CN112251528B

CN112251528B - 用于鉴定百合倍性的微卫星dna分子标记及其应用

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Publication number: CN112251528B
Application number: CN202011119778.6A
Authority: CN
Inventors: 贾桂霞; 周艳萍; 李介文; 汪莲娟; 余鹏程; 何恒斌; 高雪
Original assignee: Beijing Forestry University
Current assignee: Beijing Forestry University
Priority date: 2020-10-19
Filing date: 2020-10-19
Publication date: 2021-07-06
Anticipated expiration: 2040-10-19
Also published as: CN112251528A

Abstract

本发明涉及DNA分子标记技术领域，具体涉及用于鉴定百合倍性的微卫星DNA分子标记及其应用。本发明提供用于鉴定百合倍性的微卫星DNA分子标记，其包含9个微卫星DNA分子标记J1‑044、J2‑080、J3‑091、J4‑094、J5‑096、J6‑098、J7‑117、J8‑123、J9‑167中的一个或多个的组合。本发明还提供了扩增9个微卫星DNA分子标记的引物，并基于此建立了利用微卫星DNA分子标记进行百合倍性鉴定的方法。本发明提供的微卫星DNA分子标记及百合倍性的鉴定方法具有重复性好，准确率高的特点，为百合倍性鉴定提供了可靠有效的技术支撑。

Description

用于鉴定百合倍性的微卫星DNA分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及DNA分子标记技术领域，具体涉及用于鉴定百合倍性的微卫星DNA分子标记及其应用。

背景技术

百合(Lilium spp.)是单子叶植物亚纲百合科(Liliaceae)百合属(Lilium)所有种类的总称，是世界著名的球根花卉，可用于切花、盆花和园林绿化，而且药用和食用历史十分悠久。

百合育种有一百多年的历史，几乎每年都有新品种不断涌现出。百合育种的亲本材料除野生资源外，大量的栽培品种成为主要的亲本材料。国际上通行的百合品种分类主要釆用英国皇家园艺学会(Royal Horticultural Society，RHS)和北美百合学会(NorthAmerican Lily Society，NALS)指定的分类系统，即根据百合不同栽培品种与其原始亲缘种或杂种的遗传衍生关系、花色、花型、姿态特征等进行分类(龙雅宜,张金政.百合属植物资源的保护与利用[J].植物资源与环境,1998(01):40-44.)。目前百合主要的现代栽培品种群如下：亚洲百合杂种系(Asiatic Hybrids，简称A)、东方百合杂种系(OrientalHybrids，简称O)、麝香百合杂种系(Longiflorum Hybrids，简称L)、喇叭杂种系(Trumpetand Aurelian Hybrids，简称T)、纯白百合杂种系(Candidum Hybrids)、美洲百合杂种系(American Hybrids)、轮叶百合杂种系(Martagon Hybrids)、其他杂种系[如麝亚百合杂种系(Longiflorum Asiatic Hybrids，简称LA)、东喇百合杂种系OT、麝东百合杂种系LO等]。

现代百合商业品种中，各杂种系多起源于组内杂交，亚洲百合杂种系(A)来自于卷瓣组(Sinomartagon)，东方百合杂种系来自于具叶柄组(Archelirion)，麝香百合杂种系来自于喇叭组(Leucolirion)，除了亚百系列部分品种为三倍体或四倍体(Zhou SJ.Aneuploidy in Lily Breeding[J].Acta Horticulturae.2014,(1027):149-154.)，这些品种大多为二倍体。近年来，LA(亚洲百合×麝香百合)、LO(麝香百合×东方百合)、OT(东方百合×喇叭百合)等组间杂种系越来越受市场青睐，这些杂种多是通过远缘杂交、以及F1加倍或2n配子的诱导后再反复杂交获得的，致使品种的倍性多样。现有研究表明，LA杂种系主要为三倍体(李克虎,周桂雪,任桂玲,张线线,郭方其,周树军.百合品种染色体倍性观察[J].园艺学报.2011,38(5):970-976；霍辰思,白锦荣,窦晓莹,郎利新,孔滢,尚宏忠.8个LA百合品种的核型分析[J].山西农业大学学报(自然科学版).2018,38(3):57-62.)；LO品种现有少数报道为三倍体(李克虎,周桂雪,任桂玲,张线线,郭方其,周树军.百合品种染色体倍性观察[J].园艺学报.2011,38(5):970-976；Van Tuyl J M,Arens P.Lilium:Breedinghistory of the modern cultivar assortment[J].Acta horticulturae.2011,900.)；OT百合既有二倍体、三倍体也有四倍体(Emsweller S L,Uhring J.Lilium×'BlackBeauty'—diploid and amphidiploid[J].Lily Year Book.1966,29:45-47.；李克虎,周桂雪,任桂玲,张线线,郭方其,周树军.百合品种染色体倍性观察[J].园艺学报.2011,38(5):970-976；周桂雪.亚洲百合品种倍性调查与倍性间杂交分析[D].浙江大学硕士学位论文,2011；于雪,张铭芳,封紫,袁晓娜,贾桂霞.6个东方百合品种的染色体核型分析[J].广东农业科学.2012,10:137-144.；)。因此，百合品种的倍性鉴定已成为目前百合育种首要解决的关键问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于鉴定百合倍性的微卫星DNA(SSR)分子标记，本发明的另一目的是提供该微卫星DNA分子标记的应用。

为实现上述目的，本发明通过对多个品种的百合进行转录组测序，以转录组测序得到的序列为参考，对拼接组装得到的Unigenes进行SSR位点的识别定位；对筛选得到的含SSR位点的Unigene序列设计引物，保证SSR位点侧翼序列长度≥50bp；进一步对设计得到的引物进行排序和比较，从两万多对引物中，筛选得到151对多态性高的引物。利用15个不同品种的百合对筛选得到的151对引物进行进一步筛选，使用Touchdown PCR程序初筛，共筛选得到69对引物，合成含M13接头的引物，进一步复筛，复筛主要利用两步法PCR程序，最终选择了43对多态性较高、较稳定的核心引物进行后续试验。利用筛选得到的43对核心引物、以290个百合不同品种及野生种的基因组DNA为模板进行SSR-PCR扩增，筛选得到条带清晰、较稳定、多态性高、可用于百合倍性鉴定的微卫星标记9个，其编号分别为J1-044、J2-080、J3-091、J4-094、J5-096、J6-098、J7-117、J8-123、J9-167，其引物序列分别如SEQ ID NO.1-18所示。

基于上述发现，本发明提供以下技术方案：

本发明提供用于鉴定百合倍性的微卫星DNA分子标记，其包含微卫星DNA分子标记J1-044、J2-080、J3-091、J4-094、J5-096、J6-098、J7-117、J8-123、J9-167中的一个或多个的组合；其中，J1-044由SEQ ID NO.1-2所示引物扩增得到，J2-080由SEQ ID NO.3-4所示引物扩增得到，J3-091由SEQ ID NO.5-6所示引物扩增得到，J4-094由SEQ ID NO.7-8所示引物扩增得到，J5-096由SEQ ID NO.9-10所示引物扩增得到，J6-098由SEQ ID NO.11-12所示引物扩增得到，J7-117由SEQ ID NO.13-14所示引物扩增得到，J8-123由SEQ ID NO.15-16所示引物扩增得到，J9-167由SEQ ID NO.17-18所示引物扩增得到。

以上所述的引物序列具体如下：

SEQ ID NO.1：J1-044F:5'-CAGTATAATTAGTGACGTGCCTGG-3'

SEQ ID NO.2：J1-044R:5'-TCAATACTCTCACAATCCTCCAAA-3'

SEQ ID NO.3：J2-080F:5'-GGAGGGACTCTCGAGTATTTATCA-3'

SEQ ID NO.4：J2-080R:5'-GCTTCCTGTTTATCTCCACTGATT-3'

SEQ ID NO.5：J3-091F:5'-GTCATCACAATACCCTCTCTGGA-3'

SEQ ID NO.6：J3-091R:5'-CTCAGGTAACAGATCCTGCACAC-3'

SEQ ID NO.7：J4-094F:5'-GTCTCTCCTTCCCCATACCCTA-3'

SEQ ID NO.8：J4-094R:5'-AGTACAGCGAGGATCCGTACAT-3'

SEQ ID NO.9：J5-096F:5'-GTCTTTAAACCTCAGGCAACAAGT-3'

SEQ ID NO.10：J5-096R:5'-AGGACCTTGAACATATGTCTGTGA-3'

SEQ ID NO.11：J6-098F:5'-GTGTTGCTGCTCCATGTATTTAAC-3'

SEQ ID NO.12：J6-098R:5'-TACACTTCTCAATGTTCCCTTCAA-3'

SEQ ID NO.13：J7-117F:5'-TGTCTACAATCGAGGAAGTTGAAG-3'

SEQ ID NO.14：J7-117R:5'-GGTTACCTACATAGACCCTGTTGC-3'

SEQ ID NO.15：J8-123F:5'-TTTTTATCTCCTCGAGACTGATCC-3'

SEQ ID NO.16：J8-123R:5'-ATCTTTCTCTGCTGGTTCTCATTT-3'

SEQ ID NO.17：J9-167F：5'-ACCACATCAGATCCAAACAATG-3'

SEQ ID NO.18：J9-167R:5'-AGGTCATGCAGAGATCTTGTGTT-3'。

在进行百合倍性鉴定时，可使用微卫星DNA分子标记J1-044、J2-080、J3-091、J4-094、J5-096、J6-098、J7-117、J8-123、J9-167中的任意1个，或者任意2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个的组合，或者使用上述9个分子标记的组合。

在未知百合品种时，优选使用上述9个微卫星DNA分子标记的组合进行倍性鉴定。

优选地，本发明所述的用于鉴定百合倍性的微卫星DNA分子标记包含J1-044、J2-080、J3-091、J4-094、J5-096、J6-098、J7-117、J8-123和J9-167的组合。

以上所述的微卫星DNA分子标记的信息如表1所示。

表1微卫星DNA分子标记的信息

具体地，对于岷江百合，微卫星DNA分子标记J1-044、J2-080、J6-098的EST序列如SEQ ID NO.19-20及24所示；对于百合品种‘索邦’，微卫星DNA分子标记J3-091、J5-096、J7-117、J8-123的EST序列如SEQ ID NO.21、23、25及26所示；对于百合品种‘白光二号’，微卫星DNA分子标记J4-094的EST序列如SEQ ID NO.22所示；对于百合品种‘Tiny Todd’，微卫星DNA分子标记J9-167的EST序列如SEQ ID NO.27所示。

本发明还提供用于扩增所述微卫星DNA分子标记的引物或引物组合，其为选自SEQID NO.1-18所示引物的一对或多对的组合。

为便于检测，以上所述的引物可采用荧光标记。可选的荧光标记包括但不限于ROX、TRAMA、FAM等。

本发明还提供包含所述引物或引物组合的试剂盒。该试剂盒可用于百合的倍性鉴定。

优选地，所述试剂盒包含SEQ ID NO.1-18所示的引物。

以上所述的试剂盒还可包括用于PCR扩增的其他成分，包括但不限于PCR反应缓冲液、dNTP、DNA聚合酶、阴性对照、阳性对照等。

本发明提供所述微卫星DNA分子标记或所述引物或引物组合或所述试剂盒在百合倍性鉴定中的应用。

本发明提供所述微卫星DNA分子标记或所述引物或引物组合或所述试剂盒在百合遗传育种中的应用。

本发明提供所述微卫星DNA分子标记或所述引物或引物组合或所述试剂盒在百合种质资源多样性分析或种质资源改良中的应用。

本发明提供一种鉴定百合倍性的方法，其为以百合的基因组DNA为模板，对所述微卫星DNA分子标记进行基因分型，根据基因分型结果判断百合倍性。

具体地，以百合的基因组DNA为模板，采用所述引物或引物组合进行PCR扩增，根据PCR扩增产物的条带类型判断百合为二倍体或多倍体。

优选地，以SEQ ID NO.1-18所示的引物进行PCR扩增。

优选地，所述PCR扩增的反应程序包括：第一步：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，15-20个循环；72℃10min；第二步：95℃5min；95℃30s，52℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min。

所述PCR扩增的反应体系如下：第一步(10μl)：2×Power Taq PCR MasterMix 5μl，正向引物0.1μl(10μM)，反向引物0.1μl(10μM)，基因组DNA 1μl，ddH₂O补足；第二步(20μl)：2×Power Taq PCR MasterMix 5.6μl，反向引物0.15μl，M13荧光标记引物0.15μl，第一步反应产物10μl，ddH₂O补足。

以上所述的方法中，根据待测样品各DNA多态性位点对应扩增片段的条带数判断待测样品为多倍体或二倍体，若1个DNA多态性位点获得的条带数多于两个，则待测样品判断为多倍体，若1个DNA多态性位点获得的条带数为两个，则待测样品判断为二倍体。

本发明的有益效果在于：本发明提供了9个百合的微卫星位点以及用于扩增这9个微卫星位点的引物，并建立了利用百合的微卫星DNA分子标记鉴定百合倍性的方法。利用本发明提供的9个微卫星DNA分子标记对百合的倍性进行鉴定，准确率较高，且重复性较好，为百合多倍体育种提供了有效的技术支撑。

附图说明

图1、图2和图3为本发明实施例2中样本编号为A1、A25、A28、LA27、LA28、LA30、AT5、AT8、OT10、OT11、OT12、OT23、OT24、OT53、OT60、O1及O3的百合材料的J2-080位点扩增产物检测结果。

图4、图5和图6为本发明实施例2中样本编号为A1、A25、A28、LA27、LA28、LA30、AT5、AT8、OT10、OT11、OT12、OT23、OT24、OT53、OT60、O1及O3的百合材料的J5-096位点扩增产物检测结果。

图7、图8和图9为本发明实施例2中样本编号为A1、A25、A28、LA27、LA28、LA30、AT5、AT8、OT10、OT11、OT12、OT23、OT24、OT53、O1及O3的百合材料的J7-117位点扩增产物检测结果。

图1、图2、图3、图4、图5、图6、图7、图8和图9中，横坐标代表扩增产物大小，纵坐标代表扩增强度。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1百合转录组序列中SSR位点的鉴别及微卫星分子标记引物的设计

本发明通过对多个品种的百合进行转录组测序，以转录组测序得到的序列为参考，对拼接组装得到的Unigenes进行SSR位点的识别定位；对筛选得到的含SSR位点的Unigene序列设计引物并进行引物的逐步筛选，最终确定了非特异性条带扩增少、结果稳定、多态性丰富、可用于百合倍性鉴定的微卫星分子标记，具体方法如下：

1、以三组百合转录组测序得到的大量序列为参考，利用MISA(http://pgrc.ipkgatersleben.de/misa/)工具对拼接组装得到的Unigenes进行SSR位点的识别定位。筛选标准为：单核苷酸重复的次数在10次或10次以上，二核苷酸重复的次数在5次或5次以上，三核苷酸重复的次数在4次或4次以上，四至六核苷酸重复的次数在3次或3次以上。同时，也筛选中间被少数碱基(间隔小于100或等于100)打断的不完全重复的SSR。

2、利用Primer 3.0引物批量设计程序对筛选得到的含SSR位点的Unigene序列设计引物，并且保证SSR位点侧翼序列长度≥50bp。引物设计主要参数：引物序列长度18～24bp之间，PCR产物长度100～300bp之间，GC含量45％～65％之间，Tm值55～75℃之间，尽量避免出现发夹结构、二聚体、错配和引物二聚体。

3、参照文献(Chen C,Bock Clive H,Beckman Tom G.Sequence analysisreveals genomic factors affecting EST-SSR primer performance and polymorphism[J].Mol Genet Genomics.2014,289:1147–1156)的方法，在Microsoft Excel中将设计得到的三个数据组的引物序列进行排序和比较，首先删除来自于三个数据组，具有相同重复基序、相同扩增子的相同引物序列。其次，比较重复基序、产物长度，可能出现的三种类型如下：(1)重复基序一样，产物长度不一样，推断其具有多态性，入选；(2)产物长度一样，重复基序不一样，推断其具有多态性，入选；(3)如果两者一样就不选。例如，分别来自于新铁炮和岷江数据组的一对上下游相同引物，新铁炮的重复基序是(CCCGGC)₄，产物长度是242，岷江的重复基序是(CCCGGC)₃，产物长度是236，这样的类型就是上述提到的重复基序一样，产物长度不一样，推断其具有多态性，作为入选引物。用此方法，大大缩小了引物筛选范围，最终选出微卫星标记151个。

4、百合微卫星引物的进一步筛选：

(1)引物的初筛主要使用Touchdown PCR程序，复筛主要用两步法PCR程序。扩增体系如表2所示。

Touchdown PCR程序：95℃5min；95℃30s，65～55℃30s(每循环降1℃)，72℃30s，10个循环；95℃30s，55℃30s，72℃30s，20个循环；72℃10min，最后4℃保温。

两步法PCR程序：

第一步：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，20个循环；72℃10min，最后4℃保温。

第二步：95℃5min；95℃30s，52℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min，最后4℃保温。

表2 PCR扩增反应体系配方

(2)使用两种方法对PCR扩增产物进行检测：8％非变性聚丙稀酰胺凝胶电泳和荧光毛细管电泳，分别对引物进行的初筛和复筛。初筛以15个百合品种基因组DNA为模板进行SSR-PCR扩增，将各PCR产物在8％聚丙烯酰胺凝胶上检测各引物多态性，筛选出非特异性条带扩增少、结果稳定、多态性丰富的微卫星标记69个。进一步复筛，复筛主要利用两步法PCR程序，最终选择了43对多态性较高、较稳定的核心引物进行后续试验。利用筛选得到的43对核心引物、以290个百合不同品种及野生种的基因组DNA为模板进行SSR-PCR扩增，采用荧光毛细管电泳法，筛选出非特异性条带扩增少、结果稳定、多态性丰富的微卫星DNA分子标记9个，其编号分别为J1-044、J2-080、J3-091、J4-094、J5-096、J6-098、J7-117、J8-123、J9-167，其扩增引物依次分别如SEQ ID NO.1-2、SEQ ID NO.3-4、SEQ ID NO.5-6、SEQ IDNO.7-8、SEQ ID NO.9-10、SEQ ID NO.11-12、SEQ ID NO.13-14、SEQ ID NO.15-16、SEQ IDNO.17-18所示，这9个微卫星DNA分子标记适合用于百合倍性的鉴定。

实施例2利用百合微卫星DNA分子标记鉴定百合不同品种的倍性

利用实施例1筛选得到的9个微卫星DNA分子标记对不同品种百合的倍性进行鉴定，具体方法如下：

(1)提取116个百合不同品种的基因组DNA(新型植物基因组DNA快速提取试剂盒DN15，购自北京艾德莱生物科技有限公司)；

(2)分别用J1-044、J2-080、J3-091、J4-094、J5-096、J6-098、J7-117、J8-123、J9-167位点的特异性引物，以116个百合品种的基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增体系如表3所示：

表3 PCR扩增反应体系配方

两步法PCR程序如下：

所使用的正向引物和反向引物的序列如下：

SEQ ID NO.1：J1-044F:5'-CAGTATAATTAGTGACGTGCCTGG-3'

SEQ ID NO.2：J1-044R:5'-TCAATACTCTCACAATCCTCCAAA-3'

SEQ ID NO.3：J2-080F:5'-GGAGGGACTCTCGAGTATTTATCA-3'

SEQ ID NO.4：J2-080R:5'-GCTTCCTGTTTATCTCCACTGATT-3'

SEQ ID NO.5：J3-091F:5'-GTCATCACAATACCCTCTCTGGA-3'

SEQ ID NO.6：J3-091R:5'-CTCAGGTAACAGATCCTGCACAC-3'

SEQ ID NO.7：J4-094F:5'-GTCTCTCCTTCCCCATACCCTA-3'

SEQ ID NO.8：J4-094R:5'-AGTACAGCGAGGATCCGTACAT-3'

SEQ ID NO.9：J5-096F:5'-GTCTTTAAACCTCAGGCAACAAGT-3'

SEQ ID NO.10：J5-096R:5'-AGGACCTTGAACATATGTCTGTGA-3'

SEQ ID NO.11：J6-098F:5'-GTGTTGCTGCTCCATGTATTTAAC-3'

SEQ ID NO.12：J6-098R:5'-TACACTTCTCAATGTTCCCTTCAA-3'

SEQ ID NO.13：J7-117F:5'-TGTCTACAATCGAGGAAGTTGAAG-3'

SEQ ID NO.14：J7-117R:5'-GGTTACCTACATAGACCCTGTTGC-3'

SEQ ID NO.15：J8-123F:5'-TTTTTATCTCCTCGAGACTGATCC-3'

SEQ ID NO.16：J8-123R:5'-ATCTTTCTCTGCTGGTTCTCATTT-3'

SEQ ID NO.17：J9-167F：5'-ACCACATCAGATCCAAACAATG-3'

SEQ ID NO.18：J9-167R:5'-AGGTCATGCAGAGATCTTGTGTT-3'；

(3)将PCR产物用ABI3730XL遗传分析仪(Applied Biosystem公司)进行STR基因分型，使用GeneMarker2.0软件判读等位基因的具体数值；

(4)使用Popgen 1.32计算等位基因数、多态信息量的值来描述百合DNA多态位点的特征，结果如表4所示：

表4 9个百合微卫星多态位点的特征

(5)结果判定：对于9个微卫星DNA分子标记，若检测出的等位基因多于两个，则判断该个体可能为多倍体，否则，则为二倍体。

116份百合不同品种材料的名称及其所属杂种系信息见表5，利用9个微卫星DNA分子标记对这116份百合品种材料进行扩增的结果见表6、表7、表8和表9所示，其中，样本编号为A1、A25、A28、LA27、LA28、LA30、AT5、AT8、OT10、OT11、OT12、OT23、OT24、OT53、OT60、O1及O3的百合材料的J2-080位点扩增产物检测结果如图1、图2和图3所示；样本编号为A1、A25、A28、LA27、LA28、LA30、AT5、AT8、OT10、OT11、OT12、OT23、OT24、OT53、OT60、O1及O3的百合材料的J5-096位点扩增产物检测结果如图4、图5和图6所示；样本编号为A1、A25、A28、LA27、LA28、LA30、AT5、AT8、OT10、OT11、OT12、OT23、OT24、OT53、O1及O3的百合材料的J7-117位点扩增产物检测结果如图7、图8和图9所示。

结果显示，116份百合材料中有78份材料至少有1次检测出3或4个等位基因，判断为多倍体，38份材料只检测出1或2个等位基因，判断为二倍体。

表5 116份百合不同品种材料的名称

注：A表示亚洲百合杂种系(Asiatic hybirds)，AP表示盆栽亚洲百合杂种系，AT表示Tiger系列及Pearl系列亚洲百合杂种系(Asiatic-Tiger Hybrids，Asiatic-PearlHybrids，)；O表示东方百合杂种系(Oriental hybirids)；LO表示麝香百合杂种系与东方百合杂种系的杂交后代；LA表示麝香百合杂种系与亚洲百合杂种系的杂交后代；M表示轮叶百合杂种系(Martagon hybrids)；F代表新铁炮百合杂种系；SP为原生种的驯化品种；W表示原生种(species)。

表6 9对引物在116个种质材料中的扩增情况(仅统计扩增产物为3条及3条以上)

表7 9对引物在116个种质材料中的扩增情况(仅统计扩增产物为3条及3条以上)

表8 9对引物在116个种质材料中的扩增情况(仅统计扩增产物为3条及3条以上)

表9 9对引物在116个种质材料中的扩增情况(仅统计扩增产物为3条及3条以上)

*：流式细胞预测的倍性结果与文献记载结果有差异

(6)倍性鉴定的准确性分析：为进一步确定倍性，挑选89份材料进行流式细胞和根尖常规压片试验。流式细胞法验证了45个种及品种，通过根尖压片验证了35个种及品种，剩余27个品种通过文献查阅确定倍性。结果显示，116份材料中，41份材料为二倍体(占比35.65％)，49份材料为三倍体(占比42.61％)，25份材料为四倍体(占比21.74％)，1份材料倍性有争议需进一步验证。本发明的9个微卫星DNA分子标记在供试的116个百合品种中，正确预测了109份材料的二倍体或多倍体属性，正确率到达93.97％。由此可见，本发明的微卫星DNA分子标记可用于百合倍性的快速鉴定，重复性好、准确率高，是一种可靠、有效的DNA分子标记。

表6-表9中引用的参考文献如下：

1、李克虎,周桂雪,任桂玲,张线线,郭方其,周树军.百合品种染色体倍性观察[J].园艺学报.2011,38(5):970-976。

2、Van Tuyl J M,Arens P.Lilium:Breeding history of the modern cultivarassortment[J].Acta horticulturae.2011,900.

3、肖孔钟.奇—异源四倍体百合(Lilium)育性分析[D].江西农业大学硕士学位论文.2019。

4、霍辰思,白锦荣,窦晓莹,郎利新,孔滢,尚宏忠.8个LA百合品种的核型分析[J].山西农业大学学报(自然科学版).2018,38(3):57-62。

5、夏晶.不同倍性百合(Lilium spp.)杂交后代胚挽救及染色体分析[D].西南大学硕士论文.2010.

6、Cao Q Z,Lian Y Q,Wang L J,Zhang Q,Zhao Y Q,Jia G X,He H B.Physicalmapping of 45S rDNA loci in Lilium OT hybrids and interspecific hybrids withLilium regale[J].Scientia Horticulturae.2019,252:48-54.

7、魏迟,王中轩,贾桂霞.OT系百合3个品种的核型分析[J].东北林业大学学报.2013,41(11):59-62.

8、Emsweller S L,Uhring J.Lilium×'Black Beauty'—diploid andamphidiploid[J].Lily Year Book.1966,29:45-47.

9、Van Tuyl J M,Arens P,Shahin A,Marasek-Ciolakowska A,Barba-GonzalezR,Kim H T,Lim K B.Lilium[J].Ornamental Crops.2018,481-512.doi:10.1007/978-3-319-90698-0_20。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 北京林业大学

<120> 用于鉴定百合倍性的微卫星DNA分子标记及其应用

<130> KHP201116068.5

<160> 27

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cagtataatt agtgacgtgc ctgg 24

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcaatactct cacaatcctc caaa 24

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggagggactc tcgagtattt atca 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcttcctgtt tatctccact gatt 24

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtcatcacaa taccctctct gga 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctcaggtaac agatcctgca cac 23

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gtctctcctt ccccataccc ta 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

agtacagcga ggatccgtac at 22

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gtctttaaac ctcaggcaac aagt 24

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aggaccttga acatatgtct gtga 24

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gtgttgctgc tccatgtatt taac 24

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tacacttctc aatgttccct tcaa 24

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tgtctacaat cgaggaagtt gaag 24

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ggttacctac atagaccctg ttgc 24

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tttttatctc ctcgagactg atcc 24

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

atctttctct gctggttctc attt 24

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

accacatcag atccaaacaa tg 22

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

aggtcatgca gagatcttgt gtt 23

<210> 19

<211> 477

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cttggtgaaa aaggaccgtg gccgtccaag cgaccctaaa gctaggccaa aagcatttgg 60

agaagtcagt ataattagtg acgtgcctgg cgtagaatta ctagaacatg atgatggtga 120

tgaagaagaa gatgatgatt ctacgcatct tagttctgat aatgagggtg atggttctga 180

tagtgctcac aatgatgtag tagaggaaga ggaagaggaa gaggaagagg aagaggaaga 240

ggaagatcta gaatccgatg atgagaaagt agatgcagat gatttggagg attgtgagag 300

tattgatgaa gataatgatc ttttagatgc tagtgattct ggggatgaga cgtctgatga 360

tgaaaatcag gttgaagacg ttgataatga tggatctgaa aaagtcaaag cactttgtag 420

tgagtcagac aatgacggcc atgatgatga aaaggaaata gtcaagtccg taacagg 477

<210> 20

<211> 641

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

agattacaag caccatgggt ttgggaggga ctctcgagta tttatcagat ctgtttggaa 60

gcagcggcca cacgcacaag aagaagaaga agcagttgca gactgtggag ctcaaggtga 120

ggatggactg cgatgggtgt gagctcaaag tcaagaaaac cctatcttcc atgtcaggag 180

tgaaatcagt ggagataaac aggaagcagc agaaggtaac tgtgacggga tatgtggagc 240

caaagaaggt gctgaagaag gctcagtcaa cagggaagaa ggctgagatc tggccttatg 300

ttccatacag cttggtgtct cagccctata ttgcaggaac ctacgacaaa aaagcccctc 360

ctgggtatgt gaggtatgtt gagcctgttg ctgtctcgag ctatgcaagc aaacaggagg 420

accagatcac caacatgttc agtgatgaca atccaaattc ctgctctatc atgtgagagg 480

aatggagtac atgagtctac cgtgtggaag gagtaggcag aactaatcat ggggcagtta 540

aatattgctt gtttgtaccc agggtttaga cggaaatgag tgggttggta tgtgacagct 600

acatgttagg taacgagttt tttataatta tctgttgtgt a 641

<210> 21

<211> 458

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gcagcttgcg agtcacgcaa cgagaccggt cccgctcgga gctcagcgcc gccgttgcgg 60

gaacccggcg ccgtcgtcat cacaataccc tctctggaga ccgagcattc ggcactgacg 120

ggcggtgcga aggttaacgc ggcggcggcg ccgaaggcgc tggtggacga gcaacggccg 180

gggaggccgg cggcggcggg ggatagtgtg gcggtcgatt tggggacgag tggcggatgc 240

gggggtctgg acggcgagac ggtgtgcagg atctgttacc tgagcccggg ccgcggggat 300

gcggcggtgg agatgatcga tctcggctgc cggtgcaagg atgaactcgg gaccgcgcac 360

cggcactgcg ccgaggcttg gttcaggatc aagggcaaca ggtgctgtga aatttgtggc 420

acgaacgcaa agaacataac cagtttggaa aatggctg 458

<210> 22

<211> 1814

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

tctcccccca tttccgccgt ctctccttcc ccatacccta gctcctcgtc ctcgtcctcg 60

tcctcctcct cctcctcctc catgtccaac cacatgtacg gctacggaac gagctacggt 120

ggcggcgccg gaggctacgg ccagcgtgaa aacccctacc tctccgacgc cggcaggtac 180

ggtgtctccg gtcagctctc tgccgctgcc tccgctggca tgtacggatc ctcgctgtac 240

tcgagccagg ccgaacgata cggtctcccc agcagcgtcg gcgccggggg atacgtcggg 300

gcagcggcgc cgtccccgtt ctcgcagaac ccgtggtcgg cagcggctgc ggacccgacg 360

gctggcgcga agcgatctgc tgatgctctg taccatcaga atatcttggg aagcaatact 420

attggacaaa ctgaagctat attttcgaca aatcctttga tcaaacgccc tagatatgat 480

atagccagca atctgccgat atatccacag agaccgggag agaaggattg tcctcactat 540

atgttgacaa gaacctgtaa atttggagaa gcttgcaagt ttgaccatcc tgtttgggtt 600

ccagagggtg gggtcccaga ctggaaagag atccaaattg tcccgaacag cgaatctctt 660

cccgagagac caggggaacc tgattgtcct tactatatga agacacaaaa gtgcaagttc 720

ggattgcggt gcaagttcaa ccacccaaag gacaaactga atgtttcttc tggtggagtg 780

gtcacggaat ccattgacag agcagagtta cctgagagac catctgagcc aatttgttct 840

ttctatgcaa agacgggatt gtgcaagttt ggtgccacct gtaaatttca tcacccaaag 900

gacattcaaa tactatcagc tgggcaggat agtggtaatg ccggacaggg actaaacggt 960

agcgatgcag ctggtggaga cacaaaccca attaagacat ttgttccatt tactgcggcc 1020

ttgctgcata actcgaaggg gctacctata cgaccgggtg aaacagactg cccgttctac 1080

ctaaaaactg gcagttgcaa gtttggtgct acatgtcgat tcaaccaccc tgagagagca 1140

atcattccac cagttctagc gcctttaggg cattctgtcc tgtcttctaa tccagctaat 1200

tttcccattg gtgtctatgg tactgctaac attctcccaa atgcagccca agcattgctc 1260

ggtgtcaatt caaataccta tcctcaaagg ccagggcaaa cagaatgtga ttactatatg 1320

aagtccggac actgcagctt tggtgaacgg tgcaagtttc atcaccctat tgaccgcaca 1380

accccaacgg tgacaacaaa gcatggtccg gttccgaatg tcaagctaac ccttgcgggc 1440

ctcccaagaa gagagggttc agttgcatgt cccttctaca tgaaaactgg catttgcaag 1500

tatggtgcta cctgcaaata tgatcatcca ccaccaggtg aggctgtagc tttggcaaat 1560

gttcaaggag ccggaactac tgcaacagca ggagagcaga atgattctcc tgatgctcag 1620

gaacagtaga atgagtcagg cctgttccgt ttgtttcttt gcggcgcatt attagtttta 1680

ttgtatgtga gttaatataa tgcaactctg tttgttggga ttgatcaact atccttctgt 1740

taagtgtggg gagaaccatt gctgtctgaa tttgttagat cttggcattt taagatgaat 1800

ttattattct ggtt 1814

<210> 23

<211> 658

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gattgcagca gattggccac aatcaatgca aattgttcgc cttatagctc aatatctcat 60

gaataataaa caatacgtac gtaaggcgga ttacctggta tttcggacac taaatacaca 120

tggattcttg ggacaactgc aagaacagaa gctttgtgcc gttatccagc taccatcaca 180

aacactgctg ctctctgttt cagacaaggc aggacggttg atcggcatgc tctttcccgg 240

ggacatggtt gtctttaaac ctcaggcaac aagtcagcag caacaacaga tggtcttagg 300

ttcaggcatg aaccagcagc agcagcagca gcacatggga atgagccagc aaccacaaca 360

aatggttggg cctggtatga gccagcaaca aatgtcacag acatatgttc aaggtcctgg 420

gaggtctcag ttgatgtctc aggggaaaat gtcatcacac gggcctggtg gtaacatgtc 480

ttctggcgga tttttacctg atgggcatca ctagttgatc agagacttat tttgtattga 540

attattgggg ttttttctgt ctacttttgg tcctaacata actttggaat ttacaatatt 600

tcaaaatatt ccaaggtcgt tttcgacaac caaatctgtt atcgtattaa tttgaagc 658

<210> 24

<211> 1172

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

tgaaaataga aagttttgga tatctcgacg tggtccaccg tgtggtgttg tcggcctgaa 60

aagcattggg ctgctcggta cctctctcag cacttccggt gttgctgctc catgtattta 120

acaccgatga gaaggggcaa acctacggcg atggcgatgg cgatggcgat gtccctctgt 180

ttctcttatt cttacgcccc acaggcacag ttgaagggaa cattgagaag tgtatcccat 240

cggtctctga gtactagtac agattttggt ggtctgcatt ttaagcatca gcttcggtgg 300

agttttgttg gtggctcaca acttgtgtgc ctgcctagag tcgctcgtac ggtctgctgc 360

cacagaaaag ggtccactct ttcagcttgt ttgtttcctg tagggctcac aagttctcaa 420

attgctaaca gtgcttttac gtggggaacg gttactgtcc ttccgttcta cacgctgatg 480

gttttggctc ctaacagtga actgactaaa agaagcatgg aaagcagtgt accatatgtt 540

ctgctcagtg tgctgtatgc ataccttcta tatctctcgt ggactcctga caccttgcgc 600

tctatgtttg caagcaaata ctggctgcca gagttacctg gcatagcaag aatgttctca 660

aatgaagtaa cagtggcgtc tgcgtggatt catttactgg ttgtcgatct tttcgctgca 720

agacaggtat ttcatgatgg tttaaagaag aagatagaga cccgacattc tgtttccttg 780

tgtctgctct tctgtccggt cggaatcctc gctcacgtca tcactaagct tctccccaag 840

acggagaacc catcgcattg aagaatgctt gtgttaggta atgggtgtgt atttagtgct 900

tggcttgttt aagctgtcta tgagaaacaa ggattctcag gagataaaat acttcattag 960

aagcccaggt tcttattagt ttatccatac tcaaatgtca tatgctagtt cttgattcga 1020

cggattacaa gtcaactaag ttccttcata tttggcttca aatgcttgtt tatgaaaagc 1080

cggtaaccat tcacaatgtg gataagaccc ataaagagac gagccggatg gatgatgaaa 1140

atgtgataaa attctcattt caaaaaaaaa aa 1172

<210> 25

<211> 318

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

gtgacaatgt ctacaatcga ggaagttgaa gcagctgctc agcagttcaa tggttatgaa 60

cttgggggga gagcattgag ggtgaatgca ggaccacctc cgcctaaaga tgaagtccca 120

atgagaggat ttcgatcggg gcctggtggt ggcggcggcg gcggcggcgg tggtggttac 180

agttcgagca acagggtcta tgtaggtaac ctctcttggg gagttgacaa tgcatctctt 240

gagtccctgt tcaatgaaca aggaagggtc atggaagcca aggttgtgta cgacagggag 300

agtggccgat cgaggggc 318

<210> 26

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

cttcttctcc tcgagcttgt tggggccgaa gatttggagc cggttggccc cctctgcctc 60

tgacaaaccc tccggactgc atttcagctg cacgaatact tcctccacag gaattcgttc 120

cagatcgacg gtctcgtttt ttatctcctc gagactgatc cccttatccg tcgccatcgc 180

cgccgccgat gatcagcaga tatctccgct gcggccgaag atcagcagag atcgccgccg 240

ccgccgctgc cgcggatcag cagagagggc agaactgtga ccgaacccta gacgaaatga 300

gaaccagcag agaaagatga g 321

<210> 27

<211> 1327

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

caagctttca ccaaatatca ttcattggac tgaactaatt tttcagacat acgaagagac 60

agatcccaaa atccacagta tataacagct taacttttaa caatcaacac ggctaaataa 120

agcttaacag ccaacacgac caagaaccca cattttgatc catgattttt catcaaaaat 180

acttacaagc caaaagaatt gatgtatgca gatcagagca gaaactgtac acataaaaga 240

gaatgaatgc gccacaatat ctaatctaac ctttgctcgc caccgacttg cagacaggac 300

aagcattttt ctgaagaagc cattgcttga tacagtatgt atggtagcta tgcccacaat 360

aaagccttcc catctcatca ttcacttcat actcttcctg gcaaatgcag cattttcttt 420

ccatttcgga gaagcaaaat gaagggccag tgaaaaccgg gttcttcgat ttccgaaggc 480

agcacaaaat ctcttcttct cttaaaccag tactgacata cccaatttta tcgcctagct 540

caagcagttc ctcatatgac atgccatcca catcaagtcg caagtccctg tattggtcat 600

atgcgtcaat tgcgcccagc agaagtcgcg tttgaaacat cataatctct tcaaggccac 660

caggggaccg gcgatatccc cggatgtgcc ggagctgccc ggagggcacc acatcagatc 720

caaacaatgg cgtctcttga tcagatgacg catcaatgaa agcggagagc cgttcttgat 780

ttccgcctcc gccgccgccg ccgccgccgc gtcgtgcaac acaagatctc tgcatgacct 840

aaatcatcaa atcttgttca tatcacaata agagtgaatt acctacctga acccgatcgg 900

aatcagctct tccccctcgg acgacacagt cgacgggaac gtcggcggcg aaggcaatcc 960

cgggggcgca ccagacgtca gatgttgcgg cggcggcggg gcggcggaga tccttggcct 1020

tcttcttctg cttgactcga cggcggcgcg agcgcttgcc tggccagtcg gcggaggatc 1080

ggacggctgc ggcggcaggg gcgaagacct gggaggagga ggcggaggcg caaccgaggc 1140

cgcggagggc ggcgaagggc ttcttcttgg cggacggggg atcggggatg aaggggttgc 1200

ggtcggaggg ggtaaggcgg tttttgagga ggaggaggcg gcggattgtg ctggtggcgg 1260

cgtttggggc tgcctctgtc tccgccgcgg tcgccattga agtgaggggg atggggctct 1320

gttggtg 1327

Claims

1.用于鉴定百合倍性的微卫星DNA分子标记，其特征在于，其包含J1-044、J2-080、J3-091、J4-094、J5-096、J6-098、J7-117、J8-123和J9-167，

其中，J1-044由SEQ ID NO.1-2所示引物扩增得到，J2-080由SEQ ID NO.3-4所示引物扩增得到，J3-091由SEQ ID NO.5-6所示引物扩增得到，J4-094由SEQ ID NO.7-8所示引物扩增得到，J5-096由SEQ ID NO.9-10所示引物扩增得到，J6-098由SEQ ID NO.11-12所示引物扩增得到，J7-117由SEQ ID NO.13-14所示引物扩增得到，J8-123由SEQ ID NO.15-16所示引物扩增得到，J9-167由SEQ ID NO.17-18所示引物扩增得到。

2.用于扩增权利要求1所述的微卫星DNA分子标记的引物组合，其特征在于，其为SEQID NO.1-18所示引物的组合。

3.包含权利要求2所述的引物组合的试剂盒。

4.权利要求1所述的微卫星DNA分子标记或权利要求2所述的引物组合或权利要求3所述的试剂盒在百合倍性鉴定中的应用。

5.权利要求1所述的微卫星DNA分子标记或权利要求2所述的引物组合或权利要求3所述的试剂盒在百合遗传育种中的应用。

6.权利要求1所述的微卫星DNA分子标记或权利要求2所述的引物组合或权利要求3所述的试剂盒在百合种质资源多样性分析或种质资源改良中的应用。

7.一种鉴定百合倍性的方法，其特征在于，以百合的基因组DNA为模板，对权利要求1所述的微卫星DNA分子标记进行基因分型，根据基因分型结果判断百合倍性。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，以百合的基因组DNA为模板，采用权利要求2所述的引物组合进行PCR扩增，根据PCR扩增产物的条带类型判断百合为二倍体或多倍体。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序包括：第一步：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，15-20个循环；72℃10min；第二步：95℃5min；95℃30s，52℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min。