CN107164468A

CN107164468A - 用于鹿的多态性微卫星dna分子标记及其用途

Info

Publication number: CN107164468A
Application number: CN201710342610.3A
Authority: CN
Inventors: 王桂武; 杨万云
Original assignee: Institute Special Animal and Plant Sciences CAAS
Current assignee: Institute Special Animal and Plant Sciences CAAS
Priority date: 2017-05-16
Filing date: 2017-05-16
Publication date: 2017-09-15
Anticipated expiration: 2037-05-16
Also published as: CN107164468B

Abstract

本发明描述了用于鹿科动物的微卫星DNA分子标记。这些分子标记可用于鉴定等位基因多态性，鉴定相同或相关的鹿科动物，区分鹿科动物及研究种群中的遗传多样性。分子标记也可用于使用统计学方法的遗传和表型研究，例如，连锁分析、结合映射、连锁不平衡等。所述信息可用于植物的繁殖和/或选择。

Description

用于鹿的多态性微卫星DNA分子标记及其用途

技术领域

本发明涉及分子基因分型领域，具体而言，涉及用于鹿的多态性微卫星DNA分子标记及其用途。

背景技术

梅花鹿(Cervus nippon)主要分布于东亚，范围从西伯利亚到韩国、中国东部和越南；在日本等西太平洋岛屿也有分布。中国的梅花鹿主要分布在吉林省，而日本的梅花鹿主要分布于北海道。19世纪梅花鹿曾经被猎到几乎绝种，20世纪中开始立法保护，族群在1950年代到1980年代快速恢复。梅花鹿也被引进到澳大利亚、欧洲和美国。原先的目的是作为公园装饰用的动物，但现在许多变成野生。目前，分布于中国和日本的梅花鹿亚种已经被IUCN红色名录列为极危或濒危等级，我国的梅花鹿同时也是国家一级保护动物。

近年来，利用分子标记对物种的种群结构、遗传多样性、迁移、杂交、基因流及分子系统地理等的研究已经成为保护遗传学和分子生态学领域的热点。主要是因为它是划分种群保护管理单元和进化显著性单元、确定保护等级及制定优先保护管理措施的基础。目前，在关于梅花鹿的分子育种研究中，所应用的多态性微卫星分子标记大多数是借鉴已发布的牛的微卫星引物，只有少部分是通过传统的克隆方法得到的，且这些微卫星位点的多态性都不高，不能满足对梅花鹿进行保护、研究、管理及分子育种的要求。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明涉及微卫星DNA分子标记和用于扩增微卫星DNA分子标记的引物。本发明的微卫星DNA分子标记可用于分子基因分型和/或遗传指纹法，

根据本发明的一方面，本发明涉及一种鉴定鹿科动物样品基因型的方法，包括：

1)、提取所述鹿科动物样品的DNA；

2)、用选自下列的至少一个引物对扩增至少一种微卫星DNA分子标记：SEQ ID NO:30和31；SEQ ID NO:32和33；SEQ ID NO:34和35；SEQ ID NO:36和37；SEQ ID NO:38和39；SEQ ID NO:40和41；SEQ ID NO:42和43；SEQ ID NO:44和45；SEQ ID NO:46和47；SEQ IDNO:48和49；SEQ ID NO:50和51；SEQ ID NO:52和53；SEQ ID NO:54和55；SEQ ID NO:56和57；SEQ ID NO:58和59；SEQ ID NO:60和61；SEQ ID NO:62和63；SEQ ID NO:64和65；SEQ IDNO:66和67；SEQ ID NO:68和69；SEQ ID NO:70和71；SEQ ID NO:72和73；SEQ ID NO:74和75；SEQ ID NO:76和77；SEQ ID NO:78和79；SEQ ID NO:80和81；SEQ ID NO:82和83；SEQ IDNO:84和85以及SEQ ID NO:86和87；

或扩增各引物对对应的扩增产物的片段或变体；及

3)、鉴定所述鹿科动物样品中的至少一种多态等位基因。

在一些实施方式中，所述鹿科动物样品包括鹿科动物的毛发、体液、骨骼、粪便。

在一些实施方式中，所述鹿科动物样品的DNA的提取方法包括饱和苯酚-氯仿法、树脂提取法或磁珠提取法提取。

优选的，如上所述的方法，其中步骤2)包括用对应引物对扩增2种或更多微卫星DNA分子标记；

更优选的，其中步骤2)包括用对应引物对扩增3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29种微卫星DNA分子标记。

优选的，如上所述的方法，在步骤2)中，用所述引物对扩增至少一种微卫星DNA分子标记时，退火温度为58℃～62℃，循环次数为33～37次；

更优选的，退火温度为60℃，循环次数为35次。

如上所述的方法在鹿科动物亲子鉴定中的应用。

如上所述的方法在鹿科动物种群中的相同或相关基因型鉴定中的应用。

如上所述的方法在鉴定鹿科动物等位基因多态性中的应用。

如上所述的方法在区分鹿科动物种群中突变体中的应用。

如上所述的方法在研究鹿科动物种群中的遗传多样性中的应用。

优选的，前述任一项所述的方法及应用，所述鹿科动物包括鹿亚科、麂亚科、獐亚科和美洲鹿亚科动物；

更优选的，所述鹿科动物包括花鹿属、鹿属、黇鹿属和麋鹿属动物；

更优选的，所述鹿科动物包括马鹿、白唇鹿、坡鹿、阿氏鹿、菲律宾黑麂、宿氏鹿、鬣鹿、沼鹿、水鹿以及梅花鹿；

更优选的，所述鹿科动物为梅花鹿。

用于扩增至少一种微卫星DNA分子标记的分离的寡核苷酸引物，其包含选自下列的序列：SEQ ID NO:30～87所示核苷酸序列或其片段或变体。

寡核苷酸引物片段可包含部分SEQ ID NO:30～87，长度可以为5～25bp不等。

变体寡核苷酸引物不需要与SEQ ID NO:30～87共享任何重叠，但仅需能扩增本发明的微卫星DNA分子标记。变体寡核苷酸引物也包括与侧接本发明的微卫星DNA分子标记的区互补的任何寡核苷酸引物。如本领域技术人员明晰，用于PCR的变体寡核苷酸引物的3’端可不与SSR标志物或侧接SSR标志物的区具有任何错配，而5’端可具有错配。

本发明也提供试剂盒，其包含来自SEQ ID NO:30～87的至少一种寡核苷酸引物或其片段或变体。

优选的，在所述的试剂盒中，每对引物中至少有一条引物的5’端被荧光染料标记。

在一些实施方式中，所述荧光染料选自FAM、FITC、SYBR GreenⅠ、HEX、VIC、JOE、TAMRA、TET、ROX、Cy3、Cy5、TEXAS-Red、PET、NED、Alexa Fluor、DyLight和FTM。

分离的微卫星DNA分子标记，其由如上所述的引物扩增；

优选的，所述分离的微卫星DNA分子标记包含选自下列的序列：SEQ ID NO:1～29所示的核苷酸序列或其片段或变体。

根据SEQ ID NO:30～87的各引物对扩增来自梅花鹿的微卫星DNA分子标记的等位基因。扩增产物大小有所不同，并表示微卫星DNA分子标记的不同多态等位基因。因此，本发明涉及包含由本发明的引物对扩增的序列的微卫星DNA分子标记。

在29个座位中的每一个的微卫星DNA分子标记的不同多态等位基因具有不同序列。本发明包括29种微卫星DNA分子标记中的每一种的不同多态等位基因的序列。例如，29个序列中的每一个表示以下由寡核苷酸引物SEQ ID NO:30～87扩增的10种SSR标志物的特定等位基因。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明提供的引物对能在鹿科动物的样本中扩增出条带清晰、多态性高的微卫星DNA条带，使得本发明提供的引物能够应用于梅花鹿的种群遗传结构和遗传变异水平等方面的研究，采用微卫星DNA分子标记可以对梅花鹿的种群遗传学研究提供较为丰富的遗传基础信息。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购买获得的常规产品。

1、梅花鹿的基因组提取与检测。

取梅花鹿血液300ul，用Biotake血液提取试剂盒提取梅花鹿基因组，用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，酶标仪测定DNA浓度和纯度，-20℃储存备用。

2、简化基因组测序获得梅花鹿微卫星序列，并设计引物。

取梅花鹿血液300ul，提取基因组后，以牛基因组作为参考，选择HaeIII+Hpy166II进行酶切，酶切片段长度在414-444bp之间，检索全部非冗余基因数据库中的SSR位点，根据SSRs侧冀序列设计PCR引物。

3、对获得的梅花鹿微卫星序列进行分析，高效筛选多态性微卫星位点。

通过阅读大量文献后，从上述获得的微卫星序列中按以下原则筛选多态性微卫星位点

(1)挑选无间差碱基的、重复序列长的微卫星位点100个(单核苷酸重复的30个重复以上，二核苷酸重复的28个重复以上，三、四、五、六核苷酸重复的10个以上重复)。但是经过本次试验结果分析发现：在梅花鹿上，单核苷酸重复的微卫星几乎没有多态性，二核苷酸重复的微卫星多态性最高，且重复数越多，多态性越高。

(2)挑选AT含量高的微卫星序列。

(3)挑选出基本重复单位为(CNG)n以及(GAA)n类型的微卫星位点。

4、对筛选出来的微卫星位点进行多态性验证，包括聚丙烯酰胺凝胶电泳和毛细管电泳分析。

将筛选出来的100个微卫星位点的引物以梅花鹿基因组为模板进行PCR扩增，PCR扩增体系和条件见表1和表2。

表格1 PCR反应体系

表格2 PCR反应程序

然后进行琼脂糖电泳检测，其中70对引物可以扩增出清晰单一的目的条带。

(1)聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

随机选取8个梅花鹿的血样作为模板，用聚丙烯酰胺凝胶电泳测试这70个微卫星位点在上述8个模板上的多态性，最后发现41个位点有明显的多态性。

(2)毛细管电泳分析

从上述41个多态性微卫星位点中挑选出30个条带清晰且无杂带的位点，将其引物合成5’端带荧光标记的引物，然后用96个梅花鹿的DNA作为模板进行PCR扩增，最后用毛细管电泳进行检测。为了节省成本，我们将目的条带大小不同的引物带不同的荧光标记，然后混合一起上样。结果中有一对引物杂带太多，无法对其进行基因判型故舍弃。29对多态性微卫星引物见表3；其荧光混合信息见表4。

表格3微卫星位点及其引物信息

表格4微卫星标记分组情况

5、对获得的多态性微卫星位点的多态性进行进一步分析

根据所得到的电泳图，用Gene Mapper V4.0软件对微卫星基因型进行判定，然后用cervus2.0软件对上述30个多态性微卫星位点的期望杂合度(He)、等位基因数(k)、等位基因频率(P)、和多态信息含量(PIC)等指标进行分析。其结果整理见表5和表6.

表格5等位基因数杂合度多态信息含量

Locus：位点；k:等位基因数；N：检测的数量；Hets:异型合子；Homs:同源基因；H(0):观测杂合度；H(E):期望杂合度；PIC:多态信息含量；Excl(1)：父母一方已知时的父权排除率；Excl(2)：父母双方已知时的父权排除率；Nullfreq：无效基因频率。

表格6微卫星标记的等位基因及其等位基因频率

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院特产研究所

<120> 用于鹿的多态性微卫星DNA分子标记及其用途

<160> 87

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 489

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ccttcaaaaa agagagcaat tcattctctt cttaatactt tattactgct gcttttagct 60

ggcttctcct ggactcctac tattatatgg ttcagcgttc agttcatgtg actatgcatt 120

gctttataat atttagagca acttgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 180

gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gcatgtgtgg tgaggagtgt aggggggctt tgtgacgtgt 240

gtgtgtgtgt gcatgtgtag taaggaggtt agtggagcta catgacatgt gcatgtgagt 300

taatataagt aaatggatga atgaggatga aaggcaactc ttgaagctgg ttgaacaaca 360

cgaccaagaa agaagtgtct tagtttaacc accaagatgc ttctctgaat atcttctctt 420

atgagctttc aaaatcaata gaggctcagg ctatgagcta acccacaaaa agagatctga 480

tctcatgtg 489

<210> 2

<211> 415

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cactttagca gggcagctat ctgtttctca tccagatgct accattctcc tctttgctta 60

aatacataaa ccgagacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacttttt 120

ggtacaaaaa cccccaaacc tttattcaat ctttaaaacc ctctcaagtt tcccccagcc 180

ctctgatccc tcagtaaaga cctgggtcac tcctttttga tcccagaatt tgggatcaca 240

gaacatatca tagaaaagac tgtgagctct tggcacatgc tcaagaagtg tttgatgtgt 300

gaatgactga gtgagtgaat gaatgaagag ttgttgcagc agcttattcc tgtgaaggga 360

gaggtggttg gcacctggct ctcattctct caagatcaca ctcatctata cagat 415

<210> 3

<211> 428

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tacctgttcg atagaatttg aactgaccag tacctacagt catgtgagcc agtcccttaa 60

aataaatctg tctccatgtc actctcaagc cttccccctc tacacacaca cacacacaca 120

cacacacaca cacacacaca cacacaatat attggttctt tttttctgga gcaccctgct 180

cattacagcc gcttaacaga gaagagccat gatacatggc atcctaaatg gtgatttatt 240

caagtagttg gtattttact ttgaaaagca ctatctgccc ctcccaccct ggtgtcattt 300

ctaacaatga aaaaacctaa ataataatag taggagtggg agcgattgca gtcagaatac 360

cctggtgggg tccttactgg gtgcctggca ttgttcctgg cacttcccat gtattaacac 420

tttgagtt 428

<210> 4

<211> 427

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cctccgcgct ccaaacgcgc tccaaggact tagtgagaaa gagagagaca gagagagaga 60

gagagagaga gagagagaga gagagacaga cagagagaga gacagagaga gagagactag 120

aaagaaagaa agaaagaaag aaagaaagac acggggaccc aagctctgat ggagcaaagg 180

tggttaaatc aacatggagt gggcatatat actgacttac aaggtggcta ttctcagcaa 240

agataaagat taaaattcca aacttacaaa acataagatg atccctatca aagagagagt 300

tgcaaacaat caccttttac catatggctc ataaaaagga agagggtact tatcaccgta 360

atgagaaatg actggattcc ttagccccag gaaaggcgtg cctctccact taaggaatta 420

ataaggg 427

<210> 5

<211> 426

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cctctcactc tccttaattt gatgccaatc ccactccctc cactccttat tcagcatgga 60

tgtgcatgca aatacatcat acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac 120

acacacaagc atgctactca atataaagcc actaaataca attaaaatgt agctaaatta 180

caattaagta aatttaaaat ccagtgcttg gtctcattag tcacaaatgt tcaacagcca 240

catgtggcta gtggcttcca tactggacag catggatata ggacgctgca aagtctgacc 300

acatagcact gcactggaca ctttaaatta aaaatagttc tgttccaata tctaaaacct 360

aagctccaga gcaggggaaa acacattcct gaataatgaa actttcaaaa ttggtatgtt 420

caactt 426

<210> 6

<211> 403

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aactacaggg aagcctagca tgctgcatgc agtccatagg gtcagaaaga gttggacatg 60

actgagtgac tgaacaacaa caacaacaca gagatacaat aatgtgtgtg caaacacaca 120

cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacaccca ccccctagcc taagcatcca 180

ggctgtttgg atctcttggt tctaaaagat gggagtcaat ctaatgacct ggaaaggagg 240

cagacctgaa gttagtgata ggaacacagc ggagcaaatg ctgatggaat tagtaaaggc 300

agtttgtaag ggcaagtgag aaggtcacca gaactcacca acagctacat catcctgtta 360

ccatgatgat gccaccaagg tcccaggagg acccaggagg agg 403

<210> 7

<211> 384

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

aacatcttgt gatgacctac agtggaaaag aatctaaaga agctacacac acacacacac 60

acacacacac acacacacac acacgtgtct gtataactga accactttgc agtatatctg 120

aaacattgta aatcaagtat gcttcagtaa aatttgaaaa atacaatact gtactcttac 180

ggaagaatgg atgtcaaagg aagaactggt agttccatgt ctggattccc agtggagaag 240

acaaggagga aacaaagggg tactgagcct gggtgaatgg aaacttggtt ccacaatccc 300

caggaccaag gttggggatg gtagttcagg tggcatgtac cagaggaatg aggtgtctga 360

cagcaggggc agacagctgg ggta 384

<210> 8

<211> 431

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gacatagtgt ttaaatatag tgtgtgggtg atgtgtttgt gtgtggtatg tgatgtttgt 60

gtgtggtgtg tgatgtggtg tgtgtgtgtg tgtgaattgc agtatttatc tatctaatga 120

ttattaaaat tgactgtatc cactatccac atactcagga aaactgaagc actgctgata 180

gcgctgataa gtaaatagat agatagatag atagatagat agatagatag atagatacat 240

tctatataga tgtactagaa tatgctaaaa ttttcaagag tgtttaaata ccgcttctcg 300

agaataatta tctgcctaac agaaagtggg aaaaacgaca tggatgcttg ttatactcta 360

atccaagtct atttaagact gtgtcagaag atgctttgaa gaccacagtg agagggaact 420

cactctgggt g 431

<210> 9

<211> 420

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ccttttagat agaagtgcat tcatttttag tagaaataaa ttaagcccac gttaaaccaa 60

agtacttcag gttctgcctg aaatttcatg agtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 120

tgtgtgtgtg tctgcacacg cgcggagagg aagatgcttt catatgggct tccctggagc 180

tcagctggta aagagtccgc ctgcaatgca ggagaccctg gttcgattcc tgggttggaa 240

agataccttg gagaaggaat aggctaccca ctccagtatt cttgggcttc cctggtgtct 300

cacatggtaa aaaatccacc cgcaatgtgg gagacctggg tttgatcact gggttgggaa 360

gatcccctgg aggaaggcat ggcaacccgc tccagcattc ttgcctagag aatccctgtg 420

<210> 10

<211> 436

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cccacactgt ttagacaaag caaaacaaat ttagcttaaa gagcgtgcat caaacaatat 60

gagcagagca ctgtggtttg tgctaaaagg gaaacaaatg acgtgtgtgt gtgtgtgtgt 120

gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgcat gtgtagttca actctaaaac aaaaagttta 180

aaacctatag gtttgaagag ttgcttaata ttcaaaaaac aaagatctcc ttagaaaatg 240

aatattcatc tctaaattaa tccagcacag tgagagaagg aattacctgg taggaagtat 300

ctccttgcca ctggattagt atttgggaac attcttgcaa tatgaaaaat atgctacatc 360

ctttcaaact aggaccatac cagtctaaaa ctcagcaaga tactgccacc aaaagcccat 420

gggaactgag ctgagg 436

<210> 11

<211> 400

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ccacaagtga agatttgagg aatttggtta tacttaatga atggtgtctg gaaggtgtgt 60

gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gacacgagta tccttcatca 120

attgtagaag ataagtttcc actaatagca actgattttg atatactgtg agtttataaa 180

aatctcattt catttataac aatccaagat tattttcaca aagcttccag gctctatttt 240

ttaaataatt gcaggtatat acagaaaatg taggtttgct tccttcaaaa atatacagac 300

ttcagaagat agatcatttc agttcagttc agttcagttc agttattcag tcatgtccga 360

ctctttgcga tgccacggac tacaacacac caggcttccc 400

<210> 12

<211> 416

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ccttacttag agaagataag tgaattgccc ataatataca gaaaaccagg actggaatcc 60

aagtgtcctg ctcatatcct cgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 120

tgtgtgtttt catcatacca cagatgttta atgttctgag gctcattaaa atagcactaa 180

ataggcaatt ttcttatcta gattgtttgg gtgactctgt caaaatacct taagattatg 240

ctttcaacgg taatcctcct tttatttttc aatttgcatt aattttctgt ttttattttt 300

taaaaagata tctttgatca aaatgcttaa ctccactcac acagttacat acattctcat 360

gttgataaac aaaaaggaaa acatgcagaa gaaaatgact ccctttcttg aaggtg 416

<210> 13

<211> 427

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

caccaaagca ttattacaat gacctggaaa caacataagt gttcatcagt acatgaatgg 60

ataaagaaaa cgtcacttac actcacacac acacacacac acacacacac acacacacac 120

acacacatac tggaatatca ttcaaccaaa gaaagaaaga gatcctgcca ttaaccacaa 180

catggatgaa acttgaaggc attatgttaa gtgaaaggtc agacatagaa agataactaa 240

catatgttct cacttatgtg tggaatcttt tttaaaaaat ctttaaaaaa tcatagaaac 300

agagaacaaa ttggtggttg tcgaggttgg caggggagga aatgagggga aagtggtcag 360

acggacaagt gttcagcaat aagaagagtc actttggcga tgtaatgtac agcatggtga 420

ccacagt 427

<210> 14

<211> 424

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

aacctgcctg caaaatgcaa gagacataat tgacacaggt tcgatcccgg ggttgggaag 60

atcccctgga gaagggcatg gaaacccact ctagtattct tgcctggaga attccatgga 120

cagaggagcc tagcaggcta caatcaatag agtcacaaag agtcagatat gactcaagtg 180

actcagcatg caggggcgtg cgcacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca 240

cacatatatg tgggtatgtg tgtatatgca tataagaggg gttaggaggg tggtaacaga 300

aatgagatct ttctaacggt accactctgc acagatgtaa tattgcttct atggtaaaat 360

gcctattcat ttccatccac tgagttaccg taaatttttg aaacacagcc cattcatgaa 420

atgg 424

<210> 15

<211> 433

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ccaaggttcc tgggcttgtt gggctctgct ttctgggaca atttgggttt tattcacaga 60

agcaaccctg tgtttgtgca gggaaattgg gacaggaaac agcccaagac acattgtgga 120

gaagttcctt tccaaaatat ttttaaggtg taaaaagaga ggataaacta tataaatccc 180

aggagtctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct cacacacaca cacaccaggg 240

tgaggtttct taggtaaaaa atgacattgg tctctgtctc catagggagg accagtgccc 300

caactacaaa ggctgttgga ttcccaagag tgctgttata tctgaggctt tcttggaaaa 360

cccttcctgt ctcttgcagc caatcaagta atgaaagttg cattggactg tgatctggta 420

actaagataa agg 433

<210> 16

<211> 424

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

cctggtttta aacctttgtg ccttctcctg tcttacttct ttcagggaga tgtacctaca 60

ttcttttctc tctctctctc tctttctctc tctctctttc tctctccctc tctccctccc 120

tccctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctccc ccatgccgtt 180

cattctgaga gtatcccctg gatcctgctg aggctggacc ccggcaagat gggactttaa 240

aagtcatgta ttacagcatt tatcaactaa gtaactatat attcaatagg aacagataaa 300

gcacctttgt ttttatagaa aaccttagat gagggagcaa agggacaaaa ggaagaggca 360

aagaaaagaa tgtagggtgt tttctgcata cttctttatt agggtcttgt acattatctt 420

ctgg 424

<210> 17

<211> 419

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ccaagaattg ttaaggaggc ttacattacc aacttcacga gaagaggaga atctctagag 60

aaaaggagag tcaaaagaca gcctcccacc ccctagacac acacacacac acacacacac 120

acacacacac acacccacaa cacattcttc atgactcaga actttaaatc ctccttaaca 180

cagtggtcta gaacaaacat ctttgagtct agccctgcta tgtcttggat ttctagggtg 240

tttttgtacg gttggagatt gtttagggtt catattgcat ggtgttctca ttggttggca 300

ttgatattac ctagaagtgg taaaatagaa gagcagcaac cttgagcccc cttagagtcc 360

cccaaaattg ggctccatag aacagttgtg ggacaactat ggaaacttga ataatgggg 419

<210> 18

<211> 390

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gccacttaat ttataagctt aattgtgtaa caatcatgct caaatcttag tgtttgcaga 60

ttagttgtaa aaaattcata tatggcaggt caaaagccac atttttagag aagtattacc 120

cttttctgaa aatcttatct gaaacagtta atttgttgag gctaaaataa gaactactta 180

aaatctttca tagttagggg catcatcgtc aataagtcat aagtcaaata attggatttt 240

ttaaattatt tgtactaaag cctttcagtc atgtttgcta tcaccgtttg tttcagtaaa 300

aacaacaaca acaacaacaa caacaacaac ttatcattga gacttccctg gcagtctggt 360

gattaagttt ccatgctttt attgcagggg 390

<210> 19

<211> 348

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

tcttggctga atcactcaat ttctttatgt ataatgctga tagtgatttt tttttttttg 60

caaccacagg attttttgag actctgaaac cataattaat agtgaaactg cattgtataa 120

tatctctgac attttttcct tgggggaaga atcatggaga atagtaaaag aactggagag 180

tacagatatc tctctgtatc attattatac tccagaggag agaggtacca cttggtcttg 240

agaaaagagc aatgcttcct tgtgcttatg atgtgtttca ccagatccgg ctttataaac 300

atgatgatga tgatgatgat gatgatgatg acagagtact tgactgtt 348

<210> 20

<211> 442

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

aacagctact atatgcagct atgctggaga gtctgagaga ttccctagac cgtacctttg 60

aactcctagt tcttaggaga cacgtcacaa catgtctgga tcatgtgaga gattgatgac 120

tgtctcagaa gtcagtgatt gaaaattggg aatttaatta aaatattagc actgttttct 180

atacttgcgc tacacacaca cacccataca tacatacata catacataca tacatacata 240

catacatgtt ctgcaaacct ctgtgaagga tcttatgcat gggcggagcc tgagtacttt 300

gtatatacag tccagcacac agtaggaaca caaggagtct caatataaag ggcagagctc 360

ctcgaagggg ggacatttca cagatgggta atttggggtc ctaagggttt gttctgggag 420

cggtgggtca aggcggatta gg 442

<210> 21

<211> 417

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

cccagagtct gaaatcacga tgtcggtagg gctgtgttcc ctctgggatt tctggggaga 60

attcctcctt gtctcttcta gccttgacgg ctgctggtgt tccttggtca tattgctcca 120

aactctgcct ctgtcttcat atcactttac cgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 180

tgtgtgtgtg atcttcctct ttcctaataa ggcgcttgtg agttattatc aatctaccac 240

acctggggtt atatataaat aactgatgta atatggcagc cgtagatgtg tgccacgtgg 300

atttgccagt tagctcaagc tcagctcaag ttagctgaca gcctccaact acaacacctt 360

caggatttgc cacactctgc ctggcaaccc caagccaatg accgcgcatg gcaggtg 417

<210> 22

<211> 420

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

gacatcattt cacgttgtta aatgacgcaa cgaacaaagt tacatctgga aatcacagaa 60

ctgccaaata tgaggtctgt tttgtaattt gaaaagaatc ctttatactt ttctgatgta 120

cgtggttcga acttcagact caaagcccac aatccagcaa ggtctcctga agatacgctt 180

tatgggattc acacacacac acacacacac acacacacac acacacagac agaagcacac 240

acactctcca ggacatctca tgctaaactg tataaaagtg acagaacagc taaaatcctg 300

aaatcctttt cttaaacaaa gagagaaatc ctgaaaacaa agtggaaagg aaaagcattc 360

aatggaagtt aaaagtgaga cgtgaaaata agaggaaaac gcagtgccaa aattcctgtt 420

<210> 23

<211> 422

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

tacttcctct tctgtcataa gatgctgact cacaagagat gagcacattc tacttgggtt 60

ctagaaaaac tctctctata ggtatgtgtg tgtgagtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 120

tgtgtgtgtg tgtggcgggg ggcggggggg gcttccccga tggctcagtg gtccagaatc 180

ctccgcccaa tcaagaagac atgggtttga tccctggatc aggaagatgc cctggagaag 240

gatatggcaa cccactccag tattcttgcc tgcaaatcct catgcacaaa ggagcctggc 300

atgctacagc ctatgggggg gtcacaaaag agttggacac aacttagcaa ctaagcaaca 360

ttacacacac acacacgttc atatatgtat tttatgcata tatatgtatt ttaaaggctg 420

gg 422

<210> 24

<211> 417

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

aactgaaaaa tattcataat gtgagttaag tattatttgg gacaaaatgg ggactctagc 60

ccaggagaca gcatctagat agctctgagg aactgctctg aagaagtaga gaggagatca 120

atatctatct atctatctat ctatctatct atctatctat ctttgatttt ggtgaagaga 180

gtaggtgcag tcaagcacac attttggcag aaggttgttg ctagtcacaa gagcaggtgt 240

ctccattagc aattttaatg cttttctaga tgtgaaaaga tacaagaaat cgagctcata 300

aaaccttccc ctggaaacat ctaactgtgt gaagccctgt tctgctagtt ttcccagagc 360

acagatgcct cattcctgat ctccattccg aactcctttc aggggatgtt gaaggtt 417

<210> 25

<211> 429

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

ccaaagtttt tggggtgtta aggctataat tgctttctac caattattgt gaaagttctg 60

attatcataa ttatatgagc tggaatattg atatacatcc agtaagtact catattaaca 120

tattatagcc attaaaatcc cctttcataa aatatatgaa atacttcact gtaagtaatt 180

tatgtatgca tatatatgaa gtatatatat atactgcttt gccagagaag ctgtgaagag 240

ataccccacg tccgagtaag taagtaagta agtaagtaag taagtaagta agtaaataag 300

atggtaggca ctgagagatg gcatcagagg gctgacagac tgaagccaca ttcacagaca 360

actagccaat ctgatcacat ggaccacagc cttgtctaac tccatgaaac taatccatgc 420

tgtgtgggg 429

<210> 26

<211> 385

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

cctgctgcag tccatggggt cacagagtca gacaagactg agcaactgaa cacacacaca 60

cacacacaca cacacacaca cacacatata tatagtttta gttcatagat gcaaaaactg 120

cattgatttg attgtataat acttcttttg tgggatgggt cctgtgtatt gtaatctgtt 180

tagcaccatc tctagtctat tccctagaaa ccagttaaac atccatgccc cagttttaac 240

aatatctcta gacattgcca aacagttcct ggcaggcaaa aatatctgcc tggttgagaa 300

tcactgcact actttgatct gcagagatga cagtagtatt agttgctcat tctcaaccac 360

aagatataac ttatgggggc gaaaa 385

<210> 27

<211> 418

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

cactcttccc atacagaatt tgaccttgtg cttctttcag tctgctaaaa ataaccattt 60

cccacttgtt ttactctatg gggtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtag 120

gtatgtgtgt ttgaaagtca cgagtatatg cattggaaca tgtatgtgaa gatgaaggta 180

ttaggtagaa aatgggaaga agcacctgat atgggaaatg gaacatccaa gaacatcaag 240

tcttggatcc attaagacag gttatgtctt aacgttactc caataaaccc ttgtgctgag 300

atcggcatct tcttcccttg cattaagtca tcatcatgtc tagcatttcc taacccagtt 360

tctatctgtg ccaggactca gaattacatg ggctctggag tgggaaggat gtatagat 418

<210> 28

<211> 428

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

aacaaaacat ttaactgtgc ttggcataca gaggagctca aacagagaat ccgttgaact 60

gattcccatc tctctaaaaa agagtttgct taatgtttga tgaataaaga aacgattgat 120

gatatggata gataggtgta tggatgggta ggtggaggag tgggtgggtg gagagaggga 180

tgggtagggg gaaggggggg tggatggatg gatggatgga tggatggatg gatggaatgc 240

tgattggttg gtttgtggga tgatctgtct aaagtccttt ccaaacaaga ggatattcta 300

gaagcccctg ttactccttt cacctttggg acagaacaga gcttgtgtag gatgtgggga 360

ggtgctgtgg gtgaatctca gcagaaggat tggggtaagc tggagtagaa catactggca 420

gggagggg 428

<210> 29

<211> 388

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

cctttattat ttccaaatat tgtcatagtt ttaaagtccc ttattgatat catgtgtgtg 60

tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtt tgactcagtc atgtccaact ctttgtgatt 120

ctatgaactg tagcctgcca ggcccctcta cccagtccat gtatttctct gggtaagaat 180

agtggagtga gtacccattc ccttctccag gagatcttcc caatcaaagg atcgaaccca 240

ggtcttctgt actgcaggta tattcgttac catctgagcc accagggaaa ctatggacat 300

tgtactctac agtttttttt tgttttttta agtcctttga tcagcctttt gtatccccca 360

actgtcatcc ttggtttagg cagacatg 388

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

tggcttctcc tggactccta 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

ttgcctttca tcctcattca 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

gcagggcagc tatctgtttc 20

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

tcaaaaagga gtgacccagg 20

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

gtcatgtgag ccagtccctt 20

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

ggggcagata gtgcttttca 20

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

gcgctccaag gacttagtga 20

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

aaccaccttt gctccatcag 20

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

atttgatgcc aatcccactc 20

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

gcagcgtcct atatccatgc 20

<210> 40

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

tgcatgcagt ccatagggt 19

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

attccatcag catttgctcc 20

<210> 42

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

tcttgtgatg acctacagtg gaa 23

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

tctccactgg gaatccagac 20

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

ctgaagcact gctgatagcg 20

<210> 45

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

agcatccatg tcgtttttcc 20

<210> 46

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

aagcccacgt taaaccaaag 20

<210> 47

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

atgtgagaca ccagggaagc 20

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

cagagcactg tggtttgtgc 20

<210> 49

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 49

tccttctctc actgtgctgg 20

<210> 50

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 50

ttttcacaaa gcttccaggc 20

<210> 51

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 51

tgtgttgtag tccgtggcat 20

<210> 52

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 52

ggaatccaag tgtcctgctc 20

<210> 53

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 53

ggaggattac cgttgaaagc 20

<210> 54

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 54

ttacaatgac ctggaaacaa ca 22

<210> 55

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 55

tgttgtggtt aatggcagga 20

<210> 56

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 56

catggacaga ggagcctagc 20

<210> 57

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 57

taccaccctc ctaacccctc 20

<210> 58

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 58

ttcacagaag caaccctgtg 20

<210> 59

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 59

tttgtagttg gggcactggt 20

<210> 60

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 60

cctttgtgcc ttctcctgtc 20

<210> 61

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 61

tttaaagtcc catcttgccg 20

<210> 62

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 62

agtcaaaaga cagcctccca 20

<210> 63

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 63

ccaaccgtac aaaaacaccc 20

<210> 64

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 64

gcaggtcaaa agccacattt 20

<210> 65

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 65

gactgccagg gaagtctcaa 20

<210> 66

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 66

gattgtggga aagagggtga 20

<210> 67

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 67

gattcttccc ccaaggaaaa 20

<210> 68

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 68

tgcagctatg ctggagagtc 20

<210> 69

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 69

gcccatgcat aagatccttc 20

<210> 70

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 70

ggggagaatt cctccttgtc 20

<210> 71

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 71

atccacgtgg cacacatcta 20

<210> 72

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 72

actcaaagcc cacaatccag 20

<210> 73

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 73

aattttggca ctgcgttttc 20

<210> 74

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 74

tgagcacatt ctacttgggt tc 22

<210> 75

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 75

ttgccatatc cttctccagg 20

<210> 76

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 76

agcccaggag acagcatcta 20

<210> 77

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 77

tggagacacc tgctcttgtg 20

<210> 78

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 78

gccattaaaa tcccctttca 20

<210> 79

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 79

gccatctctc agtgcctacc 20

<210> 80

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 80

tggggtcaca gagtcagaca 20

<210> 81

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 81

aatacacagg acccatccca 20

<210> 82

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 82

tttgaccttg tgcttctttc a 21

<210> 83

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 83

ttggatgttc catttcccat 20

<210> 84

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 84

ggatgggtag gtggaggagt 20

<210> 85

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 85

ttaccccaat ccttctgctg 20

<210> 86

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 86

tgtcatagtt ttaaagtccc ttattg 26

<210> 87

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 87

tgattgggaa gatctcctgg 20

Claims

1.鉴定鹿科动物样品基因型的方法，包括：

1)、提取所述鹿科动物样品的DNA；

2)、用选自下列的至少一个引物对扩增至少一种微卫星DNA分子标记：SEQ ID NO:30和31；SEQ ID NO:32和33；SEQ ID NO:34和35；SEQ ID NO:36和37；SEQ ID NO:38和39；SEQ IDNO:40和41；SEQ ID NO:42和43；SEQ ID NO:44和45；SEQ ID NO:46和47；SEQ ID NO:48和49；SEQ ID NO:50和51；SEQ ID NO:52和53；SEQ ID NO:54和55；SEQ ID NO:56和57；SEQ IDNO:58和59；SEQ ID NO:60和61；SEQ ID NO:62和63；SEQ ID NO:64和65；SEQ ID NO:66和67；SEQ ID NO:68和69；SEQ ID NO:70和71；SEQ ID NO:72和73；SEQ ID NO:74和75；SEQ IDNO:76和77；SEQ ID NO:78和79；SEQ ID NO:80和81；SEQ ID NO:82和83；SEQ ID NO:84和85以及SEQ ID NO:86和87；

或扩增各引物对对应的扩增产物的片段或变体；及

3)、鉴定所述鹿科动物样品中的至少一种多态等位基因。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中步骤2)包括用对应引物对扩增2种或更多微卫星DNA分子标记；优选的，其中步骤2)包括用对应引物对扩增29种微卫星DNA分子标记。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，用所述引物对扩增至少一种微卫星DNA分子标记时，退火温度为58℃～62℃，循环次数为33～37次。

4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述鹿科动物包括鹿亚科、麂亚科、獐亚科和美洲鹿亚科动物；

更优选的，所述鹿科动物包括马鹿、白唇鹿、坡鹿、阿氏鹿、菲律宾黑麂、宿氏鹿、鬣鹿、沼鹿、水鹿以及梅花鹿。

5.权利要求1～4任一项所述的方法在鹿科动物亲子鉴定中的应用。

6.权利要求1～4任一项所述的方法在鹿科动物种群中的相同或相关基因型鉴定中的应用。

7.权利要求1～4任一项所述的方法在区分鹿科动物种群中突变体中的应用。

8.权利要求1～4任一项所述的方法在研究鹿科动物种群中的遗传多样性中的应用。

9.用于扩增至少一种微卫星DNA分子标记的分离的寡核苷酸引物，其包含选自下列的序列：SEQ ID NO:30～87所示核苷酸序列或其片段或变体。

10.分离的微卫星DNA分子标记，其由权利要求9所述的引物扩增；