CN105734130A - 全基因组范围的植物基因功能鉴定的方法 - Google Patents

全基因组范围的植物基因功能鉴定的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及全基因组范围的植物基因功能鉴定的方法，包括：1)将出发植物进行单核苷酸突变，构建植物突变体库；2)检测步骤1)所述植物突变体库中突变体的表型，构建植物突变体表型数据库；3)检测步骤2)所述植物突变体库中突变体的基因型，构建植物突变体基因型数据库；4)结合植物突变体表型数据库和植物突变体基因型数据库，确定出发植物中由所述单核苷酸突变导致的SNP位点所在基因的功能。本发明建立的植物突变体表型数据库和突变体基因型数据库，可以精确、迅速地找到与植物发育过程、抗逆反应或代谢途径等生物学过程相关的基因，为植物功能基因组研究开创了新途径。

Description

全基因组范围的植物基因功能鉴定的方法
技术领域
本发明涉及基因功能组学，具体地说，涉及一种全基因组范围的植物基因功能鉴定的方法。
背景技术
TILLING技术作为一种“反向遗传学”方法与传统的化学诱变技术(EMS诱变)相结合，不需要复杂的技术和设备就可以对突变体库进行大规模筛选，在植物功能基因组和作物遗传改良方面起到了巨大作用。然而TILLING技术相对劳动强度大，筛选通量小，价格昂贵。图位克隆技术作为一种有效的“正向遗传学”研究基因功能的方法，需要建立大量的作图群体，劳动强度大，筛选通量小。第二代基因组测序技术的兴起为在全基因组范围内高通量检测单核苷酸多态性(SNP)提供了有效的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种全基因组范围的植物基因功能鉴定的方法。
为了实现本发明目的，本发明提供的全基因组范围的植物基因功能鉴定的方法，包括如下步骤：
A、将出发植物进行单核苷酸突变，构建植物突变体库；
B、检测步骤A所述植物突变体库中突变体的表型，构建植物突变体表型数据库；
C、检测步骤B所述植物突变体库中突变体的基因型，构建植物突变体基因型数据库，即SNP数据库；
D、结合步骤B所述植物突变体表型数据库和步骤C所述植物突变体基因型数据库，确定所述出发植物中由所述单核苷酸突变导致的SNP位点所在基因的功能。
步骤A具体如下：
(1)收集出发植物的花粉，进行化学诱变处理，得到诱变后植物花粉；
(2)将步骤(1)得到的诱变后植物花粉涂抹在所述出发植物的花丝上，得到授粉后植物；
(3)步骤(2)得到的授粉后植物经生长、结实，收获种子，得到M1代种子，种植M1代种子，得到M1代植物突变体，即构建得到植物突变体库；
步骤B具体如下：
(4)将步骤(3)得到的M1代植物突变体自交，得到M2代植株；
(5)检测步骤(4)得到的M2代植株不同发育时期的表型，构建植物突变体表型数据库；
步骤C具体如下：
(6)分别提取步骤(3)得到的每株M1代植物突变体的基因组DNA；
(7)将步骤(6)得到的每株M1代植物突变体的基因组DNA片段化，构建二代测序文库，用玉米外显子探针富集外显子区域，测序，获得每株M1代植物突变体的外显子DNA序列；
(8)分别将步骤(7)得到的每株M1代植物突变体的外显子DNA序列与出发植物的基因组DNA序列进行对比，找出每株M1代植物突变体中的SNP位点，确定所述SNP位点所在基因的位置，将每株M1代植物突变体及其SNP位点所在基因的位置构成植物突变体基因型数据库；
步骤D具体包括如下方案Ⅰ或Ⅱ：
方案Ⅰ包括如下步骤：
(10)在步骤B中的所述植物突变体表型数据库中找出具有同类表型的M2代植物对应的M1代植物突变体；
(11)在步骤C中的所述植物突变体基因型数据库中找出每株步骤(10)所述具有同类表型的M1代植物突变体的SNP位点所在的基因，分析所述植物突变体基因型数据库和所述植物突变体表型数据库之间的连锁关系，如果所述SNP位点所在基因相同，则所述SNP位点所在的基因是与所述表型相关的基因；
方案Ⅱ包括如下步骤：
(12)在步骤C中的所述植物突变体基因型数据库中找到目标基因中所有能导致基因编码蛋白改变的SNP位点对应的M1代植物突变体；
(13)在步骤B中的所述植物突变体表型数据库中找到步骤(12)中每个M1代植物突变体对应的M2代植物的所有表型，如果表型相同，则所述待测基因为是与所述表型相关的基因。
前述的方法，步骤A中将花粉与甲基磺酸乙酯溶液按g:ml＝1:50-150的比例混合40-50min，得到诱变后植物花粉；优选地，花粉与甲基磺酸乙酯溶液按g:ml＝1:100的比例混合45min。所述甲基磺酸乙酯溶液的浓度为0.08-0.12v/v％，优选0.07v/v％。
前述的方法，步骤C中在测序前包括对基因组DNA进行超声破碎，回收200-400bpDNA片段的步骤；
其中，超声采用BioruptorTMUCD-200超声波破碎仪，选High档位，超声时间为15-25分钟，优选20分钟，超声的方式为30秒超声，30秒间隙。
前述的方法，步骤C中在超声破碎后测序前还包括如下步骤：
a)将所述200-400bpDNA片段进行DNA末端修复，得到末端修复DNA；其中，100μlDNA末端修复的反应体系为：30μl所述200-400bpDNA片段、4μl0.4mMdNTPMix、1μlKlenow酶、5μlT4DNA聚合酶、5μlT4PNK、10μl10×T4DNA连接酶缓冲液，10μl1mMATP，用ddH2O补足至100μl；DNA末端修复的反应温度为20℃，反应时间为30分钟；
b)将步骤a)得到的末端修复DNA3’末端加A，得到3’末端加A的DNA；其中，50μl3’末端加A的反应体系为：32μl末端修复DNA、3μlKlenowExo-酶(购自NEB，产品目录号0212)、5μl10×Klenow酶缓冲液、10μl1mMATP；3’末端加A的反应温度为37℃，反应时间为30分钟；产物用QIAquickPCR纯化试剂盒纯化，用10μl水洗脱；
c)将步骤b)得到的3’末端加A的DNA连接接头，回收300-500bp的片段，即为接头DNA；
其中，使用的接头为IndexPEAdapterOligo，接头序列如下：
5'-GATCGGAAGAGCACACGTCT-3’
5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’
d)将步骤c)得到的接头DNA进行PCR扩增，回收300-500bp的目的片段，得到测序前样品。
其中，PCR扩增使用的模板为所述接头DNA，使用的引物序列分别如下(SEQIDNO:3-16)：
InPE1.0的核苷酸序列如下：
5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’
InPE2.0的核苷酸序列如下：
5'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’
PCRPrimerIndex1的核苷酸序列如下：
5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTC-3’
PCRPrimerIndex2的核苷酸序列如下：
5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTC-3’
PCRPrimerIndex3的核苷酸序列如下：
5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTC-3’
PCRPrimerIndex4的核苷酸序列如下：
5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTC-3’
PCRPrimerIndex5的核苷酸序列如下：
5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTC-3’
PCRPrimerIndex6的核苷酸序列如下：
5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTC-3’
PCRPrimerIndex7的核苷酸序列如下：
5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTC-3’
PCRPrimerIndex8的核苷酸序列如下：
5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTC-3’
PCRPrimerIndex9的核苷酸序列如下：
5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTC-3’
PCRPrimerIndex10的核苷酸序列如下：
5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTC-3’
PCRPrimerIndex11的核苷酸序列如下：
5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTC-3’
PCRPrimerIndex12的核苷酸序列如下：
5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTC-3’
e)将步骤d)得到的全基因组测序文库用玉米外显子探针捕获，得到外显子组测序文库。
本发明中所述出发植物包括单子叶植物，例如玉米。
本发明建立的植物突变体表型数据库和SNP数据库，可以精确、迅速地找到与植物发育过程、抗逆反应或代谢途径等生物学过程相关的基因；或直接对感兴趣的基因在突变体库中搜索该基因中含有SNP的独立的突变体，对其功能进行研究。本方法既可以从“正向遗传学”又可以从“反向遗传学”入手鉴定某一基因的功能，并可有效挖掘参与同一代谢途径或信号途径的基因功能，为植物功能基因组研究开创了新途径。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW,Molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1全基因组范围的玉米基因功能鉴定
一、玉米花粉EMS诱变突变体库的构建
处理前一天下午，玉米(Zeamays，玉米自交系——B73，)雄穗去掉老花药后套袋。处理的当天早晨，通风橱内先用1mLEMS(甲基磺酸乙酯)加入99mL液态石蜡油(Sigma,mineraloilM8410)中，制成1％(体积百分含量)的EMS(甲基磺酸乙酯)母液，混匀，然后稀释成0.07％EMS的工作浓度，盛于小瓶中。上午10:00左右，收集玉米新鲜花粉，过100目筛去除花药，每份10g收集的花粉加入处理液小瓶(0.07％EMS)中，轻轻振荡混匀，45min后，再用毛笔把处理的花粉涂抹在相应的花丝上，并挂牌标记。当代结的种子为M1代，M1代植物组成植物突变体库。
二、植物突变体的表型库的构建
将上述种植10000粒M1代植物突变体的种子种植，得到M1植物，开花时自交，得到M2代种子。
M1自交后单株收种(每个单株为一个line)，种子为M2代子。每个line取3×20粒种子，种在四川绵阳、海南三亚和河北廊坊，分别统计表型，得到突变体的表型库。
河北种植的M2代植物突变体每个line间玉米做姊妹交，混合收种子(M3代)，留种以保存携带突变的植株的种子。
三、植物突变体的基因型库的构建
1、DNA提取
分别取上述得到的每株阳性M1代突变体玉米叶片5.0g于液氮中研磨，转入50ml离心管中。加10ml预热至65℃的CTAB提取缓冲液(1.67％CTAB，1.17MNaCl，0.0016MEDTApH8.0，0.835MTris.HClpH7.5，1％β-疏基乙醇)，混匀。65℃水浴60-90分钟，不时小心摇动离心管。取出离心管，待冷至室温(25℃)，加入等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)，小心充分摇动试管，至有机相呈深绿色。25℃下8000rpm离心10分钟，用剪口的1ml枪头将上清转移到另一离心管中。加2/3体积预冷的异丙醇，小心混匀(-20℃或常温)，然后放在4℃沉淀，用剪口的1ml枪头吸出絮状DNA，用70％(体积百分含量)乙醇水溶液漂洗两遍。将DNA晾干，加入适量水(pH8.0)溶解DNA。加入10μl10mg/mlRNaseA小心混匀，37℃温育2小时。用等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)和氯仿∶异戊醇(24∶1)各抽提一次，25℃下8000rpm离心10分钟，吸取上清液，加1/10体积的3MNaAC(pH5.2)、2倍体积无水乙醇沉淀DNA。吸出絮状DNA，放入1.5ml离心管中，用70％乙醇洗涤一次，短暂离心，倒去乙醇，晾干DNA沉淀。加入适量TE(pH8.0)缓冲液，充分溶解DNA，分别得到阳性M1代玉米基因组DNA。
0.8％琼脂糖检测DNA质量。用nanodrop1000检测DNA浓度，结果为DNA浓度均大于100ng/μL；OD260/280在1.8和2.0之间；OD260/230大于2.0。存放于-70℃冰箱中备用。
2、测序
1)样品准备
A、基因组DNA片段化
用BioruptorTMUCD-200，在high档位30秒on，30秒off的条件下超声20分钟，打碎DNA。用QIAquickPCRExtractionKit回收DNA片段，用30μl水洗脱，即得到200-400bpDNA片段。
B、DNA末端修复
将30μl步骤A中得到的200-400bpDNA片段，在100μl体系中进行DNA末端修复。100μlDNA末端修复的反应体系为：30μl所述200-400bpDNA片段、4μl0.4mMdNTPMix、1μlKlenow酶、5μlT4DNA聚合酶、5μlT4PNK、10μl10×T4DNA连接酶缓冲液，10μl1mMATP，用ddH2O补足至100μl；DNA末端修复的反应温度为20℃，反应时间为30分钟。用QIAquickPCR纯化试剂盒纯化，用32μL水洗脱，即得到末端修复DNA。
C、3’末端加A
32μl末端修复DNA在50μl体系进行3’末端加A，50μl反应体系中还包含3μlKlenowExo-酶(购自NEB，产品目录号0212)、5μl10×Klenow酶缓冲液、10μl1mMATP；3’末端加A的反应温度为37℃，反应时间为30分钟；用QIAquickPCR纯化试剂盒纯化，用10μl水洗脱，即得到3’末端加A的DNA。
D、接头连接
10μL3’末端加A的DNA在50μL的反应体系中进行接头连接，50μL的反应体系中还包含1×DNA连接缓冲液，2μMIndexPEAdapterOligo(所述接头中的一条核苷酸序列为：5'-GATCGGAAGAGCACACGTCT-3’；另一条核苷酸序列为：5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’)，5μLDNA连接酶。于20℃条件下反应15分钟，用QIAquickPCR纯化试剂盒纯化，用30μL水洗脱。然后用2％琼脂糖胶在120伏特电压下电泳30分钟，分离酶切后300-500bp的片段，用QIAquickGelExtractionKit回收胶上DNA片段，用30μl水洗脱，即得到连接接头的DNA。
E、富集DNA片段
22μL连接接头的DNA在50μL的反应体系中进行PCR富集反应，50μL的反应体系中还包含25μLPhusionDNA聚合酶(购自NEB，产品目录号F531)，200nMPCR引物InPE2.0和InPE1.0，PCR引物Index<#>，用以下程序扩增：98℃，30秒；98℃，10秒，65℃，30秒，72℃，30秒，18个循环；最后72℃，5分钟。用QIAquickPCR纯化试剂盒纯化，用30μL水洗脱。用2％琼脂糖胶在120伏特电压下电泳30分钟，分离酶切后在300–500bp的片段，用QIAquickGelExtractionKit回收胶上DNA片段，用30μl水洗脱，得到测序前样品，即得到每株M1代植物突变体的富集基因的DNA文库。
InPE1.0的核苷酸序列如下：
5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’
InPE2.0的核苷酸序列如下：
5'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’
PCR引物Index<#>如下：
PCRPrimerIndex1的核苷酸序列如下：
5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTC-3’
PCRPrimerIndex2的核苷酸序列如下：
5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTC-3’
PCRPrimerIndex3的核苷酸序列如下：
5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTC-3’
PCRPrimerIndex4的核苷酸序列如下：
5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTC-3’
PCRPrimerIndex5的核苷酸序列如下：
5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTC-3’
PCRPrimerIndex6的核苷酸序列如下：
5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTC-3’
PCRPrimerIndex7的核苷酸序列如下：
5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTC-3’
PCRPrimerIndex8的核苷酸序列如下：
5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTC-3’
PCRPrimerIndex9的核苷酸序列如下：
5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTC-3’
PCRPrimerIndex10的核苷酸序列如下：
5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTC-3’
PCRPrimerIndex11的核苷酸序列如下：
5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTC-3’
PCRPrimerIndex12的核苷酸序列如下：
5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTC-3’
AgilentBioanalyzer检测建库质量，结果得到300-500bp大小的DNA片段，说明建库成功。
F、用玉米外显子探针捕获外显子DNA片段
a)准备样品库
根据文库浓度(30-40ng/μl)，添加1200ng的文库。
b)准备Oligos
在一新的1.5mlEP管中按照表1添加与文库检索引物(PCR引物Index<#>)对应的Index-Oligo和UniversalOligo。混匀。
表1Oligos混合体系
SeqCap HE Universal Oligo 1000pmol
SeqCap HE Index Oligo 1000pmol
注：SeqCapHEUniversalOligo和SeqCapHEIndexOligo购自Roche公司生产的SeqCapHEOligoKitA(货号06777287001)或SeqCapHEOligoKitB(货号06777317001)。
c)样品杂交
在上步的体系中，按照表2添加试剂(DeveloperReagent购自Roche公司生产的NimBleGenSeqCapEZDeveloperReagent，货号06684335001.)。混匀，开盖，石蜡膜封口，并用10μl的枪头在膜中央扎2个孔。60℃真空浓缩至无液体残留。
表2浓缩体系
混合的文库 1μg
Developer Reagent 10μl
在浓缩的管中按照表3添加试剂[Hybridizationcomponent为Roche公司生产的NimBleGenSeqCapEZHybridizationandWashKit(货号05634253001)中的HybridizationComponentA]。混匀，注意用枪吸打管壁，将管壁残留溶解。95℃热变性10min。
表3杂交体系
2×杂交缓冲液 7.5μl
Hybridization component 3μl
瞬时离心，将95℃热变性后的溶液立即加入4.5μlEZLibrary(EZLibrary是Roche公司生产的SeqCapEZDeveloperLibrary，货号06471757001)中，迅速吸打混匀。47℃孵育72h。采用PCR仪控温，Block47℃，Lid57℃。记录文库编号、杂交起止时间。
d)准备捕获试剂和磁珠洗涤试剂
从-20℃取出试剂，室温(或37℃)融化。按照表4配制捕获试剂。
表4捕获试剂配制体系
将400μl1×StringentBuffer、100μl1×WashBufferI和一个1.5ml低吸附的EP管放置在47℃的干式恒温器中。
e)准备捕获磁珠
使用前，将捕获磁珠提前在室温放置30min以平衡磁珠。
涡旋15s将磁珠混匀。
在1.5mlEP管(低吸附)中，分装捕获磁珠。每个捕获样品100μl捕获磁珠，一个管中最多放置6个捕获样品所需的磁珠。
放在磁力架上，待溶液澄清，去除上清液。加入2倍体积的1×BeadWashBuffer(7号)，从磁力架上取下，涡旋10s以混匀。放回磁力架上，待溶液澄清，去除上清液。重复洗涤一次。
洗涤两次后，用等体积的1×BeadWashBuffer重悬捕获磁珠。
将捕获磁珠分装到200μl的PCR管中，每管100μl。
放回磁力架，待溶液澄清，去除上清液。此时，捕获磁珠可以用于后续实验。一旦去除上清，要立即进行捕获。
f)捕获磁珠结合DNA
将杂交样品转移至准备好的捕获磁珠中，迅速吸打混匀。
混匀完毕，立即进行47℃孵育。PCR仪控温，Block47℃，Lid57℃，孵育45min。每15min涡旋一次，每次涡旋3s。
g)洗脱捕获磁珠
45min孵育结束，加入100μl47℃的1×WashBufferI(1号)。涡旋混匀，并全部转移至47℃放置的1.5ml低吸附EP管中。
将EP管放到磁力架上，待溶液澄清，去除上清液。迅速将管放回47℃。
加入200μl47℃加热的1×StringentBuffer(4号)，快速吸打混匀，防止温度过低。
47℃孵育5min，后将管放到磁力架上，待溶液澄清，去除上清液。
重复洗涤一次。
加入200μl室温的1×WashBufferI(1号)，涡旋混匀2min。
放到磁力架上，待溶液澄清，去除上清液。加入200μl室温的1×WashBufferII(2号)，涡旋混匀1min。
放到磁力架上，待溶液澄清，去除上清液。加入200μl室温的1×WashBufferIII(3号)，涡旋混匀30s。
放到磁力架上，待溶液澄清，去除上清液。加入50μl室温的PW重悬磁珠。
h)LM-PCR富集
按照表5中的体系配制PCR反应的预混液[Oligos1和2为Roche公司生产的NimBleGenSeqCapEZAccessoryKitV2试剂盒(货号06776345001)中的Post-LM-PCROligos1和2]。
表5LM-PCR反应体系
KAPA HiFi HotStart ReadyMix 50μl
Oligos 1和2 10μl
总体积 60μl
注：Oligos1的序列为：AATGATACGGCGACCACCGAGA
Oligos2的序列为：CAAGCAGAAGACGGCATACGAG。
混匀，在每个PCR管中分装30μl。
在每个PCR管中加入20μl洗脱的磁珠，吸打混匀。每个样品做2个PCR反应。
按照表6进行PCR扩增。
表6LM-PCR反应程序
1 98℃ 45s
2 98℃ 15s
3 60℃ 30s
4 72℃ 30s
5 go to step 2 14个循环
6 72℃ 1min
7 4℃ 保存
i)纯化
将SeqCapEZPureCaptureBeadKit中的DNAPurificationBeads提前室温平衡30min。
将每个样品的PCR扩增产物转移至1.5mlEP管中。
将DNAPurificationBeads涡旋10s混匀，取180μl加入到上述EP管中，混匀。
室温放置15min，再放到磁力架上。
当溶液澄清，去除上清液。
加入200μl80％的乙醇洗涤30s，去除上清液。重复一次。
瞬时离心，放回磁力架上，用10μl的枪头彻底去除乙醇。
开盖室温放置10min以晾干乙醇。
从磁力架上取下，加入52μlPW重悬磁珠。
室温放置2min，放回磁力架上。
待溶液澄清，取50μl加入到新的1.5mlEP管中。
j)浓度测定
取1μl捕获文库，用Nanodrop2000测定文库浓度。
3)测序
将样品送去测序(北京贝瑞和康生物技术有限公司完成测序)，测序过程具体如下：加完接头的DNA连接到平面上,然后进行Solexa特有的PCR方法—固相桥梁扩增：对每个DNA分子进行扩增，每个分子都形成1000个拷贝左右的克隆簇(clonalcluster)，每个克隆簇直径1-2微米。Illumina测序仪的核心技术是拥有可逆终止基团的化学荧光核苷酸。这一特征使得每个测序循环可在四种核苷酸同时存在的前提下进行(A、C、T、G)，而不是只在仅有一种核苷酸存在的情况下合成，这样大大提高了测序的精确性。同时还可以对单碱基重复顺序(如GGGGGGGGGG)进行高精度测序。每次化学反应延长一个碱基，利用激光对其荧光信号进行检测。检测完毕后，采用Illumina特有的化学反应去除终止基团，已便延伸下一个碱基，边合成碱基边测序。所有反应都在微流体通道上进行，每个微流体通道上含有1亿个克隆簇,每个玻片有八个微流体通道,这样一次即可对8亿个克隆簇进行分析。目前，Solexa技术可精确地对每个克隆簇左右两端各150个碱基对测序。Illumina技术的通量为每次开机(三天左右)即可测序300亿以上的碱基对。
分别得到每株阳性M1代玉米突变体的基因组DNA序列。
采用与步骤1和2同样的方法提取玉米B73的基因组DNA并测序，得到玉米B73的基因组DNA序列。
4)定位SNP
将每株阳性M1代玉米突变体的基因组DNA序列分别与玉米B73的基因组DNA序列通过BWA、MAQ等生物信息分析软件比对分析，找出每株阳性M1代玉米突变体的SNP位点，确定所述SNP位点所在基因的位置，将每株阳性M1代植物突变体及其SNP位点所在基因的位置构成植物突变体基因型库。
四、植物基因功能的分析
将每个M2突变体进行系统的表型鉴定(包括玉米全生育期的发育相关的表型以及在不同生物逆境和非生物逆境条件的表型)，将其对应的M1代突变体与其表型建立相关数据库，同时针对检测到的SNP建立数据库，分析具有同类表型的突变体中SNP的数据，比对SNP所在基因的位置，如果同一基因的不同突变的等位基因在不同的突变体中有同样的表型，可以对该基因进行进一步的功能鉴定，具体为：
先在所述植物突变体表型库中找出具有同类表型的M1代植物突变体；再在所述植物突变体基因型库中找出每株所述具有同类表型的M1代植物突变体的SNP位点所在基因的位置，如果SNP位点所在基因相同，则该SNP位点所在的基因为与所述表型相关的基因。
例如，在本实施例中，从EMS诱变的突变体库中筛选到了3个植株矮化、叶片变短变窄、表皮毛增多，雌穗变短的突变体，突变体编号分别为346、689、1024。通过基因型分析发现突变体346在基因GRMZM5G821639起始密码子ATG下游214bp的位置，导致了第72个氨基酸谷氨酰胺(CAG)变为终止密码子(TAG)，突变体689和1024分别在GRMZM5G821639基因CDs区域发现起始密码子下游609和1121位置产生G到A的点突变，导致色氨酸(TRP)密码子变为终止密码子，造成蛋白的提前终止。将3个突变体相互杂交，F1代植物表现出突变体的表型，即矮化、叶片变短变窄、表皮毛增加，雌穗变短，说明这3个突变体是等位突变。充分说明该突变体的表型是由于GRMZM5G821639基因突变导致的。
实施例2全基因组范围的玉米基因功能鉴定
参照实施例1中描述的方法，也可以在突变体库中直接寻找感兴趣的基因的突变体，研究其功能，先看数据库中是否有表型统计，是否这些突变体有共同的表型，再针对这种共性研究基因的功能。具体为：先在所述植物突变体基因型库中找到待测基因中所有SNP位点对应的M1代植物突变体；再在所述植物突变体表型库中找到中每个M1代植物突变体的所有表型，如果表型相同，则所述待测基因为与所述表型相关的基因。
例如，在本实施例中，基因GRMZM2G093603编码赤霉素合成相关基因，从突变体中找到了该基因的3个等位突变，突变体编号分别为254、287和1132，突变位点分别位于基因的3、5、14外显子位置，分别导致色氨酸变成提前终止密码子，谷氨酰胺变成终止密码子，丙氨酸突变为苏氨酸。3个突变体均表现为矮化、叶片宽大、叶色深绿、晚花，由于254和287导致蛋白完全失活所以极度矮化，并不能结种子，而1132只是氨基酸的改变所以表现出半矮化，且能正常结实。254和287的杂合突变体杂交，后代有1/4的植株表现为突变体表型，说明该基因导致该突变体表型。
基于本发明提供的方法，如果在某一发育过程或代谢途径发现有多个基因参与，可以直接入手研究这些基因的在这一发育过程或代谢过程中的相互作用模式。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.全基因组范围的植物基因功能鉴定的方法，其特征在于，包括如下步骤：
A、将出发植物进行单核苷酸突变，构建植物突变体库；
B、检测步骤A所述植物突变体库中突变体的表型，构建植物突变体表型数据库；
C、检测步骤B所述植物突变体库中突变体的基因型，构建植物突变体基因型数据库；
D、结合步骤B所述植物突变体表型数据库和步骤C所述植物突变体基因型数据库，确定所述出发植物中由所述单核苷酸突变导致的SNP位点所在基因的功能。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
步骤A具体如下：
(1)收集出发植物的花粉，进行化学诱变处理，得到诱变后植物花粉；
(2)将步骤(1)得到的诱变后植物花粉涂抹在所述出发植物的花丝上，得到授粉后植物；
(3)步骤(2)得到的授粉后植物经生长、结实，收获种子，得到M1代种子，种植M1代种子，得到M1代植物突变体，即构建得到植物突变体库；
步骤B具体如下：
(4)将步骤(3)得到的M1代植物突变体自交，得到M2代植株；
(5)检测步骤(4)得到的M2代植株不同发育时期的表型，构建植物突变体表型数据库；
步骤C具体如下：
(6)分别提取步骤(3)得到的每株M1代植物突变体的基因组DNA；
(7)将步骤(6)得到的每株M1代植物突变体的基因组DNA片段化，构建二代测序文库，用玉米外显子探针富集外显子区域，测序，获得每株M1代植物突变体的外显子DNA序列；
(8)分别将步骤(7)得到的每株M1代植物突变体的外显子DNA序列与出发植物的基因组DNA序列比对，找出每株M1代植物突变体中的SNP位点，确定所述SNP位点所在基因的位置，将每株M1代植物突变体及其SNP位点所在基因的位置构成植物突变体基因型数据库；
步骤D具体包括如下方案Ⅰ或Ⅱ：
方案Ⅰ包括如下步骤：
(10)在步骤B中的所述植物突变体表型数据库中找出具有同类表型的M2代植物对应的M1代植物突变体；
(11)在步骤C中的所述植物突变体基因型数据库中找出每株步骤(10)所述具有同类表型的M1代植物突变体的SNP位点所在的基因，分析所述植物突变体基因型数据库和所述植物突变体表型数据库之间的连锁关系，如果所述SNP位点所在基因相同，则所述SNP位点所在的基因是与所述表型相关的基因；
方案Ⅱ包括如下步骤：
(12)在步骤C中的所述植物突变体基因型数据库中找到目标基因中所有能导致基因编码蛋白改变的SNP位点对应的M1代植物突变体；
(13)在步骤B中的所述植物突变体表型数据库中找到步骤(12)中每个M1代植物突变体对应的M2代植物的所有表型，如果表型相同，则所述待测基因为是与所述表型相关的基因。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤A中将花粉与甲基磺酸乙酯溶液按g:ml＝1:50-150的比例混合40-50min，得到诱变后植物花粉；优选地，花粉与甲基磺酸乙酯溶液按g:ml＝1:100的比例混合45min。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述甲基磺酸乙酯溶液的浓度为0.08-0.12v/v％，优选0.07v/v％。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤C中在测序前包括对基因组DNA进行超声破碎，回收200-400bpDNA片段的步骤。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤C中在超声破碎后测序前还包括如下步骤：
a)将所述200-400bpDNA片段进行DNA末端修复，得到末端修复DNA；其中，100μlDNA末端修复的反应体系为：30μl所述200-400bpDNA片段、4μl0.4mMdNTPMix、1μlKlenow酶、5μlT4DNA聚合酶、5μlT4PNK、10μl10×T4DNA连接酶缓冲液，10μl1mMATP，用ddH2O补足至100μl；DNA末端修复的反应温度为20℃，反应时间为30分钟；
b)将步骤a)得到的末端修复DNA3’末端加A，得到3’末端加A的DNA；其中，50μl3’末端加A的反应体系为：32μl末端修复DNA、3μlKlenowExo-酶、5μl10×Klenow酶缓冲液、10μl1mMATP；3’末端加A的反应温度为37℃，反应时间为30分钟；
c)将步骤b)得到的3’末端加A的DNA连接接头，回收300-500bp的片段，即为接头DNA；
其中，接头序列如下：
5'-GATCGGAAGAGCACACGTCT-3’
5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’；
d)将步骤c)得到的接头DNA进行PCR扩增，回收300-500bp的目的片段，得到全基因组测序文库；
e)将步骤d)得到的全基因组测序文库用玉米外显子探针捕获，得到外显子组测序文库；
其中，PCR扩增使用的模板为所述接头DNA，使用的引物序列分别如SEQIDNO:3-16所示。
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，所述出发植物包括单子叶植物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述单子叶植物包括玉米。
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