CN110029186B - 牡丹ssr标记、其引物对及dna分子身份证的构建 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了牡丹SSR标记、其引物对及DNA分子身份证的构建。本发明公开的牡丹SSR标记，由利用序列表中序列1‑40所示的40条单链DNA组成的引物组进行PCR扩增得到。利用本发明的引物组对不同牡丹品种进行PCR扩增，所得PCR产物均不相同，可以作为SSR标记用于鉴定牡丹基因型，进一步还可用于构建牡丹DNA分子身份证以及区分不同牡丹品种。本发明构建的牡丹DNA分子身份证直观，为牡丹品种资源的保护、利用及管理提供重要依据重要意义。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及牡丹SSR标记、其引物对及DNA分子身份证的构建。
背景技术
牡丹(Paeonia suffruticosa)隶属于芍药科(Paeoniaceae)芍药属(Paeonia)牡丹组(Sect.Moutan DC.)，落叶亚灌木，是我国传统名花，被誉为“花中之王”，具有重要的观赏价值和药用价值。近年来，研究还发现牡丹是一种优良的木本油料作物资源。因此，深入研究牡丹重要性状的分子机制是加速牡丹遗传改良的基础。
分子标记辅助选择(Marker-assisted selection，MAS)策略是利用分子标记与控制表型性状基因紧密连锁特点，达到快速准确筛选优势基因型，缩短育种周期，提高育种效率。在众多的分子标记中，简单重复序列(Simple sequence repeat，SSR)亦称微卫星DNA，由于具有高信息含量、变异丰富、分布广泛且扩增稳定及共显性遗传等特点，被认为是一种理想的分子标记。近年来，研究者利用磁珠富集法和转录组测序法已经开发了一些牡丹SSR标记。然而，先前开发的SSR位点多来自基因组的随机区域，不清楚所在序列功能，多呈中性进化，往往与物种表型性状的连锁不紧密。与此不同，基因内开发的SSR标记，由于功能的重要性，在进化过程中往往会受到较强烈的选择压，导致与物种的表型性状紧密连锁。因此，开发功能基因内SSR标记是利用该技术进行重要性状分子标记辅助育种的前提。
目前牡丹已经拥有大约2100个品种，随着品种的日益增多，牡丹品种的区分和鉴定越来越难，已成为困扰育种家和花农们的难题。DNA分子身份证是将植物种质资源的DNA指纹图谱按照一定规则转换为由数字或字母等符号构成的条形码标记，达到了在品种检索时更加直观的目的，为牡丹品种资源的保护、利用及管理提供重要依据重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种区分牡丹品种的方法及所用引物。
本发明首先提供了鉴定牡丹基因型的方法，所述方法包括：利用引物组对待测牡丹的基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR产物，检测各引物对PCR产物的大小，确定所述待测牡丹的基因型；所述引物组包括PSA5、PSB2、PSB7、PSB10、PSC3、PSC4、PSC8和PSD4中的至少一种；
所述PSA5为由序列表中序列1和2所示的两条单链DNA组成的引物对；
所述PSB2为由序列表中序列3和4所示的两条单链DNA组成的引物对；
所述PSB7为由序列表中序列5和6所示的两条单链DNA组成的引物对；
所述PSB10为由序列表中序列7和8所示的两条单链DNA组成的引物对；
所述PSC3为由序列表中序列9和10所示的两条单链DNA组成的引物对；
所述PSC4为由序列表中序列11和12所示的两条单链DNA组成的引物对；
所述PSC8为由序列表中序列13和14所示的两条单链DNA组成的引物对；
所述PSD4为由序列表中序列15和16所示的两条单链DNA组成的引物对。
所述引物组还包括PS180、PS144、PS158、PS356、PS068、PS166、PS271、PS095、PS273、PS280、PS033和PS193中的至少一种；
所述PS180为由序列表中序列17和18所示的两条单链DNA组成的引物对；
所述PS144为由序列表中序列19和20所示的两条单链DNA组成的引物对；
所述PS158为由序列表中序列21和22所示的两条单链DNA组成的引物对；
所述PS356为由序列表中序列23和24所示的两条单链DNA组成的引物对；
所述PS068为由序列表中序列25和26所示的两条单链DNA组成的引物对；
所述PS166为由序列表中序列27和28所示的两条单链DNA组成的引物对；
所述PS271为由序列表中序列29和30所示的两条单链DNA组成的引物对；
所述PS095为由序列表中序列31和32所示的两条单链DNA组成的引物对；
所述PS273为由序列表中序列33和34所示的两条单链DNA组成的引物对；
所述PS280为由序列表中序列35和36所示的两条单链DNA组成的引物对；
所述PS033为由序列表中序列37和38所示的两条单链DNA组成的引物对；
所述PS193为由序列表中序列39和40所示的两条单链DNA组成的引物对。
所述引物组可由所述PSA5、所述PSB2、所述PSB7、所述PSB10、所述PSC3、所述PSC4、所述PSC8和所述PSD4中的全部组成。
所述引物组可由所述PSA5、所述PSB2、所述PSB7、所述PSB10、所述PSC3、所述PSC4、所述PSC8、所述PSD4、所述PS180、所述PS144、所述PS158、所述PS356、所述PS068、所述PS166、所述PS271、所述PS095、所述PS273、所述PS280、所述PS033和所述PS193中的全部组成。
所述PSA5、所述PSB2、所述PSB7、所述PSB10、所述PSC3、所述PSC4、所述PSC8、所述PSD4、所述PS180、所述PS144、所述PS158、所述PS356、所述PS068、所述PS166、所述PS271、所述PS095、所述PS273、所述PS280、所述PS033和所述PS193均可标记有荧光物质。荧光物质可标记在各引物对正向引物的5′端。各引物对所标记的荧光物质如表3所示。序列表中序列号为奇数的单链DNA为正向引物，序列号为偶数的单链DNA为反向引物。
进行PCR扩增时，所述PSA5的退火温度可为54℃；所述PSB2的退火温度可为54℃；所述PSB7的退火温度可为54℃；所述PSB10的退火温度可为54℃；所述PSC3的退火温度可为54℃；所述PSC4的退火温度可为52℃；所述PSC8的退火温度可为52℃；所述PSD4的退火温度可为55℃；所述PS180的退火温度可为60℃；所述PS144的退火温度可为54℃；所述PS158的退火温度可为55℃；所述PS356的退火温度可为53℃；所述PS068的退火温度可为52℃；所述PS166的退火温度可为55℃；所述PS271的退火温度可为56℃；所述PS095的退火温度可为55℃；所述PS273的退火温度可为58℃；所述PS280的退火温度可为52℃；所述PS033的退火温度可为54℃；所述PS193的退火温度可为55℃。
进行PCR扩增时，每对引物分别单独进行。各单链DNA在PCR扩增反应体系中的浓度可为10μM。各引物对的10μL反应体系均可为：模板DNA(25ng)1μL，2×Power Taq PCRMasterMix(北京艾德莱生物科技有限公司货号：PC09)5μL，正反向引物各0.5μL，ddH2O 3μL。
进行PCR扩增的反应条件均可为：95℃预变性5min；95℃变性30s，各自退火温度30s，72℃延伸1min，30-35个循环；72℃延伸10min。
所述基因型可体现在上述各引物对以牡丹基因组DNA进行PCR扩增得到的SSR标记上。
所述鉴定牡丹基因型的方法在鉴定牡丹等位基因多态性或牡丹变体或牡丹品种中的应用，也属于本发明的保护范围。
所述鉴定牡丹基因型的方法在鉴定牡丹种群中相同或相关基因型中的应用，也属于本发明的保护范围。
所述鉴定牡丹基因型的方法在研究牡丹种群遗传多样性中的应用，也属于本发明的保护范围。
所述鉴定牡丹基因型的方法在牡丹种质资源的分类和/或鉴定中的应用，也属于本发明的保护范围。
所述鉴定牡丹基因型的方法在牡丹遗传连锁图谱构建中的应用，也属于本发明的保护范围。
所述鉴定牡丹基因型的方法在牡丹候选基因关联作图中的应用，也属于本发明的保护范围。
所述鉴定牡丹基因型的方法在牡丹分子标记辅助育种中的应用，也属于本发明的保护范围。
本发明还提供了所述引物组，所述引物组可用于鉴定牡丹基因型。
由所述引物组以牡丹基因组DNA进行PCR扩增得到的SSR标记，也属于本发明的保护范围。
所述引物组或所述SSR标记在鉴定牡丹等位基因多态性或牡丹变体或牡丹品种中的应用，也属于本发明的保护范围。
所述引物组或所述SSR标记在鉴定牡丹种群中相同或相关基因型中的应用，也属于本发明的保护范围。
所述引物组或所述SSR标记在研究牡丹种群遗传多样性中的应用，也属于本发明的保护范围。
所述引物组或所述SSR标记在牡丹种质资源的分类和/或鉴定中的应用，也属于本发明的保护范围。
所述引物组或所述SSR标记在牡丹遗传连锁图谱构建中的应用，也属于本发明的保护范围。
所述引物组或所述SSR标记在牡丹候选基因关联作图中的应用，也属于本发明的保护范围。
所述引物组或所述SSR标记在牡丹分子标记辅助育种中的应用，也属于本发明的保护范围。
本发明还提供了区分两种待测牡丹是否为同一品种的方法，所述方法包括：利用所述引物组对两种待测牡丹的基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR产物，比较两种待测牡丹各引物对PCR产物的大小，所述引物组中每一对引物PCR扩增产物的大小均相同的两种待测牡丹为或候选为同一品种，所述引物组中至少一对引物PCR扩增产物的大小不同的两种待测牡丹为或候选为不同品种。
本发明还提供了牡丹DNA分子身份证的构建方法，所述方法包括：利用所述引物组对待测牡丹的基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR产物，将各引物对的每种PCR产物分别利用不同数字或字母进行标记，然后按照一定的引物顺序排列，得到待测牡丹的DNA分子身份证。
将各引物对的每种PCR产物分别利用不同数字或字母进行标记可为利用不同数字或字母对各引物对的各种大小PCR产物进行标记。各种大小PCR产物可体现在PCR产物的带型上。
所述牡丹可为表2中的任何品种，也可为‘雪峰’(P.×suffruticosa′Xue Feng′)、‘白妙’(P.×suffruticosa′Bai Miao′)、‘岛乃藤’(P.×suffruticosa′Dao Nai Teng′)、‘岛根吉野川’(P.×suffruticosa′Dao Gen Ji Ye Chuan′)、‘海黄’(P.×suffruticosa′Hai Huang′)、‘金阁’(P.×suffruticosa′Jin Ge′)、‘时雨云’(P.×suffruticosa′Shi YuYun′)和‘脂红’(P.×suffruticosa′Zhi Hong′)以及表2中的任何品种，也可为‘白雁’(P.×suffruticosa′Bai Yan′)、‘初乌’(P.×suffruticosa ′Chu Wu′)、‘皇冠’P.×suffruticosa′Huang Guan′)、‘雪峰’(P.×suffruticosa′Xue Feng′)、‘白妙’(P.×suffruticosa′Bai Miao′)、‘岛乃藤’(P.×suffruticosa′Dao Nai Teng′)、‘岛根吉野川’(P.×suffruticosa′Dao Gen Ji Ye Chuan′)、‘海黄’(P.×suffruticosa′Hai Huang′)、‘金阁’(P.×suffruticosa′Jin Ge′)、‘时雨云’(P.×suffruticosa′Shi Yu Yun′)和‘脂红’(P.×suffruticosa′Zhi Hong′)以及表2中的任何品种。
本发明还可利用牡丹DNA分子身份证区分不同的品种。
实验证明，利用本发明的引物组对不同牡丹品种进行PCR扩增，所得PCR产物均不相同，可以用于鉴定以所得PCR产物表示的SSR决定的牡丹基因型，进一步还可用于构建牡丹DNA分子身份证以及区分不同牡丹品种。本发明构建的牡丹DNA分子身份证直观，为牡丹品种资源的保护、利用及管理提供重要依据重要意义。
附图说明
图1为部分品种的检测结果。蓝(A)、绿(B)、黑(C)和红(D)四种颜色分别代表FAM、HEX、TAMRA和ROX四种荧光修饰。A、B、C、D分别表示引物PS144、PS166、PS271和PS158。1-16分别代表牡丹品种‘花兢’、‘白妙’、‘白雁’、‘五大洲’、‘出梗绣球’、‘藏娇’、‘合欢娇’、‘明星’、‘八千代椿’、‘狮子头’、‘八束狮子’、‘白王狮子’、‘岛根吉野川’、‘紫羽丹霞’、‘明月花’和‘红荷’。
具体实施方式
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1、用于区分牡丹品种的SSR标记及牡丹DNA分子身份证的构建
本实施例提供了一组可以用于区分牡丹品种的SSR标记，及可以扩增该组SSR标记的一组引物，引物信息如表1所示。
表1、20对多态性引物信息
表1中F为正向引物，R为反向引物，每对引物进行PCR扩增的10μL反应体系为：模板DNA(25ng/μL)1μL，2×Power Taq PCR MasterMix(北京艾德莱生物科技有限公司货号：PC09)5μL，正反向引物各0.5μL(正反向引物在反应体系中的浓度均为10μM)，ddH2O 3μL。
PCR扩增反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，各自退火温度30s，72℃延伸1min，30-35个循环；72℃延伸10min。
引物的稳定性：
按照上述反应体系和反应条件，利用表1中的引物分别以牡丹品种‘白雁’(P.×suffruticosa ′Bai Yan′)、‘初乌’(P.×suffruticosa′Chu Wu′)和‘皇冠’P.×suffruticosa′Huang Guan′)的基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳进行检测，随后利用FluorchemTM5500(Alfa Innotech Corp.，USA)凝胶成像仪对电泳结果进行观察与记录，结果显示PCR产物条带均清晰、单一，表1中的引物扩增稳定。
其中，‘白雁’(P.×suffruticosa′Bai Yan′)、‘初乌’(P.×suffruticosa′ChuWu′)和‘皇冠’P.×suffruticosa′Huang Guan′)均来自于洛阳隋唐植物园，并均记载在文献(李嘉珏，张西方，赵孝庆.中国牡丹[M].北京：中国大百科，2011.)中
引物的多态性：
之后委托北京睿博兴科生物技术有限公司对表1各引物对的正向引物的5′端进行荧光标记，所标记物质见表3。然后按照上述反应体系和反应条件，以8个表型差异较大的牡丹品种基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增后于ABI3730DNA分析仪上进行毛细管电泳，并收集数据，验证多态性。利用GeneMarker version 2.2.0软件分析和读取数据，得到各品种的指纹数据。其中，标准内参为LIZ600(Applied Biosystems)。所用8个牡丹品种为：‘雪峰’(P.×suffruticosa′Xue Feng′)、‘白妙’(P.×suffruticosa′Bai Miao′)、‘岛乃藤’(P.×suffruticosa′Dao Nai Teng′)、‘岛根吉野川’(P.×suffruticosa′Dao Gen Ji YeChuan′)、‘海黄’(P.×suffruticosa′Hai Huang′)、‘金阁’(P.×suffruticosa′Jin Ge′)、‘时雨云’(P.×suffruticosa′Shi Yu Yun′)和‘脂红’(P.×suffruticosa′Zhi Hong′)，均来自于洛阳隋唐植物园。
结果显示，表1中的20对引物具有多态性，每个品种的20对引物的PCR扩增产物均不完全相同。
牡丹DNA分子身份证的构建：
190个牡丹品种被用于DNA分子身份证构建，其中包括58个日本品种(编号1-58)、2个法国品种(编号59-60)、2个美国品种(编号61-62)和128个中原品种(编号63-190)，信息见表2。
利用将表1的引物进行荧光标记后的引物分别以190个牡丹品种的基因组DNA为模板按照上述反应体系和反应条件进行PCR扩增，将得到的PCR产物进行毛细管电泳检测，利用GeneMarker version 2.2.0软件分析和读取数据，得到各品种的指纹数据。其中，标准内参为LIZ600(Applied Biosystems)。部分品种的结果如图1所示。
表2、190个牡丹种品种来源
注：表2中备注中标为“1”的品种均记载在“李嘉珏，张西方，赵孝庆.中国牡丹[M].北京：中国大百科，2011”中，备注中未标“1”的品种均来自于洛阳市西工区金苑牡丹种植园。
如表3所示，20对引物对190个牡丹品种进行扩增，共检测到153个等位基因，每对引物检测到2-15个等位基因，平均7.65个；共检测到372个带型，每对引物检测到带型数3-37个，平均18.63个；扩增的片段长126～522bp。
表3、20对引物对190个牡丹品种的扩增结果
将指纹数据转换为数字编码，即分子身份证。转换方法如下：将每对引物在某一品种样品上扩增出的每一种带型用数字1～9编码表示；若带型超过9时则依次增加A-Z进行编码；再超过Z时用a-z进行编码；无带用0表示，见表4。按照引物扩增带型数由少到多的顺序，将每个样品在20对引物上的扩增带型数据串联起来，即得到每个样品以20位数字或字母表示的DNA分子身份证。
按表4引物的顺序即PSD4、PSB10、PSC8、PSA5、PS180、PS144、PS158、PS356、PS068、PS166、PS271、PSB7、PS095、PS273、PSC4、PS280、PS033、PSB2、PS193和PSC3，将每对引物在样品上扩增的带型编码进行串联排列，得到190个样品的分子身份证代码(表5)。获得190个牡丹品种的分子身份证代码均不相同，能够将所有品种区分开，在对应的位置上，代码相同表示该引物在样品上扩增带型相同。
20对引物共检测到153个等位基因和372个带型，190个牡丹品种SSR分子身份证互不相同，能够达到区分各品种的目的，区分方法包括如下A1)或A2)：
A1)利用表1中的20对引物分别对两种待测牡丹进行PCR扩增，得到各待测牡丹的PCR扩增产物，比较各待测牡丹20对引物中每一对引物PCR扩增产物的大小，20对引物中每一对引物PCR扩增产物的大小均相同的两种待测牡丹为同一品种，20对引物中至少一对引物PCR扩增产物的大小不同的两种待测牡丹为不同品种；
A2)利用表1中的20对引物分别对至少两种待测牡丹进行PCR扩增，得到各待测牡丹的PCR扩增产物，根据各PCR扩增产物的大小按照表4的方法给出待测牡丹的DNA分子身份证，DNA分子身份证相同的两种待测牡丹为同一品种，DNA分子身份证不同的两种待测牡丹为不同品种。
本发明还可以利用表1中的20对引物判断待测牡丹是否与标准牡丹为同一品种，标准牡丹为‘雪峰’(P.×suffruticosa′Xue Feng′)、‘白妙’(P.×suffruticosa ′BaiMiao′)、‘岛乃藤’(P.×suffruticosa′Dao Nai Teng′)、‘岛根吉野川’(P.×suffruticosa′Dao Gen Ji Ye Chuan′)、‘海黄’(P.×suffruticosa′Hai Huang′)、‘金阁’(P.×suffruticosa′Jin Ge′)、‘时雨云’(P.×suffruticosa′Shi Yu Yun′)和‘脂红’(P.×suffruticosa′Zhi Hong′)以及表2中的任何品种，该方法包括如下B1)或B2)：
B1)利用表1中的20对引物对待测牡丹进行PCR扩增，得到待测牡丹的PCR扩增产物，比较待测牡丹与标准牡丹20对引物中每一对引物PCR扩增产物的大小，如待测牡丹与标准牡丹中某一牡丹的20对引物的PCR扩增产物的大小均相同，则该待测牡丹与该标准牡丹为同一品种，如待测牡丹与标准牡丹中任一牡丹的20对引物PCR扩增产物的大小均不完全相同，则待测牡丹不为标准牡丹中任一牡丹品种；
B2)利用表1中的20对引物对待测牡丹进行PCR扩增，得到待测牡丹的PCR扩增产物，根据各PCR扩增产物的大小按照表4的方法给出待测牡丹的DNA分子身份证，如待测牡丹与标准牡丹中某一牡丹的DNA分子身份证相同，则该待测牡丹与该标准牡丹为同一品种，如待测牡丹与标准牡丹中任一牡丹的DNA分子身份证均不完全相同，则待测牡丹不为标准牡丹中任一牡丹品种。
序列表
<110> 北京农学院
<120> 牡丹SSR标记、其引物对及DNA分子身份证的构建
<130> WHOI190029
<160> 40
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
tgctgctttc cctcttct 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
ctgacccaat gccctatt 18
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
agtgggagga ggaagagt 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
gtggtggtga gcatgtaa 18
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
acagggtgat gcctttta 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
tgcacagatg ttcaatgc 18
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
cccaacgact cttctgta 18
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
cgtataattg ttcatccc 18
<210> 9
<211> 18
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cttccagccc acaacaac 18
Claims (12)
1.用于鉴定牡丹基因型的引物组，由PSA5、PSB2、PSB7、PSB10、PSC3、PSC4、PSC8、PSD4、PS180、PS144、PS158、PS356、PS068、PS166、PS271、PS095、PS273、PS280、PS033和PS193组成；
所述PSA5为由序列表中序列1和2所示的两条单链DNA组成的引物对；
所述PSB2为由序列表中序列3和4所示的两条单链DNA组成的引物对；
所述PSB7为由序列表中序列5和6所示的两条单链DNA组成的引物对；
所述PSB10为由序列表中序列7和8所示的两条单链DNA组成的引物对；
所述PSC3为由序列表中序列9和10所示的两条单链DNA组成的引物对；
所述PSC4为由序列表中序列11和12所示的两条单链DNA组成的引物对；
所述PSC8为由序列表中序列13和14所示的两条单链DNA组成的引物对；
所述PSD4为由序列表中序列15和16所示的两条单链DNA组成的引物对；
所述PS180为由序列表中序列17和18所示的两条单链DNA组成的引物对；
所述PS144为由序列表中序列19和20所示的两条单链DNA组成的引物对；
所述PS158为由序列表中序列21和22所示的两条单链DNA组成的引物对；
所述PS356为由序列表中序列23和24所示的两条单链DNA组成的引物对；
所述PS068为由序列表中序列25和26所示的两条单链DNA组成的引物对；
所述PS166为由序列表中序列27和28所示的两条单链DNA组成的引物对；
所述PS271为由序列表中序列29和30所示的两条单链DNA组成的引物对；
所述PS095为由序列表中序列31和32所示的两条单链DNA组成的引物对；
所述PS273为由序列表中序列33和34所示的两条单链DNA组成的引物对；
所述PS280为由序列表中序列35和36所示的两条单链DNA组成的引物对；
所述PS033为由序列表中序列37和38所示的两条单链DNA组成的引物对；
所述PS193为由序列表中序列39和40所示的两条单链DNA组成的引物对。
2.鉴定牡丹基因型的方法，包括：利用权利要求1所述的引物组对待测牡丹的基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR产物，检测各引物对PCR产物的大小，确定所述待测牡丹的基因型。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：进行PCR扩增时，所述PSA5的退火温度为54℃；所述PSB2的退火温度为54℃；所述PSB7的退火温度为54℃；所述PSB10的退火温度为54℃；所述PSC3的退火温度为54℃；所述PSC4的退火温度为52℃；所述PSC8的退火温度为52℃；所述PSD4的退火温度为55℃；所述PS180的退火温度为60℃；所述PS144的退火温度为54℃；所述PS158的退火温度为55℃；所述PS356的退火温度为53℃；所述PS068的退火温度为52℃；所述PS166的退火温度为55℃；所述PS271的退火温度为56℃；所述PS095的退火温度为55℃；所述PS273的退火温度为58℃；所述PS280的退火温度为52℃；所述PS033的退火温度为54℃；所述PS193的退火温度为55℃。
4.权利要求1所述引物组、权利要求2或3所述的方法在鉴定牡丹等位基因多态性或牡丹变体或牡丹品种中的应用。
5.权利要求1所述引物组、权利要求2或3所述的方法在鉴定牡丹种群中相同或相关基因型中的应用。
6.权利要求1所述引物组、权利要求2或3所述的方法在研究牡丹种群遗传多样性中的应用。
7.权利要求1所述引物组、权利要求2或3所述的方法在牡丹种质资源的分类和/或鉴定中的应用。
8.权利要求1所述引物组、权利要求2或3所述的方法在牡丹遗传连锁图谱构建中的应用。
9.权利要求1所述引物组、权利要求2或3所述的方法在牡丹候选基因关联作图中的应用。
10.权利要求1所述引物组、权利要求2或3所述的方法在牡丹分子标记辅助育种中的应用。
11.区分两种待测牡丹是否为同一品种的方法，包括：利用权利要求1所述引物组对两种待测牡丹的基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR产物，比较两种待测牡丹各引物对PCR产物的大小，所述引物组中每一对引物PCR扩增产物的大小均相同的两种待测牡丹为或候选为同一品种，所述引物组中至少一对引物PCR扩增产物的大小不同的两种待测牡丹为或候选为不同品种。
12.牡丹DNA分子身份证的构建方法，包括：利用权利要求1所述引物组对待测牡丹的基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR产物，将各引物对的每种PCR产物分别利用不同数字或字母进行标记，然后按照一定的引物顺序排列，得到待测牡丹的DNA分子身份证。
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