总量≥5μg、OD260/280为1.8～2.2的TotalRNA样品，经液氮速冻后保存于-70℃备用；用AgiLent2100BioanaLyzer检测RNA样品，提取质量RIN值≥7.0的RNA样品用于构建文库；
用带有Oligo(dT)的磁珠富集带有polyA的mRNA，然后利用超声波将mRNA打断成短序列，回收200-700bp的片段；
以mRNA为模板，用六碱基随机引物合成第1条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNaseH和DNApolymeraseI合成第2条cDNA链；cDNA经过试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱之后做末端修复、加poly(A)并连接测序接头；
测序接头引物序列为：
5′RNAAdapter:5′-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-3′；
3′RNAAdapter:5′-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3′；
PCR扩增用上述接头序列中的引物进行15个循环的PCR扩增；
利用上述步骤中得到的序列，按照Illumina公司Sampleprepkit进行文库构建及检测；将构建好的文库放到Illumina测序仪(GenomeAnalyzerII)相应的通道上，运行36个循环；原始测序结果去除构建文库时产生的接头序列、两端低质量序列和低度复杂序列，然后利用Trinity软件(版本：v2012-10-05；参数设置：min_kmer_cov为2，其它参数为默认参数)进行序列拼接；将测序序列拼接成一个转录组，取每条基因中最长的转录本作为Unigene，以此作为后续分析的参考序列；样品的建库测序及数据分析流程见图1。
二、查找EST-SSR位点：
安装Perl语言，从http://pgrc.1pk-gatersleben.de/misa/中下载est_trimmer.pl并运行，以去除EST序列中小于100bp的过短序列和大于2000bp过长的序列，运行命令(C:\perl\bin>perlest_trimmer,piA.fasta-amb＝2,50-tr5＝T,5,50-tr3＝A,5,50-cut＝200,2000)，输出两个文件A.fasta.log和A.fasta.results(A为文件代号)。
从http://www.bioinformatics.org/cd-hit中下载CD_HIT软件，利用其去除冗余序列。把A.fasta.results复制到cd_hit文件夹中并重命名为B.fasta，运行程序cd_hit.exe；
Perl环境下运行命令为：C:\perl\bin\cd_hit>cd_hit.exe-1B.fasta-oC.fasta-cl.00-n5-M2000，输出三个文件，其中C.fsata文件用于下一步处理(A、B和C均为文件代号)。从http://pgrc.1pk-gatersleben.de/misa/中下载程序misa.pi以识别和定位EST序列中的SSR位点，参数设置如下：单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸的重复次数至少为10、8、5、4、3和3；
将C.fsata文件拷贝至C盘perl\bin目录下，Perl环境下运行命令：C:\perl\bin>perlmisa.plC.fasta，运行后产生C.fasta.misa和C.fasta.statistics两个文件，其中C.fasta.misa用于后续引物设计；
三、设计EST-SSR引物：
使用Perl环境下primer3模块批量设计EST-SSR引物，设定标准：引物长度为18～23bp，GC含量40％～60％，Tm值55～65℃，并且上下游引物Tm值相差不超过5℃，产物大小为150～400bp；运行p3_out.pi，Perl环境下运行命令为：C:\perl\bin>perlp3_in.plC.fasta.misa，产生了一个名为C.fasta.p3in的primer3的输入文件；再复制C.fasta.p3in文件到C盘perl\bin\primer3\bin根目录下，运行primer3_core.exe实现批量设计引物，Perl环境下运行命令C:\perl\bin\primer3\bin>primer3_core.exe<C.fasta.p3in>C.fasta.p3out，产生一个名为C.fasta.p3out的文件；最后将C.fasta.p3out文件复制至C盘perl\bin目录下，运行p3_out.pi，其命令为：C:\perl\bin>perlp3_out.plC.fasta.p3outC.fasta.misa，运行后得到C.fasta.results文件，此即为设计好的引物。
实施例2：鸟巢蕨EST-SSR位点的挖掘
以蕨类植物鸟巢蕨为试验材料，收集鸟巢蕨叶片进行转录组测序，测序共获得42907条EST序列，去冗余后共检测到6067个EST-SSR位点，分布于5178条EST序列中，占总数的12.07％；鸟巢蕨EST-SSR类型丰富，二核苷酸、三核苷酸和单核苷酸为优势重复类型，占总EST-SSR的81.62％，见表1；鸟巢蕨EST-SSR中，共观察到106种基元种类，单核苷酸至六核苷酸重复类型的基元种类分别为2、4、18、21、23和38，见图2；其中，出现频率最高的是AG/CT共1371个，占22.60％；其次为CA/GT，共1066个，占17.57％；A/T共628个，占10.35％；G/C共475个，占7.83％；CCT/AGG共275个，占4.53％，见表2。
使用primer3.0批量设计软件共设计获得EST-SSR引物4063对；从4063对设计的EST-SSR引物中随机抽选40对，利用鸟巢蕨DNA进行引物设计成功率检测，其中26对引物在150～400bp检测到清晰条带，说明引物设计成功率较高。
表1鸟巢蕨EST-SSR的重复基元情况
表2鸟巢蕨EST-SSR中主要基元及比例
实施例3：EST-SSR引物对10份蕨类材料DNA的多态性鉴定
提取10份蕨类材料基因组DNA，用0.8％琼脂糖凝胶电泳法检测其质量，将DNA浓度稀释至50ng/μL后置于-20℃保存备用。利用引物开发所用材料的DNA进行引物设计成功率PCR鉴定；PCR反应体系的总体积为20μL，其中包括10×PCR缓冲液2.0μL、25mmol/L的Mg2+1.6μL、2.5mmol/L的dNTPs1.8μL、10μmol/L的SSR引物1.0μL、30ng/μL的基因组DNA2.0μL、2.5U/μL的TaqDNA聚合酶0.2μL及ddH2O11.4μL；PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，50-60℃退火45s，72℃延伸1min，32个循环；72℃延伸10min；4℃保存；反应结束后，PCR产物加入2μLLoadingbuffer，采用8％聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，电泳缓冲液为1×TBE，160V稳压电泳1h，至Loadingbuffer移到凝胶底部时电泳结束。电泳结束后，采用银染法染色，最后将凝胶置于凝胶成像系统上拍照。对电泳图谱上有差异且易识别的多态性条带，在同一迁移位置上观察扩增条带的有无。实验数据的统计采用“0”，“1”矩阵的统计方法。在胶板上有清晰条带记为“1”，在胶板上没有清晰条带则记为“0”，缺失的记为“2”。统计结果生成矩阵后，使用NTSYS-pc2.10e软件进行数据处理，计算品种对之间的遗传相似系数，并获得相似系数矩阵；用SHAN程序中的UPGMA方法进行聚类分析，得到遗传聚类图。
上述的蕨类材料可以选自鸟巢蕨、狼尾蕨、铁线蕨、铁角蕨、凤尾蕨、富贵蕨、波士顿蕨、肾蕨、扇蕨、鹿角蕨中的任意一种。说明此利用鸟巢蕨转录组开发EST-SSR引物的方法，适用于蕨类植物EST-SSR引物的开发。
选取40对引物对10份蕨类材料基因组DNA进行验证，其中26对引物的PCR产物与预期片段大小相符合，5对引物的PCR产物大于预期片段长度，3对引物的PCR产物小于预期片段长度。
进一步将这26对已验证的EST-SSR引物对10份蕨类材料进行多态性检测，结果表明17对引物扩增结果具多态性(序列如SEQIDNo.1-34所示)，这些EST-SSR引物共扩增出65条多态性带，平均每对引物能扩增出3.82条。图3为引物ES7和ES29在供试蕨类材料中扩增的结果。
根据17对EST-SSR引物的扩增数据，通过遗传相似系数进行UPGMA聚类，这些引物可将这10份蕨类材料分为2大类，命名为Ⅰ类和Ⅱ类。Ⅰ类约在0.61处将鸟巢蕨、铁角蕨、扇蕨、富贵蕨和狼尾蕨聚为一组；Ⅱ类约在0.64处将铁线蕨、凤尾蕨、波士顿蕨、肾蕨和鹿角蕨聚为一类，其中波士顿蕨、肾蕨和鹿角蕨又在0.72处被区分出来，见图4。研究结果表明，基于转录组测序开发鸟巢蕨EST-SSR引物的方法是可行和有效的。

Claims (7)

1.一种基于转录组测序开发鸟巢蕨EST-SSR引物的方法，其特征在于：
包括以下步骤：
1)构建转录组文库：提取鸟巢蕨叶片总RNA，分离mRNA，反转录合成并纯化cDNA，末端修复、加腺嘌呤核苷连接测序接头，通过琼脂糖凝胶电泳回收大小为200～700bp的片段，将回收片段进行PCR扩增，即构建得到转录组文库；
2)转录组数据的获得：将步骤1)得到的转录组文库用IlluminaHiSeqTM2000平台进行测序，采用Illumina双末端测序方法，获得转录组测序数据；利用Trinity软件对测序数据进行拼接，将序列拼接成一个完整的转录组；
3)SSR位点查找：
安装Perl语言，从http://pgrc.1pk-gatersleben.de/misa下载est_trimmer.pl并运行以去除所述转录组序列中小于100bp的短序列和大于2000bp的长序列；
从http://www.bioinformatics,org/cd-hit/中下载CD_HIT软件，利用其去除冗余序列；
从http://pgrc.1pk-gatersleben.de/misa下载使用MISA软件以查找和定位序列中SSR位点，参数设置如下：单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸的重复次数至少为10、8、5、4、3和3；
4)设计EST-SSR引物：
使用软件primer3.0
http://sourceforge.net/projects/primer3/files/primer3/l.1.4/primer3-1.1.4-WINXP.zip/download批量设计SSR引物，设定标准为：引物长度为18～23bp，GC含量为40％～60％，Tm值55℃～65℃，并且上下游引物Tm值相差不超过5℃，产物大小为150～400bp。
2.根据权利要求1所述的基于转录组测序开发鸟巢蕨EST-SSR引物的方法，其特征在于：步骤1)中所述的测序接头为：
5′RNAAdapter:5′-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-3′；
3′RNAAdapter:5′-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3′。
3.根据权利要求1所述的基于转录组测序开发鸟巢蕨EST-SSR引物的方法，其特征在于：步骤4)之后还包括以下步骤：
5)EST-SSR引物对的有效性和通用性鉴定：
提取蕨类材料的基因组DNA，利用开发的SSR引物进行PCR扩增，采用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测；利用引物开发所用材料的鸟巢蕨基因组DNA进行设计引物有效性PCR鉴定，若能检测到150～400bp扩增片段，说明该引物为有效引物；利用成功扩增的引物对蕨类材料的基因组DNA进行PCR扩增，用于聚类分析验证整个体系的有效性和通用性。
4.根据权利要求3所述的基于转录组测序开发鸟巢蕨EST-SSR引物的方法，其特征在于：所述PCR鉴定的反应体系总体积为20μL，其中包括10×PCR缓冲液、25mmol/LMg2+、2.5mmol/LdNTPs、10μmol/LSSR引物、60ng基因组DNA、TaqDNA聚合酶及ddH2O；PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，50-60℃退火45s，72℃延伸1min，32个循环；72℃延伸10min；4℃保存；反应结束后，PCR产物加入2μLLoadingbuffer，采用8％聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，电泳缓冲液为1×TBE，160V稳压电泳1h，至Loadingbuffer移到凝胶底部时电泳结束；采用银染法染色，最后将凝胶置于凝胶成像系统上拍照；对电泳图谱上有差异且易识别的多态性条带，在同一迁移位置上观察扩增条带的有无：实验数据的统计采用“0”，“1”矩阵的统计方法，即在胶板上有清晰条带记为“1”，在胶板上没有清晰条带则记为“0”，缺失的记为“2”；统计结果生成矩阵后，使用NTSYS-pc2.10e软件进行数据处理，计算品种对之间的遗传相似系数，并获得相似系数矩阵。用SHAN程序中的UPGMA方法进行聚类分析，得到遗传聚类图。
5.根据权利要求3所述的基于转录组测序开发鸟巢蕨EST-SSR引物的方法，其特征在于：所述的蕨类材料选自鸟巢蕨、狼尾蕨、铁线蕨、铁角蕨、凤尾蕨、富贵蕨、波士顿蕨、肾蕨、扇蕨、鹿角蕨中的任意一种。
6.基于转录组测序开发的鸟巢蕨EST-SSR引物，其特征在于：包括以下的任一对引物：
引物1：正向引物：SEQIDNO.1，反向引物：SEQIDNO.2；
引物2：正向引物：SEQIDNO.3，反向引物：SEQIDNO.4；
引物3：正向引物：SEQIDNO.5，反向引物：SEQIDNO.6；
引物4：正向引物：SEQIDNO.7，反向引物：SEQIDNO.8；
引物5：正向引物：SEQIDNO.9，反向引物：SEQIDNO.10；
引物6：正向引物：SEQIDNO.11，反向引物：SEQIDNO.12；
引物7：正向引物：SEQIDNO.13，反向引物：SEQIDNO.14；
引物8：正向引物：SEQIDNO.15，反向引物：SEQIDNO.16；
引物9：正向引物：SEQIDNO.17，反向引物：SEQIDNO.18；
引物10：正向引物：SEQIDNO.19，反向引物：SEQIDNO.20；
引物11：正向引物：SEQIDNO.21，反向引物：SEQIDNO.22；
引物12：正向引物：SEQIDNO.23，反向引物：SEQIDNO.24；
引物13：正向引物：SEQIDNO.25，反向引物：SEQIDNO.26；
引物14：正向引物：SEQIDNO.27，反向引物：SEQIDNO.28；
引物15：正向引物：SEQIDNO.29，反向引物：SEQIDNO.30；
引物16：正向引物：SEQIDNO.31，反向引物：SEQIDNO.32；
引物17：正向引物：SEQIDNO.33，反向引物：SEQIDNO.34。
7.如权利要求6所述的基于转录组测序开发的鸟巢蕨EST-SSR引物在鸟巢蕨分子标记辅助育种中的应用。
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