CN110144418A - 一种普通油茶ssr分子标记引物及标记方法和应用 - Google Patents
一种普通油茶ssr分子标记引物及标记方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及分子标记技术领域，特别涉及一种普通油茶SSR分子标记引物及标记方法和应用，本发明通过对普通油茶根系进行RNA提取，测序和组装，利用MISA搜索SSR位点，并设计相应引物，以油茶基因组DNA为材料，对设计的SSR引物进行验证，从设计的6738对引物中得到相应的引物，该引物表现出多态性并可以成功区分不同品种来源的油茶材料；为油茶分子标记辅助育种提供新的分子标记，可为今后开展遗传育种、基因组作图、基因定位和物种亲缘关系鉴别等研究提供新的思路。
Description
【技术领域】
本发明涉及分子标记技术领域，特别涉及一种普通油茶SSR分子标记引物及标记方法和应用。
【背景技术】
普通油茶是油茶类物种中种植面积最广，总产量最高的木本油料植物，常用于榨取高质量的食用茶油；此外，榨油剩余物可进一步加工，用作化工、纺织和农药等行业的原材料。由于其不饱和脂肪酸含量高达90％以上，茶油是一种优质食用油，已被联合国粮农组织作为健康型高级食用油进行重点推广。随着生活水平的提高，人民对食用油的要求也随之提高。茶油变得供不应求，难以满足人民的需求。增加茶油的产量的关键是提高油茶的产量。油茶数量虽多，然而低产林占绝大多数，因此，培育普通油茶高产新品种十分紧迫。分子育种技术相对于常规育种周期短，准确度高等优点。然分子育种需要大量的优质分子标记。SSR就是其中之一。
虽然目前已有关于利用油茶叶片，芽，花和种子等转录组开发了大量的SSR标记，但这些SSR分子标记是叶，芽，花和种子性状相关基因的功能标记。而还尚未有关于普通油茶根的转录组及SSR标记的开发，油茶根生长发育快，细胞分裂快，开展了普通油茶根发育转录组测序和SSR分子标记的开发和转移，将能为今后开展遗传育种、基因组作图、基因定位和物种亲缘关系鉴别等研究提供新的思路。
【发明内容】
鉴于上述内容，有必要提供一种普通油茶根的转录组及SSR标记的开发方法，该方法能为今后开展遗传育种、基因组作图、基因定位和物种亲缘关系鉴别等研究提供新的思路。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种普通油茶SSR分子标记引物，所述SSR引物的序列如SEQ ID NO.1～90所示。
进一步的，所述SSR引物的序列如SEQ ID NO.1～12、SEQ ID NO.19～24、SEQ IDNO.27～28、SEQ ID NO.31～32、SEQ ID NO.39～40、SEQ ID NO.43～44、SEQ ID NO.47～56、SEQ ID NO.59～60、SEQ ID NO.63～64、SEQ ID NO.69～80、SEQ ID NO.83～86、SEQ IDNO.89～90所示。
本发明还提供了一种应用所述SSR分子标记引物进行分子标记的方法，该方法包括如下步骤：
(1)样品油茶根RNA提取：以组织培养过程中的油茶生根过程的油茶根部为材料，利用RNA提取试剂盒提取RNA，构建cDNA文库、测序；
(2)设计样品油茶的SSR引物：利用FastQC对步骤(1)测序出的RNA数据进行质量控制，构建油茶根的Unigene序列；利用MISA对Unigene进行SSR位点检索，获得并设计一系列SSR位点的引物；
(3)从步骤(2)的SSR引物中选择SSR引物用于对油茶样品进行分子标记；
(4)转移的样品油茶DNA提取：取不同品种的油茶样品嫩叶存于-20°冰箱中，用改良的CTAB法提取其基因组DNA，存于-20℃待用；
(5)SSR引物扩增：根据步骤(3)筛选的SSR引物，针对步骤(4)的样品油茶基因组DNA进行PCR扩增；反应结束后，在PCR管中加入6×Loading buffer 2μL，混合均匀，吸取2μL在8.0％聚丙烯酰胺凝胶上200V电压下电泳1.5h，再进行快速银染，显影，照相；
(6)油茶SSR引物遗传多样性分析：统计在普通油茶中无扩增产物、无多态和有多态三种情况的数量；进一步分析有扩增产物引物在不同油茶物种的转移情况；利用GenAlEx6.5估算多个油茶品种的等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、Shannon信息指数(I)。
进一步的，所述步骤(1)(2)的样品油茶为：岑软3号。
进一步的，所述步骤(4)转移的样品油茶为：金花茶3小叶、大叶金2、博白大果油茶、日本红山茶、小果油茶、南荣油茶、普通油茶、长林23号、长林4号、香花油茶、义安-2、宛田红花油茶、弄章实生、弄章01、官山01、鸿鸪01、那荡06、陆川大果油茶、鸿鸪08、鸿鸪23。
进一步的，所述步骤(5)的PCR扩增体系为：
用ddH2O补至总体积10μL；
PCR反应程序为：预变性94℃ 4min；变性94℃ 30sec，退火59℃ 30sec(Δ℃＝1℃)，延伸72℃ 45sec，9个循环；变性94℃ 30sec，退火55℃ 30sec,延伸72℃ 30sec,21个循环，72℃延伸10min，4℃保存。
本发明还提供一种所述的普通油茶SSR分子标记引物的应用，该引物用于检测不同油茶品种遗传多样性。
本发明具有如下有益效果：
本发明以油茶根系为材料，提取油茶根系的RNA并进行逆转录、测序、分析得到相应的SSR引物，油茶根生长发育快，细胞分裂快，对油茶根发育转录组测序和SSR分子标记的开发和转移，将能为今后开展遗传育种、基因组作图、基因定位和物种亲缘关系鉴别等研究提供新的引物和思路。
【附图说明】
图1是本发明实施例油茶生根过程转录组中SSR基序类型分布图；
图2是本发明实施例SSR重复单元占比最多基序的百分比图。
【具体实施方式】
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
实施例：
一、实验方法：
1、样品油茶RNA提取方法：
1)转录组测序实验材料：实验油茶品种为由普通油茶良种“岑软3号”。
2)样本处理：以组织培养过程中“岑软3号”生根过程中的三个关键时间节点：插生根前为(CK组)、插生根后1天(T1组)、插生根后14天即[出现根点](T2组)、插生根后50天[根生长阶段](T3组)，取得根部材料后，利用ddH2O冲洗干净琼脂糖后，立刻放入液氮中，待提取RNA。
3)提取测序方法：利用RNAiso for polysaccharide-rich Plant Tissue提取所有样本的RNA，并将CK，T1，T2和T3等量混合，构建cDNA文库，用于Illumina HiSeq2000测序。
2、SSR标记转移的实验材料及提取方法：
1)SSR标记转移的实验材料为如下18个品种：金花茶3小叶、大叶金2、博白大果油茶、日本红山茶、小果油茶、南荣油茶、普通油茶、长林23号、长林4号、香花油茶、义安-2、宛田红花油茶、弄章实生、弄章01、官山01、鸿鸪01、那荡06、陆川大果油茶、鸿鸪08、鸿鸪23。
2)SSR标记应用材料：取上述18个品种的嫩叶，利用改良的CTAB法提取其基因组DNA，存于-20℃待用。
3、数据分析：
利用FastQC对转录组数据进行质量控制，利用Trimmomatic过滤低质量序列，接头等得到Clean Data.再利用Trinity对clean data进行组装，得到转录组组装结果。在此基础上，利用MISA搜索SSR位点，并设计相应的SSR位点引物。
对转录组SSR标记进行特征分析，并分别从转录组开发的SSR中随机选择45对SSR标记引物(引物序列如表1所示)，用于下一步的验证和应用。
表1普通油茶根转录组开发合成用于本实验的SSR引物
4、SSR引物扩增：根据步骤表1筛选的SSR引物，针对步骤3的18个样品油茶基因组DNA进行PCR扩增
PCR反应体系：模板DNA 1L，2.5mmolL-1dNTPs 1L，10×Buffer 1L，10mmolL-1上下游引物各0.4L，Taq聚合酶1.5U，用ddH2O补足到10L体系。
扩增反应程序：预变性94℃ 4min；变性94℃ 30sec，退火59℃ 30sec(Δ℃＝1℃)，延伸72℃ 45sec，9个循环；变性94℃ 30sec，退火55℃ 30sec,延伸72℃ 30sec,21个循环，72℃延伸10min，4℃保存。
反应结束后，在PCR管中加入6×Loading buffer 2μL，混合均匀，吸取2μL在8.0％聚丙烯酰胺凝胶上200V电压下电泳1.5h，再进行快速银染，显影，照相。
5、数据分析：
统计在普通油茶中无扩增产物、无多态和有多态三种情况的数量；进一步分析有扩增产物引物在不同油茶物种的转移情况。再利用GenAlEx 6.5估算遗传多样性参数(等位基因数目Na、有效等位基因数目Ne、观测杂合度Ho、期望杂合度He、Shannon信息指数I)。
二、结果与分析：
1、转录组测序结果和SSR特征分析：
利用Illumina Hiseq 2000平台测序，共产出4956567120nt数据。组装得到57121个Unigene,总长为42633606nt，N50为1174nt。利用MISA脚本在Unigene中搜索SSR位点，SSR位点的标准为1-12，2-6，3-5，4-5，5-4，6-4。总共检测到15902个SSR位点。不同SSR基序类型分布如图1所示：二碱基基序的类型数量最多为8976，其次为三碱基基序为4008，接着为单碱基基序数量为1927，六碱基基序(511)，五碱基基序(346)，最少为四碱基基序为134。
如图2所示，在检测到的SSR位点中，AG/CT的比例为最多(48.64％)，其次为A/T(11.97％)，第三位为AAG/CTT(6.18％)。
2、SSR标记的开发和转移：
本实验在SSR位点检测的基础上，设计了6738对，合成其中的45对引物用于亲缘物种的转移分析。其中10对引物无法扩增出产物，6对可以扩增出产物，但无多态；另外29对SSR为多态引物(具体结果见表2)。
表2 48对合成的SSR在亲缘物种中的转移情况
注：“+”表示能扩增出产物；“-”不能扩增出产物；“M”表示引物没有多态；“P”表示多态引物。
3、遗传多样性：
本实验对参与SSR转移分析的样本进行了遗传多样性分析。具体结果如表3所示：检测到样本的数目N的变化范围为4到18；有效等位基因数目Ne为1.14到5.79；Shannnon’s信息指数的变化范围为0.24到1.83。
表3油茶参试样本的遗传多样性
| Locus | N | Na | Ne | I | Ho | He |
| CoSSR1 | 15 | 5 | 3.81 | 1.43 | 1.00 | 0.74 |
| CoSSR2 | 12 | 5 | 2.80 | 1.20 | 0.58 | 0.64 |
| CoSSR3 | 15 | 7 | 4.21 | 1.65 | 0.60 | 0.76 |
| CoSSR4 | 9 | 7 | 5.79 | 1.83 | 0.44 | 0.83 |
| CoSSR5 | 17 | 3 | 1.61 | 0.68 | 0.47 | 0.38 |
| CoSSR6 | 10 | 6 | 3.45 | 1.47 | 0.40 | 0.71 |
| CoSSR10 | 18 | 2 | 1.80 | 0.64 | 0.67 | 0.44 |
| CoSSR11 | 16 | 4 | 2.26 | 0.92 | 0.75 | 0.56 |
| CoSSR12 | 17 | 3 | 2.25 | 0.91 | 0.76 | 0.56 |
| CoSSR14 | 15 | 3 | 2.41 | 0.95 | 0.67 | 0.58 |
| CoSSR16 | 15 | 2 | 1.14 | 0.24 | 0.00 | 0.12 |
| CoSSR20 | 13 | 3 | 2.89 | 1.08 | 0.46 | 0.65 |
| CoSSR22 | 14 | 4 | 2.47 | 1.08 | 0.57 | 0.59 |
| CoSSR24 | 14 | 3 | 2.90 | 1.08 | 0.71 | 0.66 |
| CoSSR25 | 14 | 4 | 2.14 | 0.99 | 0.50 | 0.53 |
| CoSSR26 | 14 | 3 | 2.90 | 1.08 | 0.79 | 0.66 |
| CoSSR27 | 7 | 5 | 4.26 | 1.51 | 0.14 | 0.77 |
| CoSSR28 | 6 | 6 | 4.80 | 1.68 | 0.33 | 0.79 |
| CoSSR30 | 14 | 3 | 2.56 | 1.00 | 0.79 | 0.61 |
| CoSSR32 | 14 | 3 | 2.67 | 1.04 | 0.50 | 0.63 |
| CoSSR35 | 9 | 5 | 3.12 | 1.35 | 0.67 | 0.68 |
| CoSSR36 | 7 | 6 | 4.08 | 1.57 | 0.71 | 0.76 |
| CoSSR37 | 10 | 5 | 4.35 | 1.54 | 0.20 | 0.77 |
| CoSSR38 | 9 | 6 | 2.84 | 1.38 | 0.67 | 0.65 |
| CoSSR39 | 9 | 6 | 3.95 | 1.54 | 0.56 | 0.75 |
| CoSSR40 | 10 | 3 | 2.38 | 0.94 | 0.40 | 0.58 |
| CoSSR42 | 10 | 3 | 2.25 | 0.94 | 0.40 | 0.56 |
| CoSSR43 | 10 | 2 | 1.22 | 0.33 | 0.20 | 0.18 |
| CoSSR45 | 4 | 2 | 1.28 | 0.38 | 0.25 | 0.22 |
注：N表示样本数量；Na表示等位基因数目；Ne表示有效等位基因数目；Ho表示观测杂合度；He表示期望杂合度；I表示Shannon信息指数。
综上所述，使用本申请得到的SSR引物，能对多个品种的油茶进行扩增标记，能为今后开展遗传育种、基因组作图、基因定位和物种亲缘关系鉴别等研究提供新思路。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 钦州学院
<120> 一种普通油茶SSR分子标记引物及标记方法和应用
<130> ZP19100147/QZX
<141> 2019-02-17
<160> 90
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<400> 34
tctcacggcg aaggagtagt 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
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agcagtgagg aagccgaata 20
<210> 36
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 36
aacacctcat gactgtcaaa tca 23
<210> 37
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<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 37
ctgctgcatg cacacactta 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
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atggtgctga cgatgatgag 20
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<213> 人工序列(rengongxulie)
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cctggtcacg gtaacctctc 20
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<212> DNA
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acttgtgggt ttcaaatggc 20
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<211> 25
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<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 41
tgtgtttttg tgtttcaatc atttt 25
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atccttttga cagccaccac 20
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ttcctctcaa ccctcaccac 20
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accaggctga ttacattcgc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 45
ttcaaactca cacgcaaagg 20
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accaggctga ttacattcgc 20
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<213> 人工序列(rengongxulie)
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gggctttggg gataagaaag 20
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attgaagaag cgacgaccac 20
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<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 49
cgtgtctgcc ttggctattt 20
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<213> 人工序列(rengongxulie)
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cgatgatcgg aaagtaggga 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 51
tcaagtcctg aaagggttcg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 52
actccagaaa ttgcattggc 20
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<213> 人工序列(rengongxulie)
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gcatggtcgg aggatacagt 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
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ccagggaagg tctcaaaaca 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 55
cggagtccga cgacaataat 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 56
cgtcttcttc accgaaagca 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 57
gaaccatcaa cctggaggac 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 58
ccaaagaagc gacctttgag 20
<210> 59
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<212> DNA
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tgcttagctg ggtggatcat 20
<210> 60
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<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 60
attgagggat gaggaggagg 20
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<213> 人工序列(rengongxulie)
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aacccctctt tggaattgga 20
<210> 62
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 62
ccctatgaat agaaatcaac caa 23
<210> 63
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<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
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atcaggggtt atttcgagcc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
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cacatggtct gaacccacaa 20
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<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 65
taaaattcac ttcccgccag 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
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atctgtcttg gcttgccagt 20
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tccaaaattc caaatcccaa 20
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<213> 人工序列(rengongxulie)
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tcccctcatt caatcttcca 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 69
cccaatatga aaatcggtgc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
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gcaggctgtc aacagaaaca 20
<210> 71
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 71
atctcgaacc tcttgcctca 20
<210> 72
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<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
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ttccgcgacc tatttattcg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
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ggatctgttg ggtggtgagt 20
<210> 74
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<212> DNA
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ctgaagccgc ctcttgtatc 20
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<213> 人工序列(rengongxulie)
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gatacaagag gcggcttcag 20
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ttaattgatc ggctgggttc 20
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gagagtgggg cgttacaaaa 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 78
tatcgccatc tgttcatcca 20
<210> 79
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<400> 79
agctaatcga gctgcatggt 20
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<213> 人工序列(rengongxulie)
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tttccacaac accaccagaa 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
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tagaggaatt gttcccggtg 20
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<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 82
cggccatttt tacacacaca 20
<210> 83
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<213> 人工序列(rengongxulie)
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ccccttcctg ccctaataat 20
<210> 84
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<213> 人工序列(rengongxulie)
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ctccgagatc ctccacagag 20
<210> 85
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<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 85
tctcggtctc tgtgatgacg 20
<210> 86
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<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 86
gatacgaggg caatggagaa 20
<210> 87
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 87
gtgctattgt tggttgtggg 20
<210> 88
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<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 88
aagacagccc catttttgtg 20
<210> 89
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<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 89
tcatggcgat taaagctgtg 20
<210> 90
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 90
acggcatctg cctgtagttt 20
Claims (7)
1.一种普通油茶SSR分子标记引物，其特征在于，所述SSR引物的序列如SEQ ID NO.1～90所示。
2.根据权利要求1所述的普通油茶SSR分子标记引物，其特征在于，所述SSR引物的序列如SEQ ID NO.1～12、SEQ ID NO.19～24、SEQ ID NO.27～28、SEQ ID NO.31～32、SEQ IDNO.39～40、SEQ ID NO.43～44、SEQ ID NO.47～56、SEQ ID NO.59～60、SEQ ID NO.63～64、SEQ ID NO.69～80、SEQ ID NO.83～86、SEQ ID NO.89～90所示。
3.一种应用权利要求1所述SSR分子标记引物进行分子标记的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
(1)样品油茶根RNA提取：以组织培养过程中的油茶生根过程的油茶根部为材料，利用RNA提取试剂盒提取RNA，构建cDNA文库、测序；
(2)设计样品油茶的SSR引物：利用FastQC对步骤(1)测序出的RNA数据进行质量控制，构建油茶根的Unigene序列；利用MISA对Unigene进行SSR位点检索，获得并设计一系列SSR位点的引物；
(3)从步骤(2)的SSR引物中选择SSR引物用于对油茶样品进行分子标记；
(4)转移的样品油茶DNA提取：取不同品种的油茶样品嫩叶存于-20°冰箱中，用改良的CTAB法提取其基因组DNA，存于-20℃待用；
(5)SSR引物扩增：根据步骤(3)筛选的SSR引物，针对步骤(4)的样品油茶基因组DNA进行PCR扩增；反应结束后，在PCR管中加入6×Loading buffer 2μL，混合均匀，吸取2μL在8.0％聚丙烯酰胺凝胶上200V电压下电泳1.5h，再进行快速银染，显影，照相；
(6)油茶SSR引物遗传多样性分析：统计在普通油茶中无扩增产物、无多态和有多态三种情况的数量；进一步分析有扩增产物引物在不同油茶物种的转移情况；利用GenAlEx 6.5估算多个油茶品种的等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、Shannon信息指数(I)。
4.根据权利要求3所述SSR分子标记引物进行分子标记的方法，其特征在于，所述步骤(1)(2)的样品油茶为：岑软3号。
5.根据权利要求3所述SSR分子标记引物进行分子标记的方法，其特征在于，所述步骤(4)转移的样品油茶为：金花茶3小叶、大叶金2、博白大果油茶、日本红山茶、小果油茶、南荣油茶、普通油茶、长林23号、长林4号、香花油茶、义安-2、宛田红花油茶、弄章实生、弄章01、官山01、鸿鸪01、那荡06、陆川大果油茶、鸿鸪08、鸿鸪23。
6.根据权利要求3所述SSR分子标记引物进行分子标记的方法，其特征在于，所述步骤(5)的PCR扩增体系为：
用ddH2O补至总体积10μL；
PCR反应程序为：预变性94℃4min；变性94℃30sec，退火59℃30sec(Δ℃＝1℃)，延伸72℃45sec，9个循环；变性94℃30sec，退火55℃30sec,延伸72℃30sec,21个循环，72℃延伸10min，4℃保存。
7.如权利要求1所述的普通油茶SSR分子标记引物的应用，其特征在于：该引物用于检测不同油茶品种遗传多样性。
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Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110564886A (zh) * | 2019-09-29 | 2019-12-13 | 中国林业科学研究院亚热带林业研究所 | 金花茶ssr标记引物及其在杂种鉴定中的应用 |
| CN110628917A (zh) * | 2019-09-27 | 2019-12-31 | 北部湾大学 | 一种中国鲎ssr引物组及其应用 |
| CN110885893A (zh) * | 2019-09-04 | 2020-03-17 | 广东省农业科学院茶叶研究所 | 一种位于wd-重复蛋白基因上与茶树表儿茶素含量连锁的分子标记位点及其应用 |
| CN111607661A (zh) * | 2020-06-29 | 2020-09-01 | 北部湾大学 | 基于油茶转录组hAT转座子的分子标记引物组及其应用 |
| CN113604598A (zh) * | 2021-08-12 | 2021-11-05 | 南昌大学 | 鉴定普通油茶与小果油茶的分子标记引物及其方法 |
| CN115852013A (zh) * | 2022-08-08 | 2023-03-28 | 中南林业科技大学 | 一种油茶分子身份证的构建方法及应用 |
| CN115896336A (zh) * | 2022-12-15 | 2023-04-04 | 安徽农业大学 | 用于扩增舒茶早ssr标记的引物组合及其在茶树自交育种中的应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103667275A (zh) * | 2013-12-13 | 2014-03-26 | 江西省林业科学院 | 油茶ssr分子标记 |
| CN109337997A (zh) * | 2018-09-20 | 2019-02-15 | 江西省林业科学院 | 一种山茶属多态性叶绿体基因组微卫星分子标记引物及筛选和甄别近缘种的方法 |
-
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103667275A (zh) * | 2013-12-13 | 2014-03-26 | 江西省林业科学院 | 油茶ssr分子标记 |
| CN109337997A (zh) * | 2018-09-20 | 2019-02-15 | 江西省林业科学院 | 一种山茶属多态性叶绿体基因组微卫星分子标记引物及筛选和甄别近缘种的方法 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| FUMIYA TANIGUCHI等: "Worldwide core collections of tea (Camellia sinensis) based on SSR markers", 《TREE GENETICS & GENOMES》 * |
| SHENGRUI LIU等: "Genome-wide identification of simple sequence repeats and development of polymorphic SSR markers for genetic studies in tea plant (Camellia sinensis)", 《MOL BREEDING》 * |
| 张恩慧等: "广西普通油茶种质资源遗传多样性的SSR分析", 《广西植物》 * |
| 张震等: "油茶转录组测序与SSR特征分析", 《西南林业大学学报》 * |
| 彭婵等: "湖北油茶种质资源SSR分析", 《湖北林业科技》 * |
| 李海波等: "普通油茶转录组EST-SSR分子标记开发", 《植物生理学报》 * |
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110885893A (zh) * | 2019-09-04 | 2020-03-17 | 广东省农业科学院茶叶研究所 | 一种位于wd-重复蛋白基因上与茶树表儿茶素含量连锁的分子标记位点及其应用 |
| CN110628917A (zh) * | 2019-09-27 | 2019-12-31 | 北部湾大学 | 一种中国鲎ssr引物组及其应用 |
| CN110628917B (zh) * | 2019-09-27 | 2022-06-14 | 北部湾大学 | 一种中国鲎ssr引物组及其应用 |
| CN110564886A (zh) * | 2019-09-29 | 2019-12-13 | 中国林业科学研究院亚热带林业研究所 | 金花茶ssr标记引物及其在杂种鉴定中的应用 |
| CN110564886B (zh) * | 2019-09-29 | 2023-01-03 | 中国林业科学研究院亚热带林业研究所 | 金花茶ssr标记引物及其在杂种鉴定中的应用 |
| CN111607661A (zh) * | 2020-06-29 | 2020-09-01 | 北部湾大学 | 基于油茶转录组hAT转座子的分子标记引物组及其应用 |
| CN111607661B (zh) * | 2020-06-29 | 2022-06-14 | 北部湾大学 | 基于油茶转录组hAT转座子的分子标记引物组及其应用 |
| CN113604598A (zh) * | 2021-08-12 | 2021-11-05 | 南昌大学 | 鉴定普通油茶与小果油茶的分子标记引物及其方法 |
| CN115852013A (zh) * | 2022-08-08 | 2023-03-28 | 中南林业科技大学 | 一种油茶分子身份证的构建方法及应用 |
| CN115852013B (zh) * | 2022-08-08 | 2023-09-15 | 中南林业科技大学 | 一种油茶分子身份证的构建方法及应用 |
| CN115896336A (zh) * | 2022-12-15 | 2023-04-04 | 安徽农业大学 | 用于扩增舒茶早ssr标记的引物组合及其在茶树自交育种中的应用 |
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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