CN109593871A - 用于区分玉米杂种优势群的玉米kasp分子标记组合及其开发方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于区分玉米杂种优势群的玉米KASP分子标记组合，包括202个KASP分子标记，202个KASP分子标记分别特异性检测202个玉米SNP位点SNPjs0001～SNPjs0202。较佳地，每个KASP分子标记分别包括二条正向引物和一条反向引物，202个KASP分子标记的序列依次如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:606所示。还提供了用于区分玉米杂种优势群的玉米KASP分子标记组合的开发方法。本发明的用于区分玉米杂种优势群的玉米KASP分子标记组合能够有效区分玉米杂种优势群，具有高度稳定性、准确性和低成本的特点，设计巧妙，检测简便快捷，成本低，不受环境影响，适于大规模推广应用。

Description

用于区分玉米杂种优势群的玉米KASP分子标记组合及其开发 方法和应用
技术领域
本发明涉及生物信息学及分子标记遗传学技术领域，更具体地，涉及玉米KASP分子标记技术领域，特别是指一种用于区分玉米杂种优势群的玉米KASP分子标记组合及其开发方法和应用。
背景技术
玉米是重要的粮食及饲料作物，由于具有较高的遗传多样性已成为重要模式作物。丰富的基因组变异为开发具有高多态性分子标记提供了可能。根据变异序列的长短将基因组变异分为三种类型：(1)单核苷酸变异(SNP)；(2)插入缺失(Indel 2-50bp)；(3)>50bp的序列重排(SV)。基于Indel和SV开发的标记不仅检测通量低，而且成本相对较高。SNP标记具有分布广泛、遗传稳定性好且易于实现自动化等优点，目前已迅速取代传统的分子标记。
高通量测序技术的快速发展，有效推动玉米基因组结构变异的研究。有报道揭示玉米基因组中超过100万个SNP。SNP是单核苷酸变异产生的多态性，无法通过常规的PCR技术与凝胶电泳技术利用长度的差异来区分其多态性。目前尽管开发了多种SNP基因分型方法，包括定点测序技术、等位基因特异性PCR(AS-PCR)、裂解扩增多态性序列(CAPS)、温度开关PC(TS-PCR)和基因重测序，这些方法都存在低通量或高成本等局限性(Gaudet M,Fara AG,Beritognolo I,Sabatti M.Allele-specific PCR in SNP genotyping.Method MolBiol,2009,578(212):415–424；Huang X Q,Roder M S.Development of SNP assays forgenotyping the puroindolineb gene for grain hardness in wheat usingpyrosequencing.J Agric Food Chem,2005,53(6):2070–2075；Tabone T,Mather D E,Hayden M J.Temperature switch PCR(TSP):robust assay design for reliableamplification and genotyping of SNPs.BMC Genomics,2009,10(1):580)。基于芯片技术的SNP基因分型平台的通量较高，每张芯片包含几百到数百万的SNP位点。但大多数基于芯片的基因分型平台适用于样本量较大的全基因组扫描时，成本较高。
KASP(Kompetitive Allele Specific PCR)，即竞争性等位基因特异性PCR技术，以其高度稳定性、准确性和低成本的特点，已经被广泛应用于高通量SNP分型，尤其在样本量大，SNP位点少时，KASP的应用特点最为显著。KASP在小到中等数量的标记应用中显示出了成本效益和可扩展的灵活性，如在双亲本群体的质量控制分析、标记辅助的轮回选择、辅助回交和QTL精细定位等方面发挥重要作用。但KASP分子标记的开发需要综合考虑目的区段DNA变异、多态性以及位点专化性等因素，标记开发的成功率较低。
因此，希望提供一种玉米KASP分子标记组合，其能够有效区分玉米杂种优势群，具有高度稳定性、准确性和低成本的特点。
发明内容
为了克服上述现有技术中的缺点，本发明的一个目的在于提供一种用于区分玉米杂种优势群的玉米KASP分子标记组合，其能够有效区分玉米杂种优势群，具有高度稳定性、准确性和低成本的特点，适于大规模推广应用。
本发明的另一目的在于提供一种用于区分玉米杂种优势群的玉米KASP分子标记组合，其设计巧妙，检测简便快捷，成本低，不受环境影响，适于大规模推广应用。
本发明的另一目的在于提供一种用于区分玉米杂种优势群的玉米KASP分子标记组合的开发方法，由其开发的玉米KASP分子标记组合能够有效区分玉米杂种优势群，具有高度稳定性、准确性和低成本的特点，适于大规模推广应用。
本发明的另一目的在于提供一种用于区分玉米杂种优势群的玉米KASP分子标记组合的开发方法，其设计巧妙，操作简便快捷，成本低，不受环境影响，适于大规模推广应用。
本发明的另一目的在于提供一种用于区分玉米杂种优势群的玉米KASP分子标记组合在区分玉米杂种优势群中的应用，从而能够有效区分玉米杂种优势群，具有高度稳定性、准确性和低成本的特点，适于大规模推广应用。
本发明的另一目的在于提供一种用于区分玉米杂种优势群的玉米KASP分子标记组合在区分玉米杂种优势群中的应用，其设计巧妙，检测简便快捷，成本低，不受环境影响，适于大规模推广应用。
为达到以上目的，在本发明的第一方面，提供了一种用于区分玉米杂种优势群的玉米KASP分子标记组合，其特点是，所述的用于区分玉米杂种优势群的玉米KASP分子标记组合包括202个KASP分子标记，202个所述KASP分子标记分别特异性检测202个玉米SNP位点SNPjs0001～SNPjs0202。
较佳地，每个所述KASP分子标记分别包括二条正向引物和一条反向引物，202个所述KASP分子标记的序列依次如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:606所示。
在本发明的第二方面，提供了一种用于区分玉米杂种优势群的玉米KASP分子标记组合的开发方法，其特点是，所述的用于区分玉米杂种优势群的玉米KASP分子标记组合的开发方法包括以下步骤：
(1)从NCBI的3个SRA数据库PRJNA82843、SRP011907和PRJNA260788下载多份玉米自交系的二代原始序列，多份所述玉米自交系分别来自于瑞德群、改良瑞德群、热带群、PB群、兰卡斯特群、四平头群和其他种质群，对所述玉米自交系以最小等位基因频率＞0.05、基因型缺失率≤20％、哈迪温伯格平衡显著性阀值P<0.001、多态信息含量>0.4以及二态性为条件进行筛选得到候选SNP位点，从所述候选SNP位点中筛选出前后各100bp没有其它变异位点的待选SNP位点，再从所述待选SNP位点中选择在不同所述玉米自交系之间具有保守性的靶标SNP位点；
(2)根据所述靶标SNP位点和所述靶标SNP位点的侧翼序列设计KASP引物组合；
(3)根据所述KASP引物组合，采用KASP实验对一部分所述玉米自交系进行实验验证，获得相应的基因型分型结果，其中该一部分所述玉米自交系分别来自于所述瑞德群、所述改良瑞德群、所述热带群、所述PB群、所述兰卡斯特群、所述四平头群和所述其他种质群；
(4)根据所述基因型分型结果以及所述KASP引物组合在玉米染色体上的分布情况，从中挑选有效的多个目的KASP引物组合，多个所述目的KASP引物组合作为多个KASP分子标记形成用于区分玉米杂种优势群的玉米KASP分子标记组合。
所述玉米自交系的份数可以根据需要确定，为了能够获得用于区分玉米杂种优势群的玉米KASP分子标记组合，份数越多越好，同时考虑到工作量，较佳地，所述玉米自交系的份数为205份，205份所述玉米自交系分别为B73、A632、zheng32、H84、XOP2、D15、CAU27、A679、F618、LH190、2369、W499、CR14、6103、NC268、Beck、LH191、4676A、郑58、478、5003、huangC、zong3、tie7922、K22、CX13、CX3、CX50、CX39、CX71、CX18、CX49、shen142、su75、yu537A、yu374、ye488、hu803、yu82、1205A、Yd6、FC-13、zhongyin 15、xing230、qiong51、bao3040、ye107、ye5237、xun92-8、CX38、CX98、Suwan1611、Four-row、CML162、YML46、DY206、CML52、Ki11、Ki3、M162W、huotanghuang17、CML103、CML322、CML69、CML52、MO18W、fusheA、M37W、wu125、eman24、dai6、Lo11、EZ5、EP44、NC358、NC350、CML277、P1、H16、T877、qi319、P138、Shen137、Shen135、Yu87-1、P136、shen997、L-1、9058、shan89、P138、D20、1145、M131、N138、M101、R25、R98、RO17、cheng698、Mo17、OH43、LH51、LH61、longkang11、danhuang11、dan3115、fu8521、zheng22、lv28、ben7884、xiangai3、lv45、B98、LH93、ye52106、zhonghuang64、CX5、M14、ning55、P007、H99、zong31、jiu138、hai1134、CX12、CX11、CX28、CX26、CX2、CX81、CX69、CX72、CX47、CX29、CX53、CX23、danhuang02、W153R、Va26、MBST、LH38、LH39、78371A、200B、ji853、lian87、Huangzao4、昌7-2、S22、Huangyesi3、wu126、Huangyesi、Lx9801、444、K12、CX36、CX73、CX46、CX51、CX43、CX66、CX75、CX58、CX99、CX40、CX35、CX4、CX25、CX14、CX6、CX42、CX41、CX60、B12、CX102、han21、3H2、ye515、Q1261、changK、K12、wenhuang31413、zhong451、ji4112、ye5237、xun92、changD、RS1-8-L-1399、4F1、Lx9801、B394、F2、F7、F283、BKN010、EC49A、F03802、F7-1、F283、EP1、D152、DK105、IL14H、P39，其中B73、A632、zheng32、H84、XOP2、D15、CAU27、A679、F618、LH190、2369、W499、CR14、6103、NC268、Beck、LH191、4676A来自于所述瑞德群，郑58、478、5003、huangC、zong3、tie7922、K22、CX13、CX3、CX50、CX39、CX71、CX18、CX49、shen142、su75、yu537A、yu374、ye488、hu803、yu82、1205A、Yd6、FC-13、zhongyin 15、xing230、qiong51、bao3040、ye107、ye5237、xun92-8、CX38、CX98来自于所述改良瑞德群，Suwan1611、Four-row、CML162、YML46、DY206、CML52、Ki11、Ki3、M162W、huotanghuang17、CML103、CML322、CML69、CML52、MO18W、fusheA、M37W、wu125、eman24、dai6、Lo11、EZ5、EP44、NC358、NC350、CML277、P1、H16来自于所述热带群，T877、qi319、P138、Shen137、Shen135、Yu87-1、P136、shen997、L-1、9058、shan89、P138、D20、1145、M131、N138、M101、R25、R98、RO17、cheng698来自于所述PB群，Mo17、OH43、LH51、LH61、longkang11、danhuang11、dan3115、fu8521、zheng22、lv28、ben7884、xiangai3、lv45、B98、LH93、ye52106、zhonghuang64、CX5、M14、ning55、P007、H99、zong31、jiu138、hai1134、CX12、CX11、CX28、CX26、CX2、CX81、CX69、CX72、CX47、CX29、CX53、CX23、danhuang02、W153R、Va26、MBST、LH38、LH39、78371A、200B、ji853、lian87来自于所述兰卡斯特群，Huangzao4、昌7-2、S22、Huangyesi3、wu126、Huangyesi、Lx9801、444、K12、CX36、CX73、CX46、CX51、CX43、CX66、CX75、CX58、CX99、CX40、CX35、CX4、CX25、CX14、CX6、CX42、CX41、CX60、B12、CX102、han21、3H2、ye515、Q1261、changK、K12、wenhuang31413、zhong451、ji4112、ye5237、xun92、changD、RS1-8-L-1399、4F1、Lx9801、B394来自于所述四平头群，F2、F7、F283、BKN010、EC49A、F03802、F7-1、F283、EP1、D152、DK105、IL14H、P39来自于所述其他种质维度群；该一部分所述玉米自交系为46份所述玉米自交系B73、A632、zheng32、H84、郑58、478、5003、huangC、1205A、zong3、tie7922、K22、shen142、Suwan1611、Four-row、CML162、YML46、DY206、CML52、Ki11、Ki3、T877、qi319、P138、Shen137、Shen135、Yu87-1、P136、Mo17、OH43、LH51、LH61、longkang11、danhuang11、Huangzao4、昌7-2、S22、Huangyesi3、wu126、Huangyesi、Lx9801、444、K12、F2、F7、F283，其中B73、A632、zheng32、H84来自于所述瑞德群，郑58、478、5003、huangC、1205A、zong3、tie7922、K22、shen142来自于所述改良瑞德群，Suwan1611、Four-row、CML162、YML46、DY206、CML52、Ki11、Ki3来自于所述热带群，T877、qi319、P138、Shen137、Shen135、Yu87-1、P136来自于所述PB群，Mo17、OH43、LH51、LH61、longkang11、danhuang11来自于所述兰卡斯特群，Huangzao4、昌7-2、S22、Huangyesi3、wu126、Huangyesi、Lx9801、444、K12来自于所述四平头群，F2、F7、F283来自于所述其他种质维度群，所述KASP分子标记的数目为202个，202个所述KASP分子标记分别特异性检测202个玉米SNP位点SNPjs0001～SNPjs0202。
由于每个所述KASP分子标记分别包括二条正向引物和一条反向引物，更佳地，202个所述KASP分子标记的序列依次如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:606所示。
在所述步骤(1)中，可以采用任何合适的手段计算所述最小等位基因频率和所述多态信息含量，较佳地，利用VCFtools软件计算所述最小等位基因频率和所述多态信息含量。
在所述步骤(1)中，可以采用任何合适的手段进行所述选择，较佳地，通过多窗口比对进行所述选择。
在所述步骤(2)中，可以采用任何合适的手段进行所述选择，较佳地，采用Primer5.0或mIndel软件设计所述KASP引物组合。
所述的用于区分玉米杂种优势群的玉米KASP分子标记组合的开发方法还可以包括任何合适的其它步骤，较佳地，在所述步骤(4)后，所述的用于区分玉米杂种优势群的玉米KASP分子标记组合的开发方法还包括：
(5)基于所述候选SNP位点和所述KASP分子标记对应的SNP位点，计算该多份所述玉米自交系之间的遗传距离并构建聚类图，并进行遗传距离相似性分析。
在所述步骤(5)中，可以采用任何合适的手段进行所述计算，更佳地，采用TASSELV5.0软件的邻接算法N-J进行所述计算。
在所述步骤(5)中，可以采用任何合适的手段进行所述遗传距离相似性分析，更佳地，采用R语言的cor函数包进行所述遗传距离相似性分析。
在本发明的第三方面，提供了一种用于区分玉米杂种优势群的玉米KASP分子标记组合，其特点是，采用上述的用于区分玉米杂种优势群的玉米KASP分子标记组合的开发方法获得。
在本发明的第四方面，提供了上述的用于区分玉米杂种优势群的玉米KASP分子标记组合或者上述的用于区分玉米杂种优势群的玉米KASP分子标记组合的开发方法获得的用于区分玉米杂种优势群的玉米KASP分子标记组合在区分玉米杂种优势群中的应用。
本发明的有益效果在于：
a.本发明的用于区分玉米杂种优势群的玉米KASP分子标记组合包括202个KASP分子标记，202个KASP分子标记分别特异性检测202个玉米SNP位点SNPjs0001～SNPjs0202，因此，其能够有效区分玉米杂种优势群，具有高度稳定性、准确性和低成本的特点，适于大规模推广应用。
b.本发明的用于区分玉米杂种优势群的玉米KASP分子标记组合包括202个KASP分子标记，202个KASP分子标记分别特异性检测202个玉米SNP位点SNPjs0001～SNPjs0202，因此，其设计巧妙，检测简便快捷，成本低，不受环境影响，适于大规模推广应用。
c.本发明的用于区分玉米杂种优势群的玉米KASP分子标记组合的开发方法通过下载来自7个不同类群的玉米自交系的二代原始序列，然后采用生物信息学分析技术对这些材料的序列进行筛选和选择，获得靶标SNP变异位点，再设计KASP引物组合，对一部分玉米自交系进行实验验证，获得相应的基因型分型结果，根据基因型分型结果以及KASP引物组合在玉米染色体上的分布情况，从中挑选有效的多个目的KASP引物组合，作为多个KASP分子标记，形成用于区分玉米杂种优势群的玉米KASP分子标记组合，因此，由其开发的玉米KASP分子标记组合能够有效区分玉米杂种优势群，具有高度稳定性、准确性和低成本的特点，适于大规模推广应用。
d.本发明的用于区分玉米杂种优势群的玉米KASP分子标记组合的开发方法通过下载来自7个不同类群的玉米自交系的二代原始序列，然后采用生物信息学分析技术对这些材料的序列进行筛选和选择，获得靶标SNP变异位点，再设计KASP引物组合，对一部分玉米自交系进行实验验证，获得相应的基因型分型结果，根据基因型分型结果以及KASP引物组合在玉米染色体上的分布情况，从中挑选有效的多个目的KASP引物组合，作为多个KASP分子标记，形成用于区分玉米杂种优势群的玉米KASP分子标记组合，因此，其设计巧妙，操作简便快捷，成本低，不受环境影响，适于大规模推广应用。
e.本发明的用于区分玉米杂种优势群的玉米KASP分子标记组合在区分玉米杂种优势群中的应用，从而能够有效区分玉米杂种优势群，具有高度稳定性、准确性和低成本的特点，适于大规模推广应用。
f.本发明的用于区分玉米杂种优势群的玉米KASP分子标记组合在区分玉米杂种优势群中的应用，从而设计巧妙，检测简便快捷，成本低，不受环境影响，适于大规模推广应用。
本发明的这些和其它目的、特点和优势，通过下述的详细说明，附图和权利要求得以充分体现，并可通过所附权利要求中特地指出的手段、装置和它们的组合得以实现。
附图说明
图1是本发明的用于区分玉米杂种优势群的玉米KASP分子标记组合的其中4个玉米KASP分子标记的基因分型图，其中a为KASP081的基因分型图，b为KASP254的基因分型图，c为KASP536的基因分型图，d为KASP1112的基因分型图；AA为红色簇状，表明是具有HEX型等位基因的品种；GG为蓝色簇状，表明是具有FAM型等位基因的品种；NTC为黑色簇状，表明是不含模板的空白对照。
图2是本发明的用于区分玉米杂种优势群的玉米KASP分子标记组合的202个KASP分子标记对应的202个SNP位点的遗传多态性，其中A为202个SNP位点在染色体上的物理位置，右边数字是202个KASP分子标记的编号，左边数字是202个KASP分子标记在染色体上物理位置，单位为Mb；B为202个SNP位点的最小等位基因频率分布和多态信息含量分布。
图3是玉米自交系基于SNP位点的Neighbor-joining(N-J)树分析图，其中A为205份玉米自交系基于202个SNP位点的Neighbor-joining(N-J)树分析图，红色线条代表46个实验材料；B为205份自交系基于1,660,336个SNP位点的Neighbor-joining(N-J)树分析图。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。
本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。实施实例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
选取来自7个不同类群的205份玉米自交系(详见表1)。
表1来自7个不同类群的205份玉米自交系
从NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)的3个SRA(Sequence Read Archive)数据库(PRJNA82843、SRP011907和PRJNA260788)下载这些玉米自交系的二代原始序列，选择最小等位基因频率(MAF)大于0.05的SNP位点，删除基因型缺失率超过20％的SNP位点，以哈迪温伯格平衡显著性阀值(HWE)P<0.001为标准再次过滤，最终保留多态信息含量(PIC)>0.4并且是二态性的候选SNP位点，共1,660,336个，其中，利用VCFtools软件(版本：v0.1.16；来源：https://vcftools.github.io/examples.html)计算SNP位点的最小等位频率(MAF)和多态信息含量(PIC)。再进一步筛选出SNP位点前后各100bp没有其它变异位点的待选SNP位点，然后通过多窗口比对，从待选SNP位点中选择在不同玉米自交系之间具有保守性的700个靶标SNP位点。
根据700个靶标SNP位点和侧翼序列由mIndel软件(来源：www.github.com/lyd0527/mInDel)设计用于PCR扩增的KASP引物组合，用以开发KASP分子标记。每个KASP引物组合设计两条SNP特异性引物(F1和F2)和一条通用引物(R)，F1尾部添加能够与FAM荧光结合的特异性序列，F2尾部添加能够与HEX荧光结合的特异性序列。
对46份玉米自交系代表(详见表2，获得自江苏省农业科学院作物分子育种实验室)的叶片进行取样。
表2 46份玉米自交系代表
按照上海浦迪植物基因组提取试剂盒操作步骤提取基因组DNA。KASP反应总体系为5μL，包含2×KASP Master Mix 2.5μL、KASP Assay Mix(引物混合工作液)0.07μL、浓度为20ngμL-1的模板DNA 2.43μL。KASP反应程序为，第一步：94℃，15min；第二步：94℃，20s、61-55℃，1min，每个循环降低0.6℃，共进行10个循环；第三步：94℃，20s、55℃，1min，共进行26个循环，PCR反应在购买自LGC公司型号为Hydrocycler 16的水浴PCR仪中进行。PCR产物通过KASP荧光分析仪(LGC公司型号为PHERAstar plus)扫描分析PCR结果。根据基因型分型结果和在玉米基因组染色体上的分布情况，挑选有效的KASP分子标记，共202个(图1示出了KASP081、KASP254、KASP536、KASP1112的基因型分型结果)。
对202个KASP分子标记对应的202个SNP位点(请参见表3)的最小等位基因频率和多态信息含量进行总体评价，请参见图2所示，202个SNP位点的PIC变化范围为0.458-0.469，平均值为0.463，MAF变化范围为0.434-0.467，平均值为0.451。
表3 KASP分子标记对应的202个SNP位点信息
请参见图2和图3所示，基于实验获得的202个KASP分子标记对应的202个SNP位点和上述获得的1,660,336个二态性SNP位点，分别对205份玉米自交系构建了系统发育树。结果表明，类群划分结果高度一致，其中仅4份玉米自交系CX38,CX98、IL14H、P39的划群结果不同，其余201份玉米自交系的划群结果都相同，类群划分结果一致性达98％。205份玉米自交系中用于KASP验证的46份玉米自交系代表，分别分布各自的类群中，46份玉米自交系代表的类群划分与系谱来源相一致。
利用R语言(版本：v3.4.1)的cor函数包对202个KASP分子标记对应的202个SNP位点和上述获得的1,660,336个二态性SNP位点进行了遗传距离相似性分析，两者之间的遗传距离相似性高达89.5％。
因此，本发明通过下载来自7个不同类群的玉米自交系的二代原始序列，然后采用生物信息学分析技术对这些材料的序列进行筛选和选择，获得靶标SNP变异位点，再设计KASP引物组合，对一部分玉米自交系进行实验验证，获得相应的基因型分型结果，根据基因型分型结果以及KASP引物组合在玉米染色体上的分布情况，从中挑选有效的多个目的KASP引物组合，作为多个KASP分子标记，形成用于区分玉米杂种优势群的玉米KASP分子标记组合，能够有效区分玉米杂种优势群，具有高度稳定性、准确性和低成本的特点。
综上所述，本发明的用于区分玉米杂种优势群的玉米KASP分子标记组合能够有效区分玉米杂种优势群，具有高度稳定性、准确性和低成本的特点，设计巧妙，检测简便快捷，成本低，不受环境影响，适于大规模推广应用。
在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。

Claims (10)

1.一种用于区分玉米杂种优势群的玉米KASP分子标记组合，其特征在于，所述的用于区分玉米杂种优势群的玉米KASP分子标记组合包括202个KASP分子标记，202个所述KASP分子标记分别特异性检测202个玉米SNP位点SNPjs0001～SNPjs0202。
2.根据权利要求1所述的用于区分玉米杂种优势群的玉米KASP分子标记组合，其特征在于，每个所述KASP分子标记分别包括二条正向引物和一条反向引物，202个所述KASP分子标记的序列依次如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:606所示。
3.一种用于区分玉米杂种优势群的玉米KASP分子标记组合的开发方法，其特征在于，所述的用于区分玉米杂种优势群的玉米KASP分子标记组合的开发方法包括以下步骤：
(1)从NCBI的3个SRA数据库PRJNA82843、SRP011907和PRJNA260788下载多份玉米自交系的二代原始序列，多份所述玉米自交系分别来自于瑞德群、改良瑞德群、热带群、PB群、兰卡斯特群、四平头群和其他种质群，对所述玉米自交系以最小等位基因频率＞0.05、基因型缺失率≤20％、哈迪温伯格平衡显著性阀值P<0.001、多态信息含量>0.4以及二态性为条件进行筛选得到候选SNP位点，从所述候选SNP位点中筛选出前后各100bp没有其它变异位点的待选SNP位点，再从所述待选SNP位点中选择在不同所述玉米自交系之间具有保守性的靶标SNP位点；
(2)根据所述靶标SNP位点和所述靶标SNP位点的侧翼序列设计KASP引物组合；
(3)根据所述KASP引物组合，采用KASP实验对一部分所述玉米自交系进行实验验证，获得相应的基因型分型结果，其中该一部分所述玉米自交系分别来自于所述瑞德群、所述改良瑞德群、所述热带群、所述PB群、所述兰卡斯特群、所述四平头群和所述其他种质群；
(4)根据所述基因型分型结果以及所述KASP引物组合在玉米染色体上的分布情况，从中挑选有效的多个目的KASP引物组合，多个所述目的KASP引物组合作为多个KASP分子标记形成用于区分玉米杂种优势群的玉米KASP分子标记组合。
4.根据权利要求3所述的用于区分玉米杂种优势群的玉米KASP分子标记组合的开发方法，其特征在于，所述玉米自交系的份数为205份，205份所述玉米自交系分别为B73、A632、zheng32、H84、XOP2、D15、CAU27、A679、F618、LH190、2369、W499、CR14、6103、NC268、Beck、LH191、4676A、郑58、478、5003、huangC、zong3、tie7922、K22、CX13、CX3、CX50、CX39、CX71、CX18、CX49、shen142、su75、yu537A、yu374、ye488、hu803、yu82、1205A、Yd6、FC-13、zhongyin15、xing230、qiong51、bao3040、ye107、ye5237、xun92-8、CX38、CX98、Suwan1611、Four-row、CML162、YML46、DY206、CML52、Ki11、Ki3、M162W、huotanghuang17、CML103、CML322、CML69、CML52、MO18W、fusheA、M37W、wu125、eman24、dai6、Lo11、EZ5、EP44、NC358、NC350、CML277、P1、H16、T877、qi319、P138、Shen137、Shen135、Yu87-1、P136、shen997、L-1、9058、shan89、P138、D20、1145、M131、N138、M101、R25、R98、RO17、cheng698、Mo17、OH43、LH51、LH61、longkang11、danhuang11、dan3115、fu8521、zheng22、lv28、ben7884、xiangai3、lv45、B98、LH93、ye52106、zhonghuang64、CX5、M14、ning55、P007、H99、zong31、jiu138、hai1134、CX12、CX11、CX28、CX26、CX2、CX81、CX69、CX72、CX47、CX29、CX53、CX23、danhuang02、W153R、Va26、MBST、LH38、LH39、78371A、200B、ji853、lian87、Huangzao4、昌7-2、S22、Huangyesi3、wu126、Huangyesi、Lx9801、444、K12、CX36、CX73、CX46、CX51、CX43、CX66、CX75、CX58、CX99、CX40、CX35、CX4、CX25、CX14、CX6、CX42、CX41、CX60、B12、CX102、han21、3H2、ye515、Q1261、changK、K12、wenhuang31413、zhong451、ji4112、ye5237、xun92、changD、RS1-8-L-1399、4F1、Lx9801、B394、F2、F7、F283、BKN010、EC49A、F03802、F7-1、F283、EP1、D152、DK105、IL14H、P39，其中B73、A632、zheng32、H84、XOP2、D15、CAU27、A679、F618、LH190、2369、W499、CR14、6103、NC268、Beck、LH191、4676A来自于所述瑞德群，郑58、478、5003、huangC、zong3、tie7922、K22、CX13、CX3、CX50、CX39、CX71、CX18、CX49、shen142、su75、yu537A、yu374、ye488、hu803、yu82、1205A、Yd6、FC-13、zhongyin 15、xing230、qiong51、bao3040、ye107、ye5237、xun92-8、CX38、CX98来自于所述改良瑞德群，Suwan1611、Four-row、CML162、YML46、DY206、CML52、Ki11、Ki3、M162W、huotanghuang17、CML103、CML322、CML69、CML52、MO18W、fusheA、M37W、wu125、eman24、dai6、Lo11、EZ5、EP44、NC358、NC350、CML277、P1、H16来自于所述热带群，T877、qi319、P138、Shen137、Shen135、Yu87-1、P136、shen997、L-1、9058、shan89、P138、D20、1145、M131、N138、M101、R25、R98、RO17、cheng698来自于所述PB群，Mo17、OH43、LH51、LH61、longkang11、danhuang11、dan3115、fu8521、zheng22、lv28、ben7884、xiangai3、lv45、B98、LH93、ye52106、zhonghuang64、CX5、M14、ning55、P007、H99、zong31、jiu138、hai1134、CX12、CX11、CX28、CX26、CX2、CX81、CX69、CX72、CX47、CX29、CX53、CX23、danhuang02、W153R、Va26、MBST、LH38、LH39、78371A、200B、ji853、lian87来自于所述兰卡斯特群，Huangzao4、昌7-2、S22、Huangyesi3、wu126、Huangyesi、Lx9801、444、K12、CX36、CX73、CX46、CX51、CX43、CX66、CX75、CX58、CX99、CX40、CX35、CX4、CX25、CX14、CX6、CX42、CX41、CX60、B12、CX102、han21、3H2、ye515、Q1261、changK、K12、wenhuang31413、zhong451、ji4112、ye5237、xun92、changD、RS1-8-L-1399、4F1、Lx9801、B394来自于所述四平头群，F2、F7、F283、BKN010、EC49A、F03802、F7-1、F283、EP1、D152、DK105、IL14H、P39来自于所述其他种质维度群；该一部分所述玉米自交系为46份所述玉米自交系B73、A632、zheng32、H84、郑58、478、5003、huangC、1205A、zong3、tie7922、K22、shen142、Suwan1611、Four-row、CML162、YML46、DY206、CML52、Ki11、Ki3、T877、qi319、P138、Shen137、Shen135、Yu87-1、P136、Mo17、OH43、LH51、LH61、longkang11、danhuang11、Huangzao4、昌7-2、S22、Huangyesi3、wu126、Huangyesi、Lx9801、444、K12、F2、F7、F283，其中B73、A632、zheng32、H84来自于所述瑞德群，郑58、478、5003、huangC、1205A、zong3、tie7922、K22、shen142来自于所述改良瑞德群，Suwan1611、Four-row、CML162、YML46、DY206、CML52、Ki11、Ki3来自于所述热带群，T877、qi319、P138、Shen137、Shen135、Yu87-1、P136来自于所述PB群，Mo17、OH43、LH51、LH61、longkang11、danhuang11来自于所述兰卡斯特群，Huangzao4、昌7-2、S22、Huangyesi3、wu126、Huangyesi、Lx9801、444、K12来自于所述四平头群，F2、F7、F283来自于所述其他种质维度群，所述KASP分子标记的数目为202个，202个所述KASP分子标记分别特异性检测202个玉米SNP位点SNPjs0001～SNPjs0202。
5.根据权利要求4所述的用于区分玉米杂种优势群的玉米KASP分子标记组合的开发方法，其特征在于，每个所述KASP分子标记分别包括二条正向引物和一条反向引物，202个所述KASP分子标记的序列依次如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:606所示。
6.根据权利要求3所述的用于区分玉米杂种优势群的玉米KASP分子标记组合的开发方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，利用VCFtools软件计算所述最小等位基因频率和所述多态信息含量；或者，在所述步骤(1)中，通过多窗口比对进行所述选择；或者，在所述步骤(2)中，采用Primer5.0或mIndel软件设计所述KASP引物组合。
7.根据权利要求3所述的用于区分玉米杂种优势群的玉米KASP分子标记组合的开发方法，其特征在于，在所述步骤(4)后，所述的用于区分玉米杂种优势群的玉米KASP分子标记组合的开发方法还包括：
(5)基于所述候选SNP位点和所述KASP分子标记对应的SNP位点，计算该多份所述玉米自交系之间的遗传距离并构建聚类图，并进行遗传距离相似性分析。
8.根据权利要求7所述的用于区分玉米杂种优势群的玉米KASP分子标记组合的开发方法，其特征在于，在所述步骤(5)中，采用TASSELV5.0软件的邻接算法N-J进行所述计算；或者，在所述步骤(5)中，采用R语言的cor函数包进行所述遗传距离相似性分析。
9.一种用于区分玉米杂种优势群的玉米KASP分子标记组合，其特征在于，采用权利要求3～权利要求8中任一项所述的用于区分玉米杂种优势群的玉米KASP分子标记组合的开发方法获得。
10.根据权利要求1～权利要求2中任一项所述的用于区分玉米杂种优势群的玉米KASP分子标记组合或者权利要求3～权利要求8中任一项所述的用于区分玉米杂种优势群的玉米KASP分子标记组合的开发方法获得的用于区分玉米杂种优势群的玉米KASP分子标记组合在区分玉米杂种优势群中的应用。
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