CN104263835A - 一种采用ssr分子标记技术鉴别百合品种的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种采用SSR分子标记技术鉴别百合品种的方法。结果表明:从13对引物中筛选出2对多态性高、重复性好的引物,共检测出171个片段,其中多态性片段131个,每对引物可以检测出4~22个数目不等的片段,平均1.69个,多态率为76.60%,片段大小介于100~250bp之间;通过NTSYS-pc2.11进行相似系数和聚类分析,遗传相似系数为0.5882~0.9412,平均相似系数为0.7647;聚类分析将此材料划分为6个大类,11份百合种质间的遗传差异与品种特性、花形、花丝和花柱的颜色无相关性,但与花瓣颜色具有一定相关性,通过花色基因能较好地反映百合种质间亲缘关系远近,品种间花色不同,可通过调控花色的相关基因设计引物,为进一步区分亲缘关系远近提供了重要途径。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物品种鉴别方法,具体地说,涉及一种采用SSR分子标记技术鉴别百合品种的方法。
背景技术
百合(Lilium brownine)是百合科(Liliaceae)百合属(lilium L.)植物的总称,中国是百合属植物自然分布中心之一,具有很高的食用、药用、观赏价值。目前,百合的鉴定方法主要有形态学、细胞学、生化标记鉴定十分普遍,这极大影响了我国对百合种质资源的评价与利用,各种分子标记技术的出现为百合种质的快速鉴定提供了新的技术方法,而 SSR 标记具有遍布整个基因组、多态性高、重复性及稳定性好、操作简单等优势,是目前最适合用于种质鉴定的分子标记技术之一。然而,有关百合种质鉴定的研究相对较少,尤其是利用SSR技术对百合品种进行亲本鉴定鲜见报道。
发明内容
本发明的目的在于,提供一种采用SSR分子标记技术鉴别百合品种的方法,以解决上述的技术问题。
为实现上述目的,本发明所采用的技术方案是:
一种采用SSR分子标记技术鉴别百合品种的方法,其特征在于:包括如下步骤:
1、准备百合材料:将山丹玫紫、接曼、彩蝶、粉天使、香水白、索拉纳、黑色蒙特、紫衣姑娘、绿百合、加拿大黄、圭亚那这11种百合材料种植于园艺实验站进行常规管理;在苗期随机取每种百合材料20个单株的新鲜叶片混用,液氮冷冻后放入-70℃超低温冰箱中保存备用;
2、百合DNA的提取:用植物基因组试剂盒提取各种百合材料的DNA,用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度;将各材料的DNA浓度稀释至50ng/μL后,置于-20℃冰箱中备用;
3、SSR引物设计:根据NCBI上搜索的花色基因EST序列,剔除小于20 bp的EST后,对余下的EST—SSR用软件Primer 5.0设计36对百合SSR引物;所述百合SSR引物的长度18~24 bp,GC含量40%~70% ,理论退火温度57.2℃~59.2 ℃,产物长度控制在150~250 bp之间;
4、SSR-PCR扩增反应、电泳检测:PCR反应体系20μL ,其中,50 ng/μL DNA样品1.5μL 10μmol·L-1正反向引物共1.5μL,10倍的含Mg2+的PCR reaction buffer,2.0μL、25 mmol·L-1 dNTP、rTaq 0.75U,加超纯水至 20 μL;PCR 的反应程序:94℃变性1.5 min,94℃ 变性 30 s,退火30 s,32 个循环,72℃ 延伸 30 s,72℃ 延伸 5 min,4℃保存;PCR 扩增产物中加入6倍的Loading buffer 2.0μL,取2.5μL上样,用 8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,银染显色;
5、统计分析:拍照并读带,有带记为1,无带记为0,缺失记为9,统计扩增情况,用NTSYS-pc2.11按照类平均法进行聚类分析,构建分子进化系统树;
6、结果与分析:
6A、采用改良CTAB法提取的百合DNA条带清晰明亮,无降解现象,DNA完整性好,分光光度计检测发现A260/280比值在1.8~2.0之内,浓度在318~684 ng/μL,均能满足PCR的要求;
6B、根据SSR分析结果,计算出11个百合品种间的遗传相似系数,其中13对引物进行多态性分析,选出2对带型稳定、多态性高重复性好的引物;共检出171个片段,其中,多态性片段131个,占总数的76.60%;每对引物可以检出4~22个数目不等的片段,平均每对引物扩增出1.69条带,片段大小介于100~250bp之间;结果表明,不同引物产生的条带数不同和多态性差异,其中,扩增多态性最好的引物为FL8和FL10;
6C、各品种间遗传距离在0.5882~0.9412之间,绿百合、圭亚那和加拿大黄之间的遗传相似系数最小,为0.5882;彩蝶、粉天使与山丹玫紫、索拉纳和黑色蒙特、接曼、香水白与粉天使遗传相似系数最大,为0.9412,11个品种的平均遗传相似系数为0.7647;
6D、聚类分析结果表明:将11个百合品种分为六大类,以加拿大黄为第Ⅰ大类,以圭亚那为第II大类,以紫衣姑娘为第III大类,以绿百合为第IV大类,以接曼、香水白为为第V大类,其余的黑色蒙特、索拉纳、彩蝶、粉天使和山丹玫紫为第VI大类;花色相似的聚为一类,与遗传相似系数的分析结果一致。
有益效果:与现有技术相比,本发明利用SSR分子标记对11个品种进行亲缘关系分析,结果表明:从13对引物中筛选出2对多态性高、重复性好的引物,共检测出171个片段,其中多态性片段131个,每对引物可以检测出4~22个数目不等的片段,平均1.69个,多态率为76.60%,片段大小介于100~250bp之间;通过NTSYS-pc2.11进行相似系数和聚类分析,遗传相似系数为0.5882~0.9412,平均相似系数为0.7647,2对引物能将11个百合品种区分为2~6个类型,平均为1.83个类型;聚类分析将此材料划分为6个大类,11份百合种质间的遗传差异与品种特性、花形、花丝和花柱的颜色无相关性,但与花瓣颜色具有一定相关性,通过花色基因能较好地反映百合种质间亲缘关系远近,品种间花色不同,可通过调控花色的相关基因设计引物,为进一步区分亲缘关系远近提供了重要途径。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明。
本发明所述采用SSR分子标记技术鉴别百合品种的方法,包括如下步骤:
1、准备百合材料:将山丹玫紫、接曼、彩蝶、粉天使、香水白、索拉纳、黑色蒙特、紫衣姑娘、绿百合、加拿大黄、圭亚那这11种百合材料种植于园艺实验站进行常规管理,11种百合品种的信息参见表1;在苗期随机取每种百合材料20个单株的新鲜叶片混用,液氮冷冻后放入-70℃超低温冰箱中保存备用;
表1 11种百合品种的信息:
2、百合DNA的提取:用植物基因组试剂盒提取各种百合材料的DNA,用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度;将各材料的DNA浓度稀释至50ng/μL后,置于-20℃冰箱中备用;
3、SSR引物设计:根据NCBI上搜索的花色基因EST序列,剔除小于20 bp的EST后,对余下的EST—SSR用软件Primer 5.0设计36对百合SSR引物;所述百合SSR引物的长度18~24 bp,GC含量40%~70% ,理论退火温度57.2℃~59.2 ℃,产物长度控制在150~250 bp之间;
4、SSR-PCR扩增反应、电泳检测:PCR反应体系20μL ,其中,50 ng/μL DNA样品1.5μL 10μmol·L-1正反向引物共1.5μL,10倍的含Mg2+的PCR reaction buffer,2.0μL、25 mmol·L-1 dNTP、rTaq 0.75U,加超纯水至 20 μL;PCR 的反应程序:94℃变性1.5 min,94℃ 变性 30 s,退火30 s,32 个循环,72℃ 延伸 30 s,72℃ 延伸 5 min,4℃保存;PCR 扩增产物中加入6倍的Loading buffer 2.0μL,取2.5μL上样,用 8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,银染显色;对百合SSR引物扩增的结果参见表2:
表2 对百合SSR引物扩增的结果:
5、统计分析:拍照并读带,有带记为1,无带记为0,缺失记为9,统计扩增情况,用NTSYS-pc2.11按照类平均法进行聚类分析,构建分子进化系统树;
6、结果与分析:
6A、采用改良CTAB法提取的百合DNA条带清晰明亮,无降解现象,DNA完整性好,分光光度计检测发现A260/28比值在1.8~2.0之内,浓度在318~684 ng/μL,均能满足PCR的要求;
6B、根据SSR分析结果,计算出11个百合品种间的遗传相似系数(参见表3),其中13对引物进行多态性分析,选出2对带型稳定、多态性高重复性好的引物;共检出171个片段,其中,多态性片段131个,占总数的76.60%;每对引物可以检出4~22个数目不等的片段,平均每对引物扩增出1.69条带,片段大小介于100~250bp之间;结果表明,不同引物产生的条带数不同和多态性差异,其中,扩增多态性最好的引物为FL8和FL10;
表3 11个百合品种间的遗传相似系数:
6C、各品种间遗传距离在0.5882~0.9412之间,绿百合、圭亚那和加拿大黄之间的遗传相似系数最小,为0.5882;彩蝶、粉天使与山丹玫紫、索拉纳和黑色蒙特、接曼、香水白与粉天使遗传相似系数最大,为0.9412,11个品种的平均遗传相似系数为0.7647;
6D、聚类分析结果表明:将11个百合品种分为六大类,以加拿大黄为第Ⅰ大类,以圭亚那为第II大类,以紫衣姑娘为第III大类,以绿百合为第IV大类,以接曼、香水白为为第V大类,其余的黑色蒙特、索拉纳、彩蝶、粉天使和山丹玫紫为第VI大类;花色相似的聚为一类,与遗传相似系数的分析结果一致。
Claims (1)
1. 一种采用SSR分子标记技术鉴别百合品种的方法,其特征在于:包括如下步骤:
(1)准备百合材料:将山丹玫紫、接曼、彩蝶、粉天使、香水白、索拉纳、黑色蒙特、紫衣姑娘、绿百合、加拿大黄、圭亚那这11种百合材料种植于园艺实验站进行常规管理;在苗期随机取每种百合材料20个单株的新鲜叶片混用,液氮冷冻后放入-70℃超低温冰箱中保存备用;
(2)百合DNA的提取:用植物基因组试剂盒提取各种百合材料的DNA,用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度;将各材料的DNA浓度稀释至50ng/μL后,置于-20℃冰箱中备用;
(3)SSR引物设计:根据NCBI上搜索的花色基因EST序列,剔除小于20 bp的EST后,对余下的EST—SSR用软件Primer 5.0设计36对百合SSR引物;所述百合SSR引物的长度18~24 bp,GC含量40%~70% ,理论退火温度57.2℃~59.2 ℃,产物长度控制在150~250 bp之间;
(4)SSR-PCR扩增反应、电泳检测:PCR反应体系20μL ,其中,50 ng/μL DNA样品1.5μL 10μmol·L-1正反向引物共1.5μL,10倍的含Mg2+的PCR reaction buffer,2.0μL、25 mmol·L-1 dNTP、rTaq 0.75U,加超纯水至 20 μL;PCR 的反应程序:94℃变性1.5 min,94℃ 变性 30 s,退火30 s,32 个循环,72℃ 延伸 30 s,72℃ 延伸 5 min,4℃保存;PCR 扩增产物中加入6倍的Loading buffer 2.0μL,取2.5μL上样,用 8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,银染显色;
(5)统计分析:拍照并读带,有带记为1,无带记为0,缺失记为9,统计扩增情况,用NTSYS-pc2.11按照类平均法进行聚类分析,构建分子进化系统树;
(6)结果与分析:
(6A)采用改良CTAB法提取的百合DNA条带清晰明亮,无降解现象,DNA完整性好,分光光度计检测发现A260/280比值在1.8~2.0之内,浓度在318~684 ng/μL,均能满足PCR的要求;
(6B)根据SSR分析结果,计算出11个百合品种间的遗传相似系数,其中13对引物进行多态性分析,选出2对带型稳定、多态性高重复性好的引物;共检出171个片段,其中,多态性片段131个,占总数的76.60%;每对引物可以检出4~22个数目不等的片段,平均每对引物扩增出1.69条带,片段大小介于100~250bp之间;结果表明,不同引物产生的条带数不同和多态性差异,其中,扩增多态性最好的引物为FL8和FL10;
(6C)各品种间遗传距离在0.5882~0.9412之间,绿百合、圭亚那和加拿大黄之间的遗传相似系数最小,为0.5882;彩蝶、粉天使与山丹玫紫、索拉纳和黑色蒙特、接曼、香水白与粉天使遗传相似系数最大,为0.9412,11个品种的平均遗传相似系数为0.7647;
(6D)聚类分析结果表明:将11个百合品种分为六大类,以加拿大黄为第Ⅰ大类,以圭亚那为第II大类,以紫衣姑娘为第III大类,以绿百合为第IV大类,以接曼、香水白为为第V大类,其余的黑色蒙特、索拉纳、彩蝶、粉天使和山丹玫紫为第VI大类;花色相似的聚为一类,与遗传相似系数的分析结果一致。
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