CN110938706A

CN110938706A - 与西瓜植株无卷须基因Clnt紧密连锁的分子标记及应用

Info

Publication number: CN110938706A
Application number: CN201911422616.7A
Authority: CN
Inventors: 杨路明; 豆峻岭; 朱华玉; 杨森; 马长生; 杨会会
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Henan Agricultural University
Priority date: 2019-12-31
Filing date: 2019-12-31
Publication date: 2020-03-31
Anticipated expiration: 2039-12-31
Also published as: CN110938706B

Abstract

本发明公开了一种与西瓜植株无卷须基因Clnt紧密连锁的分子标记及应用，利用重测序比对和分子标记开发技术，首次对西瓜植株无卷须性状进行了精细定位，获得了两个与无卷须性状紧密连锁的扩增稳定和差异明显的SSR分子标记ClSSR11289和ClSSR11306。一方面，可为最终实现无卷须基因Clnt的克隆，进而为西瓜卷须形成的分子机制研究奠定技术基础；另一方面，由于这两对标记与西瓜无卷须基因Clnt紧密连锁，因此可直接用于西瓜无卷须性状的分子标记辅助育种，在西瓜无卷须新品种培育中具有较好的应用价值。这种方法快速，简单，准确，可以有效的提高育种效率，加速育种工作进程。

Description

与西瓜植株无卷须基因Clnt紧密连锁的分子标记及应用

技术领域

本发明属于分子标记技术领域，具体涉及与西瓜植株无卷须基因Clnt紧密连锁的分子标记及应用。

背景技术

育种过程中最重要的环节之一就是对目标性状进行选择，选择目标性状的过程其实就是选择基因型的过程。然而在常规育种过程中，一般很难获知后代的基因型，育种家通常都是根据肉眼观察到的表型来进行选择。这种选择的缺点就是耗时较长且可能与基因型有偏差，造成选择的不准确性和效率低下。随着分子生物学的飞速发展，利用分子标记辅助选择结合常规杂交育种来进行新品种选育的技术已经越来越成熟，利用分子标记辅助选择具有准确、快速、不受环境干扰的优点，可以快速检测到与目标性状基因紧密连锁的位点，进而选择出目标性状，缩短育种进程。

目前分子标记辅助选择已经在作物株型育种中有了一些应用，并且已经培育出了一些株型良好的水稻、小麦等品种。合理株型是作物高产的基础，作为一种重要的株型性状，卷须是作物在进化过程中为了适应环境而形成的特异组织器官。植物的卷须可以从不同器官衍生而来：目前已经了解到，葡萄卷须的同源器官为变态花序(白惠磊，2010)；豌豆卷须的同源器官为变态叶(Hofer et al.，2009)。葫芦科作物中，南瓜卷须的内部结构与茎的结构很相似，说明卷须是茎上的侧枝或叶的变态组织(吴清韩等，2011)；黄瓜中的研究表明，卷须的同源器官是植株的侧枝，且黄瓜卷须由隐性单基因控制，目前已经获得了控制黄瓜无卷须的候选基因，并开发出了特异性的分子标记(Wang et al.，2015)。

西瓜作为一种重要的葫芦科作物，越来越受到研究者和育种家的重视。随着2012年西瓜全基因组测序的完成，近年来关于西瓜的相关研究发展迅速，许多优异的性状已经进行了基因定位，开发出的一些连锁标记也已经开始用到分子标记辅助育种过程当中。然而关于西瓜植株卷须的研究还未见报道，卷须是西瓜用于攀援生长的变态器官，除了攀援作用，卷须对西瓜的生长发育几乎没有用途，同时卷须还是消耗养分的器官。因此，如果利用分子标记找到控制西瓜无卷须的基因，不仅可以为西瓜分子标记辅助选择培育无卷须的西瓜新品种提供有效的帮助，同时大大缩短育种进程并提高选择的准确性。更加有利于无卷须西瓜分子标记辅助育种体系的建立，为无卷须西瓜的分子学育种打下基础。

发明内容

本发明的目的之一在于提供两对与西瓜植株无卷须基因Clnt紧密连锁的分子标记及引物对。

本发明的目的之二在于提供上述与西瓜植株无卷须基因Clnt紧密连锁的分子标记的应用。

本发明还提供了包含上述分子标记引物的载体、重组细胞。

为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：

本发明公开了两对与西瓜植株无卷须基因Clnt紧密连锁的分子标记，所述分子标记为C1SSR11289或/和C1SSR11306，优选地，所述分子标记为C1SSR11289或C1SSR11306。更加优选地，所述分子标记为C1SSR11289和C1SSR11306。

扩增与西瓜植株无卷须基因Clnt紧密连锁的分子标记引物对，所述分子标记C1SSR11289对应的引物对序列为：

C1SSR11289-F：CCAGTTTAGATGTGCGTAAAAGG

C1SSR11289-R：CAAGGAGGTGTTTGGTTGGT；

所述分子标记C1SSR11306对应的引物对序列为：

C1SSR11306-F：TGAAAGATGCAGTAATCCTGAGA

C1SSR11306-R：ATTATTTTTGGTGGTGGGGG。

本发明还保护含有上述分子标记的载体。所述重组载体可以是插入有本发明的分子标记的表达载体或者克隆载体。获得上述重组载体后，本领域技术人员可以根据不同的需要，将重组载体转化到合适的细胞中，得到含有该重组载体的重组细胞。因此，本发明还公开了一种含有所述重组载体的重组细胞。

本发明还公开了上述分子标记在鉴定西瓜植株无卷须性状中的应用，根据所述的分子标记的核苷酸序列设计引物，当所述引物为分子标记引物对C1SSR11289-F/C1SSR11289-R时，以被检测西瓜基因组DNA为模板进行扩增，如果能扩增出如SEQ ID NO.1所示的276bp DNA片段，即可判断为该西瓜为无卷须西瓜材料“无杈早”。

当所述引物为分子标记引物对C1SSR11306-F/C1SSR11306-R时，以被检测西瓜基因组DNA为模板进行扩增，如果能扩增出如SEQ ID NO.2所示的259bp DNA片段，即可判断为该西瓜为无卷须西瓜材料“无杈早”。当同时选用上述两对引物时，以被检测西瓜基因组DNA为模板进行扩增，如果能扩增出如SEQ ID NO.1所示的276bp DNA片段也能扩增出如SEQ IDNO.2所示的259bp DNA片段，即可判断为该西瓜为无卷须西瓜材料“无杈早”。

本发明还公开了上述分子标记引物对在无卷须西瓜辅助育种中的应用。也就是说本发明的分子标记可用于今后的分子标记辅助育种中，本领域技术人员可以理解，比如通过检测是否存在本发明的分子标记来筛选无卷须西瓜品种。所述检测可以是PCR检测的方法，具体地，可以使用上述的本发明的分子标记的引物对，所述检测还可以通过测序方法进行。

另外，上述分子标记还可以对西瓜无卷须基因Clnt进行定位。上述这些应用均可以按照常规的方法进行。

本发明具有如下优点：

本发明以西瓜无卷须材料“无杈早”(国家西瓜甜瓜中期库编号：ZXG00144)和西瓜有卷须材料WT2作为种质材料基础，利用重测序比对和分子标记开发技术，首次对西瓜植株无卷须性状进行了精细定位，获得了两个与无卷须性状紧密连锁的扩增稳定和差异明显的分子标记C1SSR11289和C1SSR11306。利用这一结果，可为最终实现无卷须基因Clnt的克隆，进而为西瓜卷须形成的分子机制研究奠定技术基础。另一方面，由于这两对标记与西瓜无卷须基因Clnt紧密连锁，因此可直接用于西瓜无卷须材料的分子标记辅助育种，在西瓜无卷须新品种培育中具有较好的应用价值。并且这种方法快速，简单，准确，可以在一定程度上提高育种效率，加速育种工作的进程。

本发明的分子标记具有检测方便、扩增产物稳定、特异性高的特点，可以简便、快速、高通量地应用于西瓜育种实践及品种鉴定。

附图说明

图1为西瓜植株无卷须基因精细定位图，Clnt代表无卷须基因，与C1SSR11289相距0.1cM，与C1SSR11306相距0.7cM。

图2为C1SSR11289标记的PCR扩增结果标记图，其中M为Marker；1为有卷须亲本扩增出来的电泳条带；2为无卷须亲本扩增出来的电泳条带；F₂为在F₂群体中随机挑选的单株扩增出来的电泳条带；带型和1一样表现为显性纯合位点的单株以及同时有1、2两个条带表现为共显性位点的单株，表型为有卷须，带型和2一样表现为隐性纯合位点的单株其表型为无卷须。

图3为C1SSR11306标记的PCR扩增结果标记图，其中M为Marker；1为有卷须亲本扩增出来的电泳条带；2为无卷须亲本扩增出来的电泳条带；F₂为在F₂群体中随机挑选的单株扩增出来的电泳条带；带型和1一样表现为显性纯合位点的单株以及同时有1、2两个条带表现为共显性位点的单株，表型为有卷须，带型和2一样表现为隐性纯合位点的单株其表型为无卷须。

具体实施方式

下面将通过具体实施例对本发明进行详细的描述。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。

本发明所选用的材料和试剂如无特殊说明，均能从市场上购买得到。

材料说明

父本：西瓜植株无卷须材料“无杈早”(国家西瓜甜瓜中期库编号：ZXG00144)，该材料由中国农科院郑州果树研究所提供，在植株生长过程中不产生卷须；

母本：正常普通有卷须西瓜材料WT2：该材料在植株生长过程中有卷须。

1遗传分离群体的构建

本发明以西瓜植株无卷须材料ZXG00144为父本，该材料在植株生长过程中不产生卷须；以普通有卷须西瓜材料WT2为母本，杂交获得F₁，F₁自交后获得F₂代种子，从F₂代中随机选出518粒种子播种，鉴定每个F₂单株的表型，最终鉴定出有卷须植株387株，无卷须植株131株，卡方测验发现符合3∶1的分离比例，说明西瓜无卷须为单基因隐性性状，将该基因命名为Clnt。

2父母本以及F₁代、F₂代个体基因组DNA的提取

分别采集父母本及F₁代和F₂代每个植株顶端的幼嫩叶片，之后采用CTAB法提取DNA样品，去除RNA，DNA样品体积不低于50μL。用紫外分光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值，计算DNA含量以及OD260/280的比值。DNA样品纯度OD260/280值应在1.8-2.0，浓度稀释至100ng/μL。

3基因的初步定位

(1)混池测序法(BSA)确定基因的候选区间

从F₂代分离群体中挑选出有卷须西瓜和无卷须西瓜各30株，之后将30株有卷须西瓜DNA混合在一起，30株无卷须西瓜DNA混合在一起。利用Illumina HiSeq 2000测序仪对其进行测序，得到25G数据，与西瓜参考基因组97103(http://cucurbitgenomics.org)进行比对，鉴定两个混池间的SNP差异位点，然后利用这些SNPs进行生物信息学分析计算SNP-index值，确定西瓜植株无卷须的候选区域。

(2)多态性筛选分析

之后根据本实验室在西瓜全基因组中开发出的960对SSR标记引物，从BSA-seq鉴定的候选区段所在物理位置选择SSR引物对两个混池DNA进行多态性筛选，筛选出具有多态性的SSR标记，进一步用这些具有多态性标记的引物对518株F2群体进行PCR扩增，根据扩增出的带型进行基因型分析。PCR扩增时，10μL扩增体系设计如表1所示。

表1 PCR反应体系

PCR扩增程序为：94℃、5min；94℃、30s，55℃、30s，72℃、30s，35个循环；72℃5min。

对PCR扩增产物进行8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。电泳检测时，聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲液为0.6×TBE，200V恒压电泳1h-1.5h。

电泳结束后进行银染。银染方法为：

A、将带胶的玻璃板放入固定液中，在摇床上轻轻摇动直至指示剂退去颜色，其中固定液的组成为，冰醋酸：无水乙醇：蒸馏水的体积比为0.5∶10∶100；

B、用超纯水洗1-3min；

C、将冲洗后的胶板放入染色液中摇动10min，染色液为0.2％硝酸银水溶液；

D、将染色后的胶板放入超纯水中漂洗30s，放入装有显影液的塑料盒中，轻轻摇动直至条带清晰呈现，显影液是在1L蒸馏水中加入15gNaOH和3ml甲醛混匀得到的；

E、最后放入自来水反复漂洗几次；

F、室温下干燥，然后拍照。

G、读胶：获得与有卷须亲本相同带型的记作1，获得与无卷须亲本相同带型的记作2，获得杂合带型的记作3。

(3)基因的初步定位

根据SSR标记的分型结果，结合群体的表型数据，利用JoinMap4.0软件对西瓜植株无卷须性状进行初步定位作图，最终获得了西瓜植株无卷须的初定位区间，该区间和BSA混池测序的候选区间相互吻合，进一步证明了该初定位区间的正确性。

4遗传图谱的构建及基因的精细定位

(1)亲本重测序和基因组比对

利用Illumina Hi-seq2000高通量测序平台对两亲本材料进行重测序，控制测序深度＞20倍；

根据已公布的西瓜全基因组序列(http://cucurbitgenomics.org/)，以候选区段的基因组序列作为参考序列，利用网上公开的免费软件包BWA(http://bio-bwa.sourceforge.net/)分别将两个亲本的重测序序列和候选区段进行比对，进一步开发出更多的SSR标记，对F₂定位群体进行基因型分析，实现对无卷须基因的进一步精细定位。分析过程中PCR反应体系及PCR产物检测参考前述“多态性筛选分析”即可。

根据SSR标记的分型结果，结合群体的表型数据，利用JoinMap4.0软件对西瓜植株无卷须性状进行基因和分子标记的遗传连锁分析作图，得到遗传连锁图，综合初定位结果，获得了控制西瓜无卷须性状的候选位点Clnt以及和该位点紧密连锁的两个SSR分子标记C1SSR11289和C1SSR11306。实现对西瓜植株无卷须基因Clnt精细定位图(见图1)，无卷须基因Clnt与C1SSR11289的遗传距离为0.1cM，与C1SSR11306的遗传距离为0.7cM。

由于都是特异性PCR扩增，这些SSR标记稳定性高、重复性好，将在西瓜无卷须基因分子标记辅助育种体系的构建中起到关键作用。

5应用于西瓜材料鉴定

利用与西瓜无卷须基因Clnt紧密连锁的分子标记可以对西瓜卷须有无性状进行检测，具体的检测方法，包括如下步骤：

(1)提取待测品种基因组DNA；

(2)以步骤(1)所提取基因组DNA为模板，分别利用所述分子标记C1SSR11289或C1SSR11306进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行电泳检测；结果见图2和图3。

(3)依据步骤(2)的电泳条带结果进行判定，具体标准为：

对分子标记C1SSR11289，若待测品种为无卷须材料，PCR产物为276bp的特征条带，该特征条带的具体碱基序列如SEQ ID NO.1所示；若待测品种为有卷须材料，PCR扩增产物为280bp的特征条带时，该特征条带的具体碱基序列如SEQ ID NO.3所示。

对分子标记C1SSR11306，若待测品种为无卷须的材料，PCR产物为259bp的特征条带，该特征条带的具体碱基序列如SEQ ID NO.2所示；若待测品种为有卷须材料，PCR扩增产物为263bp的特征条带时，该特征条带的具体碱基序列如SEQ ID NO.4所示。

6分子标记克隆

将分子标记C1SSR11289在两个亲本间扩增获得的276bp和280bp(SEQ ID NO.1所示和SEQ ID NO.3所示)的PCR产物克隆到pMD18-T载体中，获得重组载体。将该重组载体转化到大肠杆菌JM109中，挑单克隆，培养获得重组细胞。从重组细胞中提取质粒，所述质粒即重组载体，采用M13通用引物(序列信息参考TaKaRa商品目录)对克隆片段进行测序，结果显示，重组载体中含有本发明的分子标记(SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3)。

同样，将分子标记C1SSR11306扩增获得的259bp和263bp(SEQ ID NO.2所示和SEQID NO.4所示)的片段克隆到pMD18-T载体中，获得重组载体。将该重组载体转化到大肠杆菌JM109中，挑单克隆，培养获得重组细胞。从重组细胞中提取质粒，所述质粒即重组载体，采用M13通用引物(序列信息参考TaKaRa商品目录)对克隆片段进行测序，结果显示，重组载体中含有本发明的分子标记(SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4)。

将上述两个片段，同样按照上述方法获得重组载体以及重组细胞，结果显示，重组载体中含有本发明的分子标记(SEQ ID NO.1-4)。

上述克隆、转化、培养、质粒提取等步骤参考《分子克隆实验指南第三版》，黄培堂等译，科学出版社2002年9月出版。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 河南农业大学

<120> 与西瓜植株无卷须基因Clnt紧密连锁的分子标记及应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 276

<212> DNA

<213> Citrullus lanatus

<400> 1

ccagtttaga tgtgcgtaaa aggactatat atatatatat atatatatat gtataaaatg 60

tgttcacagg aagttataga gagcatggca tagaaatggt ggagtattaa tgaatgaata 120

aatgtgttac ctaagagtga gttggagaaa taatatttaa gactatgggg caattggtgg 180

atagaaaaag agttgaagaa ttccatttca cacctttttt cttttctctt tcttacccaa 240

atcttagaat tagactacca accaaacacc tccttg 276

<210> 2

<211> 259

<212> DNA

<213> Citrullus lanatus

<400> 2

tgaaagatgc agtaatcctg agataaaaca taatccattt accttttttt ttcttctctg 60

tactgtttct tggagtctaa ttccatcttt atttattctc taaaacattt ttgagtcaaa 120

ttatttatga acaagaatag tagaggacat tctctctctc tctctctctc tctctctctc 180

tctctctctc tctctctctc tctctcgtgg tatgcttctt tttatttttt gttagtaacc 240

ccccaccacc aaaaataat 259

<210> 3

<211> 280

<212> DNA

<213> Citrullus lanatus

<400> 3

ccagtttaga tgtgcgtaaa aggactatat atatatatat atatatatat atatgtataa 60

aatgtgttca caggaagtta tagagagcat ggcatagaaa tggtggagta ttaatgaatg 120

aataaatgtg ttacctaaga gtgagttgga gaaataatat ttaagactat ggggcaattg 180

gtggatagaa aaagagttga agaattccat ttcacacctt ttttcttttc tctttcttac 240

ccaaatctta gaattagact accaaccaaa cacctccttg 280

<210> 4

<211> 263

<212> DNA

<213> Citrullus lanatus

<400> 4

tgaaagatgc agtaatcctg agataaaaca taatccattt accttttttt ttcttctctg 60

tactgtttct tggagtctaa ttccatcttt atttattctc taaaacattt ttgagtcaaa 120

ttatttatga acaagaatag tagaggacat tctctctctc tctctctctc tctctctctc 180

tctctctctc tctctctctc tctctctctc gtggtatgct tctttttatt ttttgttagt 240

aaccccccac caccaaaaat aat 263

Claims

1.与西瓜植株无卷须基因Clnt紧密连锁的分子标记，其特征在于，所述分子标记为C1SSR11289或/和C1SSR11306，所述分子标记C1SSR11289对应的引物对序列为：

C1SSR11289-F：CCAGTTTAGATGTGCGTAAAAGG

C1SSR11289-R：CAAGGAGGTGTTTGGTTGGT；

所述分子标记C1SSR11306对应的引物对序列为：

C1SSR11306-F：TGAAAGATGCAGTAATCCTGAGA

C1SSR11306-R：ATTATTTTTGGTGGTGGGGG。

2.一种载体，其特征在于：含有权利要求1所述的分子标记。

3.一种重组细胞，其特征在于：含有权利要求2所述的载体。

4.权利要求1所述的分子标记或分子标记引物对在西瓜分子标记辅助育种中的应用。

5.权利要求1所述的分子标记在西瓜无卷须基因Clnt定位中的应用。

6.权利要求1所述的分子标记在鉴定西瓜植株无卷须性状中的应用，其特征在于，利用引物对ClSSR11289-F、ClSSR11289-R以被检测西瓜基因组DNA为模板进行扩增，如果能扩增出如SEQ ID NO.1所示的276bp DNA片段，则西瓜植株具有无卷须性状；或/和，利用引物对ClSSR11306-F、ClSSR11306-R以被检测西瓜基因组DNA为模板进行扩增，如果能扩增出如SEQ ID NO.2所示259bp DNA片段，则西瓜植株具有无卷须性状。