CN107881250B - 基于转录组测序开发的牡丹est-ssr引物及其开发方法 - Google Patents

基于转录组测序开发的牡丹est-ssr引物及其开发方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了基于转录组测序开发的牡丹EST‑SSR引物及其开发方法。本发明所提供的牡丹的成套EST‑SSR引物，由A和B组成，所述A为Primer 1，所述B为Primer 2至Primer 6这6种引物对中的6种引物对、5种引物对、4种引物对、3种引物对、2种引物对或1种引物对；Primer 1至Primer 6的序列分别如SEQ ID No.1至SEQ ID No.12所示。本发明为牡丹遗传图谱构建、牡丹种质鉴定、牡丹育种、牡丹遗传多样性分析、牡丹亲缘关系分析和牡丹分子标记辅助育种提供了技术支持。

Description

基于转录组测序开发的牡丹EST-SSR引物及其开发方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域中基于转录组测序开发的牡丹EST-SSR引物及其开发方法。
背景技术
牡丹是芍药科芍药属牡丹组的植物，目前已确认的牡丹野生种有大花黄牡丹(Paeonia ludlowii)(Hong D Y,1997.Paeonia(Paeoniaceae)in Xizang(Tibet).Novon,7:156–161)、卵叶牡丹(Paeonia qiui)(裴颜龙、洪德元.卵叶牡丹-芍药属一新种.植物分类学报33(1)：91-93(1995))、紫斑牡丹(Paeonia rockii)(洪涛,张家勋,李家珏,赵文忠,李明瑞.中国野生牡丹研究(一)芍药属牡丹组新分类群[J].植物研究，1992，12(3):223-234)、杨山牡丹(Paeonia ostii)(洪涛,张家勋,李家珏,赵文忠,李明瑞.中国野生牡丹研究(一)芍药属牡丹组新分类群[J].植物研究，1992，12(3):223-234)、四川牡丹(Paeoniadecomposita)(Hong De-yuan,Pan Kai-yu and Pei Yan-long,1996.The Identity ofPaeonia decomposita Hand.-Mazz.Taxon,45(1):67-69)、保氏牡丹(Paeonia potanini)(方文培.中国芍药属的研究[J].植物分类学报.1958,7(4):305)、紫牡丹(Paeoniadelavayi)(方文培.中国芍药属的研究[J].植物分类学报.1958,7(4):303)、黄牡丹(Paeonia lutea)(方文培.中国芍药属的研究[J].植物分类学报.1958,7(4):303)、稷山牡丹(Paeonia jishanensis)(洪涛,张家勋,李家珏,赵文忠,李明瑞.中国野生牡丹研究(一)芍药属牡丹组新分类群[J].植物研究，1992，12(3):223-234)。
分子标记已经成为作物遗传改良和分子辅助育种研究和应用的重要部分。因此，开发大量的分子标记对于牡丹品种改良和分子辅助育种研究是十分必要的。简单重复序列(SSR)广泛分布于各类真核生物基因组的不同位置，因其重复次数不同和重复程度不同而呈现高度的多态性。相对于AFLP、RAPD等分子标记，SSR标记具有多态性高、共显性遗传、重复性好等特点，被认为是目前进行遗传多样性分析和遗传图谱构建的首选分子标记。
随着二代测序技术的不断发展和广泛应用，通过转录组序列能够获得大量EST-SSR(基于表达序列标签开发微卫星的一种新型分子标记)。EST-SSR标记反映的是转录区的差异，其多态性可能与基因功能直接相关。为了有效地开发利用牡丹的资源优势，需要建立牡丹的EST-SSR分子标记技术体系，为牡丹的种质鉴定、资源保护、杂交育种提供科学的理论依据。
发明内容
本发明所要解决的技术问题提供多态性高的牡丹EST-SSR引物并提供基于转录组测序开发的牡丹SSR引物的方法。
为了解决以上技术问题，本发明提供了牡丹的成套EST-SSR引物。
本发明所提供的牡丹的成套EST-SSR引物，由A和B组成，所述A为Primer1，所述B为Primer 2至Primer 6这6种引物对中6种引物对、5种引物对、4种引物对、3种引物对、2种引物对或1种引物对；
所述Primer 1由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA组成；
所述Primer 2由SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的两条单链DNA组成；
所述Primer 3由SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的两条单链DNA组成；
所述Primer 4由SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的两条单链DNA组成；
所述Primer 5由SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示的两条单链DNA组成；
所述Primer 6由SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示的两条单链DNA组成。
为了解决以上技术问题，本发明提供了牡丹的EST-SSR引物。
本发明所提供的牡丹的EST-SSR引物，是上述Primer 1至Primer 6中的任一种。
本发明还提供了上述牡丹的成套EST-SSR引物的下述A1-A6中的任一种用途：
A1、所述成套EST-SSR引物在构建牡丹遗传图谱中的应用；
A2、所述成套EST-SSR引物在牡丹种质鉴定中的应用；
A3、所述成套EST-SSR引物在牡丹育种中的应用；
A4、所述成套EST-SSR引物在牡丹遗传多样性分析中的应用；
A5、所述成套EST-SSR引物在牡丹亲缘关系分析中的应用；
A6、所述成套EST-SSR引物在牡丹分子标记辅助育种中的应用。
本发明还提供了上述牡丹的EST-SSR引物下述B1-B6中的任一种用途：
B1、所述EST-SSR引物在构建牡丹遗传图谱中的应用；
B2、所述EST-SSR引物在牡丹种质鉴定中的应用；
B3、所述EST-SSR引物在牡丹育种中的应用；
B4、所述EST-SSR引物在牡丹遗传多样性分析中的应用；
B5、所述EST-SSR引物在牡丹亲缘关系分析中的应用；
B6、所述EST-SSR引物在牡丹分子标记辅助育种中的应用。
本发明还提供了获取牡丹EST-SSR分子标记的方法。
本发明所提供的获取牡丹EST-SSR分子标记的方法，包括：
1)以牡丹的基因组DNA为模板，用上述牡丹的成套EST-SSR引物或上述牡丹的EST-SSR引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
2)将1)中得到的所述PCR扩增产物进行电泳，得到牡丹EST-SSR分子标记。
上述方法中，所述PCR扩增采用的引物退火条件可为55-60℃(如59-60℃)，30s。
上述方法中，所述PCR扩增中采用的PCR反应温度程序可为：94℃预变性5min；然后进入35个循环：94℃变性30s，55-60℃(如59-60℃)退火30s，72℃延伸30s，最后72℃延伸10min。
上文中，所述牡丹可为下述9种牡丹野生种中的9种、8种、7种、6种、5种、4种、3种、2种或1种：大花黄牡丹(Paeonia ludlowii)、卵叶牡丹(Paeonia qiui)、紫斑牡丹(Paeoniarockii)、杨山牡丹(Paeonia ostii)、四川牡丹(Paeonia decomposita)、保氏牡丹(Paeonia potanini)、紫牡丹(Paeonia delavayi)、黄牡丹(Paeonia lutea)和稷山牡丹(Paeonia jishanensis)。
本发明还提供了基于转录组测序开发牡丹EST-SSR引物的方法，包括：
1)构建牡丹转录组文库并测序，获得牡丹转录组EST序列；
2)采用软件MISA1.0对EST序列进行SSR位点的筛选：
获得牡丹转录组EST序列后先进行去冗余，然后从http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/下载misa.pl程序以识别EST序列中的SSR；参数设置如下：单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重复单元数目分别不少于12、6、5、5、4、4个，两个SSR序列间隔最小值为100，即序列间隔100bp以上的计为两个SSR位点；
3)采用软件Primer 3进行EST-SSR引物的设计：
使用软件primer3批量设计EST-SSR引物；引物设计参数：基于SSR重复单元前后的序列设计引物，每条SSR产生5条引物，引物长度为18-25bp，Tm 55-65℃，PCR扩增产物长度为100-500bp；
4)对步骤3)设计的EST-SSR引物在不同牡丹野生种间的有效性和通用性鉴定，得到在不同牡丹野生种间具有有效性和通用性的所述牡丹的成套EST-SSR引物。
上述方法中，所述不同牡丹野生种为下述9种牡丹野生种中的9种、8种、7种、6种、5种、4种、3种或2种：大花黄牡丹(Paeonia ludlowii)、卵叶牡丹(Paeonia qiui)、紫斑牡丹(Paeonia rockii)、杨山牡丹(Paeonia ostii)、四川牡丹(Paeonia decomposita)、保氏牡丹(Paeonia potanini)、紫牡丹(Paeonia delavayi)、黄牡丹(Paeonia lutea)和稷山牡丹(Paeonia jishanensis)。
所述有效性是指以‘凤丹’的基因组DNA为模板，用步骤3)设计的SSR引物对进行PCR扩增，在‘凤丹’中能得到100-300bp的PCR产物的SSR引物对具有有效性；所述通用性是指以牡丹野生种的基因组DNA为模板，用步骤3)设计的SSR引物对进行PCR扩增，在牡丹野生种中均能得到100-300bp的PCR产物的SSR引物对具有通用性。
实验证明，本发明基于转录组测序开发牡丹EST-SSR引物的方法共设计获得EST-SSR引物1887对，从上述引物中筛选6对引物(Primer 1至Primer 6)对9种牡丹野生种进行验证，结果表明6对引物在所有材料中均能检测到清晰条带，本发明的Primer 1至Primer 6这6种EST-SSR引物中每一种引物对均可以在9种牡丹野生种的基因组DNA中扩增出多态性条带，多态性比例均为100％。多态性条带统计显示6种EST-SSR分子标记的引物对共扩增出41条DNA片段，这些DNA片段均为多态性条带，多态性比例为100％。说明本发明的Primer 1至Primer6这6对EST-SSR引物均为有效引物且均具有通用性。本发明基于转录组测序开发牡丹EST-SSR引物的方法快捷、准确，为牡丹SSR引物开发提供了新思路。本发明为高密度牡丹遗传连锁图谱构建、牡丹种质鉴定、牡丹育种、牡丹遗传多样性分析、牡丹亲缘关系分析、牡丹重要经济性状QTL定位和牡丹分子标记辅助育种提供了技术支持。
附图说明
图1为引物Primer 1对9种牡丹野生种的毛细管电泳检测结果。
图2为引物Primer 2对9种牡丹野生种的毛细管电泳检测结果。
图3为引物Primer 3对9种牡丹野生种的毛细管电泳检测结果。
图4为引物Primer 4对9种牡丹野生种的毛细管电泳检测结果。
图5为引物Primer 5对9种牡丹野生种的毛细管电泳检测结果。
图6为引物Primer 6对9种牡丹野生种的毛细管电泳检测结果。
图1-6中，a为大花黄牡丹(Paeonia ludlowii)、b为卵叶牡丹(Paeonia qiui)、c为紫斑牡丹(Paeonia rockii)、d为杨山牡丹(Paeonia ostii)、e为四川牡丹(Paeoniadecomposita)、f为保氏牡丹(Paeonia potanini)、g为紫牡丹(Paeonia delavayi)、h为黄牡丹(Paeonia lutea)、i为稷山牡丹(Paeonia jishanensis)。
图7为利用6对EST-SSR引物构建的UPGMA聚类图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、多态性高的牡丹的EST-SSR引物的开发
本发明提供的基于转录组高通量测序，并结合生物信息学方法进行SSR序列查找和SSR标记引物设计和验证，其具体实施方式如下：
1构建转录组文库并测序，获得牡丹转录组EST序列；
1.1总RNA提取及mRNA纯化
采集牡丹(‘凤丹’)花发育不同时期的花瓣并置于液氮罐里速冻后，置于-70℃冰箱内保存。使用Trizol试剂提取‘凤丹’的总RNA。抽提得到的总RNA首先利用10U DNaseI(Ambion，美国)在37℃消化1小时；然后利用Micropoly(A)Purist TM mRNA purificationkit(Ambion，美国)，进行mRNA纯化：把RNA稀释到250μl的体积，按照Kit的操作步骤(Cat.No:1919)进行；最后得到的mRNA用100μl预热的THE缓冲液洗脱，利用NanoDrop进行定量。
1.2cDNA合成及测序
第一链cDNA合成利用GsuI-oligo dT作为反转录引物，10μg的mRNA作为模板，用1000单位的Superscript II reverse transcriptase(Invitrogen，美国)在42℃作用1小时完成；随后利用NaIO4(Sigma，美国)氧化mRNA的5’帽子结构，并连接生物素；通过DynalM280磁珠(Invitrogen，美国)筛选连接了生物素的mRNA/cDNA，并通过碱裂解释放第一链cDNA；然后通过DNAligase(TaKaRa，日本)在第一链cDNA的5’末端加上接头，然后通过ExTaq polymerase(TaKaRa，日本)合成第二链cDNA。最后通过GsuI酶切去除polyA和5’端接头。
合成的cDNA利用超声仪打断到500-800bp的范围，利用Ampure beads
(Agencourt，美国)进行纯化。随后纯化的cDNA利用GS FLX Titanium RapidLibrary Preparation Kit(Rohce，美国)制备文库，并利用GS FLX Titanium LV emPCRKit(Roche，美国)进行emPCR扩增。最后在FLX+机器上进行测序反应。利用newbler(Version2.7)进行拼装。共得到个14008EST cluster，即14008条转录组序列。
2、采用软件MISA1.0对EST序列进行SSR位点的筛选
获得EST序列后先进行去冗余，然后从http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/下载misa.pl程序以识别EST序列中的SSR。参数设置如下：单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重复基元数目分别不少于12、6、5、5、4、4个；两个SSR序列间隔最小值为100，即序列间隔100bp以上的计为两个SSR位点。
3、采用软件Primer 3进行EST-SSR引物的设计
使用软件primer 3批量设计EST-SSR引物。引物设计参数：基于SSR重复单元前后的序列设计引物，每条SSR产生5条引物。引物长度在18-25bp之间，Tm 55-65℃，PCR扩增产物长度100-500bp。成功设计的引物位点共计1887个，得到1887对EST-SSR引物。
4、EST-SSR引物在牡丹不同野生种间的有效性和通用性鉴定
从步骤3获得的1887对EST-SSR引物中筛选6对EST-SSR引物(将其分别命名为Primer 1、Primer 2、Primer 3、Primer 4、Primer 5和Primer 6)进行有效性鉴定：以‘凤丹’的基因组DNA为模板,Primer 1至Primer 6这6对EST-SSR引物分别进行PCR，结果表明Primer 1至Primer 6这6对EST-SSR引物在‘凤丹’中均能得到100-300bp的PCR产物，Primer1至Primer 6均具有有效性。
对Primer 1至Primer 6进行通用性鉴定：以9种牡丹野生种(大花黄牡丹(Paeonialudlowii)、卵叶牡丹(Paeonia qiui)、紫斑牡丹(Paeonia rockii)、杨山牡丹(Paeoniaostii)、四川牡丹(Paeonia decomposita)、保氏牡丹(Paeonia potanini)、紫牡丹(Paeonia delavayi)、黄牡丹(Paeonia lutea)、稷山牡丹(Paeonia jishanensis)的基因组DNA为模板，分别用Primer 1至Primer 6这6对EST-SSR引物分别进行PCR扩增，在9种牡丹野生种中均能得到100-300bp的PCR产物的EST-SSR引物对具有通用性。
具体方法如下：
分别提取‘凤丹’和牡丹不同野生种(如下9种牡丹野生种：大花黄牡丹(Paeonialudlowii)、卵叶牡丹(Paeonia qiui)、紫斑牡丹(Paeonia rockii)、杨山牡丹(Paeoniaostii)、四川牡丹(Paeonia decomposita)、保氏牡丹(Paeonia potanini)、紫牡丹(Paeonia delavayi)、黄牡丹(Paeonia lutea)、稷山牡丹(Paeonia jishanensis))叶片的基因组DNA，浓度稀释至50ng·μL-1后置于-20℃保存备用。
Primer 1至Primer 6这6对EST-SSR引物分别进行PCR，每个引物对的PCR反应体系均采用30μL的反应体系，其中包括50ng模板DNA1.0μL、10mM的dNTPs 0.5μL、浓度5U TaqDNA聚合酶0.5μL、浓度10μM正反向引物0.5μL及10×PCR buffer 3.0μL。
扩增反应程序为：94℃预变性5min；然后进入35个循环：94℃变性30s，59-60℃复性30s，72℃延伸30s，最后72℃延伸10min。其中，59-60℃复性(退火)30s为PCR扩增采用的引物退火条件，Primer 1至Primer 6这6对EST-SSR引物的具体退火温度如表1所示。
反应结束后，对PCR产物进行毛细管电泳检测，进行STR分析，最后结果比对。根据提供的SSR分型数据，利用Populations软件构建基于个体的UPGMA聚类树，最后利用MEGA软件编辑进化树。
其中，Primer 1至Primer 6的序列如表1所示。
表6对EST-SSR引物序列及PCR扩增采用的引物退火温度
Figure BDA0001121449910000061
Figure BDA0001121449910000071
引物Primer 1对9种牡丹野生种的PCR扩增产物的毛细管电泳检测结果表明,引物Primer 1对9种牡丹野生种共扩增出9条DNA片段，该9条DNA片段均为多态性条带：引物Primer 1在大花黄牡丹(Paeonia ludlowii)中扩增得到大小分别为244bp,250bp的两个条带；在卵叶牡丹(Paeonia qiui)中扩增得到大小分别为225bp,234bp的两个条带；在紫斑牡丹(Paeonia rockii)中扩增得到大小分别为223bp,234bp的两个条带；在杨山牡丹(Paeonia ostii)中扩增得到大小分别为239bp,246bp的两个条带；在四川牡丹(Paeoniadecomposita)中扩增得到大小分别为223bp,240bp的两个条带；在保氏牡丹(Paeoniapotanini)中扩增得到大小为237bp的一个条带；在紫牡丹(Paeonia delavayi)中扩增得到大小分别为223bp,234bp的两个条带；在黄牡丹(Paeonia lutea)中扩增得到大小为237bp的一个条带；在稷山牡丹(Paeonia jishanensis)中扩增得到大小分别为225bp,234bp的两个条带(图1)。
引物Primer 2对9种牡丹野生种的PCR扩增产物的毛细管电泳检测结果表明,引物Primer 2对9种牡丹野生种共扩增出6条DNA片段，该6条DNA片段均为多态性条带：引物Primer 2在大花黄牡丹(Paeonia ludlowii)中扩增得到大小为225bp的一个条带；在卵叶牡丹(Paeonia qiui)中扩增得到大小分别为221bp,225bp,228bp的三个条带；在紫斑牡丹(Paeonia rockii)中扩增得到大小为227bp的一个条带；在杨山牡丹(Paeonia ostii)中扩增得到大小为233bp的一个条带；在四川牡丹(Paeonia decomposita)中扩增得到大小为227bp的一个条带；在保氏牡丹(Paeonia potanini)中扩增到大小分别为227bp,230bp,233bp三个条带；在紫牡丹(Paeonia delavayi)中扩增得到大小为233bp的一个条带；在黄牡丹(Paeonia lutea)中扩增得到大小为233bp的一个条带；在稷山牡丹(Paeoniajishanensis)中扩增得到大小为233bp的一个条带(图2)。
引物Primer 3对9种牡丹野生种的PCR扩增产物的毛细管电泳检测结果表明,引物Primer 3对9种牡丹野生种共扩增出6条DNA片段，该6条DNA片段均为多态性条带：引物Primer 3在大花黄牡丹(Paeonia ludlowii)中扩增得到大小为217bp的一个条带；在卵叶牡丹(Paeonia qiui)中扩增得到大小分别为224bp,236bp的两个条带；在紫斑牡丹(Paeonia rockii)中扩增得到大小为224bp的一个条带；在杨山牡丹(Paeonia ostii)中扩增得到大小分别为223bp,236bp的两个条带；在四川牡丹(Paeonia decomposita)中扩增得到大小为224bp的一个条带；在保氏牡丹(Paeonia potanini)中扩增到大小分别为214bp,230bp两个条带；在紫牡丹(Paeonia delavayi)中扩增得到大小为223bp的一个条带；在黄牡丹(Paeonia lutea)中扩增得到大小分别为217bp,224bp的两个条带；在稷山牡丹(Paeonia jishanensis)中扩增得到大小为211bp的一个条带(图3)。
引物Primer 4对9种牡丹野生种的PCR扩增产物的毛细管电泳检测结果表明,引物Primer 4对9种牡丹野生种共扩增出8条DNA片段，该8条DNA片段均为多态性条带：引物Primer 4在大花黄牡丹(Paeonia ludlowii)中扩增得到大小为243bp的一个条带；在卵叶牡丹(Paeonia qiui)中扩增得到大小为239bp的一个条带；在紫斑牡丹(Paeonia rockii)中扩增得到大小分别为235bp,247bp的两个条带；在杨山牡丹(Paeonia ostii)中扩增得到大小为239bp的一个条带；在四川牡丹(Paeonia decomposita)中扩增得到大小为227bp的一个条带；在保氏牡丹(Paeonia potanini)中扩增得到大小为239bp的一个条带；在紫牡丹(Paeonia delavayi)中扩增得到大小为249bp的一个条带；在黄牡丹(Paeonia lutea)中扩增得到大小分别为242bp,249bp的两个条带；在稷山牡丹(Paeonia jishanensis)中扩增得到大小为246bp的一个条带(图4)。
引物Primer 5对9种牡丹野生种的PCR扩增产物的毛细管电泳检测结果表明,引物Primer 5对9种牡丹野生种共扩增出7条DNA片段，该7条DNA片段均为多态性条带：引物Primer 5在大花黄牡丹(Paeonia ludlowii)中扩增得到大小为258bp的一个条带；在卵叶牡丹(Paeonia qiui)中扩增得到大小分别为256bp,261bp,265bp的三个条带；在紫斑牡丹(Paeonia rockii)中扩增得到大小为265bp的一个条带；在杨山牡丹(Paeonia ostii)中扩增得到大小为255bp的一个条带；在四川牡丹(Paeonia decomposita)中扩增得到大小为266bp的一个条带；在保氏牡丹(Paeonia potanini)中扩增得到大小分别为254bp,266bp的两个条带；在紫牡丹(Paeonia delavayi)中扩增得到大小为266bp的一个条带；在黄牡丹(Paeonia lutea)中扩增得到大小为266bp的一个条带；在稷山牡丹(Paeoniajishanensis)中扩增得到大小分别为256bp,266bp的两个条带(图5)。
引物Primer 6对9种牡丹野生种的PCR扩增产物的毛细管电泳检测结果表明,引物Primer 6对9种牡丹野生种共扩增出5条DNA片段，该5条DNA片段均为多态性条带：Primer 6在大花黄牡丹(Paeonia ludlowii)中扩增得到大小为258bp的一个条带；在卵叶牡丹(Paeonia qiui)中扩增得到大小为258bp的一个条带；在紫斑牡丹(Paeonia rockii)中扩增得到大小为252bp的一个条带；在杨山牡丹(Paeonia ostii)中扩增得到大小为258bp的一个条带；在四川牡丹(Paeonia decomposita)中扩增得到大小为253bp的一个条带；在保氏牡丹(Paeonia potanini)中扩增得到大小为258bp的一个条带；在紫牡丹(Paeoniadelavayi)中扩增得到大小分别为258bp,263bp的两个条带；在黄牡丹(Paeonia lutea)中扩增得到大小分别为258bp,263bp的两个条带；在稷山牡丹(Paeonia jishanensis)中扩增得到大小为260bp的一个条带(图6)。
结果表明，Primer 1至Primer 6这6对引物在所有材料中均能检测到清晰条带，Primer 1至Primer 6这6种EST-SSR分子标记的引物对(EST-SSR引物)中每一种引物对均可以在9种牡丹野生种的基因组DNA中扩增出多态性条带，多态性比例均为100％。多态性条带统计显示6种EST-SSR分子标记的引物对共扩增出41条DNA片段，这些DNA片段均为多态性条带，多态性比例为100％(表2)。说明筛选获得的Primer 1至Primer 6这6对EST-SSR引物均为有效引物且均具有通用性，可用于遗传多样性或亲缘关系等分子生物学实验。
表2、6种EST-SSR分子标记的引物对的多态性结果
引物对名称 总带数 多态性条带 多态性百分比(％)
Primer 1 9 9 100
Primer 2 6 6 100
Primer 3 6 6 100
Primer 4 8 8 100
Primer 5 7 7 100
Primer 6 5 5 100
总条带数 41 41
平均值 41 4.1 100
根据Primer 1至Primer 6这6对EST-SSR引物在供试材料(9种牡丹野生种)的基因组DNA上扩增的基因型数据，对9种牡丹野生种进行了遗传多样性分析，利用其数据构建的树状聚类图谱(图7)，可将供试材料分为两大类，一类属于牡丹组革质花盘亚组，包含稷山牡丹(Paeonia jishanensis)、卵叶牡丹(Paeonia qiui)、紫斑牡丹(Paeonia rockii)、杨山牡丹(Paeonia ostii)和四川牡丹(Paeonia decomposita)；第二类属于牡丹组肉质花盘亚组，包含大花黄牡丹(Paeonia ludlowii)、保氏牡丹(Paeonia potanini)、紫牡丹(Paeonia delavayi)和黄牡丹(Paeonia lutea)。6种EST-SSR分子标记的引物对的PCR扩增鉴定结果与传统的分类学鉴定方法结果一致。说明应用Primer 1至Primer 6这6对EST-SSR引物鉴定牡丹野生种的遗传多样性和亲缘关系是可行的，本申请利用牡丹转录组开发SSR引物的方法，适用于牡丹组EST-SSR引物的开发。
Figure IDA0001121449970000011
Figure IDA0001121449970000021
Figure IDA0001121449970000031

Claims (2)

1.牡丹的成套EST-SSR引物，由A和B组成，所述A为Primer 1，所述B为Primer 2至Primer 6；
所述Primer 1由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA组成；
所述Primer 2由SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的两条单链DNA组成；
所述Primer 3由SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的两条单链DNA组成；
所述Primer 4由SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的两条单链DNA组成；
所述Primer 5由SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示的两条单链DNA组成；
所述Primer 6由SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示的两条单链DNA组成。
2.权利要求1所述的牡丹的成套EST-SSR引物的下述A1-A5中的任一种用途：
A1、所述成套EST-SSR引物在构建牡丹遗传图谱中的应用；
A2、所述成套EST-SSR引物在牡丹种质鉴定中的应用；
A3、所述成套EST-SSR引物在牡丹遗传多样性分析中的应用；
A4、所述成套EST-SSR引物在牡丹亲缘关系分析中的应用；
A5、所述成套EST-SSR引物在牡丹分子标记辅助育种中的应用；
所述牡丹可为下述9种牡丹野生种中的9种、8种、7种、6种、5种、4种、3种、2种或1种：大花黄牡丹（Paeonia ludlowii）、卵叶牡丹（Paeonia qiui）、紫斑牡丹（Paeonia rockii）、杨山牡丹（Paeonia ostii）、四川牡丹（Paeonia decomposita）、保氏牡丹（Paeoniapotanini）、紫牡丹（Paeonia delavayi）、黄牡丹（Paeonia lutea）和稷山牡丹（Paeoniajishanensis）。
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