CN114457185A - 与苦瓜果皮形态关联的分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了与苦瓜果皮形态关联的分子标记及应用。其中，果皮形态包括连续脊和无连续脊两种类型；该分子标记位于苦瓜第4号染色体21927644bp位置处，其多态性表现为碱基A是否缺失，所述分子标记所在的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述分子标记于如SEQ ID NO.1所示中的167bp处。本申请可以在苗期或种子时期对苦瓜果实果皮形态进行预测，可以鉴定出目标性状遗传位点的纯合或杂合状况，从而可对后代果皮形态表型(连续脊或非连续脊)进行较准确的预测。

Description

与苦瓜果皮形态关联的分子标记及其应用

技术领域

本申请涉及苦瓜果皮形态预测技术领域，尤其涉及与苦瓜果皮形态关联的分子标记及其应用。

背景技术

苦瓜果实的表面结构影响其储运性能，也决定其外观，其若具有光滑的果皮表面不仅不易碰伤，使其耐于存储，还有利于清洁以及减少农药残留。因此，开展针对性的苦瓜果实外观性状育种十分重要。苦瓜果皮形态相关基因的定位及开发的分子标记可以为育种者提供快速、准确的筛选方法，减少与育种筛选有关的土地、人力及经济成本，促进苦瓜育种进程。

目前对苦瓜育种材料的苦瓜果实性状的评价是肉眼观察法，需要在合适的生长季节栽培，并等到植株长到结果期、苦瓜果实膨大之后才能进行观察。为了筛选得到具有目标性状的个体，需要种下大量的群体，占用较大面积的土地，种植成本和管理成本较高。另外该方法只是对材料当代表型的鉴定，无法鉴定出目标性状位点杂合的材料，从而无法预测无连续脊(显性性状)材料后代该性状的分离情况，需要继续种植下一代才能得到稳定的表型。现有技术的缺点：受栽培季节限制；需要占用较大的种植土地，筛选成本高。

发明内容

有鉴于此，本申请的目的在于能够早期对苦瓜果皮形态进行预测，以便在苦瓜种子时期或苗期即可筛选得到具有连续脊或非连续脊果皮的苦瓜，以实现早期筛选的目的，实现快速筛选，节省筛选成本。

第一方面，本申请实施例公开了一种与苦瓜果皮形态关联的分子标记，其中，所述果皮形态包括连续脊和无连续脊两种类型；所述分子标记位于苦瓜第4号染色体21927644bp位置处，其多态性表现为碱基A是否缺失，所述分子标记于如SEQ ID NO.1所示中的167bp处。

第二方面，本申请实施例公开了用于特异性检测第一方面所述分子标记的引物对，包括如SEQ ID NO.2～3所示的核苷酸序列。

第三方面，本申请实施例公开了用于检测或预测苦瓜果皮形态的试剂盒，包括第二方面所述引物对的试剂盒。

第四方面，本申请实施例公开了一种预测苦瓜果皮形态的方法，所述果皮形态包括连续脊和无连续脊两种类型，所述方法包括：

提取苦瓜种子或苗期材料的基因组DNA；

PCR扩增所述基因组DNA，获得扩增产物；

电泳检测所述DNA片段，收集其中目标序列的片段，所述目标序列的长度为2350bp左右；以及

测序获得所述目标序列的核苷酸序列，并与参考序列比对，根据比对结果预测苦瓜果皮形态；

其中，所述参考序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述PCR扩增所用的引物对包括如SEQ ID NO.2～3所示的核苷酸序列；所述比对结果包括所述目标序列与所述参考序列由5’端起始的第167个碱基的信息差别。

在本申请实施例中，所述目标序列的基因型包括正常型和缺失型，所述正常型对应的苦瓜果皮表型为无连续脊类型，所述缺失型对应的苦瓜果皮表型为具有连续脊的类型。

在本申请实施例中，所述正常型的核苷酸序列与所述参考序列相同；所述缺失型相对于所述参考序列自5'端起始的第167位点的碱基A缺失。

在本申请实施例中，PCR的反应体系为：总体积为20μL，10μL PCR mix，0.5μL上游引物，0.5μL下游引物，8μL ddH₂O，1μLDNA；PCR反应程序设置如下：95℃预变性4min；94℃反应25s，54℃反应25s，72℃反应2分钟，共循环36次；72℃延伸5min；最后4℃保存10min。

第五方面，本申请实施例公开了第一方面所述的分子标记、或第二方面所述的引物对或第三方面所述的试剂盒在苦瓜果皮形态鉴定中的应用。

第六方面，本申请实施例公开了第一方面所述的分子标记、或第二方面所述的引物对或第三方面所述的试剂盒在苦瓜分子标记辅助育种中的应用。

第七方面，本申请实施例公开了第一方面所述的分子标记、或第二方面所述的引物对或第三方面所述的试剂盒在苦瓜种质资源改良中的应用。

与现有技术相比，本申请至少具有以下有益效果：

利用本申请公开的分子标记可在苗期或种子时期对苦瓜果实果皮形态(连续脊或非连续脊)进行预测，可以鉴定出目标性状遗传位点的纯合或杂合状况，从而可对后代表型进行较准确的预测，使得其在苦瓜果皮形态鉴定、育种以及种质资源改良中具有重要的应用前景。

附图说明

图1为本申请实施例提供的F₂遗传群体的构建示意图。

图2为本申请实施例提供的苦瓜果皮连续脊性状的基因标记定位结果。

图3为本申请实施例提供的定位亲本材‘Y-132-3-1’和‘Z-1-4’在苦瓜染色体MC04的21927644bp位置处存在单碱基A插入/缺失突变展示图。

图4为本申请实施例提供的18自交系和13份市售苦瓜的果实表皮脊形态图。

图5为本申请实施例提供的从苦瓜种子中提取的DNA样品扩增电泳结果图，M泳道为Marker，其他泳道均为样品。

图6为本申请实施例的18自交系具有不同表皮脊形态的苦瓜材料和11份具有不同表皮脊形态的市售苦瓜材料的PCR扩增产物与参考序列的比对结果图，其中Ref代表参考序列，其他均为样品序列。

图7为本申请实施例的2份苦瓜(A8和A13)在目标位点呈双峰的测序峰图。

具体实施方式

为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。

分子标记的定位

1、构建F₂遗传分离群体

如图1所示，以苦瓜自交系‘Y-132-3-1’和‘Z-1-4’(参见“杨静，苦瓜耐低温机制研究[D]华中农业大学博士论文，2008年”)为亲本杂交获得F₁代，利用F₁植株自交构建F₂遗传分离群体，其中‘Y-132-3-1’的果皮为连续脊，‘Z-1-4’的果皮为非连续脊，对F₁和F₂世代的果实的果皮脊进行观察，发现F₁的果皮为非连续脊，F₂群体中果皮脊性状表现为非连续脊的株数目与连续脊的数目的比例符合3:1分离比例，说明苦瓜果皮连续脊性状为单个隐性基因控制。

2、初步定位

利用F₂群体，采用BSA法构建连续脊和非连续脊两个混池，利用DNA重测序技术对2个混池和亲本进行DNAseq。以‘Dali-11’苦瓜基因组(CNGB：CNP0000016)为参考基因组，对测序数据进行分析，通过对混池间的SNP频率分析，发现在控制苦瓜果皮连续脊性状的基因可能位于MC04染色体上(如图2a)。进一步设计分子标记对F₂群体进行扫描，对该位点进行了精细定位，最终将该位点定位在MC04:21.88-21.99Mb之间(如图2b)。

3、精确定位

如图3所示，对两个亲本材料在定位区间内的差异位点进行分析，发现位于苦瓜第4号染色体MC04的21927644bp位置处存在单碱基A插入/缺失突变。对该F₂群体的基因型检测后发现该位点基因型与连续脊位点共分离。该位点A碱基缺失的材料，果实果皮具有连续脊；而该位点没有A缺失或者杂合型的材料，果实果皮为非连续脊。

分子标记的验证及应用

1、种植材料

将18份具有不同果实表皮脊形态的苦瓜自交系材料的种子进行催芽，之后播于50孔穴盘，正常进行苗期管理，待第一对真叶长出后，取1/2叶片用于DNA提取。另外购买13份具有不同果实表皮脊形态的市售新鲜苦瓜，切取果皮用于DNA提取。一共31份苦瓜样本。

31份苦瓜样本如图4所示，种植材料从外观即知，18份自交系包含11份(KG4、KG5、KG6、W5B_3、W6B_4L、W7B、KG3_1_5L、HZS1、HZS2、YNS1、Apple2)非连续脊(NCR)和7份(2020_1、2020_2、K122、KG3_3_3、W1_2、W6B_2、KG3_1_5S)连续脊(CR)，13份市售商品种包含10份(A2、A4、C1、C11、L1_2、L2、L9、YNS2、A8、A13)非连续脊和3份(A12、C6、C7)连续脊。

2、DNA提取及PCR扩增

采用DNA提取试剂盒(DNAzol Reagent Family for Genomic DNA Isolation，Thermo Fisher Scientific)提取各样品的DNA，稀释到50ng/μL用于后续PCR。

PCR体系总体积为20μL：包括10μL PCR mix，0.5μL上游引物，0.5μL下游引物，8μLddH₂O，1μLDNA。PCR程序设置如下：95℃预变性4min；94℃反应25s，54℃反应25s，72℃反应2分钟，共循环36次；72℃延伸5min；4℃放置10min。用于扩增的上下游引物的序列依次如如SEQ ID NO.2～3所示。

扩增产物的电泳检测结果如图5所示，1～12#泳道的条带大小符合预期目标大小的样品进行测序，长度约为2350bp左右。

3、PCR产物测序以及目标位点分析

将扩增产物长度符合预期的PCR产物送至武汉天一辉远生物公司进行测序，获得测序结果。

以本文件提供的Ref序列(如SEQ ID NO.1所示)为参考序列进行分析，目标位点在Ref序列的第167位点。测序结果采用序列分析软件Geneious进行分析。

为方便查看，各材料根据其果皮具有连续脊与否在编号之前加前缀CR(有连续脊)或NCR(无连续脊)。通过对31份材料的测序结果进行分析，发现29份材料在目标位点为纯合状态(见图6)，其中19份材料的序列与Ref相同，这19份材料的果皮均为无连续脊(编号前缀加NCR)，10份材料的序列与Ref相比缺失一个A，这10份材料的果皮均为连续脊(编号前缀加CR)。另外有2份材料(A8和A13)在目标位点的测序峰图呈双峰，暗示在目标位点为杂合状态(图7)，这2份材料的果皮为无连续脊(编号前缀加NCR)。

综合以上分析发现测试的31份苦瓜材料果皮的连续脊表型与该位点基因型一致，说明该位点可以用来预测苦瓜果皮脊性状表型。由此，利用本申请提供的分子标记可在苗期或种子时期对苦瓜果实果皮形态(连续脊或非连续脊)进行预测，可以鉴定出目标性状遗传位点的纯合或杂合状况，从而可对后代表型进行较准确的预测，使得其在苦瓜果皮形态鉴定、育种以及种质资源改良中具有重要的应用前景。

以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 与苦瓜果皮形态关联的分子标记及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2250

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

tgcaacagat gtacctcttc ctacattaaa aactaactct atataaaatg ctggcaacat 60

actaaatcat ctgtcaccaa catttccaac aaaccttgca gtctgttttc tccttttgct 120

ctaccacttc attcttccag gcttctgcat tatcaaaaaa caatgaagaa atgttctctg 180

gtagctcacc tgtcttttat ttttgtggtt ttcttcatca ttctaatgat tggcagaagt 240

cttgatgcaa catctcgctg ggaacacagt aagaaaactc atcatctatg cggtttacat 300

tgtctactta ttttgatatt ctagttgcgg aagatatgca tctgtatccc tataacggat 360

acaccgacat ttttctctga tttaatcagt tatgacatct aagcctttca agtgtgtgat 420

atttcagtga gctttaatgc agaagatatt cacagaacag tggacagttc aatgcaccag 480

aaggtattat gttactttca gcccacattt atccacccag tgttaaacct tttgcgaata 540

aataaataaa ggtcacctaa ctgagacaat aatatgaaaa atataaataa tagatgctcg 600

cttgagagta cagtaaacaa gaaaaaccat ggcaacatac tgcaaaaaag tcctcattca 660

gtttcgttat catgtgtgac tgtgcaggaa agggctaaag aagtacttgg tatggagtta 720

taccctacag gatccagcct cccagactgc tcccatgcat gcggtccatg ttttccatgc 780

aaaagggtga tggtgagctt caagtgctct gttgcagagt cctgtccaac tgtttacaga 840

tgcatgtgta aagggaaata ttaccatgta ccctccaatt gagcaaaaat tcaatctgga 900

ggaatttgca gcaaagaaca gagaaattaa tgattgggtt ggcacttagc acttatatga 960

tgactaagga tataacatag actaagacta tagtctctat tggtttcatt agggtttatt 1020

ttcttctacc ggaatcattt tgtaagagaa aatagctgag ggaacaaatt ttcaagcacg 1080

ggaagtttaa ttaggtagtg ataactcagt ttggtctact ctaggagtgt gcaaaattgt 1140

ttccctagtt atataactct actttaaaga catgtcgtga catttggctt gtcctgtttc 1200

tgccttccca ggtttctaag ttgagaatat acagttgaat ggaggtttgg aaaacaagcc 1260

agaatcagag gataaccttg taaagtttag tgtgtcagag ggacatacat ccatgttttc 1320

aaattcaacc aaaatacata ttcattcagc ccgagctcaa ggaactatgt tctgctcttt 1380

aggttgaagg aagcaatacg gaaaaattca taaaagatat gatcaaaacc aatgaaccag 1440

gatcactgtt tttgtgaatg accatctgta gaagaggatt tccaaacaaa acaatcaatg 1500

aggtaaatat aacaatagta gagtatccta tcattacaag agcaaacaac aatggctggt 1560

ttgcagaaat taatgaaaat gtaaactaag ggaaattgta gaagagaaaa aaaaggcata 1620

aaaatagtga gttttctata gcaaataaca cttgtaattc aaacattcaa acagaaatta 1680

aacagctgca cggacccaaa ctgctaaaca atatgaattt gaaaaccacc caaaactcgt 1740

tctataacag atggattcta gacctcaagc tcactcttag gcatgaaaaa aacaaacttt 1800

cttgagtccc cgacaaagac atcagcatac ttctgccttt atcaatgctc attcaaatat 1860

cacactcaca ccgaacaggt tcgtaaattc ttcataacct caaacctgga atccagtacc 1920

ctatcaaaat ttcatccgtt gttagtttct gatggtttcg tcatcgcaga ctataaattg 1980

caccctaatc tatgatattc ttctttctcg atgagtgttc agaagtagga acttggataa 2040

cttaatgcaa tcagaaccct aagactatct catccacgtt cgtgaatacc ataaggaaca 2100

ggggaaaata ctccgcagga atcatatgta ccattatagc agatttcgtg ttgatatcga 2160

aattcaatag gaaatccaca gactaaccga accagaatga gaacagacaa attgatggat 2220

ggaaatattc tgtgagaaat ttccatgtaa 2250

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

gacatgtttc ggggtgtct 19

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

cttgccaaat catgtgatcc t 21

Claims (10)

1.一种与苦瓜果皮形态关联的分子标记，其中，所述果皮形态包括连续脊和无连续脊两种类型；所述分子标记位于苦瓜第4号染色体21927644bp位置处，其多态性表现为碱基A是否缺失，所述分子标记于如SEQ ID NO.1所示中的167bp处。

2.用于特异性检测如权利要求1所述分子标记的引物对，包括如SEQ ID NO.2～3所示的核苷酸序列。

3.用于检测或预测苦瓜果皮形态的试剂盒，包括如权利要求2所述引物对，以及用所述引物对进行PCR扩增的相关试剂。

4.一种预测苦瓜果皮形态的方法，所述果皮形态包括连续脊和无连续脊两种类型，所述方法包括：

提取苦瓜种子或苗期材料的基因组DNA；

PCR扩增所述基因组DNA，获得扩增产物；

电泳检测所述扩增产物，收集其中目标序列的片段，所述目标序列的长度为2350bp左右；以及

测序获得所述目标序列的核苷酸序列，并与参考序列比对，根据比对结果预测苦瓜果皮形态；

其中，所述参考序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述PCR扩增所用的引物对包括如SEQ ID NO.2～3所示的核苷酸序列；所述比对结果包括所述目标序列与所述参考序列由5’端起始的第167个碱基的信息差别。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述目标序列的基因型包括正常型和缺失型，所述正常型对应的苦瓜果皮表型为无连续脊类型，所述缺失型对应的苦瓜果皮表型为具有连续脊的类型。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述正常型的核苷酸序列与所述参考序列相同；所述缺失型相对于所述参考序列自5’端起始的第167位点的碱基A缺失。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，PCR的反应体系为：总体积为20μL，10μLPCR mix，0.5μL上游引物，0.5μL下游引物，8μLddH₂O，1μLDNA；

PCR反应程序设置如下：95℃预变性4min；94℃反应25s，54℃反应25s，72℃反应2分钟，共循环36次；72℃延伸5min；最后4℃保存10min。

8.权利要求1所述的分子标记、或权利要求2所述的引物对或权利要求3所述的试剂盒在苦瓜果皮形态鉴定中的应用。

9.权利要求1所述的分子标记、或权利要求2所述的引物对或权利要求3所述的试剂盒在苦瓜分子标记辅助育种中的应用。

10.权利要求1所述的分子标记、或权利要求2所述的引物对或权利要求3所述的试剂盒在苦瓜种质资源改良中的应用。

Images