CN110878334B - 用于扩增子测序的引物及两步pcr建库方法 - Google Patents

用于扩增子测序的引物及两步pcr建库方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于扩增子测序的引物及两步PCR建库方法，该方法包括：1)提取待测物种样本的基因组DNA；2)在多重PCR正、反向引物的5’端分别连接通用引物序列，以基因组DNA为模板，进行第一轮多重PCR，得到两端带有通用引物序列的PCR产物；3)纯化第一轮PCR产物；4)在测序标签序列的两端分别连接与第一轮PCR通用引物序列相匹配的引物序列，获得携带标签序列的PCR产物，并以其为模板进行第二轮PCR；5)纯化PCR产物，质检合格后上机测序。本发明采用两步PCR法建库，降低了扩增子测序成本，使检测成本降50％以上，同时有效提升扩增子质量指标，即提高了位点检出率和数据均一性，有极高的经济价值。

Description

用于扩增子测序的引物及两步PCR建库方法
技术领域
本发明涉及分子生物学及生物信息学，具体地说，涉及一种用于扩增子测序的引物及两步PCR建库方法。
背景技术
扩增子测序是一种高靶向性的目标区域测序方法，用于分析特定基因组区域中的基因变异，通过PCR产物(扩增子)的超高深度测序可以有效地识别和分析变异特征。扩增子测序利用设计的引物序列靶向地捕获目标区域，然后进行高通量测序(NGS)，分析测序结果，得到相应信息。
由于现有的扩增子测序技术主要采用末端连接方式加接头建库，步骤繁琐且每个样本物料成本高于300元，因此亟需开发成本更低的测序方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于扩增子测序的引物及两步PCR建库方法。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种用于扩增子测序的引物，包括第一轮PCR引物和包括第二轮PCR引物，分别如下：
第一轮PCR引物：
F：5′-GAACGACATGGCTACGATCCGACTT-特异性靶向目标区域的正向引物-3′
R：5′-CTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTT-特异性靶向目标区域的反向引物-3′
第二轮PCR引物：
Ad153_PCR2_1：5′-GAACGACATGGCTACGA-3′
Index R：5′-TGTGAGCCAAGGAGTTGNNNNNNNNNNTTGTCTTCCTAAGAC CGCTTGGCCT-3′
其中，引物Ad153_PCR2_1的5′端经磷酸化修饰，NNNNNNNNNN为适用于MGISEQ-2000RS测序平台的接头序列(index)，N代表碱基A、T、G或C。
以牛100重扩增子测序为例，所述特异性靶向目标区域的正向引物和特异性靶向目标区域的反向引物的核苷酸序列见表1。
表1针对牛基因组设计的100对引物序列
Figure BDA0002269982510000011
Figure BDA0002269982510000021
Figure BDA0002269982510000031
Figure BDA0002269982510000041
Figure BDA0002269982510000051
Figure BDA0002269982510000061
注：1和2为一对引物，3和4为一对引物，以此类推。
第二方面，本发明提供含有上述引物的试剂盒。
第三方面，本发明提供上述引物或试剂盒在构建扩增子测序文库中的应用。
第四方面，本发明提供扩增子测序文库的构建方法，包括以下步骤：
1)提取待测物种样本的基因组DNA；
2)在多重PCR正向引物和反向引物的5’端分别连接通用引物序列，以基因组DNA为模板，进行第一轮多重PCR反应，得到两端带有通用引物序列的PCR产物；
3)对第一轮得到的PCR产物进行纯化；
4)在测序标签序列的两端分别连接与第一轮PCR通用引物序列相匹配的引物序列，获得携带标签序列的PCR产物，以纯化后的PCR产物为模板，进行第二轮PCR反应；
5)纯化步骤4)得到的PCR产物，质检合格后上机测序。
前述的方法，步骤1)中在多重PCR正向引物的5’端连接的通用引物序列为：5′-GAACGACATGGCTACGATCCGACTT-3′(SEQ ID NO:1)；
在多重PCR反向引物的5’端连接的通用引物序列为：5′-CTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTT-3′(SEQ ID NO:2)。
前述的方法，步骤4)中第二轮PCR反应所用引物为：
Ad153_PCR2_1：5′-GAACGACATGGCTACGA-3′(SEQ ID NO:3)
Index R：5′-TGTGAGCCAAGGAGTTGNNNNNNNNNNTTGTCTTCCTAAGAC CGCTTGGCCT-3′
其中，引物Ad153_PCR2_1的5′端经磷酸化修饰，NNNNNNNNNN为适用于MGISEQ-2000RS测序平台的接头序列，N代表碱基A、T、G或C。
前述的方法，步骤2)中多重PCR反应的反应条件为：95℃15min；94℃30s，60℃90s，72℃60s，16个循环；60℃30min。
前述的方法，步骤4)中第二轮PCR反应的反应条件为：95℃3min；98℃20s，60℃15s，72℃30s，8个循环；72℃10min；4℃∞。
本发明所述待测物种包括但不限于牛。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
(一)本发明采用两步PCR法建库，降低了扩增子测序成本，使建库成本降低了50％以上，同时有效提升扩增子质量指标，即提高了位点检出率和数据均一性，有极高的经济价值。
(二)本发明以适用于MGISEQ-2000RS测序平台的引物设计方法为基础，进行了牛100重扩增子测序，数据分析结果表明，本发明方法可靠、稳定，并且极大地降低了扩增子建库成本。
(三)本发明提供的适用于MGISEQ-2000RS测序平台的扩增子测序方法，基因分型准确性均大于99％，有效reads数在97％以上，并且具有良好的均一性。
附图说明
图1为本发明实施例1中用于扩增子测序的引物设计原理示意图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1扩增子测序文库的构建方法
一、引物设计
1、针对MGISEQ-2000RS测序平台，引物设计情况如下：
第一轮PCR引物：
F：5′-GAACGACATGGCTACGATCCGACTT-特异正向引物-3′
R：5′-CTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTT-特异反向引物-3′
第二轮PCR引物：(NNNNNNNNNN为index，见表2)
Ad153_PCR2_1：5′-GAACGACATGGCTACGA-3′
Index R：5′-TGTGAGCCAAGGAGTTGNNNNNNNNNNTTGTCTTCCTAAGAC CGCTTGGCCT-3′
其中，引物Ad153_PCR2_1的5′端经磷酸化修饰。
表2 MGISEQ-2000RS测序平台index序列
Figure BDA0002269982510000081
Figure BDA0002269982510000091
用于扩增子测序的引物设计原理示意图见图1。
二、基因组定量和引物panel制备
对提取的牛基因组进行定量，作为多重PCR的模板。
TE缓冲液溶解并混匀引物，引物的终浓度均为0.2μM。-20℃冻存备用。
三、多重PCR(QIAGEN Multiplex PCR Kit,货号206143)
1、扩增体系如下：
Primer Pool mix(各引物0.2μM) 1μl
牛基因组模板 1μl
2×QIAGEN Multiplex PCR Master Mix 5μl
不含RNase的水 3μl
总体积 10μl
2、反应条件：(适用于产物500bp以下的扩增子)
95℃15min；94℃30s，60℃90s，72℃60s，16个循环；60℃30min。
四、片段筛选
取30μl磁珠加入上述反应体系，混匀并悬浮磁珠，放置于磁力架上，室温静置5min后，弃上清，保留磁珠，所得产物直接用于后续试验或置于-20℃保存。
五、第二轮PCR
1、扩增体系如下：
Ad153_PCR2_1 2μl
Index R 2μl
PCR Enzyme Mix 15μl
不含RNase的水 11μl
总体积 30μl
注：PCR Enzyme Mix来自MGIEasy通用DNA文库制备试剂套装，试剂盒编号为1000006985。
将30μl上述混合物直接加入第一轮PCR产物中。
2、PCR反应条件：95℃3min；98℃20s，60℃15s，72℃30s，8个循环；72℃10min；4℃∞。
六、PCR产物纯化
1、取30μl磁珠去除基因组和引物二聚体。
2、加入20μl洗脱缓冲液(Elution Buffer)，充分悬浮磁珠，室温静置2min以洗脱DNA。将磁珠用磁铁吸附，所得上清DNA溶液转移至一新的1.5ml离心管(或0.5ml、0.2ml离心管)，或者96孔PCR板；所得产物直接用于后续试验或置于-20℃保存。
七、均一化
1、使用AccuGreen High Sensitivity dsDNA Quantitation Kit试剂盒，按照定量试剂盒的操作说明对样本进行定量(1μl样本+199μl工作缓冲液)；
2、在此处进行不同接头序列样本混合，等量混合后总量为330ng；
3、根据浓度取330ng样本到PCR管中，补充TE缓冲液至总体积60μl。
八、PCR纯化产物质检
取40ng PCR纯化产物于8联排PCR管内，加2μl的溴酚磺加样缓冲液吹打混匀，跑胶，加5μl Marker，电泳条件为：120V，25min。扩增产物的大小为300bp左右(如果产物不符合要求，需要梯度降低第二轮PCR的退火温度)。
九、上机测序
十、数据分析
1、下机数据质控，结果见表3。
表3不同数据量下质控结果
Figure BDA0002269982510000101
分别设置不同数据量的样本，以分析不同数据量对两步PCR扩增子建库的影响。根据数据质控结果，Q20约为97％，Q30约为92％，超过MGISEQ-2000RS测序平台数据质量标准，表明数据结果可靠。
2、不同建库方法的比较，结果见表4。
表4
接头法建库 两步PCR法建库
检测位点数 100重 100重
位点检出率 100％ 100％
大于200X测序深度占比 88.12％ 100％
Q20 97％ 97％
Q30 91％ 92％
Effective Rate 99.2 94％
基因分型一致性 99％ 99.51％
从上述数据分析结果可知，采用两步PCR法建库可成功降低扩增子测序成本，使建库成本从300元降低50％以上，同时提升扩增子测序质量指标，即提高了位点检出率和数据均一性，有极高的经济价值。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 北京康普森生物技术有限公司
<120> 用于扩增子测序的引物及两步PCR建库方法
<130> KHP191114842.1
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaacgacatg gctacgatcc gactt 25
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctaagaccgc ttggcctccg actt 24
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaacgacatg gctacga 17

Claims (7)

1.用于牛扩增子测序的引物，其特征在于，包括第一轮PCR引物和包括第二轮PCR引物，分别如下：
第一轮PCR引物：
F：5′-GAACGACATGGCTACGATCCGACTT-特异性靶向目标区域的正向引物-3′
R：5′-CTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTT-特异性靶向目标区域的反向引物-3′
第二轮PCR引物：
Ad153_PCR2_1：5′-GAACGACATGGCTACGA-3′
Index R：5′-TGTGAGCCAAGGAGTTGNNNNNNNNNNTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCT-3′
其中，引物Ad153_PCR2_1的5′端经磷酸化修饰，NNNNNNNNNN为适用于MGISEQ-2000RS测序平台的接头序列，N代表碱基A、T、G或C；
所述特异性靶向目标区域的正向引物和特异性靶向目标区域的反向引物的核苷酸序列如下所示：
Figure FDA0003712203160000011
Figure FDA0003712203160000021
Figure FDA0003712203160000031
Figure FDA0003712203160000041
Figure FDA0003712203160000051
其中，1和2为一对引物，3和4为一对引物，以此类推。
2.含有权利要求1所述引物的试剂盒。
3.权利要求1所述引物或权利要求2所述试剂盒在构建牛扩增子测序文库中的应用。
4.牛扩增子测序文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取待测牛样本的基因组DNA；
2)在多重PCR正向引物和反向引物的5’端分别连接通用引物序列，以基因组DNA为模板，进行第一轮多重PCR反应，得到两端带有通用引物序列的PCR产物；
3)对第一轮得到的PCR产物进行纯化；
4)在测序标签序列的两端分别连接与第一轮PCR通用引物序列相匹配的引物序列，获得携带标签序列的PCR产物，以纯化后的PCR产物为模板，进行第二轮PCR反应；
5)纯化步骤4)得到的PCR产物，质检合格后上机测序；
步骤1)中在多重PCR正向引物的5’端连接的通用引物序列为：5′-GAACGACATGGCTACGATCCGACTT-3′；
在多重PCR反向引物的5’端连接的通用引物序列为：5′-CTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTT-3′；
步骤4)中第二轮PCR反应所用引物为：
Ad153_PCR2_1：5′-GAACGACATGGCTACGA-3′
Index R：5′-TGTGAGCCAAGGAGTTGNNNNNNNNNNTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCT-3′
其中，引物Ad153_PCR2_1的5′端经磷酸化修饰，NNNNNNNNNN为适用于MGISEQ-2000RS测序平台的接头序列，N代表碱基A、T、G或C；
正向引物和反向引物的核苷酸序列如权利要求1中所述。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2)中多重PCR反应的反应条件为：95℃15min；94℃30s，60℃90s，72℃60s，16个循环；60℃30min。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤4)中第二轮PCR反应的反应条件为：95℃3min；98℃20s，60℃15s，72℃30s，8个循环；72℃10min；4℃∞。
7.根据权利要求4-6任一项所述的方法，其特征在于，步骤3)和步骤5)中采用磁珠法纯化PCR产物。
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