CN108315396A - 一种简单便捷检测snp的新方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种简单便捷检测SNP的新方法。本发明提供了的引物组；引物组Ⅰ包括两条上游引物和一条下游引物；FX1引物和FY1引物的差别：3’末端第1位核苷酸，FX1引物对应特异SNP的X多态，FY1引物对应Y多态；FX1引物和FY1引物均为碱基错配引物；引物组Ⅱ包括两条上游引物和一条下游引物；FX2引物和FY2引物差异：3’末端第1位核苷酸不同，FX2引物对应特异SNP的X多态，FY2引物对应Y多态；FY2引物的5’端增加10‑20个随机核苷酸；FX2引物和FY2引物均为碱基错配引物。本发明提供的引物组可广泛应用于各类目标SNP位点的检测中，具有广阔的应用前景。

Description

一种简单便捷检测SNP的新方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种简单便捷检测SNP的新方法。
背景技术
生命的遗传信息存贮在DNA序列之中，每一个细胞的全部DNA构成了该生物的基因组。基因组DNA序列的变异是物种遗传多样性的基础，单核苷酸的变异是DNA序列的最基本的变异形式。随着全基因组测序技术的飞速发展，大量的单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphisms，SNP)数据被挖掘出来，作为基因组特征性标记得到了广泛的应用，并成为分子育种的第三代分子标记。
SNP标记是基于单核苷酸多态性开发的，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP标记数量多、分布广，是目前最具发展潜力的分子标记，以其二态性、高密度、高代表性、高遗传稳定性等优点，在作物遗传育种和功能基因组学等研究领域发挥着越来越大的作用。
随着技术的发展，出现了多种SNP基因分型的方法。全基因组测序和SNP芯片杂交是发现SNP最高效直接的方法，但是这两种方法需要大型的仪器以及操作非常熟练的技术人员，适合于高通量检测多个SNP位点。Taqman探针法、竞争性等位基因特异性(KASP)检测及高分辨率溶解曲线(HRM)可通过Real-Time PCR仪器实现对确定的目标SNP位点的检测，但是这三种方法都需要借助荧光染料来实现SNP分型，相比于普通PCR，价格仍然较高，且这三种检测方法对DNA质量、DNA浓度以及仪器操作人员的技术水平要求较高，轻微的样品污染或者浓度的不均一即可导致假阳性的发生，导致部分结果重复性较差，影响检测结论。因此开发操作简单、重复性好的SNP标记检测方法对进一步推动SNP标记的应用具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种简单便捷检测SNP的新方法。
本发明首先保护用于检测特异SNP位点基因型的引物组，为引物组Ⅰ或引物组Ⅱ；
所述特异SNP的多态形式为X/Y多态；
引物组Ⅰ包括两条上游引物和一条下游引物；将两条上游引物分别命名为FX1引物和FY1引物，将一条下游引物命名为R1引物；FX1引物和FY1引物的差别仅在于3’末端开始计的第1位核苷酸，FX1引物对应特异SNP的X多态，FY1引物对应特异SNP的Y多态；FX1引物和R1引物组成引物对甲，FY1引物和R1引物组成引物对乙；引物对甲和引物对乙的靶序列中均具有所述特异SNP位点；FX1引物和FY1引物均为单碱基错配引物或两碱基错配引物；所述单碱基错配引物中具有错配碱基的核苷酸为3’末端开始计的第2位核苷酸；所述两碱基错配引物中具有错配碱基的核苷酸位于3’末端开始计的第2位核苷酸和第3位核苷酸；
引物组Ⅱ包括两条上游引物和一条下游引物；将两条上游引物分别命名为FX2引物和FY2引物，将一条下游引物命名为R2引物；FX2引物和FY2引物存在两个差异：①3’末端开始计的第1位核苷酸不同，FX2引物对应特异SNP的X多态，FY2引物对应特异SNP的Y多态；②与FX2引物相比，FY2引物的5’端增加10-20个随机核苷酸；FX2引物和R2引物组成引物对丙，FY2引物和R2引物组成引物对丁；引物对丙和引物对丁的靶序列中均具有所述特异SNP位点；FX2引物和FY2引物均为单碱基错配引物或两碱基错配引物；所述单碱基错配引物中具有错配碱基的核苷酸为3’末端开始计的第2位核苷酸；所述两碱基错配引物中具有错配碱基的核苷酸位于3’末端开始计的第2位核苷酸和第3位核苷酸。
X代表A\T\C\G。Y代表A\T\C\G。
例如，所述X/Y多态可为A/C多态、G/A多态等。
引物组Ⅰ由两条上游引物和一条下游引物组成。
引物组Ⅱ由两条上游引物和一条下游引物组成。
所述具有错配碱基的核苷酸指的是：如果靶序列中相应的核苷酸为A，错配引物中具有错配碱基的核苷酸为G或者C；如果靶序列中相应的核苷酸为G，错配引物中具有错配碱基的核苷酸为A或者T；如果靶序列中相应的核苷酸为T，错配引物中具有错配碱基的核苷酸为G或者C；如果靶序列中相应的核苷酸为C，错配引物中具有错配碱基的核苷酸为A或者T。
所述下游引物对应于基因组中所述特异SNP位点下游50-500bp范围内。
与FX2引物相比，FY2引物的5’端增加20个随机核苷酸。
FX2引物与FY2引物Tm值差值为20以下。
引物组Ⅰ具体可为如下(a1)、(a2)或(a3)：
(a1)引物组Ⅰ中，所述FX1引物如序列表的序列2所示；所述FY1引物如序列表的序列3所示；所述R1引物如序列表的序列5所示；
(a2)引物组Ⅰ中，所述FX1引物如序列表的序列6所示；所述FY1引物如序列表的序列7所示；所述R1引物如序列表的序列5所示；
(a3)引物组Ⅰ中，所述FX1引物如序列表的序列10所示；所述FY1引物如序列表的序列11所示；所述R1引物如序列表的序列13所示。
引物组Ⅱ具体可为如下(b1)、(b2)或(b3)：
(b1)引物组Ⅱ中，所述FX2引物如序列表的序列2所示；所述FY2引物如序列表的序列4所示；所述R1引物如序列表的序列5所示；
(b2)引物组Ⅱ中，所述FX2引物如序列表的序列6所示；所述FY2引物如序列表的序列8所示；所述R1引物如序列表的序列5所示；
(b3)引物组Ⅱ中，所述FX2引物如序列表的序列10所示；所述FY2引物如序列表的序列12所示；所述R1引物如序列表的序列13所示。
本发明还保护一种检测特异SNP的方法(方法一)，包括如下步骤：
(1)以待测生物的DNA为模板，分别进行两个体系的PCR扩增；体系甲中采用所述的引物对甲，体系乙中采用所述的引物对乙；
(2)将步骤(1)得到的PCR扩增产物进行电泳；电泳的点样方法：先将一个体系的扩增产物点样至某一点样孔，间隔时间后，再将另一个体系的的扩增产物点样至同一点样孔；
(3)基因型判断
如果体系甲的扩增产物具有目标条带且体系乙的扩增产物不具有目标条带，基于所述特异SNP，待测生物的基因型为X纯合型；
如果体系甲的扩增产物不具有目标条带且体系乙的扩增产物具有目标条带，基于所述特异SNP，待测生物的基因型为Y纯合型；
如果体系甲的扩增产物具有目标条带且体系乙的扩增产物具有目标条带，基于所述特异SNP，待测生物的基因型为XY杂合型。
本发明还保护一种检测特异SNP的方法(方法二)，包括如下步骤：
(1)以待测生物的DNA为模板，分别进行两个体系的PCR扩增；体系丙中采用所述的引物对丙，体系丁中采用所述的引物对丁；
(2)将步骤(1)得到的体系丙的扩增产物和步骤(1)得到的体系丁的扩增产物混合，得到混合物；
(3)将步骤(2)得到的混合物进行电泳；
(4)基因型判断
如果具有小片段条带且不具有大片段条带，待测生物的基因型为X纯合型；
如果具有大片段条带且不具有小片段条带，待测生物的基因型为Y纯合型；
如果具有大片段条带且具有小片段条带，待测生物的基因型为XY杂合型；
所述小片段条带为引物对丙的目标条带；所述大片段条带为引物对丁的目标条带。
所述大片段条带与所述小片段条带相差的核苷酸数量等于：与FX2引物相比，FY2引物的5’端增加的核苷酸数量。
本发明还保护一种检测特异SNP的方法(方法三)，包括如下步骤：
(1)以待测生物的DNA为模板，采用FX2引物、FY2引物和R2引物进行PCR扩增；FX2引物、FY2引物和R2引物；
(2)将步骤(1)得到的扩增产物进行电泳；
(3)基因型判断
如果具有小片段条带且不具有大片段条带，待测生物的基因型为X纯合型；
如果具有大片段条带且不具有小片段条带，待测生物的基因型为Y纯合型；
如果具有大片段条带且具有小片段条带，待测生物的基因型为XY杂合型；
所述小片段条带为所述引物对丙的目标条带；所述大片段条带为所述引物对丁的目标条带。
所述大片段条带与所述小片段条带相差的核苷酸数量等于：与FX2引物相比，FY2引物的5’端增加的核苷酸数量。
以上任一所述方法中，所述待测生物为待测植物或者待测微生物。所述植物具体可为番茄。
以上任一所述方法中，所述DNA为基因组DNA或cDNA或总DNA。
以上任一所述特异SNP具体可为SNP144。
SNP144为番茄基因组中序列表的序列1所示核苷酸的第29位核苷酸。
所述特异SNP为SNP144时，所述引物组Ⅰ为(a1)或(a2)所述的引物组Ⅰ。
所述特异SNP为SNP144时，所述引物组Ⅱ为(b1)或(b2)所述的引物组Ⅱ。
以上任一所述特异SNP具体可为SNP724。
SNP724为番茄基因组中序列表的序列9所示核苷酸的第51位核苷酸。
所述特异SNP为SNP724时，所述引物组Ⅰ为(a3)所述的引物组Ⅰ。
所述特异SNP为SNP724时，所述引物组Ⅱ为(b3)所述的引物组Ⅱ。
方法一中，间隔时间可为间隔5-10分钟。
方法一中，体系甲和体系乙的组成均可为：模板溶液3μL，上游引物溶液0.5μL，下游引物溶液0.5μL，ES Taq Master Mixture 5μL，无菌水1μL。模板溶液中，模板DNA的浓度为5.0ng/μL。上游引物溶液中，上游引物的浓度为10pmol/L。下游引物溶液中，下游引物的浓度为10pmol/L。
方法一中，PCR扩增的反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s、58-60℃退火30s、72℃延伸30s，28-35个循环；72℃保温5min。
方法二中，体系丙的组成为：模板溶液3μL，上游引物溶液0.5μL，下游引物溶液0.5μL，ES Taq Master Mixture 5μL，无菌水1μL。模板溶液中，模板DNA的浓度为5.0ng/μL。上游引物溶液中，上游引物的浓度为10pmol/L。下游引物溶液中，下游引物的浓度为10pmol/L。
方法二中，体系丙PCR扩增的反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s、58-60℃退火30s、72℃延伸30s，28-35个循环；72℃保温5min。
方法二中，体系丁的组成为：模板溶液3μL，上游引物溶液0.5μL，下游引物溶液0.5μL，ES Taq Master Mixture 5μL，无菌水1μL。模板溶液中，模板DNA的浓度为5.0ng/μL。上游引物溶液中，上游引物的浓度为10pmol/L。下游引物溶液中，下游引物的浓度为10pmol/L。
方法二中，体系丁PCR扩增的反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s、退火30s(第1个循环的退火温度为58℃，第2个循环的退火温度为59.5℃，第3个循环的退火温度为61℃)、72℃延伸30s，3个循环；94℃变性30s、64℃退火30s、72℃延伸30s，30个循环；72℃保温5min。
方法三中，PCR扩增的反应体系：模板溶液3μL，FX2引物溶液0.5μL，FY2引物溶液0.5μL，R2引物溶液0.5μL，ES Taq Master Mixture 5μL，无菌水0.5μL。模板溶液中，模板DNA的浓度为5.0ng/μL。FX2引物溶液中，FX2引物的浓度为10pmol/L。FY2引物溶液中，FY2引物的浓度为10pmol/L。R2引物溶液中，R2引物的浓度为10pmol/L。
方法三中，PCR扩增的反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s、退火30s(第1个循环的退火温度为58℃，第2个循环的退火温度为59.5℃，第3个循环的退火温度为61℃)、72℃延伸30s，3个循环；94℃变性30s、64℃退火30s、72℃延伸30s，30个循环；72℃保温5min。
以上任一所述电泳可为琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰氨凝胶电泳。可以根据灵敏度选择，在琼脂糖凝胶电泳的灵敏度不满足预期时，可以采用聚丙烯酰氨凝胶电泳。所述琼脂糖凝胶电泳可为1％琼脂糖凝胶电泳或3％琼脂糖凝胶电泳。1％琼脂糖凝胶电泳的电泳参数：电压为120V，电泳时间30min。3％琼脂糖凝胶电泳的电泳参数：电压为120V，电泳时间80min。
本发明还保护以上任一所述引物组或任一所述方法在生物育种中的应用。所述生物为植物或者微生物。所述植物具体可为番茄。例如SNP724为番茄斑萎病相关SNP，A是抗病等位基因，G是感病等位基因。通过本发明提供的方法可以鉴定待测番茄基于SNP724的基因型，在番茄育种中选择AA基因型的番茄植株。
SNP位点在基因定位克隆、分子标记辅助育种和遗传多样性评价等方面的研究中有重要的理论及应用价值，但目前常用的SNP位点检测方法普遍存在着引物合成成本高、操作复杂、需要特殊仪器设备等缺点，因而大大限制了相应方法的推广和应用。本发明提供的方法，巧妙地在上游引物3’端引入具有错配碱基的核苷酸使引物不能正常延伸，从而检测出待测材料中目标SNP位点的基因型。本发明提供的方法能准确地对待测样本中目标SNP的基因型做出检测，不需要昂贵的专有仪器设备(测序平台、荧光定量仪等)，重复性好，对DNA模板要求低(粗提DNA即可作为模板)，操作简单，成本低(采用普通Taq酶、普通PCR仪以及电泳设备即可)，可广泛应用于各类目标SNP位点的检测中，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为实施例1中试验一的结果。
图2为实施例1中试验二的结果。
图3为实施例1中试验四的结果。
图4为实施例2中步骤2的结果。
图5为实施例2中步骤3的结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到的。实施例中，所用的克隆载体为 SimpleCloning Vector。ES Taq Master Mixture：康为世纪生物科技有限公司。
实施例1、引物中不同数量错配碱基的效果比较
以番茄Solyc03g005870.2.1基因第一个外显子上的一个SNP为示例，该SNP全称为SNP144。SNP144为A/C多态。SNP144及其周边的核苷酸如序列表的序列1所示。
一、构建重组质粒
将序列表的序列1所示的双链DNA分子(此时M为A)克隆至克隆载体中，得到重组质粒A。将序列表的序列1所示的双链DNA分子(此时M为C)克隆至克隆载体中，得到重组质粒C。
二、引物的设计和制备
1、引物的设计(单碱基错配引物)
设计如下四条引物：引物SNP144-C1F、引物SNP144-A1F、引物SNP144-A201F和引物SNP144-R。
引物SNP144-C1F(序列2)：5’-ATGATACGGCATCGTATTgC-3’；
引物SNP144-A1F(序列3)：5’-ATGATACGGCATCGTATTgA-3’；
引物SNP144-A201F(序列4)：5’-GGACTCACAGACACAGTGGTATGATACGGCATCGTATTgA-3’；引物SNP144-R(序列5)：5’-TGCAATCCACTCCCTGTTTTCCCTTA-3’。
引物SNP144-C1F为上游引物，自3’末端开始计的第1个核苷酸对应SNP144(C)，自3’末端开始计的第2个核苷酸引入碱基错配(靶序列中为T，引入错配碱基的核苷酸用小写字母表示)。
引物SNP144-A1F为上游引物，自3’末端开始计的第1个核苷酸对应SNP144(A)，自3’末端开始计的第2个核苷酸引入碱基错配(靶序列中为T，引入错配碱基的核苷酸用小写字母表示)。
引物SNP144-A201F为上游引物，自上游至下游由区段甲和区段乙组成；区段乙与引物SNP144-A1F序列相同；下划线标注区段甲，由20个核苷酸组成。
引物SNP144-R为通用下游引物。
2、引物的设计(两碱基错配引物)
设计如下四条引物：引物SNP144-C2F、引物SNP144-A2F、引物SNP144-A202F和引物SNP144-R。
引物SNP144-C2F(序列6)：5’-ATGATACGGCATCGTATcgC-3’；
引物SNP144-A2F(序列7)：5’-ATGATACGGCATCGTATcgA-3’；
引物SNP144-A202F(序列8)：5’-GGACTCACAGACACAGTGGTATGATACGGCATCGTATcgA-3’；
引物SNP144-R(序列5)：5’-TGCAATCCACTCCCTGTTTTCCCTTA-3’。
引物SNP144-C2F为上游引物，自3’末端开始计的第1个核苷酸对应SNP144(C)，自3’末端开始计的第2个核苷酸和第3个核苷酸均引入碱基错配(靶序列中为TT，引入错配碱基的核苷酸用小写字母表示)。
引物SNP144-A2F为上游引物，自3’末端开始计的第1个核苷酸对应SNP144(A)，自3’末端开始计的第2个核苷酸和第3个核苷酸均引入碱基错配(靶序列中为TT，引入错配碱基的核苷酸用小写字母表示)。
引物SNP144-A202F为上游引物，自上游至下游由区段甲和区段乙组成；区段乙与引物SNP144-A2F序列相同；下划线标注区段甲，由20个核苷酸组成。
引物SNP144-R为通用下游引物。
3、分别制备步骤1和步骤2的各条引物。
三、效果比较
1、试验一
模板DNA：重组质粒A或者重组质粒C或者重组质粒混合物(重组质粒混合物是将重组质粒甲和重组质粒乙等摩尔混合得到的)。
每种模板DNA分别进行如下步骤：
(1)分别进行两个体系的PCR扩增。
PCR扩增的反应体系甲(10μL)：模板溶液3μL，SNP144-C1F溶液0.5μL，SNP144-R溶液0.5μL，ES Taq Master Mixture 5μL，无菌水1μL。模板溶液中，模板DNA的浓度为5.0ng/μL。SNP144-C1F溶液中，引物SNP144-C1F的浓度为10pmol/L。SNP144-R溶液中，引物SNP144-R的浓度为10pmol/L。
PCR扩增的反应体系乙(10μL)：模板溶液3μL，SNP144-A1F溶液0.5μL，SNP144-R溶液0.5μL，ES Taq Master Mixture 5μL，无菌水1μL。模板溶液中，模板DNA的浓度为5.0ng/μL。SNP144-A1F溶液中，引物SNP144-A1F的浓度为10pmol/L。SNP144-R溶液中，引物SNP144-R的浓度为10pmol/L。
PCR扩增的反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸30s，28个循环；72℃保温5min，16℃保存。
(2)将PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。点样方法：将反应体系甲的扩增产物5μL点样至某一点样孔，间隔5分钟后，将反应体系乙的扩增产物5μL点样至同一点样孔。电泳参数：电压为120V，电泳时间30min。然后采用Analyticjena GelStudio SA2凝胶成像系统照相分析。
电泳图见图1。图1中，泳道1和泳道2对应模板为重组质粒C的扩增产物(两个重复处理)，泳道3和泳道4对应模板为重组质粒A的扩增产物(两个重复处理),泳道5和泳道6对应模板为重组质粒混合物的扩增产物(两个重复处理),M1对应和反应体系甲同时点样的marker，M2对应和反应体系乙同时点样的marker。
模板DNA为重组质粒C时：采用引物SNP144-C1F和引物SNP144-R组成的引物对，显示具有233bp扩增产物；采用引物SNP144-A1F和引物SNP144-R组成的引物对，无233bp扩增产物显示。模板DNA为重组质粒A时：采用引物SNP144-A1F和引物SNP144-R组成的引物对，显示具有233bp扩增产物；采用引物SNP144-C1F和引物SNP144-R组成的引物对，无233bp扩增产物显示。模板DNA为重组质粒混合物时：采用引物SNP144-C1F和引物SNP144-R组成的引物对，显示具有233bp扩增产物；采用引物SNP144-A1F和引物SNP144-R组成的引物对，也显示具有233bp扩增产物。
进行20个重复处理，结果均与预期一致，准确率100％。
实际应用中，以待测基因组DNA为模板，如果满足条件甲，基于SNP144，待测生物的基因型为CC纯合型。实际应用中，以待测基因组DNA为模板，如果满足条件乙，基于SNP144，待测生物的基因型为AA纯合型。实际应用中，以待测基因组DNA为模板，如果满足条件丙，基于SNP144，待测生物的基因型为CA杂合型。
条件甲：采用引物SNP144-C1F和引物SNP144-R组成的引物对显示具有233bp扩增产物并且采用引物SNP144-A1F和引物SNP144-R组成的引物对无233bp扩增产物显示。条件乙：采用引物SNP144-C1F和引物SNP144-R组成的引物对无233bp扩增产物显示并且采用引物SNP144-A1F和引物SNP144-R组成的引物对显示具有233bp扩增产物。条件丙：采用引物SNP144-C1F和引物SNP144-R组成的引物对显示具有233bp扩增产物并且采用引物SNP144-A1F和引物SNP144-R组成的引物对显示具有233bp扩增产物。
2、试验二
模板DNA：重组质粒A或者重组质粒C或者重组质粒混合物(重组质粒混合物是将重组质粒甲和重组质粒乙等摩尔混合得到的)。
每种模板DNA分别进行一个三引物体系的PCR扩增。
PCR扩增的反应体系(10μL)：模板溶液3μL，SNP144-C1F溶液0.5μL，SNP144-A201F溶液0.5μL，SNP144-R溶液0.5μL，ES Taq Master Mixture 5μL，无菌水0.5μL。模板溶液中，模板DNA的浓度为5.0ng/μL。SNP144-C1F溶液中，引物SNP144-C1F的浓度为10pmol/L。SNP144-A201F溶液中，引物SNP144-A201F的浓度为10pmol/L。SNP144-R溶液中，引物SNP144-R的浓度为10pmol/L。
PCR扩增的反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s、退火30s(第1个循环的退火温度为58℃，第2个循环的退火温度为59.5℃，第3个循环的退火温度为61℃)、72℃延伸30s，3个循环；94℃变性30s、64℃退火30s、72℃延伸30s，30个循环；72℃保温5min，16℃保存。
PCR扩增产物进行3％琼脂糖凝胶电泳。点样方法：将扩增产物5μL点样至某一点样孔。电泳参数：电压为120V，电泳时间80min。然后采用Analyticjena GelStudio SA2凝胶成像系统照相分析。
电泳图见图2。图2中，泳道1对应模板为重组质粒C的扩增产物，泳道2对应模板为重组质粒A的扩增产物，泳道3对应重组质粒混合物的扩增产物。
模板DNA为重组质粒C时，显示仅具有233bp的扩增产物。模板DNA为重组质粒A时，显示仅具有253bp的扩增产物。模板为重组质粒混合物时，显示同时具有233bp和253bp的扩增产物。
进行20个重复处理，多数结果与预期一致，准确率80％。
实际应用中，以待测基因组DNA为模板，如果获得233bp的扩增产物且未获得253bp的扩增产物，待测生物的基因型为CC纯合型。实际应用中，以待测基因组DNA为模板，如果获得253bp的扩增产物且未获得233bp的扩增产物，待测生物的基因型为AA纯合型。实际应用中，以待测基因组DNA为模板，如果获得233bp的扩增产物且获得253bp的扩增产物，待测生物的基因型为CA杂合型。
3、试验三
模板DNA：重组质粒A或者重组质粒C或者重组质粒混合物(重组质粒混合物是将重组质粒甲和重组质粒乙等摩尔混合得到的)。
每种模板DNA分别进行如下步骤：
(1)分别两个双引物体系的PCR扩增。
PCR扩增的反应体系甲(10μL)：模板溶液3μL，SNP144-C1F溶液0.5μL，SNP144-R溶液0.5μL，ES Taq Master Mixture 5μL，无菌水1μL。模板溶液中，模板DNA的浓度为5.0ng/μL。SNP144-C1F溶液中，引物SNP144-C1F的浓度为10pmol/L。SNP144-R溶液中，引物SNP144-R的浓度为10pmol/L。
反应体系甲相应的PCR扩增的反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸30s，28个循环；72℃保温5min，16℃保存。
PCR扩增的反应体系乙(10μL)：模板溶液3μL，SNP144-A201F溶液0.5μL，SNP144-R溶液0.5μL，ES Taq Master Mixture 5μL，无菌水1μL。模板溶液中，模板DNA的浓度为5.0ng/μL。SNP144-A201F溶液中，引物SNP144-A201F的浓度为10pmol/L。SNP144-R溶液中，引物SNP144-R的浓度为10pmol/L。
反应体系乙相应的PCR扩增的反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s、退火30s(第1个循环的退火温度为58℃，第2个循环的退火温度为59.5℃，第3个循环的退火温度为61℃)、72℃延伸30s，3个循环；94℃变性30s、64℃退火30s、72℃延伸30s，30个循环；72℃保温5min，16℃保存。
(2)将PCR扩增体系甲的扩增产物和PCR扩增体系乙的扩增产物等体积混合，然后进行3％琼脂糖凝胶电泳。点样方法：将5μL扩增产物混合物点样至某一点样孔。电泳参数：电压为120V，电泳时间80min。然后采用Analyticjena GelStudio SA2凝胶成像系统照相分析。
模板为重组质粒C的扩增产物的电泳结果与图2的泳道1一致，模板为重组质粒A的扩增产物的电泳结果与图2的泳道2一致，重组质粒混合物的扩增产物的电泳结果与图2的泳道3一致。
模板DNA为重组质粒C时，显示仅具有233bp的扩增产物。模板DNA为重组质粒A时，显示仅具有253bp的扩增产物。模板为重组质粒混合物时，显示同时具有233bp和253bp的扩增产物。
进行20个重复处理，多数结果与预期一致，准确率80％。
实际应用中，以待测基因组DNA为模板，如果获得233bp的扩增产物且未获得253bp的扩增产物，待测生物的基因型为CC纯合型。实际应用中，以待测基因组DNA为模板，如果获得253bp的扩增产物且未获得233bp的扩增产物，待测生物的基因型为AA纯合型。实际应用中，以待测基因组DNA为模板，如果获得233bp的扩增产物且获得253bp的扩增产物，待测生物的基因型为CA杂合型。
4、试验四
模板DNA：重组质粒A或者重组质粒C。
每种模板DNA分别进行如下步骤：
(1)分别进行两个体系的PCR扩增。
PCR扩增的反应体系甲(10μL)：模板溶液3μL，SNP144-C2F溶液0.5μL，SNP144-R溶液0.5μL，ES Taq Master Mixture 5μL，无菌水1μL。模板溶液中，模板DNA的浓度为5.0ng/μL。SNP144-C2F溶液中，引物SNP144-C2F的浓度为10pmol/L。SNP144-R溶液中，引物SNP144-R的浓度为10pmol/L。
PCR扩增的反应体系乙(10μL)：模板溶液3μL，SNP144-A2F溶液0.5μL，SNP144-R溶液0.5μL，ES Taq Master Mixture 5μL，无菌水1μL。模板溶液中，模板DNA的浓度为5.0ng/μL。SNP144-A2F溶液中，引物SNP144-A2F的浓度为10pmol/L。SNP144-R溶液中，引物SNP144-R的浓度为10pmol/L。
PCR扩增的反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s，30个循环；72℃保温5min，16℃保存。
将PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。点样方法：将反应体系甲的扩增产物5μL点样至某一点样孔，间隔5分钟后，将反应体系乙的扩增产物5μL点样至同一点样孔。电泳参数：电压为120V，电泳时间30min。然后采用Analyticjena GelStudio SA2凝胶成像系统照相分析。
电泳图见图3。图3中，泳道1和泳道2对应模板为重组质粒A的扩增产物(两个重复处理)，泳道3和泳道4对应模板为重组质粒C的扩增产物(两个重复处理),M1对应和反应体系甲同时点样的marker，M2对应和反应体系乙同时点样的marker。
模板DNA为重组质粒C时：采用引物SNP144-C1F和引物SNP144-R组成的引物对，显示具有233bp扩增产物(主带)；采用引物SNP144-A1F和引物SNP144-R组成的引物对，无233bp扩增产物(主带)显示。模板DNA为重组质粒A时：采用引物SNP144-A1F和引物SNP144-R组成的引物对，显示具有233bp扩增产物(主带)；采用引物SNP144-C1F和引物SNP144-R组成的引物对，无233bp扩增产物(主带)显示。
进行20个重复处理，多数结果与预期一致，准确率80％。
实际应用中，以待测基因组DNA为模板，如果满足条件甲，基于SNP144，待测生物的基因型为CC纯合型。实际应用中，以待测基因组DNA为模板，如果满足条件乙，基于SNP144，待测生物的基因型为AA纯合型。实际应用中，以待测基因组DNA为模板，如果满足条件丙，基于SNP144，待测生物的基因型为CA杂合型。
条件甲：采用引物SNP144-C1F和引物SNP144-R组成的引物对显示具有233bp扩增产物(主带)并且采用引物SNP144-A1F和引物SNP144-R组成的引物对无233bp扩增产物(主带)显示。条件乙：采用引物SNP144-C1F和引物SNP144-R组成的引物对无233bp扩增产物(主带)显示并且采用引物SNP144-A1F和引物SNP144-R组成的引物对显示具有233bp扩增产物(主带)。条件丙：采用引物SNP144-C1F和引物SNP144-R组成的引物对显示具有233bp扩增产物(主带)并且采用引物SNP144-A1F和引物SNP144-R组成的引物对显示具有233bp扩增产物(主带)。
5、试验五
模板DNA：重组质粒A或者重组质粒C。
每种模板DNA分别进行一个三引物体系的PCR扩增。
PCR扩增的反应体系(10μL)：模板溶液3μL，SNP144-C2F溶液0.5μL，SNP144-A202F溶液0.5μL，SNP144-R溶液0.5μL，ES Taq Master Mixture 5μL，无菌水0.5μL。模板溶液中，模板DNA的浓度为5.0ng/μL。SNP144-C2F溶液中，引物SNP144-C2F的浓度为10pmol/L。SNP144-A202F溶液中，引物SNP144-A202F的浓度为10μmol/L。SNP144-R溶液中，引物SNP144-R的浓度为10pmol/L。
PCR扩增的反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s、退火30s(第1个循环的退火温度为58℃，第2个循环的退火温度为59.5℃，第3个循环的退火温度为61℃)、72℃延伸30s，3个循环；94℃变性30s、64℃退火30s、72℃延伸30s，30个循环；72℃保温5min，16℃保存。
PCR扩增产物进行3％琼脂糖凝胶电泳。点样方法：将扩增产物5μL点样至某一点样孔。电泳参数：电压为120V，电泳时间80min。然后采用Analyticjena GelStudio SA2凝胶成像系统照相分析。
模板DNA为重组质粒C时，显示仅具有233bp的扩增产物(主带)。模板DNA为重组质粒A时，显示仅具有253bp的扩增产物(主带)。
进行20个重复处理，准确率50％。
实际应用中，以待测基因组DNA为模板，如果获得233bp的扩增产物(主带)且未获得253bp的扩增产物(主带)，待测生物的基因型为CC纯合型。实际应用中，以待测基因组DNA为模板，如果获得253bp的扩增产物(主带)且未获得233bp的扩增产物(主带)，待测生物的基因型为AA纯合型。实际应用中，以待测基因组DNA为模板，如果获得233bp的扩增产物(主带)且获得253bp的扩增产物(主带)，待测生物的基因型为CA杂合型。
6、试验六
模板DNA：重组质粒A或者重组质粒C。
每种模板DNA分别进行如下步骤：
(1)分别两个双引物体系的PCR扩增。
PCR扩增的反应体系甲(10μL)：模板溶液3μL，SNP144-C2F溶液0.5μL，SNP144-R溶液0.5μL，ES Taq Master Mixture 5μL，无菌水1μL。模板溶液中，模板DNA的浓度为5.0ng/μL。SNP144-C2F溶液中，引物SNP144-C2F的浓度为10pmol/L。SNP144-R溶液中，引物SNP144-R的浓度为10pmol/L。
反应体系甲相应的PCR扩增的反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸30s，28个循环；72℃保温5min，16℃保存。
PCR扩增的反应体系乙(10μL)：模板溶液3μL，SNP144-A202F溶液0.5μL，SNP144-R溶液0.5μL，ES Taq Master Mixture 5μL，无菌水1μL。模板溶液中，模板DNA的浓度为5.0ng/μL。SNP144-A202F溶液中，引物SNP144-A202F的浓度为10pmol/L。SNP144-R溶液中，引物SNP144-R的浓度为10pmol/L。
反应体系乙相应的PCR扩增的反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s、退火30s(第1个循环的退火温度为58℃，第2个循环的退火温度为59.5℃，第3个循环的退火温度为61℃)、72℃延伸30s，3个循环；94℃变性30s、64℃退火30s、72℃延伸30s，30个循环；72℃保温5min，16℃保存。
(2)将PCR扩增体系甲的扩增产物和PCR扩增体系乙的扩增产物等体积混合，然后进行3％琼脂糖凝胶电泳。点样方法：将5μL扩增产物混合物点样至某一点样孔。电泳参数：电压为120V，电泳时间80min。然后采用Analyticjena GelStudio SA2凝胶成像系统照相分析。
模板DNA为重组质粒C时，显示仅具有233bp的扩增产物(主带)。模板DNA为重组质粒A时，显示仅具有253bp的扩增产物(主带)。
进行20个重复处理，准确率50％。
实际应用中，以待测基因组DNA为模板，如果获得233bp的扩增产物(主带)且未获得253bp的扩增产物(主带)，待测生物的基因型为CC纯合型。实际应用中，以待测基因组DNA为模板，如果获得253bp的扩增产物(主带)且未获得233bp的扩增产物(主带)，待测生物的基因型为AA纯合型。实际应用中，以待测基因组DNA为模板，如果获得233bp的扩增产物(主带)且获得253bp的扩增产物(主带)，待测生物的基因型为CA杂合型。
实施例2、番茄斑萎病相关SNP标记SNP724位点的基因型检测
以番茄基因组中一个番茄斑萎病相关SNP为示例，该SNP全称为SNP724。SNP724为G/A多态。SNP724及其周边的核苷酸如序列表的序列9所示。A是抗病等位基因，G是感病等位基因。
一、引物的设计和制备
设计如下四条引物：引物SNP724-AF、引物SNP724-GF、引物SNP724-G20F和引物SNP724-R。
引物SNP724-AF(序列10)：5’-TCATGGACACAACTGGAGTTATgA-3’；
引物SNP724-GF(序列11)：5’-TCATGGACACAACTGGAGTTATgG-3’；
引物SNP724-G20F(序列12)：5’-GATAAAGCTTTGGAATGGAATCATGGACACAACTGGAGTTATgG-3’；
引物SNP724-R(序列13)：5’-CTTTGTCTGGCGAAACTAGGGAACAG-3’。
引物SNP724-AF为上游引物，自3’末端开始计的第1个核苷酸对应SNP724(A)，自3’末端开始计的第2个核苷酸引入碱基错配(靶序列中为T，引入错配碱基的核苷酸用小写字母表示)。
引物SNP724-GF为上游引物，自3’末端开始计的第1个核苷酸对应SNP724(G)，自3’末端开始计的第2个核苷酸引入碱基错配(靶序列中为T，引入错配碱基的核苷酸用小写字母表示)。
引物SNP724-G20F为上游引物，自上游至下游由区段甲和区段乙组成；区段乙与引物SNP724-GF序列相同；下划线标注区段甲，由20个核苷酸组成。
引物SNP724-R为通用下游引物。
分别制备各条引物。
二、引物的应用
试验材料见表1。
表1
各个试验材料分别进行如下检测：
1、取番茄材料的叶片，提取基因组DNA。
2、以步骤1提取的基因组DNA为模板DNA，进行PCR扩增，然后进行电泳。
PCR扩增的反应体系甲(10μL)：模板溶液3μL，SNP724-AF溶液0.5μL，SNP724-R溶液0.5μL，ES Taq Master Mixture 5μL，无菌水1μL。模板溶液中，模板DNA的浓度为5.0ng/μL。SNP724-AF溶液中，引物SNP724-AF的浓度为10pmol/L。SNP724-R溶液中，引物SNP724-R的浓度为10pmol/L。
PCR扩增的反应体系乙(10μL)：模板溶液3μL，SNP724-GF溶液0.5μL，SNP724-R溶液0.5μL，ES Taq Master Mixture 5μL，无菌水1μL。模板溶液中，模板DNA的浓度为5.0ng/μL。SNP724-GF溶液中，引物SNP724-GF的浓度为10pmol/L。SNP724-R溶液中，引物SNP724-R的浓度为10pmol/L。
PCR扩增的反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s，35个循环；72℃保温5min，16℃保存。
将PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。点样方法：将反应体系甲的扩增产物5μL点样至某一点样孔，间隔5分钟后，将反应体系乙的扩增产物5μL点样至同一点样孔。电泳参数：电压为120V，电泳时间30min。然后采用Analyticjena GelStudio SA2凝胶成像系统照相分析，判断记录其基因型。
如果采用SNP724-AF和SNP724-R组成的待测引物组具有301bp扩增产物且采用SNP724-GF和SNP724-R组成的待测引物组无301bp扩增产物显示，待测番茄基于SNP724的基因型为AA纯合型。如果采用SNP724-GF和SNP724-R组成的待测引物组具有301bp扩增产物且采用SNP724-AF和SNP724-R组成的待测引物组无301bp扩增产物显示，待测番茄基于SNP724的基因型为GG纯合型。如果采用SNP724-AF和SNP724-R组成的待测引物组具有301bp扩增产物且采用SNP724-GF和SNP724-R组成的待测引物组具有301bp扩增产物，待测番茄基于SNP724的基因型为AG杂合型。
电泳图见图4。图4中，M1对应和反应体系甲同时点样的marker，M2对应和反应体系乙同时点样的marker。
3、以步骤1提取的基因组DNA为模板DNA，进行PCR扩增，然后进行电泳。
PCR扩增的反应体系甲(10μL)：模板溶液3μL，SNP724-AF溶液0.5μL，SNP724-R溶液0.5μL，ES Taq Master Mixture 5μL，无菌水0.5μL。模板溶液中，模板DNA的浓度为5.0ng/μL。SNP724-AF溶液中，引物SNP724-AF的浓度为10pmol/L。SNP724-R溶液中，引物SNP724-R的浓度为10pmol/L。
反应体系甲相应的PCR扩增的反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s，35个循环；72℃保温5min，16℃保存。
PCR扩增的反应体系乙(10μL)：模板溶液3μL，SNP724-G20F溶液0.5μL，SNP724-R溶液0.5μL，ES Taq Master Mixture 5μL，无菌水0.5μL。模板溶液中，模板DNA的浓度为5.0ng/μL。SNP724-G20F溶液中，引物SNP724-G20F的浓度为10pmol/L。SNP724-R溶液中，引物SNP724-R的浓度为10pmol/L。
反应体系乙相应的PCR扩增的反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s、退火30s(第1个循环的退火温度为58℃，第2个循环的退火温度为59.5℃，第3个循环的退火温度为61℃)、72℃延伸30s，3个循环；94℃变性30s、64℃退火30s、72℃延伸30s，30个循环；72℃保温5min，16℃保存。
将PCR扩增体系甲的扩增产物和PCR扩增体系乙的扩增产物等体积混合，然后进行3％琼脂糖凝胶电泳。点样方法：将5μL扩增产物混合物点样至某一点样孔。电泳参数：电压为120V，电泳时间80min。然后采用Analyticjena GelStudio SA2凝胶成像系统照相分析。
如果获得321bp的扩增产物且未获得301bp的扩增产物，待测生物的基因型为GG纯合型。如果获得301bp的扩增产物且未获得321bp的扩增产物，待测生物的基因型为AA纯合型。如果获得301bp的扩增产物且获得321bp的扩增产物，待测生物的基因型为AG杂合型。
电泳图见图5。
4、取步骤1得到的基因组DNA，进行测序验证。
结果见表2。结果表明，本发明提供的方法鉴定基因型的准确率为100％。
表2
品种名称 步骤2的结果 步骤3的结果 步骤4的结果
246-1 AA纯合 AA纯合 AA纯合
246-2 AA纯合 AA纯合 AA纯合
Z215 AA纯合 AA纯合 AA纯合
Z216 AA纯合 AA纯合 AA纯合
Z218 AA纯合 AA纯合 AA纯合
Z219 AA纯合 AA纯合 AA纯合
231-1 GG纯合 GG纯合 GG纯合
234-3 GG纯合 GG纯合 GG纯合
235-2 GG纯合 GG纯合 GG纯合
236-3 GG纯合 GG纯合 GG纯合
237-3 GG纯合 GG纯合 GG纯合
243-1 GG纯合 GG纯合 GG纯合
SEQUENCE LISTING
<110> 潍坊兴旺生物种业有限公司
<120> 一种简单便捷检测SNP的新方法
<130> GNCYX180742
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 252
<212> DNA
<213> Lycopersicon esculentum
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)
<223> m =a or c
<400> 1
aagaatcaaa tgatacggca tcgtatttmg ggaaagaaat cacagtgaag catccattgg 60
agcattcatg gactttttgg tttgataaac ctaccactaa atctcgacaa actgattggg 120
gaagctcact tcgaaatgtc tacactttct ccactgttga agatttttgg gggtaagttt 180
ttttttttcc tctttcaaat tggtgatagt gtagtgtaag ggaaaacagg gagtggattg 240
caaggtgggg aa 252
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
atgatacggc atcgtattgc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
atgatacggc atcgtattga 20
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
ggactcacag acacagtggt atgatacggc atcgtattga 40
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 5
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<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 6
atgatacggc atcgtatcgc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 7
atgatacggc atcgtatcga 20
<210> 8
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 8
ggactcacag acacagtggt atgatacggc atcgtatcga 40
<210> 9
<211> 328
<212> DNA
<213> Lycopersicon esculentum
<220>
<221> misc_feature
<222> (51)
<223> r =a or g
<400> 9
tccaatggat aaagctttgg aatggaatca tggacacaac tggagttatt rctatatatc 60
tttgaaactt gtacaagtaa aatttgaaga acgactgttg tcgaatgagt gaaatctcat 120
tgaagttaaa ataaccacat cttagttcta gcgcgagtaa tcttgtttac ttgcattgcg 180
atattgtgtt atgcgtgcaa ggatttgttg tacttgatta ctatatagta tgaaagtgca 240
cgatttaagt gaatattttc ttatgtaaac caaaattttg aaattcagct cctcctttcg 300
ttctgttccc tagtttcgcc agacaaag 328
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 10
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<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 11
tcatggacac aactggagtt atgg 24
<210> 12
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 12
gataaagctt tggaatggaa tcatggacac aactggagtt atgg 44
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 13
ctttgtctgg cgaaactagg gaacag 26

Claims (10)

1.用于检测特异SNP位点基因型的引物组，为引物组Ⅰ或引物组Ⅱ；
所述特异SNP的多态形式为X/Y多态；
引物组Ⅰ包括两条上游引物和一条下游引物；将两条上游引物分别命名为FX1引物和FY1引物，将一条下游引物命名为R1引物；FX1引物和FY1引物的差别仅在于3’末端开始计的第1位核苷酸，FX1引物对应特异SNP的X多态，FY1引物对应特异SNP的Y多态；FX1引物和R1引物组成引物对甲，FY1引物和R1引物组成引物对乙；引物对甲和引物对乙的靶序列中均具有所述特异SNP位点；FX1引物和FY1引物均为单碱基错配引物或两碱基错配引物；所述单碱基错配引物中具有错配碱基的核苷酸为3’末端开始计的第2位核苷酸；所述两碱基错配引物中具有错配碱基的核苷酸位于3’末端开始计的第2位核苷酸和第3位核苷酸；
引物组Ⅱ包括两条上游引物和一条下游引物；将两条上游引物分别命名为FX2引物和FY2引物，将一条下游引物命名为R2引物；FX2引物和FY2引物存在两个差异：①3’末端开始计的第1位核苷酸不同，FX2引物对应特异SNP的X多态，FY2引物对应特异SNP的Y多态；②与FX2引物相比，FY2引物的5’端增加10-20个随机核苷酸；FX2引物和R2引物组成引物对丙，FY2引物和R2引物组成引物对丁；引物对丙和引物对丁的靶序列中均具有所述特异SNP位点；FX2引物和FY2引物均为单碱基错配引物或两碱基错配引物；所述单碱基错配引物中具有错配碱基的核苷酸为3’末端开始计的第2位核苷酸；所述两碱基错配引物中具有错配碱基的核苷酸位于3’末端开始计的第2位核苷酸和第3位核苷酸。
2.如权利要求1所述的引物组，其特征在于：所述具有错配碱基的核苷酸指的是：如果靶序列中相应的核苷酸为A，错配引物中具有错配碱基的核苷酸为G或者C；如果靶序列中相应的核苷酸为G，错配引物中具有错配碱基的核苷酸为A或者T；如果靶序列中相应的核苷酸为T，错配引物中具有错配碱基的核苷酸为G或者C；如果靶序列中相应的核苷酸为C，错配引物中具有错配碱基的核苷酸为A或者T。
3.如权利要求1所述的引物组，其特征在于：
引物组Ⅰ为如下(a1)、(a2)或(a3)：
(a1)引物组Ⅰ中，所述FX1引物如序列表的序列2所示；所述FY1引物如序列表的序列3所示；所述R1引物如序列表的序列5所示；
(a2)引物组Ⅰ中，所述FX1引物如序列表的序列6所示；所述FY1引物如序列表的序列7所示；所述R1引物如序列表的序列5所示；
(a3)引物组Ⅰ中，所述FX1引物如序列表的序列10所示；所述FY1引物如序列表的序列11所示；所述R1引物如序列表的序列13所示；
引物组Ⅱ为如下(b1)、(b2)或(b3)：
(b1)引物组Ⅱ中，所述FX2引物如序列表的序列2所示；所述FY2引物如序列表的序列4所示；所述R1引物如序列表的序列5所示；
(b2)引物组Ⅱ中，所述FX2引物如序列表的序列6所示；所述FY2引物如序列表的序列8所示；所述R1引物如序列表的序列5所示；
(b3)引物组Ⅱ中，所述FX2引物如序列表的序列10所示；所述FY2引物如序列表的序列12所示；所述R1引物如序列表的序列13所示。
4.一种检测特异SNP的方法，包括如下步骤：
(1)以待测生物的DNA为模板，分别进行两个体系的PCR扩增；体系甲中采用权利要求1或2中所述的引物对甲，体系乙中采用权利要求1或2中所述的引物对乙；
(2)将步骤(1)得到的PCR扩增产物进行电泳；电泳的点样方法：先将一个体系的扩增产物点样至某一点样孔，间隔时间后，再将另一个体系的的扩增产物点样至同一点样孔；
(3)基因型判断
如果体系甲的扩增产物具有目标条带且体系乙的扩增产物不具有目标条带，基于所述特异SNP，待测生物的基因型为X纯合型；
如果体系甲的扩增产物不具有目标条带且体系乙的扩增产物具有目标条带，基于所述特异SNP，待测生物的基因型为Y纯合型；
如果体系甲的扩增产物具有目标条带且体系乙的扩增产物具有目标条带，基于所述特异SNP，待测生物的基因型为XY杂合型。
5.一种检测特异SNP的方法，包括如下步骤：
(1)以待测生物的DNA为模板，分别进行两个体系的PCR扩增；体系丙中采用权利要求1或2中所述的引物对丙，体系丁中采用权利要求1或2中所述的引物对丁；
(2)将步骤(1)得到的体系丙的扩增产物和步骤(1)得到的体系丁的扩增产物混合，得到混合物；
(3)将步骤(2)得到的混合物进行电泳；
(4)基因型判断
如果具有小片段条带且不具有大片段条带，待测生物的基因型为X纯合型；
如果具有大片段条带且不具有小片段条带，待测生物的基因型为Y纯合型；
如果具有大片段条带且具有小片段条带，待测生物的基因型为XY杂合型；
所述小片段条带为引物对丙的目标条带；所述大片段条带为引物对丁的目标条带。
6.一种检测特异SNP的方法，包括如下步骤：
(1)以待测生物的DNA为模板，采用FX2引物、FY2引物和R2引物进行PCR扩增；FX2引物、FY2引物和R2引物如权利要求1或2中所述；
(2)将步骤(1)得到的扩增产物进行电泳；
(3)基因型判断
如果具有小片段条带且不具有大片段条带，待测生物的基因型为X纯合型；
如果具有大片段条带且不具有小片段条带，待测生物的基因型为Y纯合型；
如果具有大片段条带且具有小片段条带，待测生物的基因型为XY杂合型；
所述小片段条带为权利要求1或2中所述引物对丙的目标条带；所述大片段条带为权利要求1或2中所述引物对丁的目标条带。
7.如权利要求4或5或6所述的方法，其特征在于：所述待测生物为待测植物或者待测微生物。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：
所述特异SNP为SNP144；
所述引物组Ⅰ为权利要求3中(a1)或(a2)所述的引物组Ⅰ；
所述引物组Ⅱ为权利要求3中(b1)或(b2)所述的引物组Ⅱ。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于：
所述特异SNP为SNP724；
所述引物组Ⅰ为权利要求3中(a3)所述的引物组Ⅰ；
所述引物组Ⅱ为权利要求3中(b3)所述的引物组Ⅱ。
10.权利要求1至3中任一所述引物组或权利要求4至9中任一所述方法在生物育种中的应用。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109593871A (zh) * 2018-12-27 2019-04-09 江苏省农业科学院 用于区分玉米杂种优势群的玉米kasp分子标记组合及其开发方法和应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101313078A (zh) * 2005-09-29 2008-11-26 科因股份有限公司 突变群体的高通量筛选
CN105506068A (zh) * 2014-10-20 2016-04-20 江苏所罗门兄弟医学科技有限公司 一种用于MMP2基因分型的ARMS-qPCR检测试剂盒及检测方法
CN106119397A (zh) * 2016-08-26 2016-11-16 北京通州国际种业科技有限公司 番茄斑萎病抗性基因Sw‑5b紧密连锁SNP位点获得及标记开发
CN106676172A (zh) * 2016-12-16 2017-05-17 北京通州国际种业科技有限公司 番茄212个snp位点及其在鉴定番茄品种真实性和种子纯度中的应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101313078A (zh) * 2005-09-29 2008-11-26 科因股份有限公司 突变群体的高通量筛选
CN105506068A (zh) * 2014-10-20 2016-04-20 江苏所罗门兄弟医学科技有限公司 一种用于MMP2基因分型的ARMS-qPCR检测试剂盒及检测方法
CN106119397A (zh) * 2016-08-26 2016-11-16 北京通州国际种业科技有限公司 番茄斑萎病抗性基因Sw‑5b紧密连锁SNP位点获得及标记开发
CN106676172A (zh) * 2016-12-16 2017-05-17 北京通州国际种业科技有限公司 番茄212个snp位点及其在鉴定番茄品种真实性和种子纯度中的应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CAROLINE LEBARON等: ""A new eIF4E1 allele characterized by RNAseq data mining is associated with resistance to potato virus Y in tomato albeit with a low durability"", 《JOURNAL OF GENERAL VIROLOGY》 *
SUNG-CHUR SIM等: ""High-Density SNP Genotyping of Tomato (Solanum lycopersicum L.) Reveals Patterns of Genetic Variation Due to Breeding"", 《PLOS》 *
李亚玲等: ""番茄Mi一1基因的SNP分型"", 《东北农业大学学报》 *
李璞主编: "《医学遗传学 第2版》", 29 February 2004, 北京：中国协和医科大学出版社 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109593871A (zh) * 2018-12-27 2019-04-09 江苏省农业科学院 用于区分玉米杂种优势群的玉米kasp分子标记组合及其开发方法和应用

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