CN113604598A - 鉴定普通油茶与小果油茶的分子标记引物及其方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了鉴定普通油茶与小果油茶的分子标记引物及其方法，该分子标记引物能扩增出油茶叶绿体基因组上atpH和atpI的基因间隔区。提取待测油茶叶片的基因组DNA作为模板，以所述分子标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测；若电泳结果出现609bp左右的条带则为普通油茶；若电泳结果出现227bp左右的条带则为小果油茶；所述分子标记引物序列为：上游引物：5’‑CTCCCTCTCCTAACCAACCC‑3’，下游引物：5’‑CCGCGGCTTATATAGGTGAA‑3’。本发明分子标记引物可对普通油茶与小果油茶进行快速的鉴别，方法简单、快捷、准确，是常规形态特征辨别普通油茶和小果油茶所不能替代的分子手段。

Description

鉴定普通油茶与小果油茶的分子标记引物及其方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及鉴定普通油茶与小果油茶的分子标记引物及其方法。
背景技术
油茶泛指山茶科(Theaceae)山茶属(Camellia)中种子油脂含量较高、有栽培经济价值的一类植物的总称。油茶籽油中富含以油酸和亚油酸为主的不饱和脂肪酸，其营养价值可以和橄榄油媲美，是一种优质的食用植物油。在我国，油茶具有悠久的应用历史，分布地区广、栽培面积大，其中普通油茶(C.oleifera)栽种面积已经突破6700万亩，为第一大木本油料作物，小果油茶(C.meiocarpa)次之。当前油茶林产量很低，每亩平均茶油产量不到10kg，这与迅猛提增的茶油市场需求间存在相当大的差距。低产的根本原因是目前绝大部分油茶林品种品质差，这已经成为油茶产业面临的最主要困境之一。因此，挖掘利用优质遗传资源、培育高产油茶新品种是油茶产业稳健发展的基础。
普通油茶与小果油茶的株型、叶片性状、花果性状等形态性状高度相似，常用以辨别两者种类的果实性状指标也因为个体间的连续变异，导致中间类型不易区分(图1)，而且在很多区域存在普通油茶与小果油茶同域分布的现象，因此通过常规形态性状难以准确、有效的区分两者的种类。然而，两个物种间存在着倍型差异(普通油茶6倍体、小果油茶4倍体)以及较大的遗传分化，杂交不易成功，因此在培育油茶良种前应该首先准确鉴定亲本材料的种类，以免混淆。
另外，在推广运用过程中对早期普通油茶及小果油茶苗木的鉴定也有广泛的实际需求。因此，开发一种能够准确、快速的辨识油茶种类的分子生物学方法是挖掘利用油茶资源以及良种培育、应用推广的前提条件。叶绿体基因具有较高的保守性，根据叶绿体基因间的差异开发分子标记来鉴定物种是一种常用的方法。迄今为止，尚未有叶绿体基因分子标记应用于鉴别普通油茶与小果油茶的研究报道。
发明内容
针对现有技术中的不足与难题，本发明旨在提供一种鉴定普通油茶与小果油茶的分子标记引物及其方法，能快速、准确鉴定普通油茶与小果油茶。
本发明通过以下技术方案予以实现：
本发明提供鉴定普通油茶与小果油茶的分子标记引物，所述引物将扩增出油茶叶绿体基因组上atpH和atpI的基因间隔区，所述引物对序列为：
上游引物：5’-CTCCCTCTCCTAACCAACCC-3’，如SEQ.ID.NO.1所示，
下游引物：5’-CCGCGGCTTATATAGGTGAA-3’，如SEQ.ID.NO.2所示。
通过比对普通油茶(栽培品种赣无1)与小果油茶(栽培品种白皮中子)叶绿体全基因组序列，发现与普通油茶相比，小果油茶在atpH-atpI的基因间隔区有451bp的长片段缺失，详见序列表SEQ.ID.NO.3。该引物对是通过利用atpH及atpI基因的保守性，提取普通油茶atpH-atpI两个基因及其间隔区序列，设计跨过这段间隔区序列的最优引物对。以该引物对普通油茶(赣无1)和小果油茶(白皮中子)进行PCR扩增，分别获得609bp与227bp大小的特异性片段。
本发明还涉及一种利用上述的分子标记引物对普通油茶和小果油茶进行鉴定的方法，该方法为提取待测油茶样本叶片的基因组作为模板，以上述分子特异性标记引物作为扩增引物进行扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现约609bp的条带则为普通油茶，若电泳结果出现约227bp的条带则为小果油茶。
所述分子标记引物序列为：
上游引物：5’-CTCCCTCTCCTAACCAACCC-3’，如SEQ.ID.NO.1所示，
下游引物：5’-CCGCGGCTTATATAGGTGAA-3’，如SEQ.ID.NO.2所示。
本发明方法关键在于扩增引物的选择，样本DNA的提取、PCR反应体系及反应条件确定，以及电泳检测，均可按照本领域常规方法进行。
本发明所述的PCR扩增的反应体系总体积优选为20μl，包括2×FastTaq Premix10μl(TOLOBIO，上海)，10μM上、下游引物各1μl，模板DNA2ng，余量为ddH2O。
所述的PCR扩增的反应条件优选为：94℃预变性5min；94℃变性30s、57℃退火30s、72℃延伸90s，共40个循环；最后于72℃补平10min，终止温度为4℃。
具体的，上述鉴定方法如下：
(1)取待测油茶干叶片0.02g，加液氮彻底磨碎，使用新型植物基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN，上海)提取样本的全基因组DNA。通过1.0％的琼脂糖凝胶电泳和DNA/RNA紫外分光光度计(NanoDrop2000，Thermo，美国)来检测完整性、纯度及浓度。OD260/OD280＞1.8的DNA样品，DNA提取物于-20℃冰箱贮藏备用。
(2)将步骤(1)提取的油茶基因组DNA稀释至2ng/μl，以此为模板，以上述分子标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增：
PCR反应体系每20μl组成如下：
Figure BDA0003208142420000031
PCR反应条件如下：
94℃预变性5min；94℃变性30s、57℃退火30s、72℃延伸90s，共40个循环；最后于72℃补平10min，终止温度为4℃。
(3)取上述PCR扩增产物2μl，与1μl0.25％溴酚兰缓冲液混匀，点样于1.0％的琼脂糖凝胶上，于1×TAB缓冲液中，100V电压下电泳30min，电泳结束后EB染色，于自动凝胶图像分析仪上照相；若电泳结果出现609bp左右的DNA条带则为普通油茶，若为227bp左右的DNA条带则为小果油茶。
与现有技术相比，本发明有益效果为：
普通油茶与小果油茶形态性状高度相似，种内个体间的性状都存在着渐变类型，通过形态性状不易区分，本发明是首个可对普通油茶与小果油茶进行快速准确鉴别的叶绿体基因分子标记引物，方法简单、快捷、准确、成本低，是常规形态特征辨别所不能替代的分子手段。
附图说明
图1为普通油茶(C.oleifera)与小果油茶(C.meiocarpa)的果实形态特征；
图2为对小果油茶(6个种群，每种群随机3个个体)和普通油茶(12个种群，每种群随机3个个体)进行PCR扩增的结果。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
实施例1：
(1)提取不同区域的普通油茶与小果油茶样本基因组DNA：
本次实施例选用了11个区域的普通油茶种群以及6个区域的小果油茶种群，每个种群随机挑选3个个体作为供试样本，详见表1。
取待测样本干叶片0.02g，加液氮彻底磨碎，使用新型植物基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN，上海)提取样本的全基因组DNA。
通过1.0％的琼脂糖凝胶电泳和DNA/RNA紫外分光光度计(NanoDrop 2000，Thermo，美国)来检测完整性、纯度及浓度。
OD260/OD280＞1.8的DNA样品，稀释至2ng/μl用于后续扩增。DNA提取物于-20℃冰箱贮藏备用。
表1：普通油茶与小果油茶采样点的信息
Figure BDA0003208142420000041
Figure BDA0003208142420000051
(2)设计扩增引物，引物对的序列为：
上游引物：5’-CTCCCTCTCCTAACCAACCC-3’，和
下游引物：5’-CCGCGGCTTATATAGGTGAA-3’，
由上海生物工程技术有限公司合成。
(3)PCR扩增：
PCR反应体系组成：2×FastTaq Premix 10μl(TOLOBIO，上海)，10μM上、下游引物各1μl，2μM的DNA模板1μl(反应体系模板浓度不宜超过0.2uM)，ddH2O 7μl。
扩增反应在耶拿Biometra Tone 96G PCR扩增仪上进行。
扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性30s、57℃退火30s、72℃延伸90s，共40个循环；最后于72℃补平10min，终止温度为4℃。
(4)电泳检测：
取步骤(3)PCR扩增产物2μl，与1μl0.25％溴酚兰缓冲液混匀，点样于1.0％的琼脂糖凝胶上，于1×TAB缓冲液中，100V电压下电泳30min，电泳结束后EB染色，然后在在美国伯乐自动凝胶图像分析仪(伯乐，型号：GelDoc XR+，Bio-Rad，USA)上照相。
按照上述方法，分别对多个样地的小果油茶与普通油茶的引物PCR扩增产物进行电泳检测，结果见图2，图2为对小果油茶(6个种群，每种群随机3个个体)和普通油茶(12个种群，每种群随机3个个体)进行PCR扩增的结果；M为Takara DL 2000marker，编号P1～P12分别代表：江西庐山、陕西商南、广东南岭、福建漳浦、浙江青田、安徽黄山、海南黎母山、广西融水、贵州黔灵山、湖北恩施、湖北阳新、四川都江堰的普通油茶种群，编号P13～P18分别代表：广东韶关、江西宜春、江西南昌(白皮中子)、福建宁化、福建闽清、福建浦城的小果油茶种群。
图2中，6个样地的所有小果油茶样本(每个样地3个样本)都扩增出了一条明亮、稳定的分子量约为227bp大小的特异DNA条带，12个样地的普通油茶样本(每个样地3个样本)都扩增出了一条明亮、稳定的分子量约为609bp大小的特异DNA条带，可见本发明的标记引物用于小果油茶与普通油茶的鉴定，其稳定性、可靠性、便捷性非常高。
以上所述仅表达了本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形、改进及替代，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 南昌大学
<120> 鉴定普通油茶与小果油茶的分子标记引物及其方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctccctctcc taaccaaccc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccgcggctta tataggtgaa 20
<210> 3
<211> 451
<212> DNA
<213> Camellia oleifera
<400> 3
tgaatctcat ttttttttgt aaattcttct accccttttc tttatcatta tcccccatgg 60
atagaatcga aatggacaaa ttgattaggc cgaatcattg catagaaata tcattatttg 120
attgatctaa gttcatgcaa tttattattt attaaaaatt tattttggtc aatcgttgaa 180
ttgaataaaa ttcaactgaa gggggtaatc gttctataga acatactttt ttatttttat 240
ttaatcatac gccataaaca tataccacaa gaattcttat tcaaattatg actcctaata 300
tttaaggatt gactgaacaa tagaaataga atattcattg aggagaggta tgatataagt 360
agaccaaaca ggaattttag gaaaaagatc ttttagatct ctttcctttt ttttttttac 420
aattctttaa ttttaatatc gtaatctttt t 451

Claims (3)

1.鉴定普通油茶与小果油茶的分子标记引物，其特征在于：所述分子标记引物为以下序列的上下游引物：
上游引物：5’-CTCCCTCTCCTAACCAACCC-3’；
下游引物：5’-CCGCGGCTTATATAGGTGAA-3’。
2.采用权利要求1所述的分子标记引物鉴定普通油茶与小果油茶的方法，其特征在于：提取待测油茶叶片的基因组DNA作为模板，以所述分子标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测；若电泳结果出现609bp左右的条带则为普通油茶；若电泳结果出现227bp左右的条带则为小果油茶；
所述分子标记引物序列为：
上游引物：5’-CTCCCTCTCCTAACCAACCC-3’，
下游引物：5’-CCGCGGCTTATATAGGTGAA-3’。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)取待测油茶样本干叶片0.02g，加液氮彻底磨碎，使用植物基因组DNA提取试剂盒提取叶片的全基因组DNA；
(2)将所述步骤(1)提取的油茶基因组DNA稀释至2μM，以此为模板，以所述分子标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增：
PCR反应体系总体积为20μl，组成如下：
Figure FDA0003208142410000011
PCR反应条件如下：
94℃预变性5min；94℃变性30s、57℃退火30s、72℃延伸90s，共40个循环；最后于72℃补平10min，终止温度为4℃；
(3)取上述PCR扩增产物2μl，与1μl0.25％溴酚兰缓冲液混匀，点样于1.0％的琼脂糖凝胶上，于1×TAB缓冲液中，100V电压下电泳30min，电泳结束后EB染色，于自动凝胶图像分析仪上照相，若电泳结果出现609bp左右的DNA条带则为普通油茶，若为227bp左右的DNA条带则为小果油茶。
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