CN101801176A

CN101801176A - 选择具有特异性突变的植物的方法

Info

Publication number: CN101801176A
Application number: CN200880107180A
Authority: CN
Inventors: J·斯图尔曼
Original assignee: Keygene NV
Current assignee: Keygene NV
Priority date: 2007-09-24
Filing date: 2008-09-24
Publication date: 2010-08-11
Also published as: BRPI0816048B1; EP2200424A1; CA2700563A1; EP2200424B1; JP2010539925A; AU2008303999A1; AU2008303999B2; WO2009041810A1; US8716550B2; CA2700563C; US20100212043A1; BRPI0816048A2; JP5791897B2

Abstract

本发明涉及提供经诱变的群体的方法，该方法为：通过化学和/或物理诱变剂在植物基因组的选定区域引入突变，然后使用高通量测序分析经诱变的原代M1植物的至少一个部分中是否在感兴趣区域中存在突变，从而选择可遗传的突变。

Description

选择具有特异性突变的植物的方法

本发明涉及选择具有特异性突变的植物的方法。特别地，本方法涉及选择具有位于需要的基因组区域中的能够引起改善的遗传变异和改善的表型的突变的植物的方法。

优良种质的育种是耗时且昂贵的过程。一旦建立了优良品系，育种者将避免与不适合种质进行传统杂交和以不适合种质进行的选择方法学，因为这将瓦解品系的最佳遗传构成。相反地，人们有越来越多的兴趣通过使用突变诱导技术在特异性育种品系中产生遗传变异。在2316种正式注册的携带新型诱导的变异的品种(IAEA关于正式注册的突变品种的数据库)中反映出诱导的突变对作物改善的影响。此外，这些品种中大约四分之三是来源于经伽马射线处理的直接突变品种，因此强调了通过突变产生遗传品种的重要性。所有这些转变为对农业和食品生产的巨大的经济影响，其目前以数十亿美元和数百万种植公顷而计算。但是，虽然已经很好地理解了诱导突变对于农业的潜力，但是仍然存在有关使用突变的待解决的问题。

诱变试剂可分成三类：物理的(例如伽马射线)、化学的(例如甲磺酸乙酯，EMS)和可转座的元件(例如转座子、逆转座子、T-DNA、逆转录病毒)。目前，有关在植物分子水平上诱导的遗传效应的范围和这些不同类别试剂及其引起的突变的特异性和相对有效性可以获得的数据很有限。这些效应包括DNA损伤，其导致碱基对改变(单一/简单核苷酸多态性，SNP)；小的插入和删除(indel)和染色体重排。对于诱导突变如何与表观遗传(epigenetic)过程例如甲基化、逆转录元件的激活和较高级别DNA结构的扰乱相互作用了解的更少。

虽然育种者已经使用突变诱导来拓宽种质的遗传基础，并且已经使用突变品系直接作为新品质或在杂交育种程序中作为新变异的来源，但是对于诱导的突变的确切本质的了解不是必需的。直观上保守性水平的小的碱基对重排和删除被认为是理想的。如今，诱变技术的使用已经超出育种上的应用而扩展至基因发现和反向遗传学。这些新的高通量应用需要在整个作物植物基因组上以高效性诱导的特异类别的突变，因此，关于诱导的突变的确切本质的知识正成为一个问题。

经典的高通量基因发现方法高度依赖于插入的“敲除”品系，现在为经典的“基因机器”，以及删除“敲除”库。插入突变包括诱导已知的可转座元件的转座活性以产生一系列品系，理论上在这些品系中基因组中每个基因将被转座子插入灭活。这些品系可用于鉴定引起特定表型的基因，或相反地可用于通过搜寻与特定的已知基因的灭活相关的表型而鉴定基因功能。但是，插入突变具有以下缺点：基因功能被严重扰乱，通常呈现出全基因敲除。在很多情况下，想要的突变是改变一个基因而不是消除它。与插入突变比较，常规突变诱导(特别是化学试剂例如EMS)提供了诱导点突变的优势并因此提供了广泛的潜在的等位基因变异。

一种相对新颖和重要的反向遗传学方法是“定向诱导基因组局部突变(targeting induced local lesions in genomes，TILLING)”。其中，在一系列品系中诱导大量的小的变化，或者是DNA碱基对取代，或者是跨越不超过几个碱基对的小的删除。在这些品系中可以通过将表型与特定基因中的变化相关联而确定基因的功能，并且可以产生已知基因的新的等位基因。

在未来的几年中，像这样的新技术将对实践中的植物育种产生渐增的影响。为了适应突变过程，需要这样的技术，使得在基因组的所需部分内含有突变的突变体的选择更加容易。而且，需要一些技术以从大量的突变体中进行选择，在那些突变体中已经以稳定形式引入了突变，即可用于育种并在基因组中分布。过去这是不可能的，因为缺少分析工具和方法学。现在，高通量DNA测序方法(包括，特别是平行测序方法，单分子测序)提供了上述缺失连接的一部分。一个很好的例子是例如在申请人的技术和另案待审的申请中提供的所描述的Keypoints(WO2007037678)。

但是，使用Keypoints来选择特定基因中的诱导的突变在实践中可能被限制为特异性制造的诱变的群体，其被存储为M2或甚至更远代近亲繁殖群体。在实践中最初诱变的M1种子的至少一个自交被视为对于消除DNA分析前的体细胞嵌合性是必要的。因为对于构建并繁殖这样一个诱变群体所投资的时间和资源是相当可观的，所以它们通常是稀少的并且通常不包含育种者作物的优良种质的显著性部分。对于诱变群体在改善优良育种材料中的实际应用，这是严重的缺陷。因此，存在发明在任何育种品系和在育种程序的任何阶段或谱系中允许诱变并选择突变的方法的需要。

本发明人现在发现一种解决以上问题的方案。该方案基于领悟到最初诱变的种子产生嵌合体植物，并且分部分析(sector analysis)可用于特异性选择可遗传突变。只有那些发生于胚胎顶干细胞的突变将被并入植物的整个躯体并将最终被传送至子代。非干细胞突变通常不会占据植物不同部分的主要部分，例如幼苗中的真叶或花的第一系列，并通常不会延伸至种系。这个领悟在本发明中被开发以直接在种子诱变后筛选植物的任何M1群体中的可遗传突变。

方法使用特异性多维(2个以上)网格策略，其汇聚植物的不同部分，例如多维基质的第一坐标(x)中的第一个真叶，第二坐标(y)中的第二真叶，以及3D汇聚情况下的第三坐标(z)中的第三真叶(见图)。除了真叶也可以使用花或植物的其它部分(例如花粉)。在进行KeyPoint(Tilling技术，其应用高通量测序技术以检测并鉴定突变而不是酶例如Cel1)分析后所有三个坐标中检测到的突变被认为是源自于干细胞，因为它们恒定地出现在所有连续叶或其它器官中。只在一个坐标或两个坐标中检测到的且在第三个中缺少的突变为体细胞部分。

本发明提供了在有限时间内对诱变群体取样并测序。个体突变植物可以从任何所需大小的群体中选择，并以携带特异性可遗传突变的很大机会而繁殖。群体的剩余部分可以丢弃。该方法的优势在于可以在不同作物及其优良品系中制造特异性突变，取决于实际的需要。同样，长代植物(long generation plant)((果)树，葡萄树等)变得服从，因为突变选择只需要种子以长成个体突变植物，无子代或世代次数。

在第一个方面，本发明涉及引入并选择植物中特异性突变的方法，包括以下步骤：

(a)提供多个诱变的种子；

(b)将诱变的种子种植于N-维网格，其中N≥1，优选为2，更优选为3；

(c)从种子长出植物(或秧苗)；

(d)从植物的一个部分提取含DNA的材料的样品；

(e)汇聚N-维网格的N维中的第一维中含DNA的材料成库；

(f)从库中分离DNA；

(g)对于秧苗的不同部分对于N-维网格的任何第二维和更多维重复步骤(d)-(f)；

(h)以一组引物扩增汇聚的DNA，所述引物扩增含有感兴趣突变位置的DNA(的一部分)，其中引物中至少一个含有库-特异性标签，以获得每个库的反应产物；

(i)汇聚反应产物成库；

(j)确定反应产物的核苷酸序列；

(k)使用库-特异性标签将来自步骤(h)的库的序列去卷积(deconvolute)以鉴定网格中每个植物(或秧苗)；

(l)选择携带所需突变的植物(或秧苗)。

本发明的方法旨在于在植物中引入并选择特异性突变。优选地，突变是稳定的突变，即将在世世代代的常规杂交中无限遗传。特异性突变优选位于基因中或至少编码区中。通常，将被选择的突变位于感兴趣基因的蛋白编码区内。同样地，选择的突变可位于任何其它的不编码蛋白但是代表任何其它需要的或不需要的功能的DNA序列中，例如基因调节序列、启动子、增强子等。实质上基因可从任何感兴趣基因中选择，例如抗性基因或疾病相关基因和已知的特定基因(其产量或任何发育、生理或生物化学功能是已知的)，包括其基因调节序列、启动子、增强子等。优选地，突变位于感兴趣遗传区域内。可以无需任何预先表型鉴定而进行特异性突变的选择，即无需预先分析引入的突变是否引起植物中表型的变化。

本发明还提供了通过允许鉴定感兴趣基因中的突变而分析基因功能的第一个步骤，所述基因可能没有给予的功能，但至少对其一些核苷酸序列的信息是已知的，即至少足够提供该基因的独特探针。因此本发明提供了类似于TILLING和KeyPoint的反向遗传学工具，其可应用于任何种类的植物。

因此，在第一个步骤中，提供了多个诱变的种子。这样的多个可以是至少100个种子，或至少1000个种子或甚至多至至少5000或50,000个种子，取决于具体情况。种子可以来自任何植物。种子可以是经过任何已知方法诱变的，但优选为经过化学方法诱变。多个种子可以例如由几批种子组成，其中每批使用相同或不同的诱变方法进行诱变或已经进行了后续或平行的诱变。本发明术语中的诱变方法是指化学或物理方法，例如选自例如化学试剂例如甲磺酸乙酯(EMS)，DMS，N-乙基-N-亚硝基脲(ENU)，N-甲基-N-亚硝基脲(MNU)，PRC，甲磺酸甲酯(MMS)，苯丁酸氮芥，美法仑，叠氮钠，溴乙锭，溴尿嘧啶，溴酸或亚硝酸，盐酸甲基苄肼，环磷酰胺，二乙基硫酸盐，丙烯酰胺单体，三亚乙基蜜胺(TEM)，氮芥，长春新碱，二甲基亚硝胺，N-甲基-N’-硝基-亚硝基胍(MNNG)，7，12-二甲基苯蒽(DMBA)，氧化乙烯，六甲基磷酰三胺(HMPA)，硫酸氢盐(bisulfan)，二环氧丁烷(DEB)。

通常X射线、伽马射线、中子等引起DNA断裂。DNA断裂的细胞修复机制导致含有大损伤包括重排和删除的DNA区域。虽然其它类型的突变的分析是本发明优选的，但是射线诱导的突变的分析(其倾向于更大的原因是它们包括更多的碱基)也包含在本发明内。紫外光诱导的突变很多是单一核苷酸改变。

在优选的具体实施方式中，突变的生物经过诱变，从而在每10,000-1,000个基因中发生至少约1个突变。优选地，诱变步骤包括在生物中以平均1/500的频率在感兴趣基因中诱导(遗传)突变，优选1/100，更优选1/10生物。诱变程序可以被调整以达到这些速率，例如通过延长暴露于诱变方法的时间。优选地，上述方法中任何一个中的突变都是单一碱基对突变或短的插入或删除突变，例如在大约1-10碱基对的范围内。

然后种子生长于N-维网格。网格至少是1D的，即N≥1，N＝1时意味着单独分析单个植物。如果需要的话或认为有用的话，网格可以具有更多的维数，这取决于具体情况，因为看到携带特异性突变的维数越多，该突变为可遗传的可能性越高。在实践中，在测序成本(N越大，测序成本越高，因为所需要的冗余增加)与遗传性置信区间之间存在一个权衡。其中最佳的N可以根据各个情况而确定，但通常优选N≥3。在优选的具体实施方式中，N选自3、4、5、6、7、8、9、10，优选为3、4、5、6，更优选为3。从种子开始，秧苗长成植物。可通过例如对叶子或花打孔而对秧苗(或所得植物的部分)取样，但是如果可能的话完整的真叶或花是优选的。对于每个植物或秧苗，从植物的一个部分获取含DNA的材料的样品。对于种植诱变种子获得的每个植物或秧苗，从相同的部分获取样品，例如从第一个真叶或第一朵花。对于网格中的每一维，获取含DNA的材料的样品。对每一维，从植物的另一个部分获取含DNA的材料的样品。因此，对于第二维，从例如第二个真叶等获取材料的样品。在本发明的一个具体实施方式中，植物的每个部分独立地选自花、叶、枝、茎或植物位于地面以上的其它部分及其组合。在本发明的一个具体实施方式中，部分是叶，优选为真叶。在本发明的一个具体实施方式中，对于网格的第一维，部分是第一个真叶；对于第二维，部分是第二个真叶；对于第三维，部分是第三个真叶。

含DNA的材料的样品被汇聚成库，其中每个部分被汇聚于库的一个维中。因此，对于三维网格来说，来自植物的第一部分的含DNA的材料被汇聚于库的第一维，来自植物的第二部分的含DNA的材料被汇聚于库的第二维，等等。接下来使用任何用于分离DNA的常规方法和方式从库中分离DNA。

现在可以使用用于扩增DNA的常规方式例如PCR来扩增经汇聚的DNA，其它技术也是可以的。如果使用PCR扩增，以一组引物扩增汇聚的DNA，所述引物扩增(或跨越)含有感兴趣区域或基因的DNA(的一部分)。优选地，引物中至少一个含有标签，优选为鉴定库的核苷酸标签。以这种方式获得每个库的反应产物，其中反应产物可以使用库特异性标签与其所扩增而来的库相关联。因此现在获得了反应产物的库，都含有DNA的片段，源自不同植物以及可能在感兴趣区域内含有众多突变。

术语“标签”或“核苷酸标签”、动词“加标签”是指向核酸样品添加标签以使其能够与第二个或另外的核酸样品或扩增产物相区别。加标签可以通过例如在扩增时添加序列标识符而进行或通过任何本领域已知的其它方式进行。这样的序列标识符可以是例如独特的碱基序列(长度不同但确定)，独特用于鉴定特异性核酸样品。因此典型的例子为例如ZIP序列。使用这样的标签，可在进一步处理时确定样品的来源。在组合来源于不同核酸样品的处理产物的情况下，可使用不同的标签鉴定不同的核酸样品。有时候标签也被称为标识符序列。如上所述，这样的标识符序列可以是不同长度的，这取决于待比较的核酸样品的数量。大约4个碱基(4⁴＝256个可能的不同标签序列)的长度通常足以区分有限数量(直至256)的样品的来源，虽然优选为标签序列在待区分的样品之间存在一个以上碱基的差异。按照需要，标签序列的长度可以相应调整。标签优选位于引物的5’末端。

如果需要的话现在可以将反应产物汇聚成库并进行测序。可以使用本领域已知的任何测序方法进行测序。鉴于待测序的序列的数量巨大，优选为使用高通量测序方法，例如在WO 03/004690、WO03/054142、WO 2004/069849、WO 2004/070005、WO 2004/070007和WO 2005/003375(申请人均为454Life Sciences)中所公开的方法，由Seo等人(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101：5488-93公开的方法，以及Helios、Solexa、US Genomics、etcetera的技术，这里引入作为参考。所描述的454技术现在允许在单一运行中对多达100,000,000个碱基进行测序并且与竞争的技术相比快且便宜100倍。这将提高增加的每个反应所读长度和/或增加的平行反应数。测序技术大体由5个步骤组成：1)DNA的片段化和与特异接头(adaptor)的连接以产生单链DNA(ssDNA)库；2)ssDNA退火至珠子，在油包水微反应器中珠子的乳化并进行乳状液PCR以扩增珠子上的个体ssDNA分子；3)选择/富集在其表面含有扩增的ssDNA分子的珠子；4)将携带DNA的珠子沉积到PicoTiterPlate

；和5)通过产生焦磷酸盐光信号在多个孔中同时测序。

测序后，可以将从测序步骤直接获得的片段的序列截短，优选为计算机中进行(in silico)，以除去任何珠子退火序列、测序引物或接头相关的序列信息。通过在计算机中进行这个，标签所提供的信息可保存在分开的数据库区域中，从而以后将发现的可遗传的突变(基因)与DNA库中的地址相连。

通常，比对或聚类在经过截短(以除去添加的接头/引物和/或标识符序列)的序列数据上进行，即只使用源自核酸样品的片段的序列数据。

用于比较目的的序列比对方法在本领域是熟知的。各种程序和比对算法见以下描述：Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2：482；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443；Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444；Higgins和Sharp(1988)Gene73：237-244；Higgins和Sharp(1989)CABIOS 5：151-153；Corpet等人(1988)Nucl.Acids Res.16：10881-90；Huang等人(1992)Computer Appl.in the Biosci.8：155-65；和Pearson等人(1994)Meth.Mol.Biol.24：307-31.这里引入作为参考。Altschul等人(1994)Nature Genet.6：119-29(这里引入作为参考)提供了序列比对方法和同源性计算的详细考虑。

NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul等人，1990)可从几个来源获得，包括National Center for Biological Information(NCBI，Bethesda，Md.)以及在因特网上，以用于与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx 相连。可以从<http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/>获得。可以从<http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html>获得如何使用这个程序来确定序列同一性的描述。数据库优选包括EST序列、感兴趣物种的基因组序列和/或GenBank或类似序列数据库的非冗余序列数据库。

高通量测序方法可根据Shendure等人，Science，Vol 309，Issue 5771，1728-1732的描述来使用。其例子为微电泳测序、杂交测序/通过杂交测序(SBH)、扩增分子上的循环阵列测序、单一分子上的循环阵列测序、非循环、单一分子、实时方法，例如聚合酶测序、外切核酸酶测序、纳米孔测序。

对于最佳结果，片段或扩增产物以足够的冗余被测序是有利的。冗余能够在测序错误和真实基因组序列之间产生差别。在一些具体实施方式中，测序的冗余为至少4，更优选为至少5，但是，6以上的冗余，优选8以上或甚至10以上的冗余被认为是有利的，虽然对发明概念不是必需的。

在测序后的后续步骤中，通过使用库特异性标签将步骤(h)中的序列去卷积而鉴定网格中的每个秧苗。对于每个秧苗或植物确定是否相同突变和与库相关的标签的组合可以按照网格的维数相当的数目被找回。换言之，如果网格含有三维，并且相同的突变与三个标签(该标签鉴别与特定的秧苗或植物相连的库的地址)一起被找回三次，则可能以被认为进一步处理的方式引入所诱导的突变。还参见图1中本方法的图示性表述。这些所选择的秧苗或植物可生长，突变的遗传性可在接下来的世代中得到确认。秧苗或植物还可生长并用于育种。现在可以分析所选择的秧苗或植物中存在或不存在感兴趣的表型，换言之，可以评定所选择的突变是否能够提供不同的表型或突变对于所研究的表型是无关紧要的。那些在感兴趣区域内不携带可遗传地出现的(即在所分析的植物的每个部分都被找回的)突变的经诱变种子最初群体的一部分，可以被丢弃。

附图说明

图1.取样方法和在网格上分布的图示性表述。

图2.突变体AN1和RT的嵌合体式样。圆圈对应于花冠。黑色指示突变体组织，白色指示野生型组织。每一堆垂直圆圈代表一个花序，底端圆圈为形成的第一朵花，顶端圆圈为第五朵花。部分黑色的圆圈代表嵌合体花，实际着色式样在温室中观察到。

图3.EMS诱导的点突变的位置，通过对RT基因的个体F1突变体植物进行Sanger测序而检测。突变指示为红色，规范的WT核苷酸为青绿色。

图4.用于高通量突变分析的RT基因的片段。箭头代表用于从基因组DNA库中扩增此片段的引物(也参见表1)。标示为黑色的核苷酸是以表型选择的EMS突变体m2和m17的突变的位置，以括号表示碱基改变。

图5.三坐标网格中经汇聚的植物的高通量序列分析的结果。X-轴代表坐标轴(X、Y、Z分别为黑色的、灰色的和有斑纹的)。Y-轴代表来自每个坐标的序列读数中RT片段的特异性点突变发生的次数。可以看出，对于两个突变体m2和m17来说，三个(X、Y、Z)坐标的独特组合从背景中凸现出来。这些组合对应于单一植物并且匹配网格中这些突变预先确定的位置。

实施例

诱变和嵌合分析

为了证明所描述的方法并且为了评价贡献其成功的组织取样参数，我们使用矮牵牛(Petunia hybrida)中的遗传方案，如图2所示。从自交系W5(act1，AN1∷dTph1，rt∷dTph3)和M1(act1，AN1，RT)的杂交中产生洋红色开花的F1杂交体矮牵牛，产生在两个花色基因(AN1、rt)携带隐性等位基因的双杂合子基因型。这两个基因中的一个(AN1)是产生花冠中的花青素色素所必需的转录因子(Spelt等人2000)。在AN1的空白突变(Null mutant)产生白色的花。第二个基因(PT)是UDP鼠李糖：花青素-3-葡萄糖苷鼠李糖基转移酶。在这里所使用的遗传背景中，RT的空白突变体产生红色的花，这是由于氰定-3-葡萄糖苷积累的结果(Kroon等人1994，Brugliera等人1994)。注意到两个隐性颜色标记物均为分别携带dTph1和dTph3插入的转座子插入等位基因(Spelt等人2000，Kroon等人1994)。这些元件的转座不会发生，因为亲代品系和F1杂交体均缺少dTph1的激活剂(act1，Stuurman和Kuhlemeier2005 The Plant Journal Volume 41 Issue 6，Pages 945-955)而dTph3为转座缺陷的(Kroon等人，1994)。以甲磺酸乙酯(EMS)诱变处理F1杂交体种子后，所得到的植物中一些将在野生型等位基因AN1或RT中携带新型突变。这样的植物将是嵌合体，可以通过洋红色背景上白色或红色花冠的或花冠部分的比例而可视地区分。

从EMS处理的种子生长出3600个F1植物的群体，仅在初级花序上可视地记录花颜色的分部式样。初级花序定义为克隆上源自胚胎茎尖分生组织，与次级花序相反，次级花序是从叶腋分生组织生长而来并克隆上源自其苞叶(Furner and Pumfrey 1992)。在图2中图示性给出了结果。对于AN1和RT总共观察到19个突变体。可以看出，嵌合体按照可以预测的式样：只有大的部分发生(多数是半花)并且嵌合随着花序的成熟而逐渐消失。在开出5朵花以后，嵌合丧失，植物或者是稳定获得突变体颜色或者是继续作为完全野生型。稳定突变体和野生型在数量上大约是相等的，可能反映出在胚胎顶分生组织中两种不稳定的最初细胞(干细胞)。

从这些数据中得到结论：在最初花序上第5朵花以后，矮牵牛的大的种子诱变的F1群体可被处理为非嵌合体。在实践中，这暗示着如果要通过任何DNA筛选方法在特异基因中寻找突变，则在此时期或此时期之后的节点对花序组织取样是足够的。如果这些样品显示出特定的点突变，则植物将在后续发育的所有组织和分枝中稳定携带该突变。可以从图2中看出，取样也可以早些进行，例如在第二朵花之后，具有相当好的机会可以鉴定将发育为稳定突变体的个体。

通过Sanger测序进行突变的分子确认

为了证明花颜色的表型筛选是由于AN1或RT基因中的突变所致，提取全突变体F1个体的第5花序的苞叶用于分离基因组DNA并分析基因序列。RT基因不含有内含子，这允许整个的～1.5kb的编码序列可以用单一引物对通过PCR扩增。为了方便起见，只是详细分析了RT，结果默认为类似地适用于AN1。RT的引物这样来设计：只有来自M1亲代的等位基因被扩增，来自W5亲代的等位基因不被扩增。这个特异性是基于两个亲代之间的天然的RT序列多样性，对此所设计的寡核苷酸引物可以区分(未显示)。这允许只对EMS诱导的来自M1亲代的等位基因进行测序，对存在于W5系中的转座子插入等位基因不进行测序。

在被克隆入细菌质粒载体的PCR产物上进行了所有7个开红花的F1突变体的全长RT编码区的常规Sanger测序。对于每个突变体F1植物，对20个独立的重组质粒中的RT产物进行了测序。该分析揭示出所有的F1植物中(除了一个之外)的点突变。这些突变的种类和位置见图3。

但是，在所有的F1植物中，不是所有的20个重组质粒都显示突变，每个植物中有3-6个突变插入的频率。这表明所取的组织对于突变体等位基因来说不是基因型上的纯合子。鉴于植物是表型上的纯合子，因此F1突变体是周缘嵌合体(periclinal chimaera)，其在三个克隆细胞层L1、L2、L3(植物体的组织发生基础)中的一个携带突变。L1层构成花冠的表皮，众所周知的是花青素色素被限定在表皮(refs)。因此，所分析的RT突变体含有完全的突变体L1层，但是含有野生型L2和L3层。

结论是：表型F1突变体选择鉴定出周缘嵌合体，在预测的基因中发现了点突变。因此，当在所有的3600个F1植物中进行基因型突变筛选且在一个个体植物的初级花序的第4节点后至少两个连续的花的节点上发现特定的突变时，该植物在三个细胞层L1、L2或L3中的(至少)一个是稳定的周缘嵌合体。

高通量测序正确鉴定突变体

为了进一步证明本发明允许以高通量模式在特异基因中进行突变的F1选择，使用454Life Sciences(Margulies等人2005)的测序技术在一大组个体植物中分析了RT扩增子的序列。将从总共3600个EMS诱变的F1杂交体中取出的1440个植物亚群在温室中排列于网格。网格由三个坐标轴组成(x、y、z＝行、块、列)，具有35个坐标(x1-x9，y1-y10，z1-z16)总共9x10x16＝1440个个体植物。网格中的每个植物对应于三个轴中每一个之中的一个坐标的唯一的组合(x，y，z)。在这组1440个植物中，包括两个周缘RT突变体(图3中的m2和m17)并且位于唯一的已知的位置(m2＝X10，Y2，Z8；m17＝X1，Y1，Z2)。选择这些突变体在RT基因的199个碱基对的片段内含有EMS诱导的点突变，这在GS-FLX Genome Sequencer(Roche，454 Life Sciences)的平均读数长度之内。

在网格中的所有1440个植物的花序的第4、5和6花的节点上的苞叶上进行组织的取样，第4节点代表块，第5节点代表行，第6节点代表列。对于每个植物和每个样品，小心地获取相同数量的组织。根据其坐标将组织样品汇聚，得到9+10+16＝35个组织库。将这些经汇聚的组织匀浆，然后提取基因组DNA。因此所有的1440个植物由35个DNA样品代表。因此汇聚的水平对应于每行1440/9＝160个植物，每块1440/10＝144个植物，每列1440/16＝90个植物。

在这些35个DNA样品中的每一个中，使用RT特异性引物通过PCR扩增RT基因的特异性199bp片段(图4)。通过特异的5碱基的核苷酸序列(以下称为标签)在引物的5’端延伸这些引物，网格中35个坐标的每一个由不同的标签序列所定义。将引物设计为只扩增源自M1亲代的RT等位基因，其必须携带由表型筛选所鉴定的EMS诱导的点突变。所产生的一组35个PCR产物是来自构成DNA样品的个体植物的产物的混合物。将所有的35个PCR产物汇聚成库并在GS-FLXGenome Analyzer(Roche)上测序以产生总共549646个个体序列读数。因为个体读数在紧邻RT特异性扩增引物的序列之前携带坐标特异性的5’标签，所以它们可以被分配至网格的35个单一坐标中的一个。如果特定的序列变体(即EMS诱导的点突变)发生于三个坐标轴(例如x1、y1、z1)的唯一组合，则该变体可被分配作为一个个体植物的真实点突变。在这个矮牵牛的特别的例子中，所有的其它突变，即那些只发生于一个(或极少情况下为两个)坐标的，肯定是测序错误，只要DNA样品采自第4花序节点之后的组织。

对于以预先确定的位置包含于网格中的两个具有已知序列的RT突变体(m1、m2和m17，图3)，通过寻找包括突变碱基的12个碱基序列串的完美匹配而在序列数据组中搜索它们的特定核苷酸突变。对于正向(5’->3’)和反向互补(3’->5’)均进行这些搜索。然后，在含有突变碱基的序列读数中，鉴定出5个碱基的标签并计数。可以从图5中看出，可以通过唯一的坐标(x、y、z)组合容易地鉴定这些植物的位置，其中突变比任何其它坐标中发生频率要高得多。这些数据表明：在不存在任何表型选择的情况下，可以从总共1440个植物中正确鉴定出稳定的突变体植物。植物的这个数目可以增加。

材料和方法

EMS诱变

将(W5xM1)F1杂交体的360mg干的矮牵牛种子(约5000粒种子)浸没于10ml管中的5ml 0.5％(v/v)甲磺酸乙酯(EMS，Sigma-Aldrich)中，并且完全混合。在室温将种子置于EMS溶液中14小时。然后以10ml水彻底洗涤种子10次并种植于土壤中。在秧苗产生最初的两个真叶后，将其移植到40(8x5)罐的托盘并于2008年1月排列于温室中的三维网格。它们在24℃16小时光照中生长。

嵌合体RT突变体植物的Sanger测序

从个体植物收获第5朵花的苞叶组织苞叶。使用Qiagen DNeasyPlant Mini Kit分离总的基因组DNA。使用引物08A281和08A282(分别位于RT基因的5’和3’非编码引导物和尾部)(见表1)通过PCR扩增全长RT编码序列。反应由下列组成：25pmol每个引物，0.2mM dNTP，1X PCR缓冲液，50ng基因组DNA，1单位AmpliTaq Gold DNA聚合酶(Applied Biosystems)，总体积为50微升。在最初95℃10分钟，95℃30秒、55℃60秒、72℃60秒的35个循环后，然后最终72℃延伸6分钟之后完成热循环。在琼脂糖凝胶电泳上检测产物是否为单一的带，并克隆入细菌质粒载体。使用自动毛细管测序仪，按照标准的Sanger链终止方法对来自20个随机选出的克隆的重组质粒进行测序。如果在一组20个序列中出现两次以上相同的碱基变化则宣称存在EMS诱导的突变(SNP)。

通过GS FLX测序技术高通量检测突变

将植物保持在位置严格固定的温室中。对于每个个体植物收获第4、5或6朵花的苞叶并根据系统中的35个坐标汇聚成库。将所有35个苞叶组织的库在液氮中匀浆并储存于-80℃。获取组织粉末的样品使用Qiagen DNeasy Plant Mini Kit分离总基因组DNA。使用表1中所列的引物进行RT基因的单一片段的PCR扩增。对于35个坐标的每一个，使用携带相同的5-碱基标签的成对的正向和反向引物，从而每个坐标被PCR产物的两端上的单一标签所指定。反应以下列进行：30ng基因组DNA，0.5mM dNTPs，25pmol每个引物，1单位AmpliTaq DNA聚合酶(Applied Biosystems)，总体积为25微升。在最初95℃5分钟，接着94℃30秒、65℃30秒和72℃30秒的35个循环之后完成循环。使用QIAquick PCR purification kit(Qiagen)纯化PCR产物并在琼脂糖凝胶电泳后检测是否为单一的带。

在25℃在总体积40微升中存在1mM dNTP的情况下以0.5单位的Klenow酶孵育所有的35个PCR产物15分钟而使其产生平末端。通过加入EDTA至终浓度10mM然后在72℃加热20分钟而终止反应。然后使用QIAquick PCR purification kit(Qiagen)纯化样品并在10mMTris pH＝8.5中洗脱。然后在37℃在总体积40微升中存在0.25mM ATP的情况下以20单位的T4多核苷酸激酶孵育所有的35个平末端产物30分钟，使其发生5’磷酸化，然后使用QIAquick PCR purification kit(Qiagen)纯化并在10mM Tris pH＝8.5中洗脱。

将来自3D库的平末端的磷酸化的扩增产物置于GS-FLX测序仪(Roche)使用如Margulies等人(2005)描述的454 Life Sciences技术进行高通量测序。在25℃在总体积为12微升中，将1x连接酶缓冲液(RocheLife Sciences，GS DNA library preparation kit)中的50ng PCR产物，0.1微升的接头(Roche Life Sciences，GS DNA library preparation kit)和1Weiss单位的T4DNA连接酶孵育4小时，从而将所有的35个PCR产物分别连接至454接头序列。然后，使用标准PCR扩增引物(Roche LifeSciences GS，DNA library preparation kit)对连接的产物进行PCR扩增。以下列进行循环：4微升的连接混合物，0.5mM dNTP，25pmol每个引物，1单位AmpliTaq DNA聚合酶(Applied Biosystems)，总体积为25微升。以下列进行循环：最初72℃60秒，95℃5分钟，然后94℃30秒、55℃30秒和72℃30秒的25个循环。通过琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物，并汇聚至1个最终样品。然后使用GS-FLX仪器(Roche Life Sciences)根据生产者的说明书处理该样品并对其测序。

为了检测序列输出中的突变，搜索原始序列(549646个读数)中是否存在突变体m2和m17中存在的SNP突变。通过鉴定与串″m2正向″：GGTTTAGTTCAG[SEQ ID 1]和″m2反向″：CTGAACTAAACC[SEQ ID 2]和″m17正向″：GGTGACCAGATT[SEQ ID 3]和″m17反向″：AATCTGGTCACC[SEQ ID 4]的100％匹配而进行搜索。将匹配这些串的读数根据它们的5’标签序列进行归组以进行坐标鉴定并计数。然后将计数显示于图5。

参考文献

Spelt C，Quattrocchio F，Mol JN，Koes R.(2000)Anthocyaninl ofpetunia encodes a basic helix-loop-helix protein that directly activatestranscription of structural anthocyanin genes.Plant Cell 12(9)：1619-32.

Brugliera F，Holton TA，Stevenson TW，Farcy E，Lu CY，Cornish EC.(1994)Isolation and characterization of a cDNA clone corresponding to theRt locus of Petunia hybrida.Plant J.5(1)：81-92.

Kroon J，Souer E，de Graaff A，Xue Y，Mol J，Koes R.(1994)Cloningand structural analysis of the anthocyanin pigmentation locus Rt of Petuniahybrida：characterization of insertion sequences in two mutant alleles.PlantJ.5(1)：69-80.

Furner I.J.，Pumfrey J.E.(1992)Cell fate in the shoot apical meristemof Arabidopsis thaliana.Development 115，755-764.

Margulies M，Egholm M，Altman WE，Attiya S，Bader JS，et al.(2005)Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors.Nature 437：376-80.

序列表

<110>凯津公司

<120>选择具有特异性突变的植物的方法

<130>P28781PC00

<150>US 60/974,612

<151>2007-09-24

<160>86

<170>PatentIn版本3.3

<210>1

<211>12

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>1

ggtttagttc ag 12

<210>2

<211>12

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>2

ctgaactaaa cc 12

<210>3

<211>12

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>3

ggtgaccaga tt 12

<210>4

<211>12

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>4

aatctggtca cc 12

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>5

ccaataatga acgcttgctc gcag 24

<210>6

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>6

gcatcagaat gctgggaaca tcg 23

<210>7

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>7

acacgtccac cccagcttcc atatcacc 28

<210>8

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>8

acatctccac cccagcttcc atatcacc 28

<210>9

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>9

acgactccac cccagcttcc atatcacc 28

<210>10

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>10

acgcttccac cccagcttcc atatcacc 28

<210>11

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>11

actgctccac cccagcttcc atatcacc 28

<210>12

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>12

agagctccac cccagcttcc atatcacc 28

<210>13

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>13

agatgtccac cccagcttcc atatcacc 28

<210>14

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>14

agcattccac cccagcttcc atatcacc 28

<210>15

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>15

agctctccac cccagcttcc atatcacc 28

<210>16

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>16

agtagtccac cccagcttcc atatcacc 28

<210>17

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>17

agtcttccac cccagcttcc atatcacc 28

<210>18

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>18

atacttccac cccagcttcc atatcacc 28

<210>19

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>19

atcagtccac cccagcttcc atatcacc 28

<210>20

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>20

atcgttccac cccagcttcc atatcacc 28

<210>21

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>21

atgattccac cccagcttcc atatcacc 28

<210>22

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>22

atgtgtccac cccagcttcc atatcacc 28

<210>23

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>23

cacgttccac cccagcttcc atatcacc 28

<210>24

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>24

cactgtccac cccagcttcc atatcacc 28

<210>25

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>25

cagattccac cccagcttcc atatcacc 28

<210>26

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>26

cagcgtccac cccagcttcc atatcacc 28

<210>27

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>27

catagtccac cccagcttcc atatcacc 28

<210>28

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>28

catgctccac cccagcttcc atatcacc 28

<210>29

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>29

cgacttccac cccagcttcc atatcacc 28

<210>30

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>30

cgatctccac cccagcttcc atatcacc 28

<210>31

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>31

cgcagtccac cccagcttcc atatcacc 28

<210>32

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>32

cgcgctccac cccagcttcc atatcacc 28

<210>33

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>33

cgtattccac cccagcttcc atatcacc 28

<210>34

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>34

cgtcgtccac cccagcttcc atatcacc 28

<210>35

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>35

ctagttccac cccagcttcc atatcacc 28

<210>36

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>36

ctatgtccac cccagcttcc atatcacc 28

<210>37

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>37

ctcattccac cccagcttcc atatcacc 28

<210>38

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>38

ctgagtccac cccagcttcc atatcacc 28

<210>39

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>39

ctgcttccac cccagcttcc atatcacc 28

<210>40

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>40

tatcgtccac cccagcttcc atatcacc 28

<210>41

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>41

tagtctccac cccagcttcc atatcacc 28

<210>42

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>42

tatactccac cccagcttcc atatcacc 28

<210>43

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>43

tacattccac cccagcttcc atatcacc 28

<210>44

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>44

tacgctccac cccagcttcc atatcacc 28

<210>45

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>45

tagagtccac cccagcttcc atatcacc 28

<210>46

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>46

tagcttccac cccagcttcc atatcacc 28

<210>47

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>47

acacgtcatt caggttgggt gcaacagc 28

<210>48

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>48

acatctcatt caggttgggt gcaacagc 28

<210>49

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>49

acgactcatt caggttgggt gcaacagc 28

<210>50

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>50

acgcttcatt caggttgggt gcaacagc 28

<210>51

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>51

actgctcatt caggttgggt gcaacagc 28

<210>52

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>52

agagctcatt caggttgggt gcaacagc 28

<210>53

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>53

agatgtcatt caggttgggt gcaacagc 28

<210>54

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>54

agcattcatt caggttgggt gcaacagc 28

<210>55

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>55

agctctcatt caggttgggt gcaacagc 28

<210>56

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>56

agtagtcatt caggttgggt gcaacagc 28

<210>57

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>57

agtcttcatt caggttgggt gcaacagc 28

<210>58

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>58

atacttcatt caggttgggt gcaacagc 28

<210>59

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>59

atcagtcatt caggttgggt gcaacagc 28

<210>60

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>60

atcgttcatt caggttgggt gcaacagc 28

<210>61

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>61

atgattcatt caggttgggt gcaacagc 28

<210>62

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>62

atgtgtcatt caggttgggt gcaacagc 28

<210>63

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>63

cacgttcatt caggttgggt gcaacagc 28

<210>64

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>64

cactgtcatt caggttgggt gcaacagc 28

<210>65

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>65

cagattcatt caggttgggt gcaacagc 28

<210>66

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>66

cagcgtcatt caggttgggt gcaacagc 28

<210>67

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>67

catagtcatt caggttgggt gcaacagc 28

<210>68

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>68

catgctcatt caggttgggt gcaacagc 28

<210>69

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>69

cgacttcatt caggttgggt gcaacagc 28

<210>70

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>70

cgatctcatt caggttgggt gcaacagc 28

<210>71

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>71

cgcagtcatt caggttgggt gcaacagc 28

<210>72

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>72

cgcgctcatt caggttgggt gcaacagc 28

<210>73

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>73

cgtattcatt caggttgggt gcaacagc 28

<210>74

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>74

cgtcgtcatt caggttgggt gcaacagc 28

<210>75

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>75

ctagttcatt caggttgggt gcaacagc 28

<210>76

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>76

ctatgtcatt caggttgggt gcaacagc 28

<210>77

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>77

ctcattcatt caggttgggt gcaacagc 28

<210>78

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>78

ctgagtcatt caggttgggt gcaacagc 28

<210>79

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>79

ctgcttcatt caggttgggt gcaacagc 28

<210>80

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>80

tatcgtcatt caggttgggt gcaacagc 28

<210>81

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>81

tagtctcatt caggttgggt gcaacagc 28

<210>82

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>82

tatactcatt caggttgggt gcaacagc 28

<210>83

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>83

tacattcatt caggttgggt gcaacagc 28

<210>84

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>84

tacgctcatt caggttgggt gcaacagc 28

<210>85

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>85

tagagtcatt caggttgggt gcaacagc 28

<210>86

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>86

tagcttcatt caggttgggt gcaacagc 28

Claims

1.一种在植物中引入并选择特异性突变的方法，包括以下步骤：

(a)提供多个诱变的种子；

(b)将诱变的种子种植于N-维网格，其中N≥1；

(c)从种子长出植物；

(d)从植物的一个部分提取含DNA的材料的样品；

(e)汇聚N-维网格的N维中的第一维中含DNA的材料成库；

(f)从库中分离DNA；

(g)对于植物的不同部分对于N-维网格的任何第二维和更多维重复步骤(d)-(f)；

(i)汇聚反应产物成库；

(j)确定反应产物的核苷酸序列；

(k)使用库-特异性标签将来自步骤(h)的库的序列去卷积以鉴定网格中每个植物；并且

(l)选择在N个取样部分中的至少N-1个，优选每个部分中携带所需突变的植物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所选择的植物生长并且突变的遗传性在接下来的世代中得到确认。

3.根据权利要求1所述的方法，其中N选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，优选为2、3、4、5、6，更优选为3。

4.根据权利要求1所述的方法，其中植物的部分选自花、叶、枝、茎、花粉或植物位于地面以上的其它部分及其组合。

5.根据权利要求4所述的方法，其中部分是叶或花，优选为真叶。

6.根据权利要求1所述的方法，其中对于网格的第一维，部分是第一朵花或第一个真叶；对于第二维，部分是第二个真叶；对于第三维，部分是第三个真叶。

7.根据权利要求1所述的方法，其中多个种子是指至少100个种子，更优选为至少1000个种子，再更优选为至少5000个种子。

8.根据权利要求1所述的方法，其中诱变试剂是化学的或物理的诱变试剂。

9.根据权利要求1所述的方法，其中化学试剂选自EMS，DMS，ENU，MNU，PRC，DEB，MMS，苯丁酸氮芥，美法仑，叠氮钠，溴乙锭，溴尿嘧啶，溴酸或亚硝酸。

10.根据权利要求1所述的方法，其中物理诱变试剂为离子化辐射例如UV射线，放射活性阿尔法或伽马射线。

11.根据权利要求1所述的方法，其中标签是核苷酸标签，含有至少4个核苷酸，优选位于引物的5’末端。

12.根据权利要求1所述的方法，其中测序是基于高通量的测序。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所选择的植物对应于所需要的表型的存在或不存在。

14.根据权利要求1-12的方法获得的诱变的群体。

15.方法在植物育种中的用途。

16.一种携带通过以上方法诱导并选择的突变的种子。