CN101313078A - 突变群体的高通量筛选 - Google Patents

突变群体的高通量筛选 Download PDF

Info

Publication number
CN101313078A
CN101313078A CNA2006800392660A CN200680039266A CN101313078A CN 101313078 A CN101313078 A CN 101313078A CN A2006800392660 A CNA2006800392660 A CN A2006800392660A CN 200680039266 A CN200680039266 A CN 200680039266A CN 101313078 A CN101313078 A CN 101313078A
Authority
CN
China
Prior art keywords
primer
sequence
dna
sudden change
globule
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CNA2006800392660A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101313078B (zh
Inventor
M·J·T·范艾克
A·J·范图内恩
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Keygene NV
Original Assignee
Keygene NV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=37709618&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN101313078(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Keygene NV filed Critical Keygene NV
Publication of CN101313078A publication Critical patent/CN101313078A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101313078B publication Critical patent/CN101313078B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B30/00—ICT specially adapted for sequence analysis involving nucleotides or amino acids
    • G16B30/10—Sequence alignment; Homology search
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6846—Common amplification features
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
    • C12Q1/6855—Ligating adaptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B30/00—ICT specially adapted for sequence analysis involving nucleotides or amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Evolutionary Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

揭示了高通量鉴定诱变群体成员中的基因突变的有效方法。所述方法包括DNA分离、集合、扩增、创建库、对库进行高通量测序(优选采用合成测序技术)、鉴定突变以及对群体成员的鉴定。

Description

突变群体的高通量筛选
发明背景
发明领域
在分子生物学和遗传学领域，本发明涉及用于鉴定群体中的突变的、基于使用高通量测序技术的改进策略。发明进一步提供了能用于该方法的试剂盒。
技术背景
在现代基因组研究中利用携带有诱导的或天然产生的突变的群体，通过逆向遗传方法，来鉴定影响重要性状的基因。这尤其适用于植物和具有农学重要性的农作物，并且对于其它有机体，例如酵母、细菌等等，这种群体也是有用的。还可以使用其它有机体，例如动物、鸟、哺乳动物等，但是这些群体明显难以获得或控制。然而可以观察到，此处描述的发明属于非常一般的性质，因此也能用于这种有机体。
诱变群体是基因发现的辅助工具，因为这种群体经常被用于筛选已知的功能缺失突变基因，或者评价因突变基因造成的有机体的表型变化。分别鉴定携带有突变的感兴趣基因的有机体的限速步骤是筛选工作。下面更加详细的描述了这个群体和筛选方法的原理，并且描述了更有效的筛选方法，该方法增强了这些基因发现工具的价值。
一种被称为TILLING(基因组定向诱导局部损伤)的使用诱变群体的技术(McCallum等人，Nat.Biotechnol 2000，18，455-457，McCallum et al，Plant Physiology，2000，123，439-442；Till等人Genome Research 2003，13，524-530)，利用乙基甲磺酸(EMS)或电离辐射(快中子轰击)(Li et al The Plant Journal，2001，27，235-42)将随机诱导突变(多数为核苷酸取代)大量引入基因组。在群体中每个植物都携带有数百(千)突变，其中一些因为某个或多个基因或它们的调控序列的功能缺失(敲除或下调)而影响正常的发育、形态或者产生某种表型。TILLING群体通常含有足够数量的植物来覆盖所有的(每个基因5-20个)带有多个独立突变的基因。因此，在TILLING中使用的诱变植物群体通常有3000-10,000个植物并能用于两个方面：
逆向遗传学
“逆向遗传学”是使用TILLING群体的最常用方法。鉴定一个感兴趣的基因，例如通过转录谱或候选基因法，随后要回答的问题是该基因是否影响感兴趣的特定的表型特征。因此，面临的挑战是鉴定一个(或数个)在该基因中存在功能缺失突变的植物。这通常通过多步骤的筛选过程来完成，典型的包括如下步骤：
1.分离TILLING群体的大量(混合的)M2植物(例如，3072)的基因组DNA。
2.制备等量DNA的集合(pool)，其中每个集合来自于8到32个植物，集合水平依赖于CEL I筛选系统的敏感度(见下)。因此对于3072个植物总共有96到384个DNA样品集合。
3.使用标记的PCR引物扩增所有DNA集合中的基因的多个部分。使用重叠PCR片段来覆盖整个基因(例如，从1500bp基因中扩增出3*600bp PCR片段)。
4.制备利用DNA样品集合获得的PCR产物的杂交双链，并和CELI或其它识别并切割单核苷酸序列错配(例如绿豆核酸酶、S1核酸酶、Surveyor等)的酶孵育，并在变性(测序)凝胶中或通过毛细管电泳解析处理的样品。
5.通过观测CEL I处理所得消化产物的条带来对携带有突变基因的植物所组成的集合进行鉴别。
为了鉴定携带突变的植物，对阳性集合中的植物的个别DNA重复进行PCR，随后进行双向Sanger测序。
培养包含突变的植物并和野生型进行异型杂交(out-cross)来确立突变和观测到的表型变化之间的因果关系。
CEL I筛选的优点(上述步骤3-5)是，和用Sanger测序分别测序所有植物相比预先筛选集合的样品降低了花费。
但是，CEL I筛选的一个局限是并非所有鉴定出的突变都影响基因功能(例如，沉默置换)，并且这种情况只有在阳性集合中的植物个体的PCR产物被测序之后才能知道。然而，和分别对所有植物的PCR产物测序相比，CEL I介导的筛选方法是节约成本的。
另一个局限是，CEL I筛选涉及凝胶电泳和评分，这是相对繁琐的过程，需要从第二链确认突变，因为凝胶模式并非总是明确的。
第三个缺点是CEL I筛选对PCR产物末端的突变检测是相对不敏感的，这导致不能检出一些突变。CEL I的进一步的缺点是已经发现该酶对反应条件极为敏感，例如盐浓度。这导致该酶只能用于有限数量的缓冲液中，因此阻碍了CEL I的广泛使用。另一个实践中的缺点与CEL I的应用有关，该酶在切割所有错配杂交双链中并不可靠。
最后，CEL I筛选不能区分错义突变(这种突变是最常见的)和无义突变，造成对未产生感兴趣的突变的阳性集合进行大量的筛选工作。
正向遗传学
培养植物诱变群体并表现出感兴趣性状的表型。随后，带有感兴趣表型的植物和野生型杂交来异型杂交掉和感兴趣的表型没有联系的突变。最后，利用定位克隆确认对应于感兴趣的表型的突变基因(使用遗传标志物)，类似于常规对种群进行遗传做图的QTL做图(F2，RIL等)。虽然理论上是可能的，但是诱变群体通常不用于此方面。
开发本发明部分改进了已有的筛选诱变群体策略。发明的一个目标是提供有效的方法，筛选大规模群体是否存在突变以及增加鉴定影响基因功能的突变的效率，即，减少耗费在筛选不会导致基因功能改变的突变中的工作量。本方法被设计为避免使用CEL I酶或它的等同物。
发明概述
本发明人发现，使用高通量测序策略可实现上述目标，并且能有效筛选下述群体中是否存在感兴趣的突变，所述群体包括诱变群体(例如TILLING群体)；使用(人工的)诱变剂或DNA损伤寡核苷酸或，即，利用定向核苷酸调换(TNE)或利用局部定向突变(RTM)来引入突变的群体；或者含有天然发生的突变的群体，例如寡核苷酸多态性(SNP)、小型插入和缺失和小随体重复数变异。
定义
在下面的描述和范例中使用了一些术语。为了给详细说明和权利要求提供清楚并且统一的理解，包括术语的给定范围，提供了下面的定义。除非在此处另外定义，所有使用的技术和科学术语具有和本方面所属领域普通技术人员的常规理解相同的含义。所公示的所有出版文献、专利申请书、专利和其它参考文献在此处被完整引用作为参考。
“TILLING”或“基因组中定向诱导局部损伤”是一种常用的逆向遗传策略，通过随机化学或物理诱变并进行基于PCR的筛选来确定感兴趣区域的点突变，来提供诱导(点)突变的等位基因系列。在TILLING筛选中，通过PCR扩增感兴趣的区域。通过PCR产物的变性和退火，形成野生型片段和含有诱导突变的片段之间的杂交双链。用CEL I切割这些杂交双链，解析切割产物。能够通过混合集中形成集合(pool)来增加通量。在发现集合中含有序列差异的PCR产物之后，通常通过对个别的PCR产物进行Sanger测序来再次筛选集合中所包括的PCR产物，因此，鉴定出突变植物以及突变基因中确切的序列差异。
“诱变群体”指的是已经接受诱变处理(化学的或物理的)来产生一个突变库(library)的一群有机体(通常是植物，但是其也可以它有机体，包括动物例如果蝇和小鼠，来创建诱变群体；Schimenti等人，1998，Genome Research 8/698-710)。TILLING群体的规模可以变化很大，并且对于特定目的，可以使用含有90、80、70、60、50、40、30或甚至仅仅20％原始群体的部分TILLING群体。作为诱变群体之外的另一个选择，能够使用未诱变但是其中包含带有天然产生的突变的亚群的群体，其中所述天然产生的突变例如单核苷酸多态性(SNP)、小型插入和缺失以及小随体重复数量变异。当诱变群体不容易得到(人体)或已经能够得到大量种质时，这些群体具有显著优势。参见例证Comai等人，The Plant Journal，2004，37，778-786。这种种群能够和‘参照DNA’结合使用。
“定向核苷酸调换”或“TNE”。定向核苷酸调换(TNE)是，和染色体或附加体(episomal)基因中的一个部位部分互补的合成的寡核苷酸在特定位点指导单个核苷酸逆转的过程。已经报道了使用多种寡核苷酸和靶标的TNE。在已报道的寡核苷酸中一些是RNA/DNA嵌合体，含有末端修饰来产生核酸酶抗性。
“区域定向突变”或“RTM”。区域定向突变是在基因组DNA中预定目标位点处人工产生双链断裂的过程，导致多种有效细胞修复机制中的一种对断裂进行修复，多数导致在断裂位点处产生突变。可以通过向细胞核中引入锌指核酸酶(例如，参见Lloyd等人，2005)、兆碱基大范围核酸酶(meganuclease)例如I-Scel(Epinat等人，2003)或偶联有诱变化学基团的三链形成寡核苷酸(Havre等人，1993)来产生双链断裂。
“核酸”：此处所使用的核酸可以包括核苷酸的任意聚合物或寡聚物，带有嘧啶和嘌呤碱基，优选的分别为胞嘧啶、胸腺嘧啶(或尿嘧啶)、腺嘌呤和鸟嘌呤(参见Lehninger，Principles ofBiochemistry，at 793-800(Worth Pub.1982)，此处被完整引用仅作为参考)。包括任意的脱氧核糖核酸、核糖核甘酸或核酸肽组分，以及它们的任意化学变体，例如这些碱基的甲基化的、羟甲基化的或糖基化的形式，等等。聚合物或寡聚物在组成中可以是异质的或同质的，并可以从天然产生来源中提取或可以人工或合成产生。核酸可以是DNA或RNA，或它们的混合物，并且可以以单链或双链形式永久或暂时存在，包括同型双链、异型双链和杂合状态。
“加标签”指的是为了能够和第二个或更多的核酸进行区分，向核酸中加入标签或标记。可以通过例如，在扩增过程中使用带标签引物或本领域任意其它已知方法加入序列标识符来加标签。这种序列标识符可以是一种具有不同的但是确定长度的独特的碱基序列，专门用于辨识特定核酸样品。典型的例子是ZIP序列。使用这种标签，能够通过进一步的处理来确定样品来源。对于混合的处理过的源自于不同核酸样品的产品，通常使用不同的标签鉴定不同的核酸样品。
“标记库”指的是被加上标签的核酸的库。
“测序”指的是确定核酸样品例如DNA或RNA中的核苷酸的顺序(碱基序列)。
“排列比对(Aligning和alignment)”指的是，根据是否存在相同或相似核苷酸的短或长延伸来比较两种或多种核苷酸序列。本领域已知一些比对核苷酸序列的方法，将在下面进行进一步的说明。有时，术语“组合(assembly)”或“聚类”被用作同义词。
“高通量筛选”(HTS)是一种科学实验方法，与生物学和化学领域尤其相关。通过将现代机器人技术和其它专业的实验室硬件相结合，HTS使研究研究人员能够有效的同时(或事实上同时)筛选大量样品。
“引物”一般指的是能起始DNA合成的DNA链。在没有引物时DNA聚合酶不能起始合成DNA；它在反应中只能延长现存的DNA链，在反应中互补链作为模板来指导待组装的核苷酸顺序。在此处，聚合酶链反应(PCR)中使用的合成寡核苷酸分子用引物表述。
“增强亲和力的引物”是带有修饰核苷酸例如PNA或LNA的引物，这增强了它们的热稳定性并能根据核苷酸序列差异进行等位基因特异性的扩增。为了实现该目的，通常使用一个或数个修饰的核苷酸，优选位于引物的3’末端。
“DNA扩增”典型的用于表示使用PCR的双链DNA分子的体外合成。需要注意的是，存在其它扩增方法并且在本发明中也可以使用它们。
图片简单说明
图1：聚类序列的图示，所述序列是对一个基因进行的鸟枪法测序的结果，来确定EMS诱导的突变。突变为亮色、序列错误为暗色。预计能观察到序列错误为随机的并且最多只有一次。
图2：利用4bp加标签PCR引物从3-D集合库中扩增出的100bp基因区域的加标签测序结果的聚类图示。突变为亮色、序列错误为暗色。通过3个标签(1，2，3)和(4，5，6)确定突变，获知植物编号，而不是少于2个标签(7，8)确定的那些。预计能观察到序列错误为随机的并且仅有一次。
图3：序列加标签中使用长和短PCR引物的系统的图示。
图4.用琼脂糖凝胶估算28个3D集合中每个集合的eIF4E外显子1的PCR扩增产量。
发明详述
一方面，发明指向一种检测诱变群体成员中的目标序列中的突变的方法，包括如下步骤：
(a)分离诱变群体的每个成员的基因组DNA，来提供群体中每个成员的DNA样品；
(b)集合步骤(a)所获得的DNA，形成集合(pool)；
(c)利用一对(可选标记的)引物从DNA集合中扩增目标序列；
(d)集合步骤(c)的扩增产物来创建扩增产物库(library)；
(e)可选的，片段化库中的扩增产物；
(f)使用高通量测序测定产物和/或片段的核苷酸序列；
(g)通过聚类(比对)片段的序列来确定突变；
(h)从确定的突变中筛选目标序列的改变功能；
(i)设计引物，定向杂交到鉴定出的突变处；
(j)使用步骤(i)的引物以及步骤(c)的引物中的一个来扩增步骤
(d)的库；
(k)鉴定携带突变的成员；
(l)可选的，使用步骤(c)的引物从步骤(k)的成员中扩增目标序列，来确证突变，并测定扩增产物的序列。
通常使用本领域的常规方法分离DNA，例如从群体成员中收集组织、提取DNA(例如使用Q-Biogene fast DNA试剂盒)、定量并标准化来获得每种样品的等量的DNA。作为范例，本发明基于3072个植物的TILLING群体和一个1500bp的基因进行了举例说明。
例如可以使用3维集合方案(3-dimensional pooling scheme，Vandenbussche等人，2003，The Plant Cell，15：2680-93)得到分离DNA的集合。优选使用等量DNA获得集合。3维集合方案可以包含15×15×14，得到44个集合(15+15+14)，每个集合中含有3072/14＝219或3072/15＝205种不同的DNA样品。
可以使用其它集合方案。集合步骤典型地用于一轮PCR筛选后确定携带有观察到的突变的植物。DNA集合还进一步用于在PCR之前对DNA进行归一化，来提供筛选库中更相等的代表。DNA集合的另一个优点是不必分别确定所有的序列，集合就能快速鉴定感兴趣的序列，特别是使用了加标签的库时。这特别有利于筛选大量或复杂的群体。
可以通过使用被设计为扩增感兴趣基因的一组引物来实现使用一对可选的标记的引物从集合中扩增目标序列。如所述，可以标记引物来检测感兴趣基因的扩增产物。
集合扩增产物，优选等量或归一化量的集合，因此创建了扩增产物的库。示例的，库的复杂度将为3072植物X 1500bp基因序列＝4.6Mb序列。
当库中的PCR产物长度超过测序(sequence trace)的平均长度时，扩增产物可以被随机片段化随后再对片段测序。能利用物理技术实现片段化，即，剪切、超声处理或其它随机片段化方法。在步骤(f)中，库中至少一部分(但优选所有的)片段的至少部分(但优选全部)核苷酸序列被测定。在某些特定的实施方案中，片段化步骤是可选的。例如，当测序技术的阅读长度和PCR片段长度大致相等时，不需要片段化。并且对于较大PCR产物，如果只有部分PCR产物被测序是可以接受的，例如对于1500bp PCR产物和400(从两侧)的阅读长度仍有700bp未被测序，那么也可以不需要进行片段化。
原则上可以采用本领域已知的任意方法进行测序，例如双脱氧链终止法(Sanger测序)，但是当必须对大量序列进行测定时这种方法不是首先的。使用高通量测序方法进行测序是优选的并且更具优势，例如WO 03/004690、WO 03/054142、WO 2004/069849、WO 2004/070005、WO 2004/070007和WO 2005/003375(所有都以454Life Sciences的名字)所公示的方法，Seo等人(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA101：5488-93和technologies of Helios，Solexa，US Genomics，etcetera，此处被引用作为参考。最优选的是使用WO 03/004690、WO03/054142、WO 2004/069849、WO 2004/070005、WO 2004/070007和WO 2005/003375(所有都以454Life Sciences公司的名称)所公示的装置和/或方法进行测序，此处被引用作为参考。描述的技术能在一轮运行中测序4千万碱基，并且比竞争技术快100倍并且更便宜。该测序技术大致包括5个步骤：1)DNA片段化以及特殊接头的连接，来创建单链DNA(ssDNA)库；2)ssDNA退火到小珠上，在油中水微型反应器中乳化小珠并进行乳液PCR(emulsion PCR)来扩增小珠上的个别ssDNA分子；3)选择/富集表面上含有扩增的ssDNA分子的小珠；4)在
Figure A20068003926600131
中沉淀载有DNA的小珠；以及5)利用焦磷酸盐光信号的发生在至少100,000孔中同时测序。下面将更加详细的说明该方法。
在一个优选的实施方案中，测序包括步骤：
(a)使加接头的片段退火到小珠上，每个小珠上退火有单一的加接头片段；
(b)在油中水微型反应器中乳化小珠，每个油中水微型反应器中包含单一的一个小珠；
(c)将小珠装填到小孔中，每个孔包含一个小珠；以及产生焦磷酸盐信号。
在第一步(a)中，测序接头被连接到库中的片段上。测序接头包括至少一个用于退火到小珠上的“关键”区域，一个测序引物区域和一个PCR引物区域。因此获得了加接头的片段。
在第二步中，加接头的片段被退火到小珠上，每个小珠退火有单一的一个加接头片段。在加接头片段的集合(pool)中过量加入小珠来确保对于大多数小珠(泊松分布)来说每个小珠退火单一的一个加接头片段。
在下一步中，在油中水微型反应器中乳化小珠，每个油中水微型反应器中包含单一的一个小珠。在油中水微型反应器中存在PCR试剂，能在微型反应器中进行PCR反应。随后，破坏微型反应器，富集包含DNA的小珠(DNA阳性珠)。
在下一步中，将小珠装填到小孔中，每个孔包含单一的一个小珠。优选的，这些小孔是能用于大量片段同时测序的PicoTiterTM Plate的部分。在加入携带有酶的小珠后，使用焦磷酸测序(pyrosequencing)测定片段的序列。在后续步骤中，向PicoTiterTM Plate和小珠以及其中的酶珠中加入不同的脱氧核糖核苷酸以及常规的测序试剂，当脱氧核糖核酸掺入时产生光信号并被记录。正确的核苷酸的掺入将产生焦磷酸测序能被检测到的信号。
在本领域已知焦磷酸测序法这种方法，并且在www.biotagebio.com；www.pyrosequencing.com/sectiontechnology以及其它地方被描述。该技术进一步应用于例如WO03/004690、WO 03/054142、WO 2004/069849、WO 2004/070005、WO2004/070007和WO 2005/003375(所有都以454 Life Sciences公司的名称)，此处被引用作为参照。
通过聚类扩增库中的已测序片段来确定突变。通过排列比对库中片段的已确定序列确定突变。大部分的序列是野生型的(未突变的)，但是也观察到诱导突变和偶然发生的测序错误。因为通过多倍冗余(典型的大约为4到5倍冗余)测序扩增库，多次观察到相同的序列改变表明是一个突变，而不是测序错误。见图1。
聚类提供了扩增库的排列比对(alignment)。对于库中的每个PCR产物以这种方法产生已测序片段的聚类，即，利用步骤(e)中的片段化所获得的多个片段的序列排列比对构建了片段的重叠群(contig)。用于比对目的的序列排列比对方法是本领域所熟知的。
在如下处描述了多种程序和排列比对算法：Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2：482；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443；Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444；Higgins和Sharp(1988)Gene 73：237-244；Higgins和Sharp(1989)CABIOS 5：151-153；Corpet等人(1988)Nucl.Acids Res.16：10881-90；Huang等人(1992)Computer Appl in theBiosci.8：155-65；和Pearson等人(1994)Meth.Mol.Biol.24：307-31，此处被引用作为参照。Altschul等人(1994)NatureGenet.6：119-29(此处被引用作为参照)给出了对序列排列比对和同源性计算的详细见解。
可以从若干来源获得NCBI基础局部序列比对搜索工具(BasicLocal Alignment Search Tool，BLAST，Altschul等人1990)，包括美国生物信息国家中心(National Center for BiologicalInformation，NCBI，Bethesda，麻里兰州)和因特网上，和序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx结合使用。可以登录http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/使用。如何使用这种程序确定序列一致性的说明见http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html。
在诱变群体分析中，确定突变后，评价已确定突变对相关基因功能改变的影响，例如引入终止密码子。这种评价仅在序列水平上进行，例如6-框架翻译。一旦确定了有趣的突变，就进一步研究该突变来确定群体中的相关成员。
对于每个被归类为有趣突变的突变，设计以感兴趣突变为靶点的等位基因特异性引物。因此，随后等位基因特异性引物和在集合的DNA样品的扩增中使用的引物中的一个(反向或正向引物)结合在一起使用。一个引物或两个引物都被标记。该引物对被用于扩增DNA集合。鉴定阳性集合并鉴定突变植物。在上面提到的3D集合方案(3D poolingscheme)中，使用该引物对的用于筛选3D集合的DNA样品盘的等位基因特异性PCR导致鉴定出3阳性集合(每个维度上一个)，这给出了突变植物的库地址。
在某些特定的实施方案中，等位基因特异性引物中含有替代的核苷酸，例如锁核酸(LNA)或核酸肽(PNA)，来增强它们的特异性。这种核苷酸是本领域所广泛已知的，并且可以选择供应商购得。
通过扩增来自于已鉴定植物的目标序列来验证突变。使用来自于步骤(c)的引物进行扩增。确定扩增产物的核酸序列并且通过和保守序列进行比较确定突变。优选的采用Sanger测序法进行测序。
一方面，发明属于一种检测诱变群体成员中目标序列突变的方法，包括如下步骤：
(a)分离诱变群体的每个成员的基因组DNA，来提供群体中每个成员的DNA样品；
(b)集合步骤(a)所获得的DNA；
(c)利用一对加标签的(可选标记的)引物从DNA集合中扩增目标序列的一部分或片段，优选的其中至少一个引物包含一个基因特异性部分、一个标签和一个测序引物结合部位；
(d)集合步骤(c)的扩增产物来创建扩增产物库(library)；
(e)使用高通量测序法测定扩增产物的核苷酸序列；
(f)通过聚类(排列比对)片段的序列来确定突变；
(g)利用标签确定带有突变的成员；
(h)可选的，使用步骤(c)的引物，扩增来自于步骤(g)的成员的目标序列，来确证突变并确定扩增产物的序列。
基本可以按照上面所述进行诱变群体成员的基因组DNA分离和分离DNA的集合。
使用一对加标签的、可以被标记的引物扩增目标序列的部分或片段。优选的，对于每个维度中的每个集合，使用不同的引物。在上面的说明中，这意味着优选44个正向的和44个反向的引物。优选的，每个正向和反向引物包含
(i)一个能用于下面测序步骤中的测序引物结合位点，
(ii)一个用于将引物(和所得扩增产物)联系到最初的群体成员的标签，和
(iii)一个能退火到感兴趣的目标序列(即，基因)上的基因特异性序列。
在一个典型的实施方案中，引物具有如下顺序：
5′-测序引物结合位点-标签-基因特异性PCR引物序列-3′。测序引物结合位点和基因特异性PCR引物序列的长度是普通PCR中常规使用的，即，各自为从大约10到大约30bp，优选为15到25bp。优选的，扩增的序列部分或片段具有在使用下述高通量测序技术时一次运行能测序的长度。在特定的实施方案中，部分或片段的长度在大约50bp到大约500bp之间，优选为从大约75bp到大约300bp之间，更优选的是从大约90bp到大约250bp之间。如上面所述，该长度可以随着所采用的测序技术的变化而变化，包括将来开发出来的技术。
通过使用含有标签序列的引物(正向和/或反向)，所述标签序列对于每个引物都是唯一的，代表了所有的集合的维度，能够知道每个标签序列的特定植物来源，因为测序引物退火到标签上游，结果造成每个扩增产物中都存在标签序列。在特定的实施方案中，正向和反向引物都被加上标签。在其它实施方案中，只有正向或反向引物被加上标签。选择一个或两个标签依赖于具体情况并依赖于高通量测序反应的阅读长度和/或独立验证的需求。对于，例如，单向测序100bp PCR产物时，只需要一个标签。对于200bp PCR产物和100bp阅读长度，双标签结合双向测序是有益的，因为这样使效率提高了2倍。并且还进一步提供了在相同步骤中进行独立验证的可能性。当使用双标签引物进行100bp PCR产物的双向测序时，无论哪个方向，两个扫描都提供了突变信息。因此两个引物都提供了关于哪个植物含有哪个突变的“地址信息”。
标签可以具有任意数量的核苷酸，但是优选含有2、3、4或5个核苷酸。因4核苷酸变更，所以可能有256种标签，而3核苷酸变更可以有64种不同的标签。在使用的示例中，标签优选差异＞1碱基，因此优选标签是4bp长的。使用这些引物进行的扩增得到一个加标签的扩增产物的库。
在特定的实施方案中，能在扩增过程中使用的标签系统包括：
(1)长PCR引物，包含(a)5′恒定片段，连接到(b)一个简并标签片段(NNNN)，连接到(c)一个基因特异性片段-3′和
(2)在后续扩增中使用的短PCR引物，包含(a)5′恒定片段，连接到(b)非简并标签片段-3′(即，在NNNN中的一种选择)。
对于每种样品，非简并标签片段可以是唯一的，例如，ACTG对应于样品1，AATC对应于样品2，等等。短引物退火到长引物的一个亚群上。引物的恒定片段可以被用作测序引物。参见图3。
优选的库包含来自于所有扩增集合的等量的PCR产物。在示例性的例子中，库含有3072植物x 100bp＝307kb需要测序的序列。
库中的PCR产物进行上述测序过程。特别的，利用和连接到小珠上的序列相对应的测序引物结合位点，PCR产物结合到小珠上。因此本实施方案不需要片段化和接头连接。并且，在该实施方案中，已经通过PCR引物设计事先引入接头。这提高了该方法的可靠性。在退火到小珠上之后，如上述进行测序，即，(1)在油中水微反应器中乳化小珠，(2)进行乳液PCR扩增小珠上的个别ssDNA分子；(3)选择/富集表面上含有扩增的ssDNA分子的小珠，(4)将携带DNA小珠转移到
Figure A20068003926600181
中；并且(5)利用产生焦磷酸盐光信号的方法在100,000个孔中同时测序。典型的输出是大约200.000×100-200bp序列，代表了对库中所有PCR产物的66倍覆盖。
基本如上述进行聚类和比对。能够利用标签鉴定含有突变的个别植物。在范例中，3个标签的联合指明了阳性集合以及集合中个别植物的坐标。
如上述，通过对已鉴定突变样品的PCR产物进行再测序来进行验证。
本发明可以使用多种集合策略，其中的范例是多微集合(包括3D集合)或列-、行-或盘集合。
此处能使用的高通量测序方法已被描述，例如，在Shendure等人Science 309：1728-32。范例包括微电泳测序，杂交测序/利用杂交测序(SBH)，对扩增分子的循环阵列测序(cyclic-array sequencing)，对单一分子的循环阵列测序，非循环、单一分子、实时方法，例如，聚合酶测序、核酸外切酶测序或微孔测序(nanopore sequencing)。
为了得到最佳结果，应该以足够的冗余测序片段或扩增产物。冗余能够区分测序错误和真正可能存在的突变。在特定的实施方案中，测序冗余优选为至少4，更优选为至少5，但是，如在范例中所见，超过10的冗余，优选为超过25或甚至超过50，被认为是有益的，虽然对于本发明是非必须的。
本发明的方法的优点尤其是，可以在计算机中评定突变对基因功能的影响，意味着选择活性突变。可以选择仅产生沉默替换的突变，因此使整个过程更经济更有效率。这对于已知的基于CEL I的TILLING技术尤其有益，因为大部分的CEL I突变是C/G到T/A转变，其中通常只有5％产生终止子(Colbert等人2001)。绝大部分是不太感兴趣的错义突变。有效识别群体中带有终止子突变的成员降低了操作过程的成本，并且避免了对阳性集合个别成员的额外筛选。
能以相同的几率发现所有突变，无关于它们在PCR产物中的位置，尤其是当筛选整个目标序列时。
该方法进一步避免了使用CEL I消化、异源双链形成和繁琐的凝胶评分。因此，该发明对CEL I技术伴随的集合限制是不敏感的。
该发明进一步涉及可以含有如下一种或多种化合物的试剂盒：对应于一个特定基因或性状的一种或多种(标记的)引物，突变-或等位基因-特异性引物。该试剂盒可以进一步包括小珠、测序引物、软件、集合策略的说明书和其它已知用于试剂盒的化合物。在特定的实施方案中，提供试剂盒来专用于发现特异性突变，例如疾病相关突变。
现在在下面对发明进行阐述。
实施例
可以通过使用新型高通量测序方法来改进筛选TILLING群体，例如454Life Sciences公司(Margulies等人，2005)或PolonySequencing公司(Shendure等人，2005)的方法。在目前的技术水平下，454Life Sciences技术的一次测序流程产生大约20Mb的序列。阅读长度大约为100bp/每次阅读。假定在含有3072株植物的群体中筛选1500bp基因中的突变(如上述第2章中引用的参考文献中所述)，有两种方法，并且在下面进行更详细的描述。
(1)一种方法是，研究整个1500bp基因，看是否存在EMS诱导的突变；
和(2)一种方法是，研究一个或数个100bp的延伸，看是否存在EMS诱导的突变。
实施例1筛选整个1500bp区域：
分离TILLING群体3072株植物的基因组DNA，建立每株植物等量DNA的3-D集合方案(例如，15×15×14)，产生了含有3072/14＝219或3072/15＝205种不同DNA样品的44个集合(15+15+14＝44)(Vandenbussche等人，如上)。这个集合步骤用于帮助在一轮PCR筛选(步骤8)后鉴定含有观测到的突变的植物。集合基因组DNA进一步用于在PCR扩增之前标准化DNA，来增加在测序库中所有DNA等量存在的几率。
使用1对未标记的PCR引物从集合的DNA样品中扩增1500bp基因。
将来自于所有集合孔中的等量的PCR产物集合在一起，来构建集合的PCR产物库(复杂性3072植物×1500bp＝4.6Mb序列)。
使用常规技术(例如454 Life Sciences公司提供的技术)对集合的PCR产物库进行鸟枪法测序，其中PCR产物被随机片段化，在个别小珠上扩增，并在小珠上测序。输出大约是200,000 100bp序列，代表了库中所有PCR产物的4-5倍的覆盖。
聚类所有的序列。多数序列是野生型的，但是也观测到EMS诱导的突变(和序列错误)。因为以4-5冗余度测序PCR产物，对相同的序列变化的多次观测表明是一个突变，而不是测序错误(图1)。评价突变对基因功能的影响，例如引入终止子。
设计以感兴趣的突变为目标的等位基因特异性引物(3’锁核酸；LNA；或肽核酸；PNA)，用于和步骤3中所使用的正向或反向引物联用，来筛选3-D集合DNA样品盘。等位基因特异性PCR将产生3个阳性集合(每个维度一个)，这指定了突变植物的库地址。
使用步骤3的引物通过扩增1500bp基因，随后用Sanger测序(双向)来验证突变。
实施例II
筛选100bp的延伸
(100bp是454测序运行的阅读长度)
分离TILLING群体的3072株植物的基因组DNA，建立每株植物等量DNA的3-D集合方案(例如，15×15×14)，产生了含有3072/14＝219或3072/15＝205种不同DNA样品的44个集合(15+15+14＝44)(Vandenbussche等人，如上)。
这个集合步骤用于帮助从序列数据中直接鉴定含有观测到的突变的植物。集合基因组DNA进一步用于在PCR扩增之前标准化DNA，来增加在测序库中所有DNA等量存在的几率。使用加标签的未标记PCR引物通过PCR从集合中扩增基因的100bp(或200bp)区域。这需要44个正向和44个反向引物(每个针对于每个维度的每个集合)，设置如下：
5′-测序引物结合位点-4bp标签-基因特异性引物序列-3′。通过使用含有4bp测序标签的、和代表了所有集合维度的44个引物中的每个引物都不同的加尾正向和反向引物，能知道每个序列的特异性的植物来源，因为测序引物在标签的上游退火。因此，在每个序列顺序中存在标签序列。4bp标签能产生44＝256种不同的标签。3bp标签能产生64种不同的标签-足够区分44种标签-但是优选标签序列有1个碱基以上的差异。
将来自于所有集合孔中的等量的PCR产物集合在一起，来构建集合的PCR产物库(复杂性3072植物×100bp＝307kb序列)。将集合的PCR产物库提供到454中进行测序，即，在小珠上扩增并测序PCR产物。输出为大约200,000个100bp的序列，代表了库中所有PCR产物的66倍覆盖。
聚类所有的序列(来自于每个方向)；多数序列是野生型的，但是也观测到EMS诱导的突变(和序列错误)。因为以66倍冗余度测序PCR产物，对相同的序列变化的多次观测表明是一个突变，而不是测序错误(图1)。根据在包含突变的序列顺序中发生的唯一的3标签序列组合(图2)，能立即获知含有突变的个别植物的坐标。使用步骤3的引物通过扩增1500bp基因，随后用Sanger测序(双向)来验证突变。
实施例III：在蕃茄突变库中鉴定特定突变
该范例描述了通过大量平行测序筛选蕃茄突变库，来鉴特定部位(目标基因)中的定点突变。所使用的突变库是一种近交型蕃茄栽培品种M82的同基因库，M82含有利用EMS诱变处理得到的5075M2家族。每种5075M2家族的种子储存于10％RH和7℃。Menda等人(PlantJ.38：861-872，2004)和数据库http://zamir.sgn.cornell.edu/mutants/index.html描述了库的来源和特征。
DNA分离
从库中随机选择的、来自于每个3072M2家族的5株温室生长的植物中收集叶材料。因为库中发生的任何突变都将在M2子代中以孟德尔方式分离，所以集合来自于5株个别M2植物的叶材料能够降低忽略任何突变的可能性，因为分离小于0.1％。使用修改的CTAB过程(被Stuart和Via所描述，Biotechniques，14：748-750，1993)从集合的叶材料中提取基因组DNA。在TE(10mM Tris-HCl pH8.0，1mM EDTA)中将DNA样品稀释为100ng/μl，并在96孔微孔板中储存于-20℃。
DNA样品的3D集合
分离的DNA样品被标准化到20ng/μl浓度，随后4倍集合，得到8块96孔微孔板中的768个样品。随后，对这8块微孔板进行3D集合策略，得到DNA的28个集合。3D集合策略包括以3种不同方式将所有DNA集合到一起，因此确保了每个单一的4倍集合在X-坐标集合中只发生一次，在Y-坐标集合和Z-坐标集合中只发生一次。通过将所有8块微孔板中的每列8孔(例如A1-H1)所有DNA样品集合到一起组装出X-集合，得到12个X-集合。因此每个X-集合保存有8(列中孔)×8(板)＝64种4倍集合的样品，代表了256个M2家族。通过将所有8块微孔板中的每行12孔(例如A1-A12)所有DNA样品集合到一起组装出Y-集合，得到8个Y-集合。因此每个Y-集合保存有12(行中孔)×8(板)＝96种4倍集合的样品，代表了384个M2家族。通过将整块微孔板中的所有DNA样品集合到一起组装出Z-集合，得到8个Z-集合。因此每个Z-集合保存有12×8＝96种4倍集合的样品，代表了384个M2家族。
目标基因座(locus)
在这个范例中的目标基因座是蕃茄真核起动因子4E(eIF4E)基因的一部分。已经显示该基因涉及了在拟南芥(Duprat等人，Plant J.32：927-934，2002)、莴苣(Nicaise等人Plant Physiol.132：1272-1282，2003)和茄(Ruffel等人，Plant J.32：1067-1075，2002；MoI Gen.Genomics 274：346-353，2005)中的蕃茄Y病毒(potyvirus)感染的易感性，并且在该基因中的特定突变涉及了隐性蕃茄Y病毒抗性。在这个范例中描述的突变筛选的目的是鉴定有可能是新的蕃茄Y病毒抗性来源的、蕃茄eIF4E基因中的额外突变。对于蕃茄eIF4E，只知道cDNA序列(NCBI登录号AY723733和AY723734)。使用以cDNA序列为基础设计的引物，使用PCR方法，扩增并测序蕃茄Moneyberg品系的eIF4E座位的基因组序列的片段。这样得到了蕃茄eIF4E基因组座位的大部分序列。该基因座含有4个外显子和3个内含子。对于突变筛选，选择基因的外显子1作为目标序列(SEQ ID 57)。
SEQ ID 57：蕃茄Moneyberg eIF4E的外显子1的序列：ATGGCAGCAGCTGAAATGGAGAGAACGATGTCGTTTGATGCAGCTGAGAAGTTGAAGGCCGCCGATGGAGGAGGAGGAGAGGTAGACGATGAACTTGAAG从GGTGAAATTGTTGAAGAATCAAATGATACGGCATCGTATTTAGGGAAAG从ATCACAGTGAAGCATCCATTGGAGCATTCATGGACTTTTTGGTTTGATAACCCTACCACTAAATCTCGACAAACTGCTTGGGG从GCTCACTTCGAAATGTCTACACTTTCTCCACTGTTGAAAATTTTTGGGG
用于目标基因座扩增的引物设计
设计引物用于蕃茄eIF4E的外显子1的PCR扩增。对应于外显子1的开放阅读框ATG起始密码子设计正向引物，ATG的5’端带有4碱基标签序列，为28个集合中的每个集合提供了一个唯一的鉴别器。在正向PCR引物的远5′末端，加入一个5′-C。所有的引物在其5′末端都被磷酸化，以便于后续的接头连接。28个正向引物的序列和名称被列于表1.标签序列被下划线。
表1.正向引物，用于外显子1扩增的序列和集合鉴定。
  名称   序列   3D集合   SEQID#
  06I009   CACACATGGCAGCAGCTGAAATGG   X1   1
  06I010   CACAGATGGCAGCAGCTGAAATGG   X2   2
  06I011   CACGAATGGCAGCAGCTGAAATGG   X3   3
  06I012   CACGTATGGCAGCAGCTGAAATGG   X4   4
  06I013   CACTCATGGCAGCAGCTGAAATGG   X5   5
  06I014   CACTGATGGCAGCAGCTGAAATGG   X6   6
  06I015   CAGACATGGCAGCAGCTGAAATGG   X7   7
  06I016   CAGAGATGGCAGCAGCTGAAATGG   X8   8
  06I017   CAGCAATGGCAGCAGCTGAAATGG   X9   9
  06I018   CAGCTATGGCAGCAGCTGAAATGG   X10   10
  06I019   CAGTCATGGCAGCAGCTGAAATGG   X11   11
  06I020   CAGTGATGGCAGCAGCTGAAATGG   X12   12
  06I021   CATCGATGGCAGCAGCTGAAATGG   Y1   13
  06I022   CATGCATGGCAGCAGCTGAAATGG   Y2   14
  06I023   CTACGATGGCAGCAGCTGAAATGG   Y3   15
  06I024   CTAGCATGGCAGCAGCTGAAATGG   Y4   16
  06I025   CTCACATGGCAGCAGCTGAAATGG   Y5   17
  06I026   CTCAGATGGCAGCAGCTGAAATGG   Y6   18
  06I027   CTCGAATGGCAGCAGCTGAAATGG   Y7   19
  06I028   CTCGTATGGCAGCAGCTGAAATGG   Y8   20
  06I029   CTCTCATGGCAGCAGCTGAAATGG   Z1   21
  06I030   CTCTGATGGCAGCAGCTGAAATGG   Z2   22
  06I031   CTGACATGGCAGCAGCTGAAATGG   Z3   23
  06I032   CTGAGATGGCAGCAGCTGAAATGG   Z4   24
  06I033   CTGCAATGGCAGCAGCTGAAATGG   Z5   25
  06I034   CTGCTATGGCAGCAGCTGAAATGG   Z6   26
  06I035   CTGTCATGGCAGCAGCTGAAATGG   Z7   27
  06I036   CTGTGATGGCAGCAGCTGAAATGG   Z8   28
对应于外显子1的非编码链中的267到287碱基对位置设计反向引物。再一次，引物启动部分的5′端包含了相同系列的4碱基标签序列，为28个集合中的每个集合提供了一个鉴别器。在反向PCR引物的远5′末端，加入一个5′-C。所有的引物在其5′末端都被磷酸化，以便于后续的接头连接。28个反向引物的序列和名称被列于表2.标签被下划线。
表2.反向引物，用于外显子1扩增的序列和集合鉴定。
  名称   序列   3D集合   SEQID#
  06I037   CACACCCCCAAAAATTTTCAACAGTG   X1   29
  06I038   CACAGCCCCAAAAATTTTCAACAGTG   X2   30
  06I039   CACGACCCCAAAAATTTTCAACAGTG   X3   31
  06I040   CACGTCCCCAAAAATTTTCAACAGTG   X4   32
  06I041   CACTCCCCCAAAAATTTTCAACAGTG   X5   33
  06I042   CACTGCCCCAAAAATTTTCAACAGTG   X6   34
  06I043   CAGACCCCCAAAAATTTTCAACAGTG   X7   35
  06I044   CAGAGCCCCAAAAATTTTCAACAGTG   X8   36
  06I045   CAGCACCCCAAAAATTTTCAACAGTG   X9   37
  06I046   CAGCTCCCCAAAAATTTTCAACAGTG   X10   38
  06I047   CAGTCCCCCAAAAATTTTCAACAGTG   X11   39
  06I048   CAGTGCCCCAAAAATTTTCAACAGTG   X12   40
  06I049   CATCGCCCCAAAAATTTTCAACAGTG   Y1   41
  06I050   CATGCCCCCAAAAATTTTCAACAGTG   Y2   42
  06I051   CTACGCCCCAAAAATTTTCAACAGTG   Y3   43
  06I053   CTAGCCCCCAAAAATTTTCAACAGTG   Y4   44
  06I053   CTCACCCCCAAAAATTTTCAACAGTG   Y5   45
  06I054   CTCAGCCCCAAAAATTTTCAACAGTG   Y6   46
  06I055   CTCGACCCCAAAAATTTTCAACAGTG   Y7   47
  06I056   CTCGTCCCCAAAAATTTTCAACAGTG   Y8   48
  06I057   CTCTCCCCCAAAAATTTTCAACAGTG   Z1   49
  06I058   CTCTGCCCCAAAAATTTTCAACAGTG   Z2   50
  06I059   CTGACCCCCAAAAATTTTCAACAGTG   Z3   51
  06I060   CTGAGCCCCAAAAATTTTCAACAGTG   Z4   52
  06I061   CTGCACCCCAAAAATTTTCAACAGTG   Z5   53
  06I062   CTGCTCCCCAAAAATTTTCAACAGTG   Z6   54
  06I063   CTGTCCCCCAAAAATTTTCAACAGTG   Z7   55
  06I064   CTGTGCCCCAAAAATTTTCAACAGTG   Z8   56
目标基因座扩增
从3D集合的DNA中使用上述正向和反向引物扩增目标基因座外显子1。对于每个PCR反应，使用带有相同标签的一个正向引物和一个反向引物。对于从28个3D集合中的每个集合中扩增外显子1，使用不同的正向和反向引物组。
每个样品的PCR扩增反应条件如下：
25μl DNA(＝50ng)；5μl核糖核酸酶-混合物；10μl 5xHerculase PCR-缓冲液；0.6μl 4dNTPs(20mM)；1.25μl正向引物(50ng/μl)；1.25μl反向引物(50ng/μl)；0.5μlHerculase DNA聚合酶；28.9μl milliQ-纯化的水。核糖核酸酶-混合物含有157,5μl milliQ-纯化的水+17,5μl核糖核酸酶。
在带有金或银反应头的PE9600热循环仪中使用如下条件进行PCR扩增：94℃2分钟的热启动，随后进行35个循环，94℃30秒，53℃30秒，72℃1分钟，最后保持在4℃。通过在1％琼脂糖凝胶中分析10μl PCR产物来检验PCR扩增的效率。图4显示了来自于28个3D集合中的每个集合的外显子1PCR产物的有效扩增，和相同凝胶中的γDNA的浓度范围进行比较。
扩增后，混合等量的PCR产物并使用QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN)根据Spin手册(第18页)进行纯化。每个柱子上最多装载100μl产物。在10mM Tris-EDTA中洗脱产物。
序列库制备和高通量测序
随后，在GS20测序仪上使用如Margulies等人所述的454LifeSciences测序技术(Nature 437：376-380，2005，以及互联网上的附录)对来自于3D集合的混合的扩增产物进行了高通量测序。特别的，PCR产物被连接到接头上，以便于进行乳液PCR扩增以及后续的如Margulies等人所述的片段测序。454接头序列、乳液PCR引物、测序引物和测序运行条件都如Margulies等人所述。在454测序过程中在Sepharose小珠上进行的乳液PCR片段扩增的功能元件的线性顺序如下：
454PCR接头-454测序接头-C-核苷酸-4bp标签-目标扩增引物序列1-目标片段内部序列-目标扩增引物序列2-4bp标签-G-核苷酸-454测序接头-454PCR接头-Sepharose小珠。
454测序运行数据处理
在使用454软件对微孔板的每个区域进行碱基破译(basecalling)后，产生带有FASTA格式的序列的文件。这些被连接到一个文件。在这个文件内使用正则表达式搜索100％匹配正向引物、之前带有5核苷酸(C加标签序列)。对延伸5核苷酸(C加4bp标签序列)的反向引物进行相同步骤。随后在分别文件中通过所有序列的标签序列(集合鉴定器)分组所有序列。使用ssahaSNP工具分析每个文件，并将已知的外显子核苷酸序列作为参考。ssahaSNP工具指出了454测序和对照基因组之间的所有单核苷酸序列差异和“统计indel”(因诱变或错误的碱基破译造成的单碱基插入或缺失)。将这些单核苷酸序列差异和indel储存到数据库中并用于错误率分析和点突变鉴定。
454测序错误率
对所有28个集合组合的数据进行处理所获得的正确序列的总数为247,052。这些序列被分为2组，分别为：和外显子1PCR产物的正向引物和编码链(5′末端)联配(align)的那些(128,594＝52％)，以及和PCR产物的反向引物和互补链(5′末端)联配的那些(118,458＝48％)。从每个不同的集合与联配组中获得的序列数量范围为从69到7269。平均起来，在总序列收集中每个3072M2家族应该被描绘了80次，并且每个等位基因40次。
在对应于正向引物的联配组中，和eIF4E对照序列相比，沿着联配的目标序列的63个碱基的延伸，128,594个序列中的1338个(1.2％)显示了一个或数个单核苷酸序列差异。对于反向引物组，和eIF4E对照序列相比，沿着联配的目标序列的102个碱基的延伸，118,458个序列中的743个(0.6％)显示了一个或数个单核苷酸序列差异。因此，两个序列组的单碱基置换的错误率对于165碱基延伸等于0.84％，或者每个碱基位置0.0051％(每10,000碱基0.5个错误)。这个错误率和Margulies等人报告的在检测序列中个别阅读置换错误为0.004％相似，但和整个基因组再测序(0.68％)相比要低很多。
在两个联配组中进行的对Indel发生的相似分析显示，在总共247,052个序列中，indel发生率为3883(正向引物组)和3829(反向引物组)(在165bp延伸中3.1％)。因此Indel发生率等于每碱基位置0.01891％(每10000碱基1.89个indel)。Inde l率明显比碱基置换错误率高。两种类型的测序错误结合发生平均频率为2.39每10,000碱基，或者每碱基位置0.024。该错误率比Margulies等人报告的低很多，并且可以用eIF4e外显子1序列中缺乏长均聚物延伸来解释。
在目标基因座中检测突变
因为该筛选的目的是鉴定(EMS)诱导的点突变(优选的是C->T和G->A突变)，所以对于该范例中的分析，和对照序列相比所有表现出indel的序列都被排除。在任何给定的3D集合中，多数单碱基置换仅发生一次，一些发生2或3此，很少发生多次。因此这些单碱基置换在联配序列的每个位置上以或少或多的一致性发生，并且是或少或多一致性的0.005％每碱基的频率，所以认为它们表示了测序错误，而不是存在于突变库中的特异性的突变。但是，在扫描序列中的少数特别的碱基位置上，特别的单碱基序列差异以高很多的发生率发生。当达到下述标准时，这种单碱基序列差异显示了库中的突变：
1.单碱基序列差异表现为C->T或G->A突变；
2.发生率高于20每10,000序列阅读每3D集合；
3.单碱基序列差异发生于精确的一个而不是超过1个的X-集合、Y-集合和Z-集合。
在该范例中，在对应于反向引物的联配组中发现了一个这种突变，在eIF4E外显子1序列中的碱基位置221。该突变，G->A突变(对应于互补链中的C->>T突变)，发生在集合X12，发生率为70每10,000序列，在集合Y3中的发生率为33每10,000序列，而在集合Z6中为62每10,000序列。这种在相同位置的相同的突变不发生于任何其它集合中，甚至不发生于背景错误率中，
这种G221A突变仅在三个集合中的唯一存在能确定最初的DNA 4倍集合，表示了4个M2家族。使用和表1和2中的正向与反向引物相同但是不带有5′5碱基序列标签的引物06F598和06F599，分别扩增这4个M2家族中的每个家族的DNA。对扩增的PCR产物进行常规的Sanger测序。4个家族中1个的eIF4E基因的序列(编码24)在位置221显示了双峰，对应于G和A的重叠。这表明M2家族集合，其中一半等位基因是野生型的，而另一半携带有G221A点突变(图2)。其它M2家族的碱基位置221周围序列依照参照(野生型)。
该突变引起精氨酸到谷氨酰胺的置换。这种特定M2家族的种子被种植到温室中，来选择纯合突变个体，用于显型。
以相似的方式，在454序列阅读中鉴定了其它两个点突变。因此估计M82蕃茄突变库的突变密度等于3个突变每165bp扫描序列，或者在3072M2家族中18个突变每1000碱基。这对应于报道的拟南芥的突变密度(Greene等人，Genet ics 164：731-740，2003)。
参考文献
Colbert等人.2001.High-throughput screening for inducedpoint mutations.Plant Physiology 126：480-484.
Duprat等人，2002.The Arabidopsis eukaryotic initiationfactor(iso)4E is dispensable for plant growth but required forsusceptibility to potyviruses.Plant J.32：927-934.
Epinat等人，2003.A novel engineered meganuclease induceshomologous recombination in yeast and mammalian cells.NucleicAcids Research，31(11)：2952-2962.
Havre等人，1993.Targeted mutagenesis of DNA using triplehelix-forming oligonucleotides linked to psoralen.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：7879-7883.
McCallum等人，2000.Targeted screening for inducedmutations.Nature Biotechnology 18：455-457.
Greene等人，2003.Spectrum of chemically inducedmutations from a large-scale reverse-genetic screen inArabidopsis.Genetics 164：731-740.
Lloyd等人，2005.Targeted mutagenes is using zinc-fingernucleases in Arabidopsis.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：2232-2237.
Margulies等人，2005.Genome sequencing in microfabricatedhigh-density picolitre reactions.Nature 437：376-380.
Mends等人，2004.In screening of a saturatedmutation library of tomato.Plant J.38：861-872.
Nicaise等人，2003.The eukaryotic translation initiationfactor 4E controls lettuce susceptibility to the p otyviruslettuce mosaic virusl.Plant Physiol.132：1272-1282.
Ruffel等人，2002.A natural recessive resistance geneagainst potato virus Y in pepper corresponds to the eukaryoticinitiation factor 4E(eIF4E).Plant J.32：1067-1075.
Ruffel等人，2005.The recessive potyvirus resistance genepot-1 is the tomato orthologue of the pepper pvr2-eIF4E gene.MoI Gen.Genomics 274：346-353.
Shendure等人，2005.Accurate multiplex polony sequencingof an evolved bacterial genome.Scienceexpress Report，August4.
Stuart和Via，1993.A rapid CTAB DNAi solation techniqueuseful for RAPD fingerprinting and other PCR applications.Biotechniques，14：748-750.
Vandenbussche等人，2003.Toward the analys is of thepetunia MADS box gene family by reverse and forward transposoninsertion mutagenesis approaches：B，C，and D floral organidentity functions require SEP ALLAT A-like MADS box genes inpetunia.The Plant Cell 15.-2680-2693.
序列表
<110>Keygene NV
<120>突变群体的高通量筛选
<130>P27926PC00
<150>60/721,528
<151>2005-09-29
<160>57
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>1
cacacatggc agcagctgaa atgg    24
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>2
cacagatggc agcagctgaa atgg    24
<210>3
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>3
cacgaatggc agcagctgaa atgg    24
<210>4
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>4
cacgtatggc agcagctgaa atgg    24
<210>5
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>5
cactcatggc agcagctgaa atgg    24
<210>6
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>6
cactgatggc agcagctgaa atgg    24
<210>7
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>7
cagacatggc agcagctgaa atgg    24
<210>8
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>8
cagagatggc agcagctgaa atgg    24
<210>9
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>9
cagcaatggc agcagctgaa atgg    24
<210>10
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>10
cagctatggc agcagctgaa atgg    24
<210>11
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>11
cagtcatggc agcagctgaa atgg    24
<210>12
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>12
cagtgatggc agcagctgaa atgg    24
<210>13
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>13
catcgatggc agcagctgaa atgg    24
<210>14
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>14
catgcatggc agcagctgaa atgg    24
<210>15
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>15
ctacgatggc agcagctgaa atgg    24
<210>16
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>16
ctagcatggc agcagctgaa atgg    24
<210>17
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>17
ctcacatggc agcagctgaa atgg    24
<210>18
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>18
ctcagatggc agcagctgaa atgg    24
<210>19
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>19
ctcgaatggc agcagctgaa atgg    24
<210>20
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>20
ctcgtatggc agcagctgaa atgg    24
<210>21
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>21
ctctcatggc agcagctgaa atgg    24
<210>22
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>22
ctctgatggc agcagctgaa atgg    24
<210>23
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>23
ctgacatggc agcagctgaa atgg    24
<210>24
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>24
ctgagatggc agcagctgaa atgg    24
<210>25
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>25
ctgcaatggc agcagctgaa atgg    24
<210>26
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>26
ctgctatggc agcagctgaa atgg    24
<210>27
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>27
ctgtcatggc agcagctgaa atgg    24
<210>28
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>28
ctgtgatggc agcagctgaa atgg    24
<210>29
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>29
cacaccccca aaaattttca acagtg    26
<210>30
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>30
cacagcccca aaaattttca acagtg    26
<210>31
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>31
cacgacccca aaaattttca acagtg    26
<210>32
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>32
cacgtcccca aaaattttca acagtg    26
<210>33
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>33
cactccccca aaaattttca acagtg    26
<210>34
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>34
cactgcccca aaaattttca acagtg    26
<210>35
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>35
cagaccccca aaaattttca acagtg    26
<210>36
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>36
cagagcccca aaaattttca acagtg    26
<210>37
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>37
cagcacccca aaaattttca acagtg    26
<210>38
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>38
cagctcccca aaaattttca acagtg    26
<210>39
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>39
cagtccccca aaaattttca acagtg    26
<210>40
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>40
cagtgcccca aaaattttca acagtg    26
<210>41
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>41
catcgcccca aaaattttca acagtg    26
<210>42
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>42
catgccccca aaaattttca acagtg    26
<210>43
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>43
ctacgcccca aaaattttca acagtg    26
<210>44
<21126
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<40044
ctagccccca aaaattttca acagtg    26
<210>45
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>45
ctcaccccca aaaattttca acagtg    26
<210>46
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>46
ctcagcccca aaaattttca acagtg    26
<210>47
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>47
ctcgacccca aaaattttca acagtg    26
<210>48
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>48
ctcgtcccca aaaattttca acagtg    26
<210>49
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>49
ctctccccca aaaattttca acagtg    26
<210>50
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>50
ctctgcccca aaaattttca acagtg    26
<210>51
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>51
ctgaccccca aaaattttca acagtg    26
<210>52
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>52
ctgagcccca aaaattttca acagtg    26
<210>53
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>53
ctgcacccca aaaattttca acagtg    26
<210>54
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>54
ctgctcccca aaaattttca acagtg                                         26
<210>55
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>55
ctgtccccca aaaattttca acagtg                                         26
<210>56
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>56
ctgtgcccca aaaattttca acagtg                                         26
<210>57
<211>287
<212>DNA
<213>番茄(Lycopersicon esculentum)
<220>
<221>misc feature
<223>蕃茄Moneyberg eIF4E的外显子1
<400>57
atggcagcag ctgaaatgga gagaacgatg tcgtttgatg cagctgagaa gttgaaggcc    60
gccgatggag gaggaggaga ggtagacgat gaacttgaag aaggtgaaat tgttgaagaa    120
tcaaatgata cggcatcgta tttagggaaa gaaatcacag tgaagcatcc attggagcat    180
tcatggactt tttggtttga taaccctacc actaaatctc gacaaactgc ttggggaagc    240
tcacttcgaa atgtctacac tttctccact gttgaaaatt tttgggg                  287

Claims (17)

1.一种用于在诱变群体成员中检测目标序列中的突变的方法，包括步骤：
(a)分离诱变群体每个成员的基因组DNA来提供每个群体成员的DNA样品；
(b)集合步骤(a)中获得的DNA；
(c)用一对(优选标记的)引物从DNA集合中扩增目标序列；
(d)集合步骤(c)的扩增产物来创建扩增产物库；
(e)可选的，片段化库中的扩增产物；
(f)使用高通量测序测定扩增产物或片段的核苷酸序列；
(g)通过聚类/联配片段的序列鉴定突变；
(h)对于目标序列的修改的功能筛选鉴定的突变；
(i)设计一个直接杂交到鉴定的突变上的引物；
(j)用步骤(i)的引物和步骤(c)的引物中的一个扩增步骤(d)的库；
(k)鉴定携带突变的群体成员；
(l)可选的，通过从步骤(k)中的成员使用步骤(c)的引物扩增目标序列来验证突变并测定扩增产物的序列。
2.一种用于在诱变群体成员中检测目标序列中的突变的方法，包括步骤：
(a)分离诱变群体每个成员的基因组DNA来提供每个群体成员的DNA样品；
(b)集合步骤(a)中获得的DNA；
(c)用一对加标签的(优选标记的)引物从DNA集合中扩增目标序列的部分，其中至少一个引物优选包含一个基因特异性部分、一个标签和一个测序引物结合位点；
(d)集合步骤(c)的扩增产物来创建扩增产物库；
(e)使用高通量测序测定扩增产物的核苷酸序列；
(f)通过聚类/联配片段的序列鉴定突变；
(g)使用标签鉴定具有突变的成员；
(h)可选的，通过从步骤(g)的成员使用步骤(c)的引物扩增目标序列来验证突变并测定扩增产物的序列。
3.根据权利要求1或2的方法，其中诱变群体通过用诱变化学试剂、电离辐射、定向核酸变换或区域定向诱变中的一种或多种处理基因组来获得。
4.根据权利要求1或2的方法，其中群体未被诱变但是包含含有天然发生突变的亚群。
5.根据权利要求1-4的方法，其中集合是一种3D-集合策略。
6.根据权利要求1-5的方法，其中高通量测序通过合成来进行，优选焦磷酸测序。
7.根据权利要求1-6的方法，其中测序在一种固体支撑物例如小珠上进行。
8.根据权利要求1-7的任意一个的方法，其中测序基于高通量测序，优选通过合成测序。
9.根据权利要求1-7的任意一个的方法，其中测序通过合成来进行，优选焦磷酸测序。
10.根据权利要求6的方法，其中测序包括步骤：
(i)将测序接头连接到片段上；
(ii)将所述接头-连接片段退火到小珠上，每个小珠退火一个片段；
(iii)在油中水微反应器中乳化小珠，使得每个微反应器含有一个小珠；
(iv)进行乳化PCR来扩增小珠表面上的接头-连接片段(v)选择/富集连接有所述的扩增的接头-连接片段的小珠(vi)将小珠置于孔中，使得每个孔包含一个小珠；和
(vii)产生焦磷酸信号。
11.根据权利要求1-10的任意一个的方法，其中步骤(c)和/或步骤(i)中的引物含有具有增强结合亲和性的核苷酸。
12.根据权利要求2-11的任意一个的方法，其中在步骤(c)中扩增的目标序列的部分为大约80到大约400bp。
13.根据权利要求12的方法，其中其中在步骤(c)中扩增的目标序列的部分为大约90到大约300bp。
14.根据权利要求12的方法，其中其中在步骤(c)中扩增的目标序列的部分为100到大约200bp。
15.包含针对于特定基因或性状的一个或多个(标记的)引物的试剂盒。
16.根据权利要求15的试剂盒，进一步包括突变-或等位基因-特异性引物。
17.根据权利要求15或16的试剂盒，进一步包括小珠和/或测序引物。
CN2006800392660A 2005-09-29 2006-09-21 突变群体的高通量筛选 Active CN101313078B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US72152805P 2005-09-29 2005-09-29
US60/721,528 2005-09-29
PCT/NL2006/000467 WO2007037678A2 (en) 2005-09-29 2006-09-21 High throughput screening of mutagenized populations

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101313078A true CN101313078A (zh) 2008-11-26
CN101313078B CN101313078B (zh) 2013-04-10

Family

ID=37709618

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2006800392660A Active CN101313078B (zh) 2005-09-29 2006-09-21 突变群体的高通量筛选

Country Status (11)

Country Link
US (12) US20090170713A1 (zh)
EP (1) EP1929039B2 (zh)
JP (1) JP5237099B2 (zh)
CN (1) CN101313078B (zh)
AT (1) ATE453728T1 (zh)
AU (1) AU2006295556B2 (zh)
CA (2) CA2623539C (zh)
DE (1) DE602006011486D1 (zh)
DK (1) DK1929039T4 (zh)
ES (1) ES2338459T5 (zh)
WO (1) WO2007037678A2 (zh)

Cited By (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101921841A (zh) * 2010-06-30 2010-12-22 深圳华大基因科技有限公司 基于Illumina GA测序技术的HLA基因高分辨率分型方法
CN101921842A (zh) * 2010-06-30 2010-12-22 深圳华大基因科技有限公司 Hla-a,b基因分型用pcr引物及其使用方法
CN101921840A (zh) * 2010-06-30 2010-12-22 深圳华大基因科技有限公司 一种基于dna分子标签技术和dna不完全打断策略的pcr测序方法
WO2012000445A1 (zh) * 2010-06-30 2012-01-05 深圳华大基因科技有限公司 新的的pcr测序方法及其在hla基因分型中的应用
CN102459592A (zh) * 2009-06-15 2012-05-16 考利达基因组股份有限公司 用于长片段阅读测序的方法和组合物
CN102933721A (zh) * 2010-06-09 2013-02-13 凯津公司 用于高通量筛选的组合序列条形码
CN103617375A (zh) * 2013-12-02 2014-03-05 深圳华大基因健康科技有限公司 聚合酶链式反应产物测序分型的方法及系统
CN104346539A (zh) * 2013-07-29 2015-02-11 安捷伦科技有限公司 从目标测序面板中寻找变异的方法
CN104955961A (zh) * 2012-12-11 2015-09-30 塞勒密斯株式会社 利用密码子随机化和诱变来合成基因文库的方法
CN105734130A (zh) * 2016-03-11 2016-07-06 中国农业科学院生物技术研究所 全基因组范围的植物基因功能鉴定的方法
CN108315396A (zh) * 2018-03-28 2018-07-24 潍坊兴旺生物种业有限公司 一种简单便捷检测snp的新方法
CN110904258A (zh) * 2019-12-03 2020-03-24 湖南杂交水稻研究中心 一种高通量靶向鉴定理化诱变植株m1代突变及获取突变体的方法
CN113130005A (zh) * 2021-04-12 2021-07-16 中国科学院东北地理与农业生态研究所 一种基于m2群体的候选因果突变位点基因定位的方法
US11389779B2 (en) 2007-12-05 2022-07-19 Complete Genomics, Inc. Methods of preparing a library of nucleic acid fragments tagged with oligonucleotide bar code sequences
US11414702B2 (en) 2005-06-15 2022-08-16 Complete Genomics, Inc. Nucleic acid analysis by random mixtures of non-overlapping fragments

Families Citing this family (117)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2292788B1 (en) 2005-06-23 2012-05-09 Keygene N.V. Strategies for high throughput identification and detection of polymorphisms
DK1929039T4 (en) 2005-09-29 2014-02-17 Keygene Nv High throughput-screening af mutageniserede populationer
US10316364B2 (en) 2005-09-29 2019-06-11 Keygene N.V. Method for identifying the source of an amplicon
EP3404114B1 (en) 2005-12-22 2021-05-05 Keygene N.V. Method for high-throughput aflp-based polymorphism detection
EP3239304B1 (en) 2006-04-04 2020-08-19 Keygene N.V. High throughput detection of molecular markers based on aflp and high troughput sequencing
ES2679996T3 (es) * 2006-11-15 2018-09-03 Biospherex Llc Secuenciación multi-etiqueta y análisis ecogenómico
CA2700563C (en) * 2007-09-24 2017-03-14 Jeroen Stuurman Method for the selection of plants with specific mutations
EP2227557B1 (en) * 2007-11-27 2012-12-12 Vib Vzw Marker assisted directed evolution
US8697363B2 (en) * 2008-08-26 2014-04-15 Fluidigm Corporation Methods for detecting multiple target nucleic acids in multiple samples by use nucleotide tags
EP2366029A1 (en) * 2008-11-17 2011-09-21 Keygene N.V. Bulked mutant analysis (bma)
WO2010057525A1 (en) * 2008-11-19 2010-05-27 Fondazione Parco Tecnologico Padano Oligonucleotide primers for nucleotide indexing of polymorphic pcr products and methods for their use
CN102317452B (zh) 2008-12-05 2015-02-04 关键基因股份有限公司 法尼烯合酶
CN103952482A (zh) 2009-04-02 2014-07-30 弗卢伊蒂格姆公司 用于对目标核酸进行条形码化的多引物扩增方法
WO2010126356A1 (en) * 2009-04-29 2010-11-04 Hendrix Genetics B.V. Method of pooling samples for performing a biological assay
US9085798B2 (en) 2009-04-30 2015-07-21 Prognosys Biosciences, Inc. Nucleic acid constructs and methods of use
CN104611423B (zh) * 2009-11-16 2018-03-20 基因特力株式会社 基因分型的方法
WO2011074964A1 (en) * 2009-12-18 2011-06-23 Keygene N.V. Improved bulked mutant analysis
CA2794522C (en) 2010-04-05 2019-11-26 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
US20190300945A1 (en) 2010-04-05 2019-10-03 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially Encoded Biological Assays
US10787701B2 (en) 2010-04-05 2020-09-29 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
WO2012008831A1 (en) * 2010-07-13 2012-01-19 Keygene N.V. Simplified de novo physical map generation from clone libraries
CN102409047B (zh) * 2010-09-21 2014-07-23 深圳华大基因科技服务有限公司 一种构建杂交测序文库的方法
EP3940084A1 (en) * 2011-02-09 2022-01-19 Bio-Rad Laboratories, Inc. Analysis of nucleic acids
WO2012129363A2 (en) 2011-03-24 2012-09-27 President And Fellows Of Harvard College Single cell nucleic acid detection and analysis
GB201106254D0 (en) 2011-04-13 2011-05-25 Frisen Jonas Method and product
WO2012158603A2 (en) 2011-05-13 2012-11-22 Bioo Scientific Corporation Pooled adapter strategy for reducing bias in small rna characterization
CN103890245B (zh) 2011-05-20 2020-11-17 富鲁达公司 核酸编码反应
WO2012169893A1 (en) 2011-06-10 2012-12-13 Stichting Technologisch Topinstituut Groene Genetica (Foundation Technological Top Institute Green Genetics) Transcription factor modulating terpene biosynthesis
US20150045258A1 (en) * 2012-02-14 2015-02-12 Gnubio, Inc. Cascaded addition of target specific universal adapters to nucleic acids
ES2665071T3 (es) 2012-02-17 2018-04-24 Fred Hutchinson Cancer Research Center Composiciones y métodos para identificar mutaciones de manera precisa
EP4234713A3 (en) 2012-03-20 2024-02-14 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Methods of lowering the error rate of massively parallel dna sequencing using duplex consensus sequencing
EP2852682B1 (en) 2012-05-21 2017-10-04 Fluidigm Corporation Single-particle analysis of particle populations
US20150011396A1 (en) 2012-07-09 2015-01-08 Benjamin G. Schroeder Methods for creating directional bisulfite-converted nucleic acid libraries for next generation sequencing
JP2014023434A (ja) * 2012-07-24 2014-02-06 Lotte Co Ltd デンタルプラークの細菌叢の解析方法
US11913065B2 (en) 2012-09-04 2024-02-27 Guardent Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US10876152B2 (en) 2012-09-04 2020-12-29 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US20160040229A1 (en) 2013-08-16 2016-02-11 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
ES2906714T3 (es) 2012-09-04 2022-04-20 Guardant Health Inc Métodos para detectar mutaciones raras y variación en el número de copias
WO2014134729A1 (en) 2013-03-08 2014-09-12 Vineland Research And Innovation Centre High throughput method of screening a population for members comprising mutation(s) in a target sequence
US9822408B2 (en) 2013-03-15 2017-11-21 Nugen Technologies, Inc. Sequential sequencing
SG11201508193TA (en) 2013-04-17 2015-11-27 Agency Science Tech & Res Method for generating extended sequence reads
EP3013984B1 (en) 2013-06-25 2023-03-22 Prognosys Biosciences, Inc. Methods for determining spatial patterns of biological targets in a sample
WO2015013681A1 (en) 2013-07-25 2015-01-29 Bio-Rad Laboratories, Inc. Genetic assays
WO2015073711A1 (en) 2013-11-13 2015-05-21 Nugen Technologies, Inc. Compositions and methods for identification of a duplicate sequencing read
EP3074528A1 (en) * 2013-11-26 2016-10-05 Qiagen GmbH Generation of ligation-ready dna amplicons
WO2015083004A1 (en) * 2013-12-02 2015-06-11 Population Genetics Technologies Ltd. Method for evaluating minority variants in a sample
ES2822125T3 (es) 2013-12-28 2021-04-29 Guardant Health Inc Métodos y sistemas para detectar variantes genéticas
WO2016012346A1 (en) 2014-07-25 2016-01-28 Enza Zaden Beheer B.V. Stay green cucumber plant
US10233490B2 (en) 2014-11-21 2019-03-19 Metabiotech Corporation Methods for assembling and reading nucleic acid sequences from mixed populations
EP3901282B1 (en) 2015-04-10 2023-06-28 Spatial Transcriptomics AB Spatially distinguished, multiplex nucleic acid analysis of biological specimens
WO2016201142A1 (en) 2015-06-09 2016-12-15 Life Technologies Corporation Methods, systems, compositions, kits, apparatus and computer-readable media for molecular tagging
JP2018530323A (ja) 2015-10-02 2018-10-18 キージーン ナムローゼ フェンノートシャップ 半数体及びそれに続く倍加半数体植物の産生方法
AU2016331020B2 (en) 2015-10-02 2021-04-29 Keygene N.V. Method for the production of haploid and subsequent doubled haploid plants
CA2911002C (en) 2015-11-04 2016-11-29 Travis Wilfred BANKS High throughput method of screening a population for members comprising mutations(s) in a target sequence using alignment-free sequence analysis
PL3387152T3 (pl) 2015-12-08 2022-05-09 Twinstrand Biosciences, Inc. Ulepszone adaptory, sposoby i kompozycje do sekwencjonowania dupleksowego
US11117113B2 (en) 2015-12-16 2021-09-14 Fluidigm Corporation High-level multiplex amplification
JP2019507585A (ja) 2015-12-17 2019-03-22 ガーダント ヘルス， インコーポレイテッド 無細胞ｄｎａの分析による腫瘍遺伝子コピー数を決定するための方法
EP3199642A1 (en) 2016-02-01 2017-08-02 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Plant breeding using high throughput sequencing
EP3443066A4 (en) 2016-04-14 2019-12-11 Guardant Health, Inc. EARLY DETECTION METHODS FOR CANCER
US11384382B2 (en) 2016-04-14 2022-07-12 Guardant Health, Inc. Methods of attaching adapters to sample nucleic acids
JP2019516373A (ja) 2016-05-20 2019-06-20 キージーン ナムローゼ フェンノートシャップ 半数体及びそれに続く倍加半数体植物の産生方法
US9850523B1 (en) 2016-09-30 2017-12-26 Guardant Health, Inc. Methods for multi-resolution analysis of cell-free nucleic acids
CA3027919C (en) 2016-09-30 2023-02-28 Guardant Health, Inc. Methods for multi-resolution analysis of cell-free nucleic acids
WO2018183942A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Grail, Inc. Improved library preparation and use thereof for sequencing-based error correction and/or variant identification
US10633651B2 (en) 2017-07-10 2020-04-28 Agilent Technologies, Inc. Assay methods and compositions for detecting contamination of nucleic acid identifiers
US11505826B2 (en) 2017-07-12 2022-11-22 Agilent Technologies, Inc. Sequencing method for genomic rearrangement detection
US11099202B2 (en) 2017-10-20 2021-08-24 Tecan Genomics, Inc. Reagent delivery system
EP3707273B1 (en) 2017-11-08 2024-04-10 Twinstrand Biosciences, Inc. Reagents and adapters for nucleic acid sequencing and methods for making such reagents and adapters
WO2019121603A1 (en) 2017-12-18 2019-06-27 Keygene N.V. Chemical mutagenesis of cassava
WO2019236726A1 (en) 2018-06-06 2019-12-12 The Regents Of The University Of California Methods of producing nucleic acid libraries and compositions and kits for practicing same
JP2021530219A (ja) 2018-07-12 2021-11-11 ツインストランド・バイオサイエンシズ・インコーポレイテッドTwinstrand Biosciences, Inc. ゲノム編集、クローン増殖、および関連用途を特徴付けるための方法および試薬
US11519033B2 (en) 2018-08-28 2022-12-06 10X Genomics, Inc. Method for transposase-mediated spatial tagging and analyzing genomic DNA in a biological sample
WO2020069350A1 (en) 2018-09-27 2020-04-02 Grail, Inc. Methylation markers and targeted methylation probe panel
US10945844B2 (en) 2018-10-10 2021-03-16 Edwards Lifesciences Corporation Heart valve sealing devices and delivery devices therefor
JP2020080761A (ja) * 2018-11-28 2020-06-04 大成建設株式会社 植物種の地域性変異特定方法
AU2019390691A1 (en) 2018-11-28 2021-05-13 Keygene N.V. Targeted enrichment by endonuclease protection
SG11202105824RA (en) 2018-12-10 2021-06-29 10X Genomics Inc Imaging system hardware
CN111378557B (zh) 2018-12-26 2023-06-06 财团法人工业技术研究院 用于产生液珠的管状结构及液珠产生方法
US11926867B2 (en) 2019-01-06 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
US11649485B2 (en) 2019-01-06 2023-05-16 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
CN113661249A (zh) 2019-01-31 2021-11-16 夸登特健康公司 用于分离无细胞dna的组合物和方法
WO2020169830A1 (en) 2019-02-21 2020-08-27 Keygene N.V. Genotyping of polyploids
EP3975704A1 (en) 2019-05-24 2022-04-06 Enza Zaden Beheer B.V. Downy mildew resistant melon plants
EP3976820A1 (en) 2019-05-30 2022-04-06 10X Genomics, Inc. Methods of detecting spatial heterogeneity of a biological sample
EP4025711A2 (en) 2019-11-08 2022-07-13 10X Genomics, Inc. Enhancing specificity of analyte binding
JP2023505712A (ja) 2019-12-12 2023-02-10 キージーン ナムローゼ フェンノートシャップ 半固体状態での核酸操作
JP2023506631A (ja) 2019-12-20 2023-02-17 キージーン ナムローゼ フェンノートシャップ 共有結合で閉端された核酸分子末端を使用したｎｇｓライブラリー調製
EP3891300B1 (en) 2019-12-23 2023-03-29 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using rna-templated ligation
US11702693B2 (en) 2020-01-21 2023-07-18 10X Genomics, Inc. Methods for printing cells and generating arrays of barcoded cells
US11732299B2 (en) 2020-01-21 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Spatial assays with perturbed cells
US11898205B2 (en) 2020-02-03 2024-02-13 10X Genomics, Inc. Increasing capture efficiency of spatial assays
US11732300B2 (en) 2020-02-05 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Increasing efficiency of spatial analysis in a biological sample
US11475981B2 (en) 2020-02-18 2022-10-18 Tempus Labs, Inc. Methods and systems for dynamic variant thresholding in a liquid biopsy assay
US11211147B2 (en) 2020-02-18 2021-12-28 Tempus Labs, Inc. Estimation of circulating tumor fraction using off-target reads of targeted-panel sequencing
US11211144B2 (en) 2020-02-18 2021-12-28 Tempus Labs, Inc. Methods and systems for refining copy number variation in a liquid biopsy assay
US11891654B2 (en) 2020-02-24 2024-02-06 10X Genomics, Inc. Methods of making gene expression libraries
WO2021216708A1 (en) 2020-04-22 2021-10-28 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using targeted rna depletion
WO2021226581A1 (en) * 2020-05-08 2021-11-11 Baebies, Inc. Multidimensional barcode pooling
EP4153776A1 (en) 2020-05-22 2023-03-29 10X Genomics, Inc. Spatial analysis to detect sequence variants
EP4153775A1 (en) 2020-05-22 2023-03-29 10X Genomics, Inc. Simultaneous spatio-temporal measurement of gene expression and cellular activity
WO2021242834A1 (en) 2020-05-26 2021-12-02 10X Genomics, Inc. Method for resetting an array
WO2021252499A1 (en) 2020-06-08 2021-12-16 10X Genomics, Inc. Methods of determining a surgical margin and methods of use thereof
EP4165207A1 (en) 2020-06-10 2023-04-19 10X Genomics, Inc. Methods for determining a location of an analyte in a biological sample
WO2021263111A1 (en) 2020-06-25 2021-12-30 10X Genomics, Inc. Spatial analysis of dna methylation
US11761038B1 (en) 2020-07-06 2023-09-19 10X Genomics, Inc. Methods for identifying a location of an RNA in a biological sample
US11981960B1 (en) 2020-07-06 2024-05-14 10X Genomics, Inc. Spatial analysis utilizing degradable hydrogels
US11981958B1 (en) 2020-08-20 2024-05-14 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using DNA capture
AU2020466782A1 (en) 2020-09-01 2023-03-02 Enza Zaden Beheer B.V. Disease resistant squash plants
US11926822B1 (en) 2020-09-23 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Three-dimensional spatial analysis
WO2022074058A1 (en) 2020-10-06 2022-04-14 Keygene N.V. Targeted sequence addition
US11827935B1 (en) 2020-11-19 2023-11-28 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using rolling circle amplification and detection probes
US20240002904A1 (en) 2020-11-24 2024-01-04 Keygene N.V. Targeted enrichment using nanopore selective sequencing
US20240093288A1 (en) 2020-11-25 2024-03-21 Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen Ribosomal profiling in single cells
WO2022140028A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for capturing probes and/or barcodes
EP4312518A1 (en) 2021-04-01 2024-02-07 Enza Zaden Beheer B.V. Stay green cucurbitaceae plant
IL305936A (en) 2021-04-15 2023-11-01 Keygene Nv Integrated regeneration of recalcitrant plants
EP4196605A1 (en) 2021-09-01 2023-06-21 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and kits for blocking a capture probe on a spatial array

Family Cites Families (96)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US24939A (en) 1859-08-02 Improvement in sewing-machines
EP0124990B1 (en) 1983-04-28 1987-08-19 Flexible Steel Lacing Company Method and apparatus for riveting fasteners to a belt
WO1990008821A1 (en) 1989-01-31 1990-08-09 University Of Miami Microdissection and amplification of chromosomal dna
KR100321510B1 (ko) 1991-09-24 2005-01-10 키진 엔.브이. 선택적인 제한단편의 증폭:디엔에이(dna) 핑거프린트법
US20100267023A1 (en) 1992-09-24 2010-10-21 Keygene N.V. Selective restriction fragment amplification: fingerprinting
AU1682595A (en) 1994-01-21 1995-08-08 North Carolina State University Methods for within family selection in woody perennials using genetic markers
EG23907A (en) 1994-08-01 2007-12-30 Delta & Pine Land Co Control of plant gene expression
US6013445A (en) 1996-06-06 2000-01-11 Lynx Therapeutics, Inc. Massively parallel signature sequencing by ligation of encoded adaptors
AU704660B2 (en) 1994-11-28 1999-04-29 E.I. Du Pont De Nemours And Company Compound microsatellite primers for the detection of genetic polymorphisms
US5565340A (en) 1995-01-27 1996-10-15 Clontech Laboratories, Inc. Method for suppressing DNA fragment amplification during PCR
US5935793A (en) * 1996-09-27 1999-08-10 The Chinese University Of Hong Kong Parallel polynucleotide sequencing method using tagged primers
US6100030A (en) 1997-01-10 2000-08-08 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Use of selective DNA fragment amplification products for hybridization-based genetic fingerprinting, marker assisted selection, and high-throughput screening
US6090556A (en) 1997-04-07 2000-07-18 Japan Science & Technology Corporation Method for quantitatively determining the expression of a gene
JP2001515362A (ja) 1997-05-13 2001-09-18 ディスプレイ・システムズ・バイオテック・アクティーゼルスカブ ｍＲＮＡをクローニングする方法および差次的に発現された転写物のディスプレイ（ＤＯＤＥＴ）
ES2290979T3 (es) * 1997-12-15 2008-02-16 Csl Behring Gmbh Cebador marcado para uso en la deteccion de acidos nucleicos diana.
CA2273616A1 (en) 1998-06-08 1999-12-08 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method for parallel screening of allelic variation
US6124201A (en) 1998-06-12 2000-09-26 Advanced Micro Devices, Inc. Method for manufacturing semiconductors with self-aligning vias
DE69816286T2 (de) 1998-07-29 2004-05-27 Keygene N.V. Verfahren zur Erkennung von Nukleinsäuremethylierungen durch AFLP
US6232067B1 (en) 1998-08-17 2001-05-15 The Perkin-Elmer Corporation Adapter directed expression analysis
US6703228B1 (en) 1998-09-25 2004-03-09 Massachusetts Institute Of Technology Methods and products related to genotyping and DNA analysis
EP1001037A3 (en) 1998-09-28 2003-10-01 Whitehead Institute For Biomedical Research Pre-selection and isolation of single nucleotide polymorphisms
WO2000024939A1 (en) 1998-10-27 2000-05-04 Affymetrix, Inc. Complexity management and analysis of genomic dna
US6480791B1 (en) 1998-10-28 2002-11-12 Michael P. Strathmann Parallel methods for genomic analysis
AU780119B2 (en) 1999-01-06 2005-03-03 Cornell Research Foundation Inc. Accelerating identification of single nucleotide polymorphisms and alignment of clones in genomic sequencing
US20040029155A1 (en) 1999-01-08 2004-02-12 Curagen Corporation Method for identifying a biomolecule
ATE247465T1 (de) 1999-01-12 2003-09-15 Quanam Medical Corp Arzneimittel und verfahren zur verabreichung von wasserunlöslichen paclitaxelderivaten
DE19911130A1 (de) 1999-03-12 2000-09-21 Hager Joerg Verfahren zur Identifikation chromosomaler Regionen und Gene
US6261782B1 (en) 1999-04-06 2001-07-17 Yale University Fixed address analysis of sequence tags
EP1173612B1 (en) 1999-04-09 2004-09-29 Keygene N.V. METHOD FOR THE DETECTION AND/OR ANALYSIS, BY MEANS OF PRIMER EXTENSION TECHNIQUES, OF SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISMS IN RESTRICTION FRAGMENTS, IN PARTICULAR IN AMPLIFIED RESTRICTION FRAGMENTS GENERATED USING AFLP$m(3)
US20040031072A1 (en) 1999-05-06 2004-02-12 La Rosa Thomas J. Soy nucleic acid molecules and other molecules associated with transcription plants and uses thereof for plant improvement
US20020119448A1 (en) 1999-06-23 2002-08-29 Joseph A. Sorge Methods of enriching for and identifying polymorphisms
US20030204075A9 (en) 1999-08-09 2003-10-30 The Snp Consortium Identification and mapping of single nucleotide polymorphisms in the human genome
AU7712400A (en) 1999-09-23 2001-04-24 Gene Logic, Inc. Indexing populations
US6287778B1 (en) * 1999-10-19 2001-09-11 Affymetrix, Inc. Allele detection using primer extension with sequence-coded identity tags
US6958225B2 (en) 1999-10-27 2005-10-25 Affymetrix, Inc. Complexity management of genomic DNA
WO2001038572A1 (fr) 1999-11-19 2001-05-31 Takara Bio Inc. Methode d'amplification d'acides nucleiques
AU2001253063A1 (en) 2000-03-31 2001-10-15 Fred Hutchinson Cancer Research Center Reverse genetic strategy for identifying functional mutations in genes of known sequence
US20110131679A2 (en) 2000-04-19 2011-06-02 Thomas La Rosa Rice Nucleic Acid Molecules and Other Molecules Associated with Plants and Uses Thereof for Plant Improvement
EP1282729A2 (en) 2000-05-15 2003-02-12 Keygene N.V. Microsatellite-aflp
US7300751B2 (en) 2000-06-30 2007-11-27 Syngenta Participations Ag Method for identification of genetic markers
GB0016742D0 (en) * 2000-07-10 2000-08-30 Simeg Limited Diagnostic method
AU2002246612B2 (en) * 2000-10-24 2007-11-01 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Direct multiplex characterization of genomic DNA
US6958217B2 (en) * 2001-01-24 2005-10-25 Genomic Expression Aps Single-stranded polynucleotide tags
US7141364B1 (en) 2001-03-29 2006-11-28 Council Of Scientific And Industrial Research Universal primers for wildlife identification
US20040053236A1 (en) * 2001-03-30 2004-03-18 Mccallum Claire M. Reverse genetic strategy for identifying functional mutations in genes of known sequences
WO2002083911A1 (en) 2001-04-12 2002-10-24 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Production of plants with increased tolerance to drought stress or with increased transpiration
WO2002086163A1 (en) 2001-04-20 2002-10-31 Karolinska Innovations Ab Methods for high throughput genome analysis using restriction site tagged microarrays
AU2002323509A1 (en) 2001-08-30 2003-03-18 Purdue Research Foundation Methods to produce transgenic plants resistant to osmotic stress
EP1288301A1 (en) 2001-08-31 2003-03-05 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Berlin Plant-derived resistance gene
US7504222B2 (en) 2001-10-31 2009-03-17 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of breast cancer
AU2003224789B2 (en) 2002-03-27 2007-03-15 Agrinomics, Llc Generation of plants with improved drought tolerance
US6815167B2 (en) 2002-04-25 2004-11-09 Geneohm Sciences Amplification of DNA to produce single-stranded product of defined sequence and length
US20070065816A1 (en) 2002-05-17 2007-03-22 Affymetrix, Inc. Methods for genotyping
US7108976B2 (en) 2002-06-17 2006-09-19 Affymetrix, Inc. Complexity management of genomic DNA by locus specific amplification
AU2003243720A1 (en) 2002-06-21 2004-01-06 Bayer Bioscience N.V. Method for detecting foreign dna in a host genome
ATE358182T1 (de) 2002-09-05 2007-04-15 Plant Bioscience Ltd Genomteilung
US20040157238A1 (en) 2002-09-20 2004-08-12 Quinn John J. Method for detection of multiple nucleic acid sequence variations
EP1551983A2 (en) 2002-10-18 2005-07-13 CropDesign N.V. Identification of e2f target genes and uses thereof
AU2003297541A1 (en) 2002-12-18 2004-07-14 Third Wave Technologies, Inc. Detection of small nucleic acids
JP2004208586A (ja) * 2002-12-27 2004-07-29 Wakunaga Pharmaceut Co Ltd Ｈｌａの検出
US7970548B2 (en) 2003-01-10 2011-06-28 Keygene N.V. AFLP-based method for integrating physical and genetic maps
EP2159285B1 (en) 2003-01-29 2012-09-26 454 Life Sciences Corporation Methods of amplifying and sequencing nucleic acids
US8105771B2 (en) 2003-02-26 2012-01-31 Callida Genomics, Inc. Random array DNA analysis by hybridization
JP4888876B2 (ja) 2003-06-13 2012-02-29 田平 武 アルツハイマー病の治療のための組換えアデノ随伴ウィルスベクター
WO2005002325A2 (en) 2003-06-24 2005-01-13 Agrinomics Llc Generation of plants with improved drought tolerance
WO2005002326A2 (en) 2003-06-24 2005-01-13 Agrinomics Llc Generation of plants with improved drought tolerance
US7051935B2 (en) 2003-07-28 2006-05-30 Imageid Ltd. Color calibration for color bar codes
US7365179B2 (en) 2003-09-09 2008-04-29 Compass Genetics, Llc Multiplexed analytical platform
US8420322B2 (en) * 2003-10-21 2013-04-16 The Volcani Center—The State of Israel Ministry of Agriculture, Agricultural Research Organization Isolated nucleotide sequences responsible for the tomato high pigment-1 mutant phenotype (hp-1) and uses thereof
US20050153317A1 (en) 2003-10-24 2005-07-14 Metamorphix, Inc. Methods and systems for inferring traits to breed and manage non-beef livestock
ES2949821T3 (es) 2004-01-07 2023-10-03 Illumina Cambridge Ltd Matrices moleculares
US20050233354A1 (en) 2004-01-22 2005-10-20 Affymetrix, Inc. Genotyping degraded or mitochandrial DNA samples
US7217522B2 (en) 2004-02-12 2007-05-15 Campass Genetics Llc Genetic analysis by sequence-specific sorting
EP1721014B1 (en) * 2004-02-18 2013-07-17 Trustees Of Boston University Method for detecting and quantifying rare mutations/polymorphisms
EP1574585A1 (en) 2004-03-12 2005-09-14 Plant Research International B.V. Method for selective amplification of DNA fragments for genetic fingerprinting
JP4809594B2 (ja) 2004-08-02 2011-11-09 東京エレクトロン株式会社 検査装置
FR2876479B1 (fr) 2004-10-11 2006-12-15 Parkeon Machine a pieces a receptacle de pieces de monnaie amovible
US7220549B2 (en) * 2004-12-30 2007-05-22 Helicos Biosciences Corporation Stabilizing a nucleic acid for nucleic acid sequencing
US7407757B2 (en) 2005-02-10 2008-08-05 Population Genetics Technologies Genetic analysis by sequence-specific sorting
US7393665B2 (en) 2005-02-10 2008-07-01 Population Genetics Technologies Ltd Methods and compositions for tagging and identifying polynucleotides
US20070009925A1 (en) * 2005-05-05 2007-01-11 Applera Corporation Genomic dna sequencing methods and kits
AU2006244042B2 (en) 2005-05-10 2010-07-29 State Of Oregon Acting By & Through The State Board Of Higher Education On Behalf Of The University Of Oregon Methods of mapping polymorphisms and polymorphism microarrays
DK2463386T3 (en) 2005-06-15 2017-07-31 Complete Genomics Inc Nucleic acid analysis using random mixtures of non-overlapping fragments
EP2292788B1 (en) 2005-06-23 2012-05-09 Keygene N.V. Strategies for high throughput identification and detection of polymorphisms
ES2344802T3 (es) 2005-06-23 2010-09-07 Keygene N.V. Estrategias mejoradas para la secuenciacion de genomas complejos utilizando tecnologias de secuenciacion de alto rendimiento.
US20070020640A1 (en) 2005-07-21 2007-01-25 Mccloskey Megan L Molecular encoding of nucleic acid templates for PCR and other forms of sequence analysis
DK1929039T4 (en) * 2005-09-29 2014-02-17 Keygene Nv High throughput-screening af mutageniserede populationer
US10316364B2 (en) 2005-09-29 2019-06-11 Keygene N.V. Method for identifying the source of an amplicon
US8071310B2 (en) 2005-11-14 2011-12-06 Keygene Nv Method for the high throughput screening of transposon tagging populations and massive parallel sequence identification of insertion sites
EP3404114B1 (en) 2005-12-22 2021-05-05 Keygene N.V. Method for high-throughput aflp-based polymorphism detection
US7537897B2 (en) 2006-01-23 2009-05-26 Population Genetics Technologies, Ltd. Molecular counting
EP3239304B1 (en) 2006-04-04 2020-08-19 Keygene N.V. High throughput detection of molecular markers based on aflp and high troughput sequencing
US8362325B2 (en) 2007-10-03 2013-01-29 Ceres, Inc. Nucleotide sequences and corresponding polypeptides conferring modulated plant characteristics
US20090124758A1 (en) 2007-11-09 2009-05-14 Bridgestone Sports Co., Ltd. Golf ball
US20140051585A1 (en) 2012-08-15 2014-02-20 Natera, Inc. Methods and compositions for reducing genetic library contamination
WO2014196863A1 (en) 2013-06-07 2014-12-11 Keygene N.V. Method for targeted sequencing

Cited By (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11414702B2 (en) 2005-06-15 2022-08-16 Complete Genomics, Inc. Nucleic acid analysis by random mixtures of non-overlapping fragments
US11389779B2 (en) 2007-12-05 2022-07-19 Complete Genomics, Inc. Methods of preparing a library of nucleic acid fragments tagged with oligonucleotide bar code sequences
CN107267596A (zh) * 2009-06-15 2017-10-20 考利达基因组股份有限公司 用于长片段阅读测序的方法和组合物
CN102459592A (zh) * 2009-06-15 2012-05-16 考利达基因组股份有限公司 用于长片段阅读测序的方法和组合物
CN102933721B (zh) * 2010-06-09 2015-12-02 凯津公司 用于高通量筛选的组合序列条形码
CN102933721A (zh) * 2010-06-09 2013-02-13 凯津公司 用于高通量筛选的组合序列条形码
CN101921842B (zh) * 2010-06-30 2013-08-07 深圳华大基因科技有限公司 Hla-a,b基因分型用pcr引物及其使用方法
WO2012000445A1 (zh) * 2010-06-30 2012-01-05 深圳华大基因科技有限公司 新的的pcr测序方法及其在hla基因分型中的应用
CN101921841B (zh) * 2010-06-30 2014-03-12 深圳华大基因科技有限公司 基于Illumina GA测序技术的HLA基因高分辨率分型方法
CN101921840B (zh) * 2010-06-30 2014-06-25 深圳华大基因科技有限公司 一种基于dna分子标签技术和dna不完全打断策略的pcr测序方法
CN101921842A (zh) * 2010-06-30 2010-12-22 深圳华大基因科技有限公司 Hla-a,b基因分型用pcr引物及其使用方法
CN101921840A (zh) * 2010-06-30 2010-12-22 深圳华大基因科技有限公司 一种基于dna分子标签技术和dna不完全打断策略的pcr测序方法
CN101921841A (zh) * 2010-06-30 2010-12-22 深圳华大基因科技有限公司 基于Illumina GA测序技术的HLA基因高分辨率分型方法
US9957564B2 (en) 2010-06-30 2018-05-01 Bgi Genomics Co., Ltd. Application of a PCR sequencing method, based on DNA barcoding technique and DNA incomplete shearing strategy, in HLA genotyping
US10036007B2 (en) 2012-12-11 2018-07-31 Celemics, Inc. Method of synthesis of gene library using codon randomization and mutagenesis
CN104955961B (zh) * 2012-12-11 2017-03-08 塞勒密斯株式会社 利用密码子随机化和诱变来合成基因文库的方法
CN104955961A (zh) * 2012-12-11 2015-09-30 塞勒密斯株式会社 利用密码子随机化和诱变来合成基因文库的方法
CN104346539A (zh) * 2013-07-29 2015-02-11 安捷伦科技有限公司 从目标测序面板中寻找变异的方法
CN103617375B (zh) * 2013-12-02 2017-08-25 深圳华大基因健康科技有限公司 聚合酶链式反应产物测序分型的方法及系统
CN103617375A (zh) * 2013-12-02 2014-03-05 深圳华大基因健康科技有限公司 聚合酶链式反应产物测序分型的方法及系统
CN105734130A (zh) * 2016-03-11 2016-07-06 中国农业科学院生物技术研究所 全基因组范围的植物基因功能鉴定的方法
CN105734130B (zh) * 2016-03-11 2019-10-25 中国农业科学院生物技术研究所 全基因组范围的植物基因功能鉴定的方法
CN108315396A (zh) * 2018-03-28 2018-07-24 潍坊兴旺生物种业有限公司 一种简单便捷检测snp的新方法
CN108315396B (zh) * 2018-03-28 2021-07-16 潍坊兴旺生物种业有限公司 一种简单便捷检测snp的新方法
CN110904258A (zh) * 2019-12-03 2020-03-24 湖南杂交水稻研究中心 一种高通量靶向鉴定理化诱变植株m1代突变及获取突变体的方法
CN113130005A (zh) * 2021-04-12 2021-07-16 中国科学院东北地理与农业生态研究所 一种基于m2群体的候选因果突变位点基因定位的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN101313078B (zh) 2013-04-10
US10538806B2 (en) 2020-01-21
JP5237099B2 (ja) 2013-07-17
ES2338459T5 (es) 2014-02-24
CA2910861A1 (en) 2007-04-05
US20170159120A1 (en) 2017-06-08
AU2006295556A1 (en) 2007-04-05
US11649494B2 (en) 2023-05-16
CA2623539C (en) 2015-12-15
US9745627B2 (en) 2017-08-29
US20120309633A1 (en) 2012-12-06
ES2338459T3 (es) 2010-05-07
JP2009509527A (ja) 2009-03-12
DE602006011486D1 (de) 2010-02-11
US20160258006A1 (en) 2016-09-08
EP1929039B1 (en) 2009-12-30
DK1929039T4 (en) 2014-02-17
US20180245151A1 (en) 2018-08-30
US20170166962A1 (en) 2017-06-15
EP1929039B2 (en) 2013-11-20
US20170342486A1 (en) 2017-11-30
EP1929039A2 (en) 2008-06-11
US9574230B2 (en) 2017-02-21
US20090170713A1 (en) 2009-07-02
US10233494B2 (en) 2019-03-19
US20190153534A1 (en) 2019-05-23
US8614073B2 (en) 2013-12-24
US20200291471A1 (en) 2020-09-17
US9670542B2 (en) 2017-06-06
WO2007037678A3 (en) 2007-05-31
US20170114405A1 (en) 2017-04-27
CA2623539A1 (en) 2007-04-05
CA2910861C (en) 2018-08-07
DK1929039T3 (da) 2010-03-08
US9376719B2 (en) 2016-06-28
WO2007037678A2 (en) 2007-04-05
ATE453728T1 (de) 2010-01-15
US9657335B2 (en) 2017-05-23
AU2006295556B2 (en) 2012-07-05
US20140080716A1 (en) 2014-03-20
US20170022560A1 (en) 2017-01-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101313078B (zh) 突变群体的高通量筛选
EP2620511B1 (en) Single molecule nucleic acid sequence analysis processes
EP2427569B1 (en) The use of class iib restriction endonucleases in 2nd generation sequencing applications
CN101310024B (zh) 高通量筛选转座子标记群体和大量平行的插入位点的序列鉴定方法
US20200102612A1 (en) Method for identifying the source of an amplicon
Koebner et al. Contributions of DNA molecular marker technologies to the genetics and breeding of wheat and barley
Karaca et al. Molecular markers in Salvia L.: past, present and future
Xu Molecular breeding tools: markers and maps.

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant