CN110157831A

CN110157831A - 与西瓜短蔓基因Cldw1共分离的分子标记

Info

Publication number: CN110157831A
Application number: CN201910434493.2A
Authority: CN
Inventors: 杨路明; 孙守如; 朱华玉; 马长生; 杨森; 胡建斌; 刘东明; 张敏娟
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Henan Agricultural University
Priority date: 2019-05-23
Filing date: 2019-05-23
Publication date: 2019-08-23
Anticipated expiration: 2039-05-23
Also published as: CN110157831B

Abstract

本发明属于西瓜遗传育种技术领域，具体涉及与西瓜短蔓基因Cldw1共分离的分子标记专利申请事宜。该分子标记dCAPS3与西瓜短蔓基因Cldw1共分离，利用该分子标记来检测判定西瓜茎蔓长度性状。本申请中，以西瓜长蔓材料中WT4和西瓜短蔓材料WM102作为种质材料基础，对西瓜短蔓基因Cldw1进行了精细定位，并找到了与短蔓性状共分离的分子标记。利用这一结果，可为最终实现对Cldw1基因的克隆，进而为西瓜蔓长形成的分子机制研究奠定技术基础。另一方面，由于该标记与西瓜短蔓基因Cldw1共分离，因此可直接用于西瓜短蔓材料的分子标记辅助育种，在西瓜短蔓新品种培育中具有较好的应用价值。

Description

与西瓜短蔓基因Cldw1共分离的分子标记

技术领域

本发明属于西瓜遗传育种技术领域，具体涉及与西瓜短蔓基因Cldw1共分离的分子标记专利申请事宜。

背景技术

近年来，设施栽培已成为我国西瓜栽培的主要方式之一，而设施栽培中西瓜主要采取吊蔓栽培方式，也因此，西瓜蔓长是品种选择和株型表型选择的主要考虑因素之一。现有西瓜主栽品种中，其主蔓表型普遍较长，可达2-4米，进而容易影响群体内的透光和通风条件，这样不仅会降低植株光合效率，而且易导致病虫害的传播和蔓延，最终影响西瓜的产量和品质。生产上通常采用增大株行距、人工整枝打杈等方式来降低上述影响，但这种方法势必将导致单位面积产量的降低和人力成本的上升。而短蔓植株株型紧凑、占用空间相对较少，具有适宜密植、单位面积产量高的优点；同时短蔓西瓜还具有便于管理、劳动成本低、单位面积经济效益高的优势。符合目前“轻简化”栽培的需求，因此，短蔓株型已成为西瓜及其它葫芦科植物株型改良的一个重要方向。

现有技术中，在水稻、玉米、小麦等农作物和豌豆、番茄等园艺作物上，目前对矮生种质资源的利用已取得了巨大成就。研究人员相继利用矮生种质资源培育出了大批矮生优质新品种，明显提高了作物产量和品质，其中矮生水稻品种的选育和推广更是被作为“第一次绿色革命”的主要标志之一。而矮生基因的发掘和鉴定对矮生种质资源的利用具有极大推动作用，也因此，对矮生基因的研究一直是农业科学领域的重要研究内容之一。近年来，科研人员相继在玉米、水稻、小麦等主要农作物上发现和分离了多个矮生基因。

由于葫芦科作物大多是蔓生植物，因此短蔓性状对其生产应用具有重要价值。现有技术中，研究人员相继发现了多个葫芦科短蔓材料，并对其进行了生理、遗传及分子机理等方面的研究，其中在黄瓜上发现的短蔓材料最多，研究也最深入。例如：研究表明，黄瓜矮生短蔓性状主要由两类基因控制，分别是控制封顶的de基因和控制节间长度的cp基因；其中de基因位于黄瓜6号染色体上，cp基因在黄瓜基因组中存在多个同源基因，如scp-1和scp-2等 (Je FGS, Stevens MR. Genetic mapping and QTL analysis ofhorticultural traits in cucumber (Cucumis sativus L.) using recombinantinbred lines. Theoretical & Applied Genetics, 2003, 107: 864-874)。进一步地，围绕de基因和cp基因研究有：Li等将cp基因定位在4号染色体一个220kb的区段内，并克隆了一个编码细胞分裂素氧化酶的基因CKX，认为CKX基因可通过降低细胞分裂素含量的方式调控植株高度 (Li Y, et al. Fine genetic mapping of cp: a recessive gene forcompact (dwarf) plant architecture in cucumber, Cucumis sativus L.Theoretical and Applied Genetics, 2011, 123: 973)；Wang和Hou分别克隆了scp-1和scp-2短蔓基因，认为这两个基因均与油菜素内酯代谢相关 (Wang H, et al. Thecytochrome P450 gene CsCYP85A1 is a putative candidate for super compact-1(Scp-1) plant architecture mutation in cucumber (Cucumis sativus L.).Frontiers in Plant Science, 2017, 8: 266; Hou S, et al. A mutant in theCsDET2 gene leads to a systemic brassinosteriod deficiency and super compactphenotype in cucumber (Cucumis sativus L.). Theoretical and Applied Genetics,2017, 130: 1693-1703)。

现有技术中，针对西瓜基因组中的短蔓基因也有部分研究和报道，例如已发现的的短蔓基因有：dw-1，dw-1s，dw-2和dw-3，其中dw-1和dw-1s位于同一位点，dw-2和dw-3分别位于另外两个不同的位点 (Huang H, et al. Inheritance of male-sterility anddwarfism in watermelon [Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum. and Nakai].Scientia Horticulturae, 1998, 74: 175-181)。但上述研究只定位了短蔓基因，并未克隆到短蔓基因或者获得与短蔓基因紧密连锁的分子标记，很难实际应用于西瓜短蔓育种。也因此，进一步筛选确定与西瓜短蔓性状紧密连锁甚至共分离的分子标记，并进一步图位克隆该基因，才有可能为西瓜短蔓优质新品种的培育奠定良好的技术基础。

发明内容

本发明的目的是提供一对用于定位西瓜短蔓基因Cldw1的、与西瓜短蔓基因Cldw1共分离的分子标记，从而为进一步克隆获得西瓜短蔓基因Cldw1奠定一定技术基础，进而为西瓜短蔓优质新品种的培育奠定基础。

本申请所采取的技术方案详述如下。

与西瓜短蔓基因Cldw1共分离的分子标记dCAPS3，为一对PCR扩增用引物，具体为：

dCAPS3-F: 5’-TATGCTTATACTCTCACTGGAATT-3’，

dCAPS3-R: 5’-TTAACATTGCAGCCAAAAATAG-3’。

所述与西瓜短蔓基因Cldw1共分离的分子标记dCAPS3在西瓜品种培育中的应用，该分子标记dCAPS3与西瓜短蔓基因Cldw1共分离，利用该分子标记来检测判定西瓜茎蔓长度性状；即，利用该分子标记通过进一步的PCR扩增产物酶切片段大小在种子阶段或苗期即可早期判定西瓜茎蔓长度性状，从而加快育种进程。

利用所述与西瓜短蔓基因Cldw1共分离的分子标记dCAPS3的西瓜茎蔓长度性状的检测判定方法，采用PCR产物酶切方法检测判定，具体包括如下步骤：

（1）提取待测品种基因组DNA，

（2）以步骤（1）中所提取基因组DNA为模板，利用所述分子标记dCAPS3进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行电泳检测和/或测序、和/或进行EcoR1酶切并对酶切产物进行电泳检测；

（3）依据步骤（2）的电泳条带和/或测序、和/或酶切产物的电泳条带进行判定，具体判定标准为：

如果待测品种为短蔓性状品种，PCR扩增产物仅有一条长度为120 bp的特征条带，该120bp的特征条带的具体碱基序列如SEQ ID NO.1所示；可被EcoR1酶切，酶切产物中包含一个100bp长度片段（与SEQ ID NO.2对比可以看出，SEQ ID NO.1序列在25bp处有一个A碱基的缺失，因此使得20-25bp处形成了一个EcoR1的酶切位点5’-GAATTC-3’）；

如果待测品种为长蔓性状品种，则有两种情况：

当PCR扩增产物中仅有一条长度为121 bp的特征条带时，该品种为纯合长蔓性状品种，该121bp的特征条带的具体碱基序列如SEQ ID NO.2所示；该PCR产物不能被EcoR1酶切；酶切产物仍为121bp长度片段；

当PCR扩增产物中既有一条长度为121 bp的特征条带，又有一条长度为120 bp的特征条带时，表明该长蔓性状品种为杂合品种；120bp的特征条带的具体碱基序列如SEQ IDNO.1所示，可被EcoR1酶切；121bp的特征条带的具体碱基序列如SEQ ID NO.2所示，不能被EcoR1酶切；因此该PCR扩增产物部分可被EcoR1酶切，酶切产物中同时包含121bp和100bp长度片段；

换言之，检测判定时，直接基于PCR产物电泳结果判定时：

如果电泳条带仅有一种120bp带型，则可判定待测品种为短蔓品种；

如果电泳条带仅有一种121 bp带型，则可判定待测品种为长蔓品种；

如果电泳条带有120bp和121bp两种带型，则可判定待测品种为长蔓品种；

基于PCR产物EcoR1酶切后电泳结果判定：

如果电泳条带仅有一种100bp带型，则可判定待测品种为短蔓品种；

如果电泳条带有100bp和121bp两种带型，则可判定待测品种为长蔓品种；

基于测序结果判定时，则需基于测序结果为一种或者两种，并是否与SEQ ID NO.1、SEQID NO.2相同进行判定。

需要说明的是，本申请中，长蔓基因ClDW1与短蔓基因Cldw1为等位基因，其中长蔓基因ClDW1为显性控制（即含有该基因的西瓜茎蔓表型为长蔓，也即对应基因对为ClDW1/ClDW1或ClDW1/Cldw1），而短蔓基因Cldw1为隐性控制（即，只有纯合基因对Cldw1/Cldw1时，该西瓜品种才表现为短蔓表型）。

还需说明的是，本申请中，所述长蔓是指正常材料的蔓长，一般为2-4米，短蔓是指蔓长明显短于正常材料，一般为1-1.5米左右。

本申请中，以西瓜长蔓材料中WT4和西瓜短蔓材料WM102作为种质材料基础，对西瓜短蔓基因Cldw1进行了精细定位，并找到了与短蔓性状共分离的分子标记。利用这一结果，可为最终实现对Cldw1基因的克隆，进而为西瓜蔓长形成的分子机制研究奠定技术基础。另一方面，由于该标记与西瓜短蔓基因Cldw1共分离，因此可直接用于西瓜短蔓材料的分子标记辅助育种，而由于分子标记在辅助育种体系中具有简便、快速、高通量的优势，因而可使本申请所提供的分子标记在西瓜短蔓新品种培育中具有较好的应用价值。

附图说明

图1为西瓜短蔓基因Cldw1精细定位图，其中Cldw1代表西瓜短蔓基因；

图2为dCAPS3在自然群体中PCR产物的酶切电泳图，其中M 代表marker；1为长蔓植株材料WT4；2为短蔓植株材料WM102；其余条带为从本实验室保存的种质材料中随机选取的29份自然群体材料（由于材料较多，但结果一致，因此对于条带对应种质材料不再详细说明），材料株型（表型）都是长蔓。

具体实施方式

下面结合申请做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中生物材料、实验试剂及相关实验背景情况简要介绍如下。

生物材料：

西瓜短蔓材料WM102，由美国农业部USDA种质资源中心提供，其节间较短、株型紧凑、约为正常西瓜株高的一半，果实为绿果皮；

西瓜长蔓材料WT4是由发明人选育的高代自交系，株高正常、果实为黄果皮（需要解释的是，采用该材料作为研究基础，仅是实验材料获得的便捷性原因，不应理解为本申请相关技术方案的实现必须依赖于该实验材料）；

实验过程中，西瓜亲本及群体种植于河南农业大学毛庄科教园区日光温室内，种植过程为：催芽后进行穴盘育苗，采用正常的西瓜栽培管理方式，定植45天和60天后对株高与节间长度等表型性状进行调查统计。

实验试剂：

实验过程中，PCR扩增用PCR MagicMix 3.0购于北京天恩泽基因科技有限公司；其它电泳与银染相关试剂如丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、AgNO₃、NaOH和甲醛等试剂购自北京索莱宝科技有限公司；

实验过程中的PCR扩增用引物（人工合成）及基因测序，由北京诺赛基因组研究中心有限公司提供完成。

实验设备：

PCR仪为珠海黑马医学仪器有限公司Hema9600型基因扩增仪；

电泳仪为JY300HC通用型电泳仪，由北京君意东方电泳设备有限公司生产；

电泳槽为HT-SCZ04A高通量垂直电泳槽，由北京鸿涛基业科技发展有限责任公司生产。

实施例1

本实施例简要介绍一下对西瓜短蔓基因Cldw1的精细定位过程，包括遗传分离群体的构建及精细定位等过程（定位图谱如图1所示）。

（一）遗传分离群体的构建

以西瓜短蔓材料WM102作为母本，以西瓜长蔓材料WT4作为父本（需要解释的是，实验期间，从材料易得性及操作方便考虑，发明人以WT4作为父本，在采用其他纯合长蔓材料时，同样可以进行相关实验），利用这两个亲本配置了杂交组合，结果表明，获得的F₁代植株全部表现为长蔓。

从F₁代植株中选择10个单株，自交获得F₂代种子，用于遗传分析与基因定位。

对这些F₂代个体的蔓长表型进行鉴定，并用卡方测验进行验证。结果表明：

对2018年春季种植的的465株F₂群体的株高表型调查分析显示：长蔓植株有332株，短蔓植株有133株，，符合3:1的分离比。

对2018年秋季种植的128株F₂群体表型调查显示，长蔓植株有101株，短蔓植株有27株，，同样符合3:1的分离比。

综合上述结果分析可知，西瓜短蔓性状是由1对隐性核基因控制的，将该基因命名为Cldw1，长蔓（ClDW1）对短蔓（Cldw1）为完全显性。

（二）采用BSA法对Cldw1基因进行精细定位

（1）首先，制备基因池，具体为：

在上述步骤（一）的F₂群体中随机选取10个短蔓单株与10个长蔓单株，采集未展开的幼嫩叶片，采用CTAB法提取其基因组DNA，并分别混合制成短蔓基因池和长蔓基因池（短蔓与短蔓混合，长蔓与长蔓混合）。

（2）多态性筛选分析，具体为：

利用发明人前期从西瓜全基因组开发的744对SSR引物（具体引物序列参考《Genomewide characterization of simple sequence repeats in watermelon genome andtheir application in comparative mapping and genetic diversity analysis》，Zhuet al.，BMC Genomics，2016，17: 557-573.），对步骤（1）中所制备的两个基因池进行多态性筛选，将在两个基因池中获得的不同带型的标记称为多态性标记。

进一步，将筛选出的多态性SSR标记对414株F₂群体（在F₂群体中选出DNA质量较高的单株）进行基因型分析，将所获得的与短蔓亲本相同带型的记作2，获得与长蔓亲本相同带型的记作1，获得杂合带型的记作3。

多态性筛选分析过程中，PCR扩增时，10μL扩增体系设计如下：

基因池样品（基因组DNA，30ng/μL），1μL（约30ng）；

F、R引物，各0.5μL（引物浓度均为5 μmol/L）

PCR MagicMix，5.0μL；

ddH₂O ，3.0μL；

PCR扩增程序为：94℃、5min；94℃、30s，55℃、30s，72℃、30s，35个循环；72℃、5min。

需要解释的是，上述PCR扩增体系中的F、R引物（744对SSR引物）分别代表一对引物中的前引物和后引物，由于这些引物与本申请欲保护主题并不直接关联，文本简明起见，不再详细说明。

对PCR扩增产物进行8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。电泳检测时，聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲液为0.6×TBE，200V恒压电泳1~1.5h。电泳结束后进行银染，以便观察和检测，银染方法为：

A、将带胶的玻璃板放入固定液中，在摇床上轻轻摇动直至指示剂退去颜色，其中固定液的组成为，冰醋酸：无水乙醇：蒸馏水的体积比为0.5:10:100；

B、用超纯水洗1~3min；

C、将冲洗后的胶板放入染色液中摇动10 min，染色液为0.2%硝酸银水溶液；

D、将染色后的胶板放入超纯水中漂洗30s，放入装有显影液的塑料盒中，轻轻摇动直至条带清晰呈现，显影液是在1L蒸馏水中加入15g NaOH和3mL甲醛混匀得到的；

E、最后放入自来水反复漂洗几次；

F、室温下干燥，然后拍照。

（3）基因精细定位，具体为：

结合初步定位群体表型调查数据和步骤（2）中最终SSR标记的分型结果，利用JoinMap3.0软件，对控制西瓜短蔓性状的基因进行定位，结果将Cldw1基因定位在ClSSR26018和ClSSR26045之间（相关编码为研究过程中发明人自行编码，并不具有特殊含义），分别与Cldw1基因相距2.7cM和0.7cM（如图1所示）。

实施例2

在实施例1的精细定位基础上，发明人进一步对西瓜短蔓基因Cldw1候选区段进行了生物信息学分析，并开发了与短蔓性状共分离的标记dCAPS3，具体过程简要介绍如下。

（1）亲本重测序和新标记的开发

利用Illumina Hi-seq2000高通量测序平台对两亲本材料进行重测序，控制测序深度>20倍；以西瓜全基因组序列在SSR标记CLSSR26018和CLSSR26045之间的区段作为参考序列，对CLSSR26018和CLSSR26045之间的170.05 kb的序列进行比对，最终针对两亲本序列之间的SNPs 和Indels差异，开发设计了3对dCAPS引物（dCAPS1-dCAPS3）和1对Indel引物（Indel1）。利用新开发的分子标记，对F₂群体进行基因型分析，结果发现分子标记dCAPS3与Cldw1基因共分离，因此可进一步用于标记该短蔓基因Cldw1。

（2）以dCAPS3区分短蔓和长蔓性状的原理

前期设计及分析表明，与Cldw1基因共分离的分子标记dCAPS3，其扩增序列在两亲本内存在一个Indel差异，短蔓亲本序列有一个A碱基的缺失；正是基于该Indel位点设计了dCAPS3标记，从而可用于识别短蔓性状和长蔓性状。换言之，利用所述dCAPS3分子标记进行PCR扩增区别时，引物序列设计为：

dCAPS3-F: 5’-TATGCTTATACTCTCACTGGAATT-3’，

dCAPS3-R: 5’-TTAACATTGCAGCCAAAAATAG-3’。

具体验证时：

利用分子标记dCAPS3检测西瓜短蔓基因Cldw1时，可PCR扩增获得120 bp的特征条带，所述120bp的特征条带的具体碱基序列如SEQ ID NO.1所示；具体如下：

TATGCTTATACTCTCACTGGAATTCTTCAAAGAGTCGAGAATCCTATGCCAATGCTGGCATAATTGCCGAACAGGTGAAACTTTTTTCCCCTTCTTTTCTATTTTTGGCTGCAATGTTAA；

利用分子标记dCAPS3检测西瓜长蔓基因ClDW1时，可PCR扩增获得121 bp的特征条带，所述121 bp的特征条带的具体碱基序列如SEQ ID NO.2所示；具体如下：

TATGCTTATACTCTCACTGGAATTACTTCAAAGAGTCGAGAATCCTATGCCAATGCTGGCATAATTGCCGAACAGGTGAAACTTTTTTCCCCTTCTTTTCTATTTTTGGCTGCAATGTTAA。

序列比对表明，SEQ ID NO.1序列在25bp处有一个A碱基的缺失，因此在20-25bp处形成一个EcoR1的酶切位点5’-GAATTC-3’，酶切后酶切产物中为一个100bp大小片段；而SEQID NO.2由于不含有该酶切位点，因此酶切后产物大小仍为121bp；换言之，对PCR产物进行EcoR1酶切后，短蔓亲本（Cldw1/Cldw1）中有EcoR1的酶切位点，PCR扩增后的酶切产物为100bp的片段；而长蔓亲本（ClDW1/ClDW1）因在酶切位点区域发生碱基插入而没有EcoR1的酶切位点，PCR产物切不开，仍保持原始大小121bp。

综上，根据PCR产物酶切后的条带大小，可有效区分ClDW1/ClDW1、ClDW1/Cldw1、Cldw1/Cldw1三种基因型。

实施例3

在上述实施例基础上，发明人以所收集的来自世界各地的西瓜种质材料为基础，随机选择29份材料为例（需要解释的是，这些自然群体的甜瓜种质材料都为长蔓材料，而所述西瓜种质材料均为发明人工作过程中搜集所得，相关种质材料在国内及国外部分专业种质库中亦有保藏，加上下述工作仅为实验验证，相关种质材料与本申请保护主题并不具有直接关联性，因而不再提供这些种质材料的信息），对dCAPS3分子标记功能进行了进一步验证，具体过程简要介绍如下。

（1）提取基因组DNA

以育苗后未展开的幼嫩叶片（分别采集亲本长蔓材料中WT4、短蔓材料WM102和29份自然群体材料）为样品，CTAB法提取其基因组DNA；

（2）PCR扩增

利用dCAPS3分子标记（即引物对dCAPS3-F、dCAPS3-R），以步骤（1）中的基因组DNA为模板进行PCR扩增，

PCR扩增时，10μL扩增体系设计如下：

基因组DNA（30ng/μL），1μL（约30ng）；

dCAPS3-F，0.5μL（引物浓度均为5 μmol/L）；

dCAPS3-R，0.5μL（引物浓度均为5 μmol/L）；

PCR MagicMix，5.0μL；

ddH₂O ，3.0μL；

（3）对PCR扩增产物进行EcoR1酶切

对步骤（2）中的PCR扩增产物进行EcoR1酶切，并对酶切产物进行8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；

EcoR1酶切过程中，10μL酶切体系设计如下：

PCR产物，2μL；

10×Buffer EcoR1，1μL；

EcoR1，1μL；

Nuclease-free water（ddH₂O），6μL；

37℃酶切10h。

电泳结果如图2所示。从图2中可以看出，对PCR产物酶切后，除短蔓材料WM102为100bp的一条带外，其他所有材料都是只有121bp的条带，说明其他材料都为ClDW1/ClDW1基因型，与材料表型一致。基于此结果，表明dCAPS3分子标记能有效的区分短蔓材料和长蔓材料。

综上可以看出，用现有已知的29份不同遗传背景的西瓜品种材料验证分子标记dCAPS3，条带显示结果与短蔓/长蔓的表型（或后代分离情况）的一致性为100%。这也进一步证实，通过本发明所述分子标记dCAPS3，可在将短蔓基因Cldw1引入到其他正常型西瓜材料的过程中，在西瓜生长的任意阶段较为准确地进行分子标记辅助选择，从而大大提高育种效率。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南农业大学

<120> 与西瓜短蔓基因Cldw1共分离的分子标记

<130> none

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 120

<212> DNA

<213> Citrullus lanatus

<400> 1

tatgcttata ctctcactgg aattcttcaa agagtcgaga atcctatgcc aatgctggca 60

taattgccga acaggtgaaa cttttttccc cttcttttct atttttggct gcaatgttaa 120

<210> 2

<211> 121

<212> DNA

<213> Citrullus lanatus

<400> 2

tatgcttata ctctcactgg aattacttca aagagtcgag aatcctatgc caatgctggc 60

ataattgccg aacaggtgaa acttttttcc ccttcttttc tatttttggc tgcaatgtta 120

a 121

Claims

1.与西瓜短蔓基因Cldw1共分离的分子标记dCAPS3，其特征在于，该分子标记为一对PCR扩增用引物，具体为：

dCAPS3-F: 5’-TATGCTTATACTCTCACTGGAATT-3’，

dCAPS3-R: 5’-TTAACATTGCAGCCAAAAATAG-3’。

2.权利要求1所述与西瓜短蔓基因Cldw1共分离的分子标记dCAPS3在西瓜品种培育中的应用，其特征在于，该分子标记dCAPS3与西瓜短蔓基因Cldw1共分离，利用该分子标记来检测判定西瓜茎蔓长度性状。

3.利用权利要求1所述与西瓜短蔓基因Cldw1共分离的分子标记dCAPS3的西瓜茎蔓长度性状的检测判定方法，其特征在于，采用PCR扩增方法检测判定，具体包括如下步骤：

（1）提取待测品种基因组DNA，

（2）以步骤（1）中所提取基因组DNA为模板，利用所述分子标记dCAPS3进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行电泳检测和/或测序、和/或进行EcoR1酶切并对酶切产物进行电泳；

（3）依据步骤（2）的电泳条带和/或测序、和/或酶切结果进行判定，具体判定标准为：

如果待测品种为短蔓性状品种，PCR扩增产物仅有一条长度为120 bp的特征条带，该120bp的特征条带的具体碱基序列如SEQ ID NO.1所示；PCR扩增产物可被EcoR1酶切，酶切产物中包含一个100bp长度片段；

如果待测品种为长蔓性状品种，则有两种情况：

当PCR扩增产物中仅有一条长度为121 bp的特征条带时，该品种为纯合长蔓性状品种，该121bp的特征条带的具体碱基序列如SEQ ID NO.2所示；该PCR产物不能被EcoR1酶切；

当PCR扩增产物中既有一条长度为121 bp的特征条带，又有一条长度为120 bp的特征条带时，表明该长蔓性状品种为杂合品种。

4.如权利要求3所述西瓜茎蔓长度性状的检测判定方法，其特征在于，步骤（1）中，采用CTAB法提取其基因组DNA。

5.如权利要求3所述西瓜茎蔓长度性状的检测判定方法，其特征在于，步骤（2）中，PCR扩展时，PCR扩增时，10μL扩增体系设计如下：

基因组DNA，1μL；

dCAPS3-F，0.5μL；

dCAPS3-R，0.5μL；

PCR MagicMix，5.0μL；

ddH₂O ，3.0μL；

6.如权利要求3所述西瓜茎蔓长度性状的检测判定方法，其特征在于，步骤（2）中，EcoR1酶切时， 10μL酶切体系设计如下：

PCR产物，2μL；

10×Buffer EcoR1，1μL；

EcoR1，1μL；

ddH₂O，6μL；

37℃酶切10h。