DE69816286T2

DE69816286T2 - Verfahren zur Erkennung von Nukleinsäuremethylierungen durch AFLP

Info

Publication number: DE69816286T2
Application number: DE69816286T
Authority: DE
Inventors: Marnik Johan Roger Vuylsteke; Petrus Antonius Josephina Vos; Marcus Florent Oscar Zabeau
Original assignee: Keygene NV
Current assignee: Keygene NV
Priority date: 1998-07-29
Filing date: 1998-07-29
Publication date: 2004-05-27
Anticipated expiration: 2018-07-30
Also published as: EP0976835A1; DE69816286D1; EP0976835B1; ATE244771T1; US6300071B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis der DNA-Methylierung unter Verwendung von AFLP^TM. Dieses Verfahren kann insbesondere dazu verwendet werden, um zwischen methylierten und nicht-methylierten Stellen (Nukleotiden) in einer Nukleinsäure zu unterscheiden, insbesondere zwischen methylierten und nicht-methylierten Restriktionsschnittstellen. Aus diesem Grund kann das Verfahren der Erfindung Information über das Methylierungsmuster der DNA liefern, das als DNA-Fingerabdruck sichtbar gemacht werden kann.
Selektive Restriktionsfragment-Amplifizierung oder AFLP ist bekannt, z. B. durch die Europäische Patentanmeldung 0 534 858 des Anmelders. Allgemein umfaßt AFLP die Schritte:

(a) Restriktion einer Nukleinsäure, insbesondere einer DNA mit einer oder mehr spezifischen Restriktionsendonuklease(n), um die DNA in eine Reihe von einander entsprechenden Restriktionsfragmenten zu spalten;
(b) Ligieren der so erhaltenen Restriktionsfragmente mit mindestens einem doppelsträngigen synthetischen Oligonukleotid-Adapter, von denen ein Ende mit einem oder beiden Enden des Restriktionsfragments kompatibel ist, um auf diese Weise markierte Restriktionsfragmente der Ausgangs-DNA herzustellen;
(c) Verbinden der markierten Restriktionsfragmente unter hybridisierenden Bedingungen mit mindestens einem Oligonukleotid-Primer;
(d) Amplifizieren der markierten Restriktionsfragmente, die mit den Primern durch PCR oder ein ähnliches Verfahren hybridisiert sind, um die weitere Verlängerung der hybridisierten Primer ent lang der Restriktionsfragmente der Ausgangs-DNA herbeizuführen, an die die Primer hybridisiert sind; und
(e) Identifizierung oder Gewinnung des so erhaltenen amplifizierten oder verlängerten DNA-Fragments.

Das so erhaltene amplifizierte DNA-Fragment kann dann untersucht und/oder sichtbar gemacht werden, z. B. mittels Gelelektrophorese. Dies liefert einen genetischen Fingerabdruck, der spezifische Banden zeigt, welche den Restriktionsfragmenten entsprechen, die mit dem Adapter verbunden wurden, durch den Primer erkannt wurden und folglich während des Amplifizierungsschrittes amplifiziert wurden. Der so erhaltene Fingerabdruck liefert Information über das spezifische Restriktionsschnittstellenmuster der Ausgangs-DNA bereit, und somit über den genetischen Aufbau des Organismus, aus dem diese DNA stammt.
Deshalb kann AFLP verwendet werden, um die DNA zu identifizieren; zur Untersuchung der DNA auf das Vorhandensein spezifischer Restriktionsschnittstellenmuster, auf Restriktionsfragment-Längen-Polymorphismen (RFLP's) und/oder spezifische genetische Marker (sogenannte "AFLP-Marker"), die hinweisend für das Vorhandensein bestimmter Gene oder genetischer Vererbungsmerkmale sein können; oder für ähnliche Zwecke, beispielsweise, um die erhaltenen Ergebnisse mit DNA-Proben bekannten Ursprungs oder Restriktionsmustern oder Daten von diesen zu vergleichen.
Die für AFLP verwendeten Primer sind derart, dass sie den Adapter erkennen und als Ausgangspunkt für die Polymerase-Kettenreaktion dienen können. Zu diesem Zweck müssen die Primer eine Nukleotidsequenz aufweisen, die mit (zumindest Teilen von) der Nukleotidsequenz des an das 3'-Ende des Restriktionsfragments angrenzenden Adapters hybridisieren können, um amplifiziert zu werden. Die Primer können auch eine oder mehrere weitere Basen (genannt "selektive Basen") am 3'-Ende ihrer Sequenz zur Hybridisierung mit jeder komplementären Base oder Basen am 3'-Ende des mit einem Adapter ligierten Restriktionsfragments enthalten. Da von allen in der Mischung vorhandenen, mit einem Adapter ligierten Restriktionsfragmenten nur diejenigen Fragmente anschließend amplifiziert werden, welche zu den selektiven Basen komplementäre Basen enthalten, wird die Verwendung dieser "selektiven" Primer die Gesamtzahl der Banden im endgültigen Fingerabdruck reduzieren, wodurch der Fingerabdruck klarer und spezifischer wird. Auch liefert die Verwendung von verschiedenen selektiven Primern im all- gemeinen voneinander abweichende Fingerabdrücke, die ebenfalls als Hilfsmittel für die Zwecke der Identifizierung oder Untersuchung verwendet werden können.
Da AFLP die Amplifizierung beider Stränge einer doppelsträngigen Ausgangs-DNA liefert, erlaubt AFLP vorteilhaft die exponentielle Amplifizierung des Fragments, d. h. gemäß der Reihe 2, 4, 8, 16 etc.. Auch erfordert AFLP weder Vorkenntnisse der zu analysierenden DNA-Sequenz, noch vorhergehende Identifizierung geeigneter Proben und/oder die Konstruktion einer Genbank aus der Ausgangs-DNA.
Für eine weitergehende Beschreibung von AFLP, ihrer Vorteile, ihrer Ausführungsformen sowie den dabei benutzten Techniken, Enzymen, Adaptern, Primern und weiteren Komponenten und Hilfsmitteln wird auf EP-0 534 858 als Referenz verwiesen. Auch in der nachfolgenden Beschreibung werden die in Abschnitt 5.1 von EP-0 534 858 gegebenen Definitionen verwendet werden, wenn nicht anders angegeben.
Es ist bekannt, dass die DNA von prokaryontischen und eukaryontischen Organismen methylierte Stellen enthalten kann, d. h. bestimmte Nukleotide der DNA-Stränge können mit einer Methylgruppe substituiert sein. Insbesondere Cytosin-Reste sowie Adenin-Reste (in Bakterien) können methyliert sein; beispielsweise ist bekannt, dass in Säugetieren 2–7%. aller Cytosin-Reste methyliert sind und es in Pflanzen bis zu 30% sein können. Methylierte Cytosine können als mCG-Paare, als kleine palindromische
Sequenzen, wobei beide Cytosin-Reste methyliert sind, oder als ^mCNG-Triple (letzteres besonders in Pflanzen) auftreten. Oft ist die Mehrzahl der CG-Stellen in der DNA sowohl von Eukaryonten als auch von Bakterien methyliert.
Bei prokaryontischen Organismen kann das DNA-Methylierungsmuster verwendet werden, um einen bestimmten Bakterienstamm zu identifizieren oder zwischen replizierter und nicht-replizierter DNA zu unterscheiden (siehe B. Lewin, GENES V, Oxford Univ. Press 1994, Kapitel 20). DNA-Methylierung spielt auch bei der DNA-Reparatur und für die Bestimmung des Zeitpunkts der DNA-Replikation eine Rolle.
Bei Eukaryonten ist bekannt, dass die DNA-Methylierung an verschiedenen genetischen Mechanismen beteiligt ist, wie der Regulation der Genexpression, beispielsweise durch die "Abschaltung" (Silencing) von Genen oder bei der Genaktivierung (siehe B. Lewin, GENES V, Oxford Univ. Press 1994, Kapitel 28).
Außerdem wird angenommen, dass die DNA-Methylierung bei Eukaryonten mit genetischen Krankheiten durch den Mechanismus des "Imprinting" in Zusammenhang steht, sowie der gesteigerten Empfänglichkeit für Mutagenese und dem Ursprung von Krebs. Zum Beispiel kann die DNA-Methylierung, die an der Aktivierung/Inaktivierung von X-Chromosomen beteiligt ist, zur Unterscheidung zwischen neoplastischen (klonalen) Zellpopulationen und pseudoplastischen oder hyperplastischen Populationen verwendet werden, um zu bestimmen, ob das Wachstum dieser Zellen bösartig ist oder nicht (WO 96/27024). Ferner wurde der Methylierungszustand von Reportergenen in in vivo-Mutagenitätsprüfungen benutzt (WO 93/17123 und darin zitierte Literaturangaben).
Darüberhinaus können Veränderungen der DNA-Methylierung während der Gentransformation auftreten, wodurch es möglich wird zwischen transformierten und nicht-transformierten Genen oder Sequenzen zu unterscheiden. Zum Beispiel wurde die Analyse (der Veränderungen) des DNA-Methylierungsmusters für die Früherkennung von transgenen Embryos (WO 92/22647) benutzt.
In Pflanzen wie der Erbse und Tomate können Methylierungsmuster dazu verwendet werden, um durch den Nachweis von Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismen, die charakteristisch für diese bestimmten Arten sind, zwischen Arten zu unterscheiden (WO 90/05195). Bei der Tomate wird dies durchgeführt, indem genomische DNA mit einem nicht-methylierungs-sensitiven Restriktionsenzym verdaut wird, und die so erhaltenen Fragmente mittels Southern-Hybridisierung unter Verwendung nachweisbar markierter Sonden gescreent werden, wobei die Sonden durch den Verdau genomischer Tomaten-DNA mit einem methylierungs-sensitiven Restriktionsenzym erhalten wurden. Die Banden des daraus resultierenden DNA-Fingerabdrucks ermöglichen die Identifizierung von Speziesspezifischen, Art-spezifischen oder individuellen RFLP's.
Dennoch ist diese Methode nicht geeignet oder dazu bestimmt, spezifisch zwischen methylierten und nicht-methylierten Stellen innerhalb der Ziel-DNA zu unterscheiden. Außerdem wird die zu untersuchende genomische DNA selbst nicht mit einem methylierungssensitiven Restriktionsenzym (diese werden nur für die Erzeugung der Sonden verwendet) behandelt. Darüber hinaus umfaßt das in WO 90/05195 beschriebene Verfahren keinen DNA-Amplifizierungsschritt und leidet an den allgemeinen Nachteilen ähnlicher konventioneller RFLP-Nachweismethoden, wie geringer Auflösung, sowie zeitaufwändig und arbeitsaufwändig zu sein (vergleiche EP-A-O 534 858, Abschnitt 2.1).
Die Methylierung von Nukleotiden unter Verwendung von sequenzspezifischen Methylasen oder Restriktionsmethylasen wurde ebenfalls als Hilfsmittel für die Markierung spezifischer DNA-Stränge oder Fragmente verwendet. Beispielsweise wurden in WO 93/22462 auf diese Weise markierte DNA'-Fragmente bei der Genkartierung verwendet. Natürlich ist bei der Verwendung derartiger Methylierungsmarker ein geeignetes Verfahren zur Unterscheidung von methylierten und nicht-methylierten DNA-Fragmenten, oder sogar spezifisch methylierten und nicht-methylierten Stellen, notwendig für die anschließende Identifizierung und Zuordnung der markierten Sequenzen.
Donini P. et al, 1997 "AFLP^® fingerprinting reveals pattern differences between template DNA extracted from different plant Organs" Genome, Vol. 40, Seiten 521–526, beschreibt ein auf AFLP^® basierendes Verfahren zur Bestimmung der Methylierungsunterschiede von DNA. Der Artikel offenbart ein Verfahren zur Aufde c??kung der Unterschiede in Methylierungsmustern zwischen DNA aus unterschiedlichen Quellen. Das von Donini et al. beschriebene Verfahren unterscheidet zwischen methylierten und nicht-methylierten Stellen der Matrizen-DNA, die aus unterschiedlichen Pflanzenorganen gewonnen wurde, wobei die Unterschiede in der Methylierung der Matrizen-DNA verschiedenartige Muster erzeugen, wenn die Ausgangs-DNA methylierte Restriktionsschnittstellen für ein Restriktionsenzym mit selten vorkommenden Schnittstellen wie Sse83871 enthält, welches ein methylierungs-sensitives Enzym ist, und bei Restriktionssequenzen, die ein C5-Methylcytosin oder N6-Methyladenin enthalten, nicht schneidet. Wenn nicht-methylierte, PCR-amplifizierte DNA einer Sse-Behandlung unterzogen wird, kann ein DNA-Muster erhalten werden, das Banden enthält, die sowohl den relevanten methylierten als auch nicht-methylierten Stellen entsprechen. Ein Vergleich von AFLP^®-Profilen, die vor und nach der Restriktion mit Sse erzeugt wurden, versagte dabei, einen Mobilitätsverlust der polymorphen Fragmente zu zeigen. Dennoch eignet sich dieses Verfahren zur Aufdeckung von Unterschieden bei Methylierungsmustern nicht als Verfahren zur Identifizierung von spezifischen Methylierungsmarkern.
Für eine weitergehende Erörterung der DNA-Methylierung bei Prokaryonten und Eukaryonten wird auf Standardhandbücher, US-A-4,405,760, WO 90/05195 und die oben angeführten Anwendungen sowie die zitierten Literaturangaben verwiesen.
Es ist bekannt, dass bestimmte Restriktionsenzyme ihre Erkennungssequenzen in Bezug auf deren Methylierungszustand schneiden, beispielsweise nur, wenn die Erkennungssequenz nicht-methyliert ist. Bekannte Beispiele solcher Enzyme sind PstI, HpaII, MspI und ClaI, die benutzt werden können, um den Status und/oder den Grad der Methylierung der DNA-Sequenzen, oder das Vorhandensein von spezifischen methylierten Schnittstellen darin, mittels selektiver Restriktion von (im allgemeinen) nicht-methylierten Stellen zu bestimmen, gefolgt von der gewöhnlich mittels Sondentechnik (siehe US-A-5,405,760, DE-PS-293 139 und WO 93/22462) erfolgenden Identifizierung der erhaltenen Fragmente. Aber diese Methoden sind beschwerlich, ungenau und benötigen im allgemeinen die Entwicklung geeigneter Sonden und/oder zumindest eine gewisse Vorkenntnis der zu untersuchenden Sequenz.
Andere Restriktionsenzyme, wie MseI, schneiden ihre Erkennungssequenz unabhängig davon, ob diese methyliert ist oder nicht. Obwohl beide Arten von Restriktionsenzymen in dem in EP-0 534 858 beschriebenen AFLP-Verfahren benutzt werden können und benutzt werden (siehe beispielsweise Beispiel 2), eignet sich diese Methode als solche nicht, um das Methylierungsmuster einer Ausgangs-DNA zu bestimmen.
In Anbetracht der obigen Ausführungen wäre ein schnelles und verläßliches Verfahren zur Erhaltung von Information über das Methylierungsmuster einer Anfangs- oder Ziel-DNA von erheblichem Nutzen für den Stand der Technik. Deshalb wurde jetzt ein Verfahren zur Unterscheidung zwischen methylierten und nicht-methylierten Stellen in einer Anfangs-Nukleinsäure entwickelt, insbesondere für die Unterscheidung zwischen methylierten und nicht-methylierten Restriktionsschnittstellen von genomischer DNA. Allgemein umfaßt diese Methode mindestens:

(A) Erzeugen eines ersten DNA-Fingerabdrucks, enthaltend Banden, die nur den relevanten methylierten Stellen entsprechen; oder
(B) Erzeugen eines zweiten DNA-Fingerabdrucks, enthaltend Banden, die sowohl den relevanten methylierten als auch den relevanten nicht-methylierten Stellen entsprechen; und darüber hinaus gegebenenfalls umfasst
(C) Erzeugen eines dritten DNA-Fingerabdrucks, enthaltend Banden, die nur den relevanten nicht-methylierten Stellen entsprechen; sowie
(D) Analysieren und/oder Vergleichen des/der so erhaltenen Fingerabdrucks/Fingerabdrücke;

In einem Punkt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Untersuchung oder Bestimmung des Methylierungsmusters einer Ausgangs-DNA und/oder zum Unterscheiden zwischen methylierten und nicht-methylierten Stellen einer Ausgangs-DNA, der einen Vergleich einer Kombination von mindestens zwei DNA-Fingerabdrücken umfasst, die erzeugt werden, indem mindestens zwei unterschiedliche DNA-Fingerabdruckverfahren verwendet werden, die ausgewählt werden aus einer Gruppe bestehend aus:

A) Verfahren (A) umfassend:
A1) Restriktion einer Ausgangs-DNA mit einem Restriktionsenzym mit häufig vorkommenden Schnittstellen und einem methylierungssensitiven Restriktionsenzym mit selten vorkommenden Schnittstellen;
A2) Ligieren der so erhaltenen Restriktionsfragmente mit einem ersten und zweiten Adapter für das Restriktionsenzym mit häufig vorkommenden Schnittstellen sowie einem ersten Adapter für das Restriktionsenzym mit selten vorkommenden Schnittstellen, wobei die Adapter an die geschnittenen Enden der Restriktionsfragmente ligiert werden können;
A3) Amplifizieren der so erhaltenen Mischung unter Verwendung von Primern, die mit dem ersten und zweiten Adapter des Restriktions enzyms mit häufig vorkommenden Schnittstellen hybridisieren können;
A4) Restriktion der so erhaltenen amplifizierten Fragmente unter Verwendung eines methylierungs-sensitiven Restriktionsenzyms mit selten vorkommenden Schnittstellen;
A5) Ligieren der so erhaltenen Restriktionsfragmente mit einem zweiten AFLP-Adapter für das methylierungs-sensitive Restriktionsenzym mit selten vorkommenden Schnittstellen, der ein AFLP-Adapter ist;
A6) Ampflizieren der so erhaltenen Restriktionsfragmente unter Verwendung von auf AFLP beruhenden, selektiven Amplifizierungsschritten, umfassend die Verwendung eines AFLP-Primers für den ersten oder zweiten Adapter des Restriktionsenzyms mit häufig vorkommenden Schnittstellen und eines AFLP-Primers für den zweiten AFLP-Adapter des Restriktionsenzyms mit selten vorkommenden Schnittstellen;
A7) Erzeugen eines ersten DNA-Fingerabdrucks, enthaltend Banden, die nur den methylierten Schnittstellen des Restriktionsenzyms mit selten vorkommenden Schnittstellen entsprechen, durch Untersuchung der Mischung von amplifizierten Fragmenten beruhend auf dem Unterschied in der Größe oder dem Molekulargewicht der amplifizierten Fragmente, und Sichtbarmachung der amplifizierten Fragmente;
B) Verfahren (B) umfassend:
B1) Restriktion einer Ausgangs-DNA mit einem Restriktionsenzym mit häufig vorkommenden Schnittstellen;
B2) Ligieren der so erhaltenen Restriktionsfragmente mit einem dritten und vierten Adapter für das Restriktionsenzym mit häufig vorkommenden Schnittstellen, wobei die Adapter an die geschnittenen Enden der Restriktionsfragmente ligiert werden können;
B3) Amplifizieren der so erhaltenen Mischung unter Verwendung von Primern, die mit dem dritten und vierten Adapter des Restriktionsenzyms mit häufig vorkommenden Schnittstellen hybridisieren können;
B4) Restriktion der so erhaltenen amplifizierten Fragmente unter Verwendung eines methylierungs-sensitiven Restriktionsenzyms mit selten vorkommenden Schnittstellen;
B5) Ligieren der so erhaltenen Restriktionsfragmente mit einem dritten AFLP-Adapter für das methylierungs-sensitive Restriktionsenzym mit selten vorkommenden Schnittstellen, der ein AFLP-Adapter ist;
B6) Ampflizieren der so erhaltenen Mischung unter Verwendung von auf AFLP beruhenden selektiven Amplifizierungsschritten unter Verwendung eines AFLP-Primers für den dritten AFLP-Adapter des methylierungs-sensitiven Restriktionsenzyms mit selten vorkommenden Schnittstellen sowie eines AFLP-Primers für den dritten oder vierten AFLP-Adapter des Restriktionsenzyms mit häufig vorkommenden Schnittstellen;
B7) Erzeugen eines DNA-Fingerabdrucks, enthaltend Banden, die sowohl den relevanten methylierten als auch den relevanten nichtmethylierten Schnittstellen entsprechen, durch Untersuchung der Mischung von amplifizierten Fragmenten beruhend auf dem Unterschied in der Größe oder dem Molekulargewicht der amplifizierten Fragmente, und Sichtbarmachung der amplifizierten Fragmente;
C) Verfahren (C) umfassend:
C1) Restriktion einer Ausgangs-DNA mit einem Restriktionsenzym mit häufig vorkommenden Schnittstellen und einem methylierungssensitiven Restriktionsenzym mit selten vorkommenden Schnittstellen;
C2) Ligieren der so erhaltenen Restriktionsfragmente mit einem fünften Adapter für das Restriktionsenzym mit häufig vorkommenden Schnittstellen sowie einem vierten Adapter für das methylierungssensitive Restriktionsenzym mit selten vorkommenden Schnittstellen, wobei die Adapter an die geschnittenen Enden der Restriktionsfragmente ligiert werden können und die Adapter AFLP-Adapter sind;
C3) Amplifizieren der so erhaltenen Mischung unter Verwendung von auf AFLP beruhenden selektiven Amplifizierungsschritten, umfassend die Verwendung eines AFLP-Primers für den fünften AFLP-Adapter des Restriktionsenzyms mit häufig vorkommenden Schnittstellen sowie eines AFLP-Primers für den vierten AFLP-Adapter des methylierungs-sensitiven Restriktionsenzyms mit selten vorkommenden Schnittstellen;
C4) Erzeugen eines DNA-Fingerabdrucks, enthaltend Banden, die nur den nicht-methylierten Schnittstellen des Restriktionsenzyms mit selten vorkommenden Schnittstellen entsprechen, durch Untersuchung der Mischung von amplifizierten Fragmenten, beruhend auf dem Unterschied in der Größe oder dem Molekulargewicht der amplifizierten Fragmente, und Sichtbarmachung der amplifizierten Fragmente.

In einem Punkt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Erzeugung eines Fingerabdrucks, enthaltend Banden, die den methylierten Stellen einer Ausgangs-DNA entsprechen, umfassend:

1. Restriktion einer Ausgangs-DNA mit einem Restriktionsenzym mit häufig vorkommenden Schnittstellen und einem methylierungssensitiven Restriktionsenzym mit selten vorkommenden Schnittstellen;
2. Ligieren der so erhaltenen Restriktionsfragmente mit einem ersten und zweiten Adapter für das Restriktionsenzym mit häufig vorkommenden Schnittstellen, sowie einem ersten Adapter für das Restriktionsenzym mit selten vorkommenden Schnittstellen;
3. Amplifizieren der so erhaltenen Mischung unter Verwendung von Primern für den ersten und zweiten Adapter des Restriktionsenzyms mit häufig vorkommenden Schnittstellen;
4. Restriktion der so erhaltenen amplifizierten Fragmente unter Verwendung eines methylierungs-sensitiven Restriktionsenzyms mit selten vorkommenden Schnittstellen;
5. Ligieren der so erhaltenen Restriktionsfragmente mit einem zweiten Adapter für das methylierungs-sensitive Restriktionsenzym mit selten vorkommenden Schnittstellen, der ein AFLP-Adapter ist;
6. Ampflizieren der so erhaltenen Restriktionsfragmente unter Verwendung eines Primers für den ersten oder zweiten Adapter des Restriktionsenzyms mit häufig vorkommenden Schnittstellen und eines Primers für den zweiten Adapter des Restriktionsenzyms mit selten vorkommenden Schnittstellen;
7. Analysieren der so erhaltenen Mischung amplifizierter Fragmente auf eine an sich bekannte Weise, vorzugsweise durch die Erzeugung eines DNA-Fingerabdrucks.

Durch den Vergleich von mindestens zwei Fingerabdrücken, die aus (A), (B) und/oder (C) resultieren, kann Information über das Methylierungsmuster einer Ausgangs-DNA erhalten werden, wie nachfolgend weitergehend beschrieben wird.
Vorzugsweise werden mindestens die Fingerabdrücke erzeugt und miteinander verglichen, die aus (A) und (B) resultieren; bevor zugt werden alle drei Fingerabdrücke erzeugt und miteinander verglichen, die aus (A), (B) und (C) resultieren.
Zur Vereinfachung können die obigen Fingerabdrücke in Verbindung miteinander erzeugt werden, d. h. parallel und mehr oder weniger gleichzeitig unter Verwendung des gleichen Pools oder Ansatzes von Ausgangs-DNA, wie einem Ansatz intakter genomischer DNA, wie sie direkt aus dem relevanten Organismus erhalten wurde. Die resultierenden DNA-Fingerabdrücke können dann in getrennten Spuren des gleichen Elektrophoresegels laufen gelassen werden, wodurch der sofortige und einfache Vergleich der resultierenden Bandenmuster ermöglicht wird. Auf diese Weise kann die Information über das Methylierungsmuster direkt aus einem Gel erhalten werden. Ferner kann jeder Fingerabdruck auf einfache Weise in einer "Eintopfreaktion" unter Verwendung weitverbreiteter AFLP-Technologie und Ausrüstung erzeugt werden.
Obwohl es aus Gründen der Zuverlässigkeit und des einfachen Vergleichs allgemein bevorzugt wird, die obigen Fingerabdrücke gemeinsam zu erzeugen und laufen zu lassen, vorzugsweise ausgehend von der gleichen DNA oder der gleichen DNA-Präparation, wie einer Präparation von intakter genomischer DNA wie sie aus dem relevanten Organismus isoliert wird, ist es auch möglich, die mit (A) und/oder (B) erzeugten Muster mit bekannten DNA-Fingerabdrücken oder früher erhaltenen Ergebnissen, wie einer Datenbank, zu vergleichen. Diese äquivalente Methode ist ebenfalls eingeschlossen im Umfang der vorliegenden Erfindung. Ferner sollte klar sein, dass anstelle des bevorzugten Verfahrens zur Erzeugung eines DNA-Fingerabdrucks auch äquivalente Verfahren zur Untersuchung und/oder Sichtbarmachung der Restriktionsfragmentmischung verwendet werden können, insbesondere basierend auf Unterschieden in der Größe/dem Molekulargewicht der verschiedenen erzeugten Fragmente, wie jedem Fachmann bekannt ist.
Weitere Gesichtspunkte der Erfindung liegen in der Art, auf welche die oben angeführten Fingerabdrücke erhalten werden, sowie in der dabei benutzten AFLP-Methodik. Weitere Punkte liegen in den amplifizierten Fragmenten oder Mischungen von Fragmenten, die gemäß den unten beschriebenen Verfahren (A) und (B) erhalten werden.
Ein weiterer Gesichtspunkt umfaßt alle mit dem Verfahren der Erfindung erzeugten Daten, wahlweise auf einem geeigneten Datenträger wie Papier oder einem Computerdatenspeicher. Dies beinhaltet die erzeugten DNA-Fingerabdrücke (einschließlich der Gele), Fotos oder Reproduktionen derselben, sowie (gespeicherte) analoge oder digitale Daten davon.
Die Erfindung umfaßt außerdem Ausrüstungen zur Benutzung der Erfindung, mindestens umfassend: Ein Restriktionsenzym mit häufig vorkommenden Schnittstellen; ein methylierungs-sensitives Restriktionsenzym mit selten vorkommenden Schnittstellen; (mindestens) einen ersten und zweiten Adapter zur Verwendung mit dem Restriktionsenzym mit häufig vorkommenden Schnittstellen; und (wenigstens) einen ersten und zweiten Adapter zur Verwendung mit dem Restriktionsenzym mit den selten vorkommenden Schnittstellen; sowie Primer zur Verwendung mit diesen Adaptern; wobei diese Komponenten im wesentlichen wie hier beschrieben sind.
Die Ausrüstungen können darüber hinaus alle bekannten Komponenten für AFLP-Ausrüstungen enthalten, wie Restriktionsenzyme (in diesem Fall sind die Adapter vorzugsweise geeignet, an die mit den Restriktionsenzymen erzeugten Schnittstellen ligiert zu werden); eine Polymerase für die Amplifizierung, wie Taq-Polymerase; Nukleotide zur Verwendung bei der Primerverlängerung; sowie Puffer und andere Lösungen und Reagenzien; Anleitungen; etc.. Darüber hinaus wird auf die Europäische Patentanmeldung 0 534 858 hingewiesen.
Ferner sollte beachtet werden, dass das Verfahren der Erfindung einige Merkmale umfaßt und/oder kombiniert, die als solche ebenfalls in anderen AFLP-Verfahren und/oder Anwendungen benutzt werden können, wie nachfolgend erörtert werden wird. Diese bilden getrennte Ausführungsformen der Erfindung.
Das Verfahren der Erfindung wird mittels der beigefügten Figuren veranschaulicht, wobei
1 schematisch das allgemeine Verfahren (A) zeigt, um einen DNA-Fingerabdruck zu erhalten, der nur die methylierten Stellen zeigt; und
2 schematisch das allgemeine Verfahren (B) zeigt, um einen DNA-Fingerabdruck zu erhalten, der sowohl die methylierten als auch die nicht-methylierten Stellen zeigt;
3 schematisch ein allgemeines Verfahren zeigt, um einen DNA-Fingerabdruck zu erhalten, der nur die nicht-methylierten Stellen enthält.
4 zeigt die Bildung von Einzelstrang-DNA-Schleifenstrukturen bei Fragmenten geeigneter Länge, die an jedem Ende mit dem hybridisierenden oder gleichen Adapter ligiert wurden.
5 zeigt die Unterschiede in den wesentlichen Banden, die mit den Verfahren der 1, 2 und 3 erhalten wurden.
6 zeigt eine allgemeine schematische Darstellung des Verfahrens der Erfindung für die Enzymkombination (EC) PstI/MseI, in welcher die oben genannten Verfahren A, B und C (wie in 1 bis 3 gezeigt) nebeneinander gezeigt sind.
7A und B zeigen Methylierungs-AFLP-Fingerabdrücke. 7A und B zeigen eine Reihe von typischen Methylierungs-AFLP-Fingerabdrücken, die mit der zwei-stufigen Amplifizierungsstrategie aus genomischer DNA der drei durch Inzucht erzeugten Mais-Linien A7, B73 und Mo17 erhalten wurden.
8A und 8B sind DNA-Fingerabdrücke, die die Auftrennung des (A) PstI/MseI ^mAFLP-Markers und (B) PstI/MseI AFLP-Markers bei einer rekombinanten Inzucht (RI) Population zeigen, die aus einer Kreuzung von zwei Mais-Linien erhalten wurde.
Die in der Erfindung benutzte Ausgangs-DNA kann jede DNA sein, die DNA-Methylierung enthält, verdächtigt wird, DNA-Methylierung zu enthalten oder auf DNA-Methylierung untersucht wird (einschließlich hemi-methylierter DNA). Gewöhnlich wird native methylierte DNA verwendet, insbesondere genomische DNA; wenn genomische DNA verwendet wird, wird das Verfahren der Erfindung im all- gemeinen benutzt, um zwischen nativen methylierten und nativen nicht-methylierten Stellen zu unterscheiden, wobei obiges Verfahren (A) benutzt wird, um einen ersten DNA-Fingerabdruck zu erzeugen, der Banden enthält, die nur den relevanten nativen methylierten Stellen entsprechen; obiges Verfahren (B) wird benutzt, um einen zweiten DNA-Fingerabdruck zu erzeugen, der Banden enthält, die sowohl den relevanten nativen methylierten als auch den relevanten nativen nicht-methylierten Stellen entsprechen; und Verfahren (C) – falls angewandt- wird benutzt, um einen dritten DNA-Fingerabdruck zu erzeugen, der Banden enthält, die nur den relevanten nativen nicht-methylierten Stellen entsprechen.
Die Ausgangs-DNA kann von jeder geeigneten Quelle erhalten werden, wie prokaryontischen oder eukaryontischen Organismen (einschließlich Viren, Hefen und Bakterien), abhängig von der geplanten Anwendung. Vorzugsweise wird eukaryontische DNA verwendet, noch bevorzugter aus Pflanzen oder Tieren (einschließlich des Menschen) stammende DNA. Ferner kann auch DNA verwendet werden, die mit Methylierung versehen wurde (d. h. als ein Marker) oder die einer Methylierungsbehandlung unterzogen wurde.
Anstelle von DNA kann die Erfindung darüber hinaus auf andere Arten von methylierten Nukleinsäuren angewandt werden, wie methylierter Einzelstrang-RNA, die von Natur aus in der Zelle vorkommen kann.
Bei dem Verfahren der Erfindung werden zwei verschiedene Restriktionsenzyme verwendet: Ein Enzym dient dem Zweck, die Größe der Restriktionsfragmente auf einen Größenbereich zu beschränken, der effektiv amplifiziert wird, nachfolgend als "Restriktionsenzym mit häufig vorkommenden Schnittstellen" bezeichnet, und ein weiteres Enzym, das dem Zweck dient, seltene Sequenzen anzuvisieren, nachfolgend als "Restriktionsenzym mit selten vorkommenden Schnittstellen" bezeichnet. Für die Bezeichnungen Restriktionsenzym mit selten vorkommenden Schnittstellen und Restriktionsenzym mit häufig vorkommenden Schnittstellen wird auf EP-A-721 987 des Anwenders verwiesen.
Wenigstens eins der verwendeten Enzyme muss sensitiv gegenüber (dem Status der) Methylierung der anvisierten Schnittstelle sein, d. h. fähig sein, zwischen methylierten und nicht-methylierten Schnittstellen in der Ziel-DNA zu unterscheiden. In der Praxis wird im allgemeinen ein methylierungs-sensitives Restriktionsenzym mit selten vorkommenden Schnittstellen benutzt.
Beispiele für geeignete Restriktionsenzyme mit häufig vorkommenden Schnittstellen sind MseI und TagI.
Beispiele für geeignete, kommerziell erhältliche, methylierungssensitive Restriktionsenzyme mit selten vorkommenden Schnittstellen sind PstI, HpaII, MspI, ClaI, HhaI, EcoRII, BstBI, HinP1, MaeII, BbvI, PvuII, XmaI, SmaI, NciI, AvaI, HaeII, SalI, XhoI und PvuII, von denen PstI, HpaII, MspI, ClaI, EcoRII, BstBI, HinP1 und MaeII bevorzugt werden. Andere geeignete Restriktionsenzyme sind beispielsweise beschrieben in US-A-5,487,994, US 5,340,733 , oder sind dem Fachmann bekannt. Methylierungs-sensitive Mutanten dieser und anderer Restriktionsenzyme können ebenfalls verwendet werden.
Zur Untersuchung von eukaryontischer genomischer DNA werden vorzugsweise C-methylierungs-sensitive Restriktionsenzyme verwendet. Außerdem werden in der allgemeinen Praxis der Erfindung Restriktionsenzyme verwendet werden, die die nicht-methylierten Schnittstellen spalten, aber nicht die entsprechenden methylierten Schnittstellen. Trotzdem können Enzyme, die die methylierten Stellen spalten und nicht die entsprechenden nicht-methylierten Schnittstellen, wie DpnI, analog verwendet werden.
Von den oben genannten Restriktionsenzymen wird aus den nachfolgend erörterten Gründen die Verwendung der Enzyme bevorzugt, die nach dem Verdau eine geschnittene doppelsträngige DNA mit einem 3'-überhängenden Ende zurücklassen, wie PstI.
Allgemein werden zur Erzeugung der aus (A), (B) und/oder (C) resultierenden Fingerabdrücke nur ein Restriktionsenzym mit häufig vorkommenden Schnittstellen und ein Restriktionsenzym mit selten vorkommenden Schnittstellen verwendet. Dennoch ist die Verwendung von mehr als einem Restriktionsenzym mit häufig vorkommenden Schnittstellen und insbesondere von mehr als einem Restriktionsenzym mit selten vorkommenden Schnittstellen ebenfalls von der Erfindung umfasst. Auch sollten die für die Erzeugung der aus (A), (B) und/oder (C) resultierenden Fingerabdrücke verwendeten Restriktionsenzyme im allgemeinen die gleichen sein, um den Vergleich der erhaltenen Fingerabdrücke zu ermöglichen, obwohl die Verwendung verschiedener Enzyme bei diesen Verfahren vom Erfindungsgedanken erfaßt ist, solange die erhaltenen Fingerabdrücke einen Vergleich miteinander oder zu bekannten Daten erlauben oder andererseits Information über die Methylierung der Ausgangs-DNA liefern.
Aus Gründen der Vereinfachung wird die Erfindung nachfolgend unter Verwendung der nicht-einschränkenden Kombination des Restriktionsenzyms MseI mit häufig vorkommenden Schnittstellen und des methylierungs-sensitiven Restriktionsenzym PstI mit selten vorkommenden Schnittstellen ausführlicher erläutert. Es sollte dennoch klar sein, dass jede andere geeignete Kombination von einem Restriktionsenzym mit häufig vorkommenden Schnittstellen und einem Restriktionsenzyme mit selten vorkommenden Schnittstellen, beispielsweise ausgewählt aus den oben angegebenen Enzymen, ebenfalls verwendet werden kann.
Ferner sollte klar sein, dass obwohl die Verfahren (A), (B) und (C) die einfachsten und bevorzugtesten Arten zur Erzeugung der Methylierungsmusterdaten (Fingerabdrücke) darstellen, äquivalente Verfahren oder Schritte ebenfalls verwendet werden können, insbesondere äquivalente Amplifizierungsverfahren, solange die erhaltenen Ergebnisse Information über die Methylierung der Ausgangs-DNA liefern.
Das Verfahren der Erfindung kann außerdem unter Verwendung der bekannten genetischen Manipulationstechniken ausgeführt werden, wie beschrieben in Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2nd. ed.), Vols. 1–3, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) und F. Ausubel et al, eds., "Current protocols in molecular biology", Green Publishing and Wiley Interscience, New York (1987), sowie Verwendung der Standard AFLP-Methodik und Ausrüstung auf eine an sich bekannte Weise oder analog dazu. Für AFLP wird wiederum auf EP-A-O 534 858 als Referenz verwiesen. Die Restriktionsenzyme und andere kommerziell erhältliche Produkte werden im allgemeinen gemäß den Anleitungen der Hersteller benutzt.
A. Verfahren zur Erzeugung eines Fingerabdrucks, enthaltend Banden, die den methylierten Stellen entsprechen.
Diese Ausführungsform der Erfindung umfasst:

1. Restriktion einer Ausgangs-DNA mit einem Restriktionsenzym mit häufig vorkommenden Schnittstellen und einem methylierungssensitiven Restriktionsenzym mit selten vorkommenden Schnittstellen;
2. Ligieren der so erhaltenen Restriktionsfragmente mit einem ersten und zweiten Adapter für das Restriktionsenzym mit häufig vorkommenden Schnittstellen, sowie einem ersten Adapter für das Restriktionsenzym mit selten vorkommenden Schnittstellen;
3. Amplifizieren der so erhaltenen Mischung unter Verwendung von Primern für den ersten und zweiten Adapter des Restriktionsenzyms mit häufig vorkommenden Schnittstellen;
4. Restriktion der so erhaltenen amplifizierten Fragmente unter Verwendung eines methylierungs-sensitiven Restriktionsenzyms mit selten vorkommenden Schnittstellen;
5. Ligieren der so erhaltenen Restriktionsfragmente mit einem zweiten Adapter für das methylierungs-sensitive Restriktionsenzym mit selten vorkommenden Schnittstellen;
6. Amplifizieren der so erhaltenen Restriktionsfragmente unter Verwendung eines Primers für den ersten oder zweiten Adapter des Restriktionsenzyms mit häufig vorkommenden Schnittstellen und eines Primers für den zweiten Adapter des Restriktionsenzyms mit selten vorkommenden Schnittstellen;
7. Gegebenenfalls Analyse der so erhaltenen Mischung amplifizierter Fragmente auf eine an sich bekannte Weise, vorzugsweise durch die Erzeugung eines DNA-Fingerabdrucks.

Verfahren (A) ist schematisch in 1 und (zusammen mit Verfahren B und C) in 5 dargestellt, die beide eine Ausgangs-DNA (im allgemeinen vollständige – d. h. ungeschnittene – genomische DNA) zeigen, die Schnittstellen für ein Restriktionsenzym mit häufig vorkommenden Schnittstellen (MseI) sowie methylierten und nicht-methylierten Schnittstellen für ein Restriktionsenzym mit selten vorkommenden Schnittstellen (PstI) enthält.
In Schritt 1 wird die Ausgangs-DNA auf eine an sich bekannte Weise gespalten, sowohl unter Verwendung des Restriktionsenzyms MseI mit häufig vorkommenden Schnittstellen als auch des Restriktionsenzyms PstI mit selten vorkommenden Schnittstellen. Dies spaltet sowohl die MseI-Schnittstellen als auch die nicht-methylierten PstI-Schnittstellen, läßt aber die methylierten PstI-Schnittstellen intakt. Bevorzugt werden die Restriktionen mit PstI und MseI gleichzeitig unter Verwendung einer Mischung dieser Enzyme ausgeführt, obwohl es auch möglich ist, zwei getrennte Restriktionsschritte zu verwenden.
In Schritt 2 wird die Restriktionsmischung auf eine an sich bekannte Weise mit Adaptern ligiert, wobei eine Mischung von zwei unterschiedlichen MseI-Adaptern, d. h. einem "ersten" und einem "zweiten" MseI-Adapter, sowie einem ersten PstI-Adapter verwendet wird (Die Adapter werden in den 1–4 jeweils mit "M1", "M2" und "P1" bezeichnet. Die Bezeichnungen "erster", "zweiter" Adapter/Primer etc. werden in dieser Offenbarung nur verwendet, um die unterschiedlichen verwendeten Adapter /Primer zu kennzeichnen/zu unterscheiden. Jeder Adapter/Primer, der die unten angegebenen Bedingungen erfüllt, kann als solcher als erster, zweiter oder irgendein weiterer Primer/Adapter verwendet werden.) .
Der erste und zweite MseI-Adapter (M1, M2) sowie der erste PstI-Adapter (P1) sind im wesentlichen wie in EP-A-O 534 858 beschrieben, oder dadurch analog dazu, dass sie für die Verwendung als Adapter bei AFLP geeignet sind und sie jeweils an die geschnittenen Enden der MseI-Fragmente oder PstI-Fragmente ligiert werden können. Außerdem sind bei dem Verfahren der Erfindung der erste und zweite verwendete MseI-Adapter (M1, M2) vorzugsweise so, dass sie unter den verwendeten Bedingungen nicht miteinander hybridisieren können. Dies verhindert die Bildung von DNA-Schleifenstrukturen, wie in 4 gezeigt, die die Amplifizierung des Fragments behindern können. Vorzugsweise werden der erste und zweite MseI-Adapter (M1, M2) in ungefähr gleichen Mengen verwendet. Die Menge an PstI-Adapter (P1) (verglichen mit der Menge an MseI) kann im allgemeinen durch den Fachmann geeignet gewählt werden.
Nach der Ligation der oben genannten Adapter wird eine Mischung von verschiedenen Restriktionsfragmenten erhalten. Für die Zwecke der Erfindung können diese in die folgenden Arten unterteilt werden.

– MseI/MseI-Fragmente, die entweder eine ungeschnittene methylierte PstI-Schnittstelle enthalten (in 1 mit I-A bezeichnet) oder nicht enthalten (in 1 mit II-A bezeichnet). von diesen Fragmenten sind in 1 nur diejenigen gezeigt, welche an jedem Ende unterschiedliche MseI-Adapter (M1, M2) haben. Fragmente mit den gleichen MseI-Adaptern (M1/M1 oder M2/M2) an jedem Ende (nicht gezeigt) werden ebenfalls erhalten, aber diese werden aufgrund der oben beschriebenen Schleifenbildung nicht effizient amplifiziert.
– PstI/MseI-Fragmente, die entweder den ersten oder den zweiten MseI-Adapter (M1, M2) an einem Ende, und den ersten PstI-Adapter (P1) am anderen Ende enthalten (von diesen beiden sind in 1 nur die Fragmente mit dem ersten MseI-Adapter als III-A/III-B (M1/P1, P1/M1) gezeigt). Selten können diese Fragmente auch ungeschnittene methylierte PstI-Stellen enthalten.
– PstI/PstI-Fragmente (in 1 als IV-A gezeigt). Diese Fragmente, die weitere methylierte PstI-Stellen enthalten oder nicht enthalten können, werden sehr selten und im allgemeinen aufgrund der relativen Häufigkeit von MseI-Stellen im Genom viel länger als die MseI/MseI-Fragmente I-A/II-A oder die PstI/MseI-Fragmente III-A sein.

Wie dem Fachmann bewusst ist, werden im allgemeinen einige verschiedene Fragmente jeder Art mit unterschiedlichen Längen oder unterschiedlichen Positionen der nicht-geschnittenen methylierten PstI-Stellen in der nach der Adapter-Ligation erhaltenen Mischung vorhanden sein, abhängig vom Restriktionsschnittstellen- und Methylierungsmuster der Ausgangs-DNA. [Ferner sollte klar sein, dass für jedes in 1 gezeigte MseI/MseI-Fragment ein ent- sprechendes Fragment (nicht gezeigt) vorhanden ist, in welchem der erste und der zweite Mseh-Adapter (M1, M2) vertauscht sind (d. h. an die entgegengesetzten Enden des Fragments gebunden). Für die Zwecke des vorliegenden Verfahrens können diese im wesentlichen als äquivalent zu den in 1 gezeigten Fragmenten betrachtet werden, wie nachfolgend ersichtlich werden wird.]
In Schritt 3 wird die aus Schritt 2 erhaltene Fragmentmischung unter Verwendung einer Mischung von Primern für den ersten und zweiten MseI-Adapter (M1, M2) amplifiziert. Diese Primer sind im wesentlichen wieder wie in EP-A-O 534 858 beschrieben oder dadurch analog dazu, dass sie für die Verwendung als Primer bei der AFLP geeignet sind, und sie jeweils mit den verwendeten ersten und zweiten MseI-Adaptern (M1, M2) hybridisieren können. Die Anzahl der benötigten selektiven Nukleotide bei einem spezifischen Primer/für eine spezifische Anwendung kann Spezies-abhängig sein.
Die Amplifizierung selbst kann in einer an sich bekannten Weise ausgeführt werden, wie in EP-A-O 534 858 beschrieben oder in einer dazu analogen Weise, und wird vorzugsweise als eine (Prä)-Amplifizierung unter Verwendung nicht-selektiver Primer ausgeführt, d. h. am 3'-Ende der Primersequenz sind keine selektiven Nukleotide enthalten oder höchstens eine selektive Base. Bevorzugt werden der erste und zweite Primer in ungefähr gleichen Mengen verwendet.
Während dieses Amplifizierungsschritts werden nur die MseI-MseI-Fragmente I-A und II-A, die eine methylierte PstI-Schnittstelle enthalten oder nicht enthalten – abhängig von der Ursprungs-DNA und der Position der MseI- und methylierten PstI-Schnittstellen darin – exponentiell und effizient amplifiziert. Da keine PstI-Primer verwendet werden, werden die PstI/MseI-Fragmente III-A nur linear amplifiziert und die PstI/PstI-Fragmente IV werden überhaupt nicht amplifiziert.
Da die Amplifizierung außerdem in einem nur nicht-methylierte Nukleotide enthaltenden Medium durchgeführt wird, verlieren die Fragmente I-A ihre Methylierungskennzeichnung; die entsprechenden nicht-methylierten Fragmente, wie sie nach der Amplifizierung erhalten werden, sind in 1 mit I-A' bezeichnet. Diese I-A'-Fragmente können nun unter Verwendung von PstI im nachfolgenden Restriktionsschritt 4 gespalten werden. Diese Restriktion wird die Fragmente II-A nicht betreffen, die ursprünglich keine PstI-Schnittstelle enthielten.
Weil die so erhaltenen amplifizierten Fragmente jetzt nicht methyliert sind, kann in Schritt 4 außerdem ein nicht-methylierungs-sensitives Isoschizomer anstelle des entsprechenden methylierungsensitiven Restriktionsenzyms benutzt werden, das die gleiche (nicht-methylierte) Restriktionsschnittstelle schneidet. Wenn beispielsweise das methylierungs-sensitive EcoRII verwendet wird, kann bei Schritt 4 dessen nicht-methylierungs-sensitives Isoschizomer BstNI benutzt werden.
Nach Restriktionsschritt 4 werden die PstI-geschnittenen Enden des Restriktionsfragments I-A' in Schritt 5 mit einem zweiten PstI-Adapter (P2) ligiert, wobei das ursprüngliche Fragment I-A zwei Fragmente I-B und I-C liefert, die den zweiten PstI-Adapter (P2) an einem Ende und entweder den ersten oder den zweiten MseI-Adapter (M1, M2) am anderen Ende enthalten. [Da es in der Tat ursprünglich zwei oben beschriebene äquivalente Fragmente I-A sind, welche sich nur bezüglich des Endes unterscheiden, an das der erste bzw. zweite MseI-Adapter (M1, M2) gebunden ist, werden außerdem zwei Paare von äquivalenten Fragmenten I-B und I-C erhalten (nicht gezeigt), die einander entsprechende Längen haben und sich nur bezüglich des dem zweiten PstI-Adapter (P2) gegenüberliegenden MseI-Adapters unterscheiden. Wie unten ersichtlich wird, können diese Fragmente für die Zwecke des vorliegenden Verfahrens als äquivalent zu den Fragmenten I-B und I-C angenommen werden und werden nicht weiter unterschieden werden.]
Der zweite PstI-Adapter (in den 1–3 mit "P2" bezeichnet) ist im wesentlichen wieder wie in EP-A-O 534 858 beschrieben oder dadurch analog dazu, dass er für die Verwendung als Adapter bei AFLP geeignet ist und an die PstI geschnittenen Enden der Fragmente I-B und I-C ligiert werden kann. Dennoch sollte sich der zweite Adapter (P2) des Restriktionsenzyms mit selten vorkommenden Schnittstellen von dem ersten Adapter (P1) unterscheiden, d. h. nicht fähig sein, mit dem ersten Adapter des Restriktionsenzyms mit selten vorkommenden Schnittstellen unter den verwendeten Bedingungen zu hybridisieren. Wie unten außerdem angemerkt, ist der zweite PstI-Adapter (P2) vorzugsweise der gleiche wie der in Schritt 5 des unten genannten Verfahrens B verwendete dritte PstI-Primer.
Die entsprechenden Längen der Fragmente I-B und I-C hängen von der Länge des Ursprungsfragments I-A und der Position der darin enthaltenen methylierten PstI-Schnittstelle ab; normalerweise unterscheiden sich die Fragmente I-B und I-C in der Länge/dem Molekulargewicht voneinander und unterscheiden sich außerdem in der Länge/dem Molekulargewicht von den ungeschnittenen Fragmenten II-A, so dass diese Fragmente unter Verwendung eines geeigneten Verfahrens unterschieden werden können.
Zu diesem Zweck wird die Mischung in Schritt 6 unter Verwendung eines geeigneten Primers für den zweiten PstI-Adapter (P2) sowie mindestens einem geeigneten Primer für den ersten (M1) und/oder zweiten (M2) MseI-Rdapter amplifiziert.
Am Besten wird neben dem PstI-Primer nur ein MseI-Primer (d. h. entweder für den ersten (M1) oder den zweiten (M2) MseI-Adapter) verwendet. Auf diese Weise werden nur die Fragmente exponentiell amplifiziert, die einen PstI-Adapter an einem Ende und den entsprechenden MseI-Adapter am anderen Ende enthalten. Andere in der Mischung vorliegende Fragmente werden nur linear amplifiziert und/oder weniger effizient oder überhaupt nicht, entweder aufgrund der Schleifenbildung, oder weil nur einer oder keiner der für die exponentielle Amplifizierung benötigten Primer zur Verfügung steht, wodurch sowohl die Gesamtzahl der Banden im endgültigen Fingerabdruck als auch die Anzahl der nicht-aufschlußreichen Banden beschränkt wird.
Der Amplifizierungsschritt selbst kann auf eine an sich bekannte Weise ausgeführt werden, wie in EP-A-O 534 858 beschrieben oder auf eine dazu analoge Weise, und wird vorzugsweise als eine zweistufige Amplifizierung ausgeführt, wobei der erste Schritt eine (Prä)-Amplifizierung unter Verwendung eines Primers für den zweiten PstI-Adapter (P2) mit einem selektiven Nukleotid am 3'-Ende der Primersequenz und einem Primer für den ersten (respektive zweiten) MseI-Adapter (M1, M2) mit einem selektiven Nukleotid am 3'-Ende der Primersequenz (sogenannter +1 Primer) ist. Daran schließt sich eine Amplifizierung unter Verwendung von selektiven Primern für den zweiten PstI-(P2) und ersten (M1) (respektive zweiten (M2)) MseI-Rdapter an, zum Beispiel unter Verwendung von Primern, die drei selektive Nukleotide am 3'-Ende (+3 Primer) enthalten. Sowohl bei der Prä-Amplifizierung als auch bei der endgültigen Amplifizierung können die entsprechenden Primer in ungefähr gleichen Mengen verwendet werden.
Bei Schritt 6 kann die Anzahl der benötigten selektiven Nukleotide bei einem spezifischen Primer für eine spezifische Anwendung Spezies-abhängig sein. Zum Beispiel kann für Mais eine +2/+3 Amplifizierung und die doppelte +3/+3 Selektivität für die PstI/MseI Primerkombination (PC) verwendet werden.
Die resultierenden amplifizierten Fragmente werden dann unter Verwendung eines geeigneten Verfahrens sichtbar gemacht, wie der Entwicklung eines DNA-Fingerabdrucks mittels Gelelektrophorese. Mindestens wird dieser Fingerabdruck Banden zeigen, die den Fragmenten der Art I-B und I-C entsprechen, die durch Vergleich mit Fingerabdrücken, die gemäß den Verfahren (B) oder (C) erzeugt wurden, oder mit bekannten Daten, Informationen über das Methylierungsmuster der Ausgangs-DNA liefern können, wie unten weiter erörtert.
Der Fingerabdruck kann auch kleinere und/oder weniger aufschlußreiche Banden enthalten, die – obwohl sie immer noch einige nützliche Informationen über die Ausgangs-DNA liefern können – nicht entscheidend für die Zwecke der Erfindung sind. Im allgemeinen werden diese Banden die für die Zwecke der Erfindung wesentliche Information nicht beeinträchtigen.
B. Verfahren zur Erzeugung eines Fingerabdrucks, der Banden enthält, die sowohl den methylierten als auch nicht-methylierten Schnittstellen entsprechen.
Diese Ausführungsform der Erfindung umfasst:

1. Restriktion einer Ausgangs-DNA mit einem Restriktionsenzym mit häufig vorkommenden Schnittstellen;
2. Ligieren der so erhaltenen Restriktionsfragmente mit einem dritten und vierten Adapter für das Restriktionsenzym mit häufig vorkommenden Schnittstellen;
3. Amplifizieren der so erhaltenen Mischung unter Verwendung von Primern für den dritten und vierten Adapter des Restriktionsenzyms mit häufig vorkommenden Schnittstellen;
4. Restriktion der so erhaltenen amplifizierten Fragmente unter Verwendung eines methylierungs-sensitiven Restriktionsenzyms mit selten vorkommenden Schnittstellen;
5. Ligieren der so erhaltenen Restriktionsfragmente mit einem dritten Adapter für das methylierungs-sensitive Restriktionsenzym mit selten vorkommenden Schnittstellen;
6. Amplifizieren der so erhaltenen Mischung unter Verwendung eⁱnes Primers für den dritten Adapter des methylierungs-sensitiven Restriktionsenzyms mit selten vorkommenden Schnittstellen sowie eines Primers für den dritten und vierten Adapter des Restriktionsenzyms mit häufig vorkommenden Schnittstellen;
7. Gegebenenfalls Analyse der so erhaltenen Mischung von amplifizierten Fragmenten auf eine an sich bekannte Weise, vorzugsweise durch Erzeugen eines DNA-Fingerabdrucks.

Verfahren (B) ist schematisch in 2 dargestellt, die ein DNA-Fragment zeigt, das Schnittstellen (wieder als kleine Pfeile in der Sequenz gezeigt) für ein Restriktionsenzym (MseI) mit häufig vorkommenden Schnittstellen sowie methylierte (große Pfeile mit Kreuz) und nicht-methylierte (große Pfeile) Schnittstellen für ein Restriktionsenzym (PstI) mit selten vorkommenden Schnittstellen enthält.
Bei Verfahren (B) sind der dritte und vierte Adapter des Restriktionsenzyms mit häufig vorkommenden Schnittstellen und der zweite und dritte Adapter des Restriktionsenzyms mit selten vorkommenden Schnittstellen im wesentlichen wiederum wie in EP-A-O 534 858 beschrieben oder dadurch analog dazu, dass sie für die Verwendung als Adapter bei AFLP geeignet sind und dass sie jeweils an die geschnittenen Enden der Fragmente des Restriktionsenzyms mit häufig vorkommenden Schnittstellen und der Fragmente des Restriktionsenzyms mit selten vorkommenden Schnittstellen ligiert werden können. Die beiden Adapter des Restriktionsenzyms mit häufig vorkommenden Schnittstellen sind vorzugsweise wieder der Art, dass sie unter den verwendeten Bedingungen nicht miteinander hybridisieren können, um die unerwünschte Schleifenbildung zu vermeiden.
Der dritte und vierte Restriktionsenzym-Adapter können sich in der Sequenz und/oder der Anzahl der Nukleotide von dem ersten und dem zweiten in obigen Verfahren (A) oder bei Verfahren (C) unten verwendeten Adaptern des Restriktionsenzyms mit häufig vorkommenden Schnittstellen unterscheiden. Dennoch sind aus Gründen der Vereinfachung, und um die Gesamtzahl der für die Ausführung der Erfindung benötigten unterschiedlichen Adapter zu minimieren, der dritte und vierte Adapter für das Restriktionsenzym mit häufig vorkommenden Schnittstellen vorzugsweise die gleichen wie jeweils der erste und der zweite oben verwendete Adapter des Restriktionsenzyms mit häufig vorkommenden Schnittstellen. Dies gestattet außerdem einen noch direkteren Vergleich der erhaltenen Fingerabdrücke, wodurch das gesamte Verfahren noch zuverlässiger wird.
Obwohl der dritte Adapter des Restriktionsenzyms mit selten vorkommenden Schnittstellen sich außerdem sowohl in der Sequenz als auch in der Anzahl der Nukleotide von dem ersten und zweiten in Verfahren (A) verwendeten Adapter des Restriktionsenzyms mit selten vorkommenden Schnittstellen unterscheiden kann, ist der vorzugsweise in Verfahren (B) verwendete dritte Adapter des Restriktionsenzyms mit häufig vorkommenden Schnittstellen der gleiche wie der in Schritt 5/6 verwendete zweite Adapter des Restriktionsenzyms mit selten vorkommenden Schnittstellen von Verfahren (A) oben.
Nachfolgend werden gemäß dieser bevorzugten Ausführungsform der dritte und vierte Adapter des Restriktionsenzyms mit häufig vorkommenden Schnittstellen und der dritte Adapter des Restriktionsenzyms mit selten vorkommenden Schnittstellen als "erster" (M1) und "zweiter" (M2) MseI-Primer und "zweiter" Pst1-Primer (P2) bezeichnet.
In Schritt 1 wird die Ausgangs-DNA unter Verwendung des Restriktionsenzyms MseI mit häufig vorkommenden Schnittstellen auf eine an sich bekannte Weise gespalten. Dies spaltet die MseI-Schnittstellen, läßt aber sowohl die methylierten als auch die nicht-methylierten PstI-Schnittstellen intakt.
In Schritt 2 wird die Restriktionsmischung mit Adaptern unter Verwendung einer Mischung des ersten und zweiten MseI-Adapters (M1, M2) auf eine an sich bekannte Weise ligiert.
Nach der Ligation der Adapter des Restriktionsenzyms mit häufig vorkommenden Schnittstellen wird eine Mischung von verschiedenen Restriktionsfragmenten erhalten. Von diesen Fragmenten sind in 2 nur diejenigen Fragmente gezeigt, welche unterschiedliche MseI-Adapter (M1/M2) an jedem Ende enthalten. Es sollte dennoch klar sein, dass auch entsprechende Fragmente (nicht gezeigt) erhalten werden, die entweder den ersten oder den zweiten Adapter des Restriktionsenzyms mit häufig vorkommenden Schnittstellen an beiden Enden (M1/M1, M2/M2) des Fragments enthalten. Aufgrund der oben erwähnten Schleifenbildung werden diese Fragmente während des anschließenden Amplifizierungsschritts nicht effizient amplifiziert.
Von den Fragmenten, die den ersten (M1) und den zweiten (M2) in 2 gezeigten Adapter des Restriktionsenzyms mit häufig vorkommenden Schnittstellen enthalten, können für die Zwecke des vorliegenden Verfahrens drei verschiedene Arten von Fragmenten unterschieden werden, d. h. eine Art enthält die methylierte(n) PstI-Schnittstelle(n) (in 2 mit V-A bezeichnet), eine zweite Art enthält die ursprünglich nicht-methylierte(n) PstI-Schnittstelle(n) (in 2 mit VI-A bezeichnet) und eine dritte Art enthält keine PstI-Schnittstellen (in 2 mit VII bezeichnet).
Wie oben werden, in der nach der Adapterligation erhaltenen Mischung wiederum einige verschiedene Fragmente jeder Art mit unterschiedlichen Längen und/oder (bei Fragmenten V-A und VI-A) Positionen der PstI-Schnittstellen vorhanden sein, abhängig vom Restriktionsschnittstellenmuster und dem Methylierungsmuster der Ausgangs-DNA. [Ferner sollte es wiederum klar sein, dass für jede in 2 gezeigte Fragmentart ein entsprechendes Fragment (nicht gezeigt) vorhanden ist, in welchem der erste und der zweite Adapter vertauscht sind (d. h. an die entgegengesetzten Enden gebunden, wie in 2 gezeigt). Für die Zwecke des vorliegenden Verfahrens können diese im wesentlichen als äquivalent zu den in 2 gezeigten Fragmenten angesehen werden, wie nachfolgend ersichtlich werden wird.]
In Schritt 3 wird die aus Schritt 2 erhaltene Fragmentmischung unter Verwendung einer Mischung von Primern für den ersten (M1) und zweiten (M2) MseI-Adapter amplifiziert. Diese Primer sind wiederum im wesentlichen wie in EP-A-O 534 858 beschrieben oder dadurch analog dazu, dass sie für die Verwendung als Primer bei AFLP geeignet sind und sie jeweils mit den ersten (M1) und zweiten (M2) verwendeten MseI-Adaptern hybridisieren können. Die Anzahl der benötigten selektiven Nukleotide bei einem spezifischen Primer/für eine spezifische Anwendung kann wiederum Spezies-abhängig sein.
Es sollte außerdem beachtet werden, dass die in Verbindung mit jedem der entsprechenden Adapter verwendeten Primer, wenn mög- lich, für die Verfahren (A), (B) und (C) vorzugsweise im wesentlichen die gleichen für jeden der verwendeten Adapter sind, dergestalt, dass sie die gleiche Sequenz in der Hybridisierungsregion mit dem Adapter haben und sich möglicherweise nur im Vorhandensein von selektiven Basen an ihrem 3'-Ende unterscheiden, d. h. in deren Anzahl und/oder bezüglich der spezifischen Nukleotide. Dies ermöglicht es, die gleichen Primer zu benutzen, oder die Primer in Verbindung miteinander zu synthetisieren und/oder von der entsprechenden nicht-selektiven Primersequenz auszugehen, so dass eine begrenzte Anzahl an Ausgangsmaterialien (Primer) benötigt wird, um die drei Verfahren der Erfindung auszuführen.
Die Amplifizierung selbst kann auf eine an sich bekannte Weise ausgeführt werden, wie in EP-A-O 534 858 beschrieben oder auf eine dazu analoge Weise, und wird vorzugsweise als eine (Prä)-Amplifizierung unter Verwendung von nicht-selektiven Primern durchgeführt, d. h. am 3'-Ende der Primersequenz sind keine selektiven Nukleotide enthalten oder höchstens eine selektive Base. Bevorzugt werden der erste und zweite Primer in ungefähr gleichen Mengen verwendet.
Während des Amplifizierungsschritts wird eine exponentielle Amplifzierung aller Fragmente erhalten, die zwei verschiedene MseI-Adapter (M1/M2, M2/M1) enthalten. Aufgrund der oben beschriebenen Schleifenbildung werden Fragmente, die gleiche MseI-Adapter an jedem Ende enthalten, nicht oder weniger effizient amplifiziert, und sind deshalb in geringen Mengen in der amplifizierten Mischung vorhanden, die sich nicht störend auf das restliche Verfahren auswirken.
Da die Amplifizierung außerdem in einem nur nicht-methylierte Nukleotide enthaltenden Medium ausgeführt wird, verlieren die me thylierten Fragmente V-A ihre Methylierungskennzeichnung während der Amplifizierung; die entsprechenden nicht-methylierten Fragmente, wie sie nach der Amplifizierung erhalten werden, sind in 2 mit V-A' bezeichnet. Diese V-A'-Fragmente können jetzt im nachfolgenden Restriktionsschritt 4, zusammen mit den amplifizierten Fragmenten VI-A, die die ursprünglich nicht-methylierten PstI-Schnittstellen enthalten, unter Verwendung von PstI gespalten werden.
Wiederum kann bei Schritt 4 des obigen Verfahrens (A) anstelle eines methylierungs-sensitiven Restriktionsenzyms ein nicht-methylierungs-sensitives Isoschizomer desselben verwendet werden, das die gleiche (nicht-methylierte) Restriktionsschnittstelle schneidet.
Nach Restriktionsschritt 4 werden die PstI-geschnittenen Enden der Restriktionsfragmente mit dem dritten PstI-Adapter (P3) ligiert, wobei wiederum eine Mischung von verschiedenen Adapterenthaltenden Restriktionsfragmenten erhalten wird, wie in 2 gezeigt. Der dritte PstI-Adapter (P3) ist wiederum im wesentlichen wie in EP-A-O 534 858 beschrieben oder dadurch analog dazu, dass er für die Verwendung als Adapter bei AFLP geeignet ist, und dass er an die geschnittenen Enden der PstI-Fragmente ligiert werden kann. Außerdem ist der dritte PstI-Adapter (P3) wie erwähnt, vorzugsweise der gleiche wie der zweite in Schritt 5 des obigen Verfahrens A verwendete PstI-Adapter (P2) und ist nachfolgend so bezeichnet.
Nach der Ligation liefern die Fragmente V-A/V-A' im wesentlichen zwei Restriktionsfragmente (V-B und V-C), von denen jedes an einem Ende den zweiten PstI-Adapter (P2) und am anderen Ende entweder den ersten (M1) oder den zweiten (M2) MseI-Adapter enthält.
Diese Fragmente werden sich in der Länge unterscheiden, abhängig von der Position der methylierten PstI-Schnittstelle im ursprünglichen MseI-Fragment V-A. [Wie bei den Fragmenten I-A und I-B/I-C des obigen Verfahrens (A) sollte es wiederum klar sein, dass für jedes in 2 gezeigte Fragment V-B und V-C (d. h. das entweder den ersten (M1) oder den zweiten (M2) MseI-Adapter enthält) zwei entsprechende Fragmente (nicht gezeigt) vorhanden sind, die den entgegengesetzten MseI-Adapter enthalten (d. h. die jeweils den zweiten (M2) oder den ersten (M1) MseI-Adapter enthalten). Von diesen vier Fragmenten werden im allgemeinen nur die zwei Fragmente im folgenden Schritt 6 amplifiziert, welche den ersten (oder den zweiten) MseI-Adapter enthalten.]
Entsprechend werden von dem (den) Fragment(en) VI-A, das/die ursprünglich die nicht-methylierte PstI-Schnittstelle enthielt(en), ebenfalls zwei verschiedene Fragmente (VI-B und VI-C) mit unterschiedlichen Längen erhalten, abhängig von der Position der nicht-methylierten PstI-Schnittstelle im ursprünglichen MseI-Fragment VI-A. [Wie bei Fragment V-A und V-B/V-C werden in der Praxis zwei Paare von äquivalenten Fragmenten mit der gleichen Länge erhalten, aber entweder mit dem ersten (M1) oder dem zweiten (M2) MseI-Adapter dem PstI-Adapter (P1) gegenüberliegend, die im wesentlichen wieder äquivalent sind und folgend nicht unterschieden werden.]
Die nach der Restriktion mit PstI und Ligation mit dem PstI-Adapter (P2) erhaltene Mischung wird darüber hinaus die MseI-Fragmente VII enthalten, die ursprünglich weder eine methylierte noch eine nicht-methylierte PstI-Schnittstelle enthielten.
Prinzipiell werden alle Fragmente V-B, V-C, VI-B, VI-C sowie die Fragmente VII unterschiedliche Längen/Molekulargewichte haben, so dass sie unter Verwendung eines geeigneten Verfahrens unterschieden werden können.
Zu diesem Zweck wird die Mischung in Schritt 6 unter Verwendung geeigneter Primer für den zweiten PstI-Adapter (P2) sowie mindestens einem geeigneten Primer für den ersten (M1) und/oder zweiten (M2) MseI-Adapter amplifiziert. Diese Primer sind im wesentlichen wiederum wie in EP-A-O 534 858 beschrieben oder dadurch analog dazu, dass sie für die Verwendung als Primer bei AFLP geeignet sind, und sie jeweils mit dem zweiten PstI-Adapter (P2) und dem ersten (M1) und/oder zweiten (M2) MseI-Adapter hybridisieren können. Bevorzugt werden selektive Primer verwendet.
Wie oben erwähnt sind diese Primer vorzugsweise die gleichen wie die entsprechenden bei Schritt 6 des obigen Verfahrens A verwendeten Primer. Aus den bei Verfahren A genannten Gründen wird außerdem am besten nur ein MseI-Primer (d. h. entweder für den ersten (M1) oder den zweiten (M2) MseI-Adapter) neben dem Primer für den zweiten PstI-Adapter verwendet. Ferner sollte beachtet werden, dass die im ersten Restriktionsschritt des Verfahrens B erzeugten MseI/MseI-Fragmente VI-A (M1/M2) wieder nur linear amplifiziert werden, da in Schritt 6 keine Primer für den zweiten MseI-Adapter (M2) verwendet werden.
Der Amplifizierungsschritt selbst kann auf eine an sich bekannte Weise ausgeführt werden, so wie in EP-A-O 534 858 beschrieben oder auf eine dazu analoge Weise, und wird vorzugsweise wie die zwei-stufige Amplifizierung des Schrittes 6 des obigen Verfahrens A ausgeführt, d. h. als eine +1/+1 (Prä)-Amplifizierung (PstI+1/MseI+1), gefolgt von einer +2/+3 oder +3/+3 Amplifizierung (PstI+2/MseI+3 oder (PstI+3/MseI+3). Sowohl bei der Prä-Amplifizierung als auch bei der abschließenden Amplifizierung können die entsprechenden Primer in ungefähr gleichen Mengen verwendet werden.
Wie in Schritt 6 des Verfahrens (A) kann die Anzahl der benötigten selektiven Nukleotide bei einem spezifischen Primer für eine spezifische Anwendung wiederum Spezies-abhängig sein. Beispielsweise kann bei Mais eine +2/+3 Amplifizierung und die doppelte +2/+3 Selektivität für die PstI/MseI-Primerkombination (PC) verwendet werden.
Die resultierenden amplifizierten Fragmente werden dann unter Verwendung eines geeigneten Verfahrens sichtbar gemacht, wie der Entwicklung eines DNA-Fingerabdrucks mittels Gelelektrophorese. Dieser Fingerabdruck wird mindestens Banden zeigen, die den Fragmenten der Art V-B, V-C, VI-B und VI-C entsprechen, die durch Vergleich mit gemäß den Verfahren (A) oder (C) erzeugten Fingerabdrücken oder mit bekannten Daten Information über das Methylierungsmuster der Ausgangs-DNA liefern können, wie unten erörtert.
Der Fingerabdruck kann auch kleinere und/oder weniger aufschlußreiche Banden enthalten, die – obwohl sie immer noch einige nützliche Informationen über die Ausgangs-DNA liefern können – nicht entscheidend für die Zwecke der Erfindung sind. Im allgemeinen werden diese Banden die für die Zwecke der Erfindung wesentliche Information nicht beeinträchtigen.
C. Verfahren zur Erzeugung eines Fingerabdrucks, der Banden enthält, die nur den nicht-methylierten Schnittstellen entsprechen.
Dieses Verfahren entspricht im wesentlichen dem in der Europäischen Patentanmeldung 0 534 858 beschriebenen herkömmlichen AFLP-Verfahren, und ist deshalb als solches keine getrennte Ausfüh rungsform der Erfindung. Dennoch wird die Verwendung dieses Verfahrens im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung durch die vorliegende Anmeldung umfaßt, insbesondere für die Erzeugung einer Referenz für den Vergleich zu den aus den obigen Verfahren A und/oder B erhaltenen Fingerabdrücken. Verfahren (C) umfaßt:

1. Restriktion der Ausgangs-DNA mit einem Restriktionsenzym mit häufig vorkommenden Schnittstellen und einem methylierungs-sensitiven Restriktionsenzym mit selten vorkommenden Schnittstellen;
2. Ligieren der so erhaltenen Restriktionsfragmente mit einem fünften Adapter für das Restriktionsenzym mit häufig vorkommenden Schnittstellen sowie einem vierten Adapter für die methylierungssensitive Restriktion;
3. Amplifizieren der so erhaltenen Mischung unter Verwendung eines Primers für den fünften Adapter des Restriktionsenzyms mit häufig vorkommenden Schnittstellen sowie einem Primer für den vierten Adapter des methylierungs-sensitiven Restriktionsenzyms mit selten vorkommenden Schnittstellen;
4. Gebenenfalls Sichtbarmachung der so erhaltenen amplifizierten Fragmente, bevorzugt mittels eines DNA-Fingerabdrucks.

Verfahren (C) ist schematisch in 3 dargestellt, die ein DNA-Fragment zeigt, das Schnittstellen, (wieder als kleine Pfeile in der Sequenz gezeigt) für ein Restriktionsenzym (MseI) mit häufig vorkommenden Schnittstellen sowie methylierte (Pfeile mit Kreuz) und nicht-methylierte (große Pfeile) Schnittstellen für ein Restriktionsenzym (PstI) mit selten vorkommenden Schnittstellen enthält.
Der fünfte Adapter für das Restriktionsenzym mit häufig vorkommenden Schnittstellen und der vierte Adapter für das Restriktionsenzym mit selten vorkommenden Schnittstellen sind wiederum im wesentlichen wie in EP-A-O 534 858 beschrieben oder dadurch analog dazu, dass sie für die Verwendung als Adapter bei AFLP geeignet sind und, sie an die geschnittenen Enden der Restriktionsfragmente ligiert werden können (jeweilige Fragmente des Restriktionsenzyms mit häufig vorkommenden Schnittstellen und Fragmente des Restriktionsenzyms mit selten vorkommenden Schnittstellen).
Obwohl sich diese Adapter wiederum in der Sequenz und/oder der Anzahl der Nukleotide von den bei den obigen Verfahren (A) und (B) verwendeten Adaptern des Restriktionsenzyms mit häufig vorkommenden Schnittstellen und den Adaptern des Restriktionsenzyms mit selten vorkommenden Schnittstellen unterscheiden können, wird vorzugsweise aus den oben ausgeführten Gründen der Einfachheit als fünfter Adapter für das Restriktionsenzym mit häufig vorkommenden Schnittstellen vorzugsweise der gleiche wie der erste oder zweite – bevorzugt der erste – der oben benutzten Adapter des Restriktionsenzyms mit häufig vorkommenden Schnittstellen verwendet, und der vierte Adapter des Restriktionsenzyms mit selten vorkommenden Schnittstellen ist der gleiche wie der erste oder zweite – bevorzugt der zweite – der oben verwendeten Adapter des Restriktionsenzyms mit selten vorkommenden Schnittstellen. Gemäß dieser bevorzugten Ausführungsform werden der fünfte Adapter des Restriktionsenzyms mit häufig vorkommenden Schnittstellen und der vierte Adapter des Restriktionsenzyms mit selten vorkommenden Schnittstellen nachfolgend als "erster" MseI-Adapter (M1) und "zweiter" PstI-Adapter (P2) bezeichnet.
Außerdem sind die in Verbindung mit jedem der entsprechenden Adapter benutzten Primer vorzugsweise wiederum im wesentlichen die gleichen wie die entsprechenden Primer in den obigen Verfahren (A) und (B) verwendeten Primer.
In Schritt 1 wird die Ausgangs-DNA sowohl unter Verwendung des Restriktionsenzyms MseI mit häufig vorkommenden Schnittstellen als auch des Restriktionsenzyms PstI mit selten vorkommenden Schnittstellen auf eine an sich bekannte Weise gespalten. Dies spaltet sowohl die MseI-Schnittstellen als auch die nicht-methylierten PstI-Schnittstellen, läßt die methylierten PstI-Schnittstellen aber intakt.
Die PstI- und MseI-Restriktionen werden wiederum vorzugsweise gleichzeitig unter Verwendung einer Mischung dieser Enzyme ausgeführt, obwohl es auch möglich ist, zwei getrennte Schritte zu verwenden.
In Schritt 2 wird die Restriktionsmischung ebenfalls auf eine an sich bekannte Weise mit den MseI- und PstI-Adaptern ligiert. Aber anstelle einer Mischung von zwei unterschiedlichen MseI-Adaptern und im Unterschied zu den obigen Verfahren A und B wird neben dem zweiten PstI-Adapter (P2) nur ein MseI-Adapter (M1, M2) (d. h. entweder der erste oder der zweite) verwendet.
Nach der Ligation der Adapter des Restriktionsenzyms mit häufig vorkommenden Schnittstellen wird eine Mischung von verschiedenen Restriktionsfragmenten erhalten. Für die Zwecke der Erfindung können diese als MseI/MseI-Fragmente (M1/M1) (in 3 mit VII bezeichnet) PstI/MseI-Fragmente (P2/M1, M1/P2) (in 3 mit VIII-A und VIII-A' bezeichnet) und PstI/PstI-Fragmente (in 3 mit IX bezeichnet) unterschieden werden. Alle diese Fragmente können ungespaltene methylierte PstI-Schnittstellen enthalten oder nicht (jeweils nur für die MseI/MseI-Fragmente VII-A bzw.
VII-A' gezeigt); da dieses Verfahren nur dem Nachweis der nichtmethylierten PstI-Schnittstellen dient, sind diese Schnittstellen nicht entscheidend und beeinträchtigen auch nicht den resultierenden Fingerabdruck.
Nach der Adapter-Ligation werden wiederum einige verschiedene Fragmente jeder Art mit unterschiedlichen Längen in der erhaltenen Mischung vorhanden sein, abhängig vom Restriktionsschnittstellenmuster der Ausgangs-DNA. Die entsprechenden Längen der Fragmente VII; VIII und IX werden von der Position der MseI-Schnittstellen und der nicht-methylierten PstI-Schnittstellen in der Ausgangs-DNA (aber nicht der methylierten PstI-Schnittstellen) abhängen. Gewöhnlich werden sich die Fragmente VII, VIII und IX in der Länge/dem Molekulargewicht unterscheiden, wobei die PstI/PstI-Fragmente aufgrund der relativen Häufigkeit der MseI-Schnittstellen wesentlich länger als die anderen Fragmente sind. Aufgrund ihrer unterschiedlichen Längen/Molekulargewichte können diese Fragmente unter Verwendung eines geeigneten Verfahrens unterschieden werden.
Zu diesem Zweck wird die Mischung in Schritt 3 unter Verwendung eines geeigneten Primers für den zweiten PstI-Adapter (P2) sowie eines geeigneten Primers für den ersten MseI-Adapter (M1) amplifiziert. Wie oben erwähnt sind diese Primer vorzugsweise die gleichen wie die entsprechenden, bei Schritt 6 der obigen Verfahren A und/oder B verwendeten Primer.
Der Amplifizierungsschritt selbst kann auf eine an sich bekannte Weise ausgeführt werden, so wie in EP-A-O 534 858 beschrieben oder auf eine dazu analoge Weise, und wird vorzugsweise wie die zwei-stufige Amplifizierung des Schrittes 6 des obigen Verfahrens A ausgeführt, d. h. als eine (Prä)-Amplifizierung unter Verwendung eines +1 Primers für den zweiten PstI-Adapter (P2) und den ersten MseI-Adapter (M1), gefolgt von einer selektiven Amplifizierung unter Verwendung von +3 Primern. Sowohl bei der Prä-Amplifizierung als auch bei der abschließenden Amplifizierung können die entsprechenden Primer in ungefähr gleichen Mengen verwendet werden.
Wiederum kann die Anzahl der benötigten selektiven Nukleotide bei einem spezifischen Primer für eine spezifische Anwendung wieder Spezies-abhängig sein. Beispielsweise kann bei Mais eine +2/+3 Amplifizierung und die doppelte +3/+3 Selektivität für die PstI/MseI-Primerkombination (PC) verwendet werden.
Es sollte beachtet werden, dass die MseI/MseI-Fragmente VII-A und VII-A' (d. h. mit oder ohne einer methylierten PstI-Schnittstelle) während der Amplifizierung aufgrund der Schleifenbildung nicht effizient amplifiziert werden. Außerdem werden alle PstI/PstI-Fragmente im allgemeinen nicht effizient amplifiziert werden, da sie zu lang sind, um während der verwendeten Zykluszeiten zu ihrer vollen Länge amplifiziert zu werden.
Die resultierenden amplifizierten Fragmente werden dann unter Verwendung eines geeigneten Verfahrens sichtbar gemacht, wie der Entwicklung eines DNA-Fingerabdrucks mittels Gelelektrophorese. Dieser Fingerabdruck wird mindestens Banden zeigen, die den Fragmenten der Art VIII-A und VIII-B entsprechen, die als Vergleich für die gemäß den Verfahren (A) oder (B) erzeugten Fingerabdrücke verwendet werden können, wie unten erörtert.
D. Bestimmung des Methylierungsmusters einer Ausgangs-DNA aus den in Verfahren (A), (B) und (C) erzeugten Fingerabdrücken.
Die für die Bestimmung des Methylierungsmusters einer Ausgangs-DNA wesentlichen, unterschiedlichen Fragmente, die bei jedem der Verfahren (A), (B) und (C) erzeugt, amplifiziert und nachgewiesen werden, sind in 5 schematisch gezeigt, die ein DNA-Fragment zeigt, das Schnittstellen eines Restriktionsenzyms (MseI) mit häufig vorkommenden Schnittstellen sowie methylierte und nichtmethylierte Schnittstellen für ein Restriktionsenzym (PstI) mit selten vorkommenden Schnittstellen enthält.
Wie aus 5 ersichtlich wird, liefert Verfahren A Fragmente und Banden im DNA-Fingerabdruck, die den methylierten (I-B und I-C) Schnittstellen aber nicht den nicht-methylierten (III-A und III-A') Schnittstellen entsprechen.
Verfahren B liefert Fragmente und Banden im DNA-Fingerabdruck, die den methylierten (V-B und V-C) und den nicht-methylierten (VI-B und VI-C) Schnittstellen entsprechen.
Verfahren C liefert Fragmente und Banden im DNA-Fingerabdruck, die den nicht-methylierten (VIII-B und VIII-C) Schnittstellen entsprechen, aber nicht den methylierten (VII-A) Schnittstellen.
Wie aus 5 sofort ersichtlich wird, werden die entsprechenden, relevanten Fragmente (d. h. I-B/I-C und V-B/V-C einerseits, und VI-B/VI-C und VIII-A und VIII-B adererseits) außerdem die gleiche Größe/das gleiche Molekulargewicht haben und deshalb im Fingerabdruck entsprechende Banden ergeben, wenn die entsprechenden Elektrophoresen in parallelen Spuren des gleichen Gels laufen gelassen werden.
Deshalb wird ein Vergleich des mit Verfahren (B) erzeugten Fingerabdrucks mit dem mit Verfahren (A) erzeugten Fingerabdruck In formation über die ursprünglich nicht-methylierten Schnittstellen liefern, die in Fingerabdruck (B) als Banden auftreten, die in Fingerabdruck (A) nicht vorhanden sind (d. h. Banden V-A und V-B). Diese Banden werden außerdem in Fingerabdruck (C) vorhanden sein (d. h. Banden VIII-A und VIII-B).
Information über die ursprünglich methylierten Schnittstellen kann aus dem Vergleich zwischen entweder Fingerabdruck (A) oder Fingerabdruck (B), vorzugsweise beide, und Fingerabdruck (C) erhalten werden: Diese werden als Banden auftreten, die in (A) und (B) (d. h. Banden I-B/I-C und VI-B/VI-C), aber nicht in (C) vorhanden sind.
Außerdem kann unter Verwendung bekannter Verfahren zur Analyse der Ergebnisse, der aus einer aufgetrennten Population erhaltenen DNA-Fingerabdrücke, weitere Information über die Position der methylierten und nicht-methylierten Schnittstellen im Genom erhalten werden, beispielsweise über die relative Position der methylierten Schnittstelle zu bekannten AFLP-Markern oder genetischen Markern in der Ausgangs-DNA.
Ferner kann Information über die methylierte Sequenz aus der von dem verwendeten methylierungs-sensitiven Restriktionsenzym mit selten vorkommenden Schnittstellen erkannten Restriktionsschnittstelle erhalten werden; die Verwendung von unterschiedlichen methylierungs-sensitiven Restriktionsenzymen mit selten vorkommenden Schnittstellen liefert Information über den Status der Methylierung von unterschiedlichen Schnittstellen/Sequenzen im Genom.
Das Verfahren der Erfindung kann als allgemeines Hilfsmittel zum Nachweis von DNA-Methylierung oder von Methylierungsmustern verwendet werden, sowohl bei Prokaryonten als auch bei Eukaryonten, einschließlich Viren, Hefen, Pilzen, Bakterien, Pflanzen, Tieren und Menschen. Als solches kann es benutzt werden, um bekannte Verfahren zur Bestimmung und/oder Abschätzung des Maßes der DNA-Methylierung in allen Anwendungen zu ersetzen, bei denen solche Information von Interesse ist, wie den oben ausgeführten.
Das Verfahren der Erfindung ist besonders geeignet für Anwendungen, bei denen eine schnelle qualitative Bestimmung des Methylierungszustandes oder des Methylierungsmusters benötigt wird, die für Tests im großen Maßstab verwendet werden können. Im allgemeinen werden diese Anwendungen ähnlich denen sein, in welchen die herkömmlichen AFLP-Verfahren ebenfalls das Verfahren der Wahl für die Bestimmung des genetischen Aufbaus oder von RFLP's sind.
Einige nicht-einschränkende Anwendungen von spezifischem Interesse sind:

– Unterscheidung, Identifizierung oder Klassifizierung von Individuen, Varietäten oder Species auf der Basis ihrer DNA-Methylierung durch Vergleich der Methylierungsmuster aus verschiedenen individuellen Quellen;
– Fingerabdruck von Genomen und Nachweis der Methylierungspolymorphismen;
– Nachweis spezifischer Methylierungsmuster, die dem Vorhandensein von spezifischen Sequenzen oder genetischen Vererbungsmerkmalen sowie vererbter DNA-Methylierung (Muster) und Allel-spezifischer Methylierung (Muster) entsprechen;
– Abschätzen des Grades der Methylierung in einer DNA oder einem Genom;
– Unterscheidung von transformierten und nicht-transformierten Genen oder Sequenzen, zum Beispiel beim Nachweis von Transgenen; und Unterscheidung von replizierter und nicht-replizierter DNA bei Bakterien;
– Nachweis der Gen-Abschaltung oder Gen-Aktivierung, und im allgemeinen, die Untersuchung der Regulation der Gen-Expression in Eukaryonten;
– Nachweis der DNA-Methylierung, die mit genetischen Krankheiten, genomischen Kennzeichnungen (imprinting) und Krebs in Verbindung stehen;
– Bestimmung der Methylierung von Reportergenen in in vivo Mutagenitäts-Prüfverfahren;
– Nachweis methylierter DNA-Marker;
– Nachweis von Schnittstellen-spezifischer Methylierung (enzymatisch oder chemisch), methylierungs-sensitiven Schnittstellen und/oder Methylierung im Zusammenhang mit Mutationen;

Die Erfindung wird nun mittels der folgenden nichteinschränkenden Beispiele erläutert.
Beispiele
Die folgenden Beispiele beschreiben das neue auf PCR-basierende Verfahren der Erfindung zum Nachweis der Methylierung von zufällig über das Genom verteilten Restriktionsschnittstellen. Die Methode wird nachfolgend als "Methylierungs-AFLP^TM" bezeichnet.
Das Verfahren basiert auf (i) der Verwendung eines Paars von Restriktionsenzymen, das aus einem methylierungs-sensitiven Restriktionsenzym mit selten vorkommenden Schnittstellen und einem nicht-methylierungs-sensitiven Restriktionsenzym mit häufig vorkommenden Schnittstellen besteht, (ii) dem Vergleich von Fragmenten, die aus nativer und PCR amplifizierter DNA erhalten wurden und (iii) der selektiven Amplifizierung genomischer Restriktionsfragmente unter Verwendung von PCR.
Die Stärke der Methylierungs-AFLP besteht in ihrer eindeutigen gemeinsamen und getrennten Anzeige der unmethylierten der nativen methylierten Schnittstellen, wie sie nach der selektiven Amplifizierung der Restriktionsfragmente mittels PCR erhalten wird. Das Verfahren basiert auf der selektiven Amplifizierung von genomischen Restriktionsfragmenten, die direkt aus nativer DNA und außerdem aus nicht-selektiv amplifizierter DNA unter Verwendung eines methylierungs-sensitiven Restriktionsenzyms mit selten vorkommenden Schnittstellen und einem nicht-methylierungs-sensitiven Restriktionsenzyms mit häufig vorkommenden Schnittstellen erhalten werden. Die nicht-selektive Amplifizierung der Restriktionsfragmente wird erreicht, indem nur die Adapter- und Restriktionsschnittstellensequenz als Erkennungssequenz für das Anhybridisieren der Primer verwendet werden. Die selektive Amplifizierung wird durch die Verwendung von Primern erreicht, die mit den Restriktionsfragmenten überlappen, wobei nur diese Fragmente amplifiziert werden, deren die Restriktionsschnittstelle flankierende Nukleotide mit den Primerverlängerungen übereinstimmen.
Die Vorteile der Methylierungs-AFLP sind vielfältig keine vorhergehende Kenntnis der Sequenz wird benötigt, ein beschränkter Satz von generischen Primern wird verwendet, ein hohes Verviel fältigungsverhältnis (das Verhältnis ist eine Funktion des gewählten spezifischen Primersatzes) wird erhalten und eine positive Anzeige der nicht-methylierten und der nativen methylierten Schnittstellen wird geliefert. Außerdem erfaßt der Nachweis der DNA-Methylierung das gesamte Genom. Typischerweise werden 50–100 Restriktionsfragmente co-amplifiziert und auf denaturierenden Polyacrylamidgelen aufgetrennt. Die folgenden Beispiele werden näher erläutern, wie Methylierungs-ALFP benutzt werden kann, um das Maß der CpG- und CpNpG-Methylierung abzuschätzen, Epiallele und zusätzliche Sequenzpolymorphismen nachzuweisen und der Vererbung von C-Methylierung nachzuspüren.
Eine Vielzahl von Verfahren, um den Grad der DNA-Methylierung zu bestimmen, ist gegenwärtig verfügbar, die in Sequenzunspezifische und Sequenz-spezifische Verfahren unterteilt werden können. Die erste Kategorie kann verwendet werden, um verschiedene Arten von modifizierten Basen zu untersuchen und diese zu quantifizieren, aber man erhält keine Information über den genauen Ort der modifizierten Stelle innerhalb einer gegebenen Nukleinsäuresequenz. In diese Kategoriefallen immunologische, chromatographische, elektrophoretische und spektrophotometrische Verfahren, die einer vollständigen chemischen oder enzymatischen Hydrolyse der Ziel-DNA folgen. Ein anderer Sequenz-unabhängiger Ansatz schließt die Verwendung von methylierungs-sensitiven Restriktionsendonukleasen Mit ein, wobei mit diesen Restriktionsenzymen erhaltene Verdaue genomischer DNA unter Verwendung einer Gelelektrophorese verglichen werden (Saluz, H. P. und Jost, J -P. (1993) Jost, P. und Saluz, H. P.(ed.), DNA Methylation: Molecular Biology and Biological Significance, Saluz Birkhäuser Verlag, Basel, Schweiz). Ein Vergleich der Fragmentlängen und Intensitäten der resultierenden Spaltungsmuster auf dem Gel erlaubt eine Abschätzung des Anteils der methylierten Schnittstellen.
Die zweite Kategorie ermöglicht die Untersuchung des genauen Ortes der methylierten Base innerhalb einer bekannten DNA-Sequenz. In diese Kategorie fallen Verfahren, die auf der Verwendung von Paaren von isoschizomeren Restriktionsenzymen basieren, die sich in ihrer Empfindlichkeit gegenüber Methylierung unterscheiden, in Kombination mit Southern-Blot Analyse (Bird, A. P. und Southern, E. M. (1978), J. Mol. Biol. 118, 27–47; Waalwijk, C. und Flavell, R. A. (1978) Nucl. Acids Res. 5, 3231–3236) oder PCR.
Andere auf PCR basierende Verfahren zum Nachweis der DNA-Methylierung wurden ebenfalls berichtet; eines dieser PCR-basierten Verfahren nutzt die Tatsache aus, dass PCR-Amplifizierung nur stattfindet, wenn die DNA zwischen den beiden Primerstellen durch das methylierungs-sensitive Restriktionsenzym HpaII nicht gespalten wird (Singer-Sam, J., LeBon, J. M., Tanguay, R. L. und Riggs A. D. (1990) Nucl. Acids Res. 18, 687; Singer-Sam, J., Grant, M., LeBon, J. M., Okuyama, K., Chapman, V., Monk, M. und Riggs, A. D. (1990) Mol. Cell. Biol. 10, 4987–4989; Heiskanen M., Syvanen, A. C. Siitari, H., Laine, S. und Palotie, A. (1994) PCR Methods and Applic. 4, 26–30). Andere auf PCR-basierende Verfahren kombinieren PCR mit genomischer Sequenzierung, um methylierte Cytosinreste zu identifizieren (Maxam, A. M. und Gilbert, W. (1980) Methods Enzymol. 65, 499–560; Pfeiffer, G. P., Steigerwald, S. D., Mueller, P. R., Wold, B. und Riggs A. D. (1989) Science 246, 810-813), unter Verwendung der chemischen Spaltungsreaktionen nach Maxam und Gilbert, die an genomischer DNA mit verschiedenen zusätzlichen Verfahren durchgeführt werden, um das Signal der untersuchten Sequenz zu verstärken.
Das von Frommer et al. (Frommer, M., McDonald L. E., Millar, D. S., Collis, C. M., Watt, F., Grigg, G. W., Molloy, P. L. und Paul C. L. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. 89, 1827–1831) beschriebene Bisulfitverfahren zur genomischen Sequenzierung umgeht die Nachteile der vorhergehenden Methoden, indem die chemischen Spaltungsreaktionen weggelassen werden und eine eindeutige Identifizierung von 5-Methylcytosinresten ermöglicht wird. Weitere kürzlich entwickelte Verfahren verwenden eine Behandlung der DNA mit Bisulfit als Ausgangspunkt für die Methylierungsanalyse. Diese umfassen die methylierungsspezifische PCR (MSP) (Herman, J. G., Graff, J. R., Myohanen, S., Nelkin, B. D. und Baylin, S. B. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci., 93, 9821–9826), den restriktionsenzymatischen Verdau von PCR Produkten, die von Bisulfit-behandelter DNA amplifiziert wurden (Sadri, R. und Hornsby, P. J. (1996) Nucleic Acids Res. 24, 5058–5059; Xiong, Z. und Laird, P. W. (1997) Nucleic Acids Res. 25, 2532–2534) und die von Einzelnukleotid Primerextension gefolgte Behandlung der DNA mit Bisulfit (Gonzalgo, M. L. und Jones, P. A. (1997) Nucleic Acids Res. 25, 2529–2531). Im Gegensatz zum Bisulfitverfahren zur genomischen Sequenzierung und damit verwandter Verfahren kann mit dem Verfahren der Erfindung die Methylierung von einer nahezu unbegrenzten Anzahl von Genloci bestimmt werden.
Das Prinzip des Verfahrens der Erfindung ist schematisch in 6 gezeigt, die eine schematische Darstellung des Verfahrens der Methylierungs-AFLP mit der Enzymkombination (EC) PstI/MseI zeigt: 'nicht-selektive Amplifizierung' steht für die nicht-selektive M1/M2 (MseI/MseI⁺) Amplifizierung; 'selektive Amplifizierung' steht für die selektive PstI/MseI Amplifizierung.
Die linke Spalte zeigt die Erzeugung eines Satzes von Matrizen (nachfolgend: "Satz A" oder "A-Template") gemäß dem obigen allgemeinen Verfahren "A", das Restriktionsfragmente mit einer nativen methylierten PstI-Schnittstelle liefert, gefolgt von einem selektiven PstI/MseI Amplifizierungsverfahren.
Die mittlere Spalte zeigt die Erzeugung eines Satzes von Matrizen (nachfolgend: "Satz B" oder "B-Template" gemäß dem obigen allgemeinen Verfahren "B", das Restriktionsfragmente mit einer nativen methylierten oder einer nicht-methylierten PstI-Schnittstelle liefert, gefolgt von einem selektiven PstI/MseI Amplifizierungsverfahren.
Die rechte Spalte. zeigt die Erzeugung eines Satzes von Matrizen (nachfolgend: "Satz C" oder "C-Template") gemäß dem obigen allgemeinen Verfahren "C", das die Restriktionsfragmente mit einer nativen nicht-methylierten PstI-Schnittstelle darstellt, gefolgt von einem selektiven PstI/MseI Amplifizierungsverfahren.
Das Methylierungs-AFLP Verfahren der Erfindung basiert auf der PCR-Amplifizierung von drei erhaltenen Sätzen (A, B, C) genomischer Restriktionsfragmente, die sich unterscheiden im (i) Verdau der genomischen DNA unter Verwendung von zwei Restriktionsenzymen und (ii) den ligierten doppelsträngigen (ds) Adaptern.
Eine allgemeine Darstellung dieses Verfahrens ist in 6 für die EC PstI/MseI gezeigt. Satz A stellt nur die Restriktionsfragmente mit einer nativen methylierten PstI-Schnittstelle dar und wird auf die folgende Weise erhalten (siehe 6): Die genomische DNA wird vollständig mit den beiden Restriktionsenzymen PstI und MseI verdaut und die entsprechenden ds (AFLP) PstI-Adapter* (P1) und MseI-Adapter⁽⁺⁾ (M2) werden mit den nicht-methylierten PstI-Schnittstellen und den MseI-Schnittstellen ligiert, um die nicht-methylierten PstI-Enden zu blockieren und Matrizen-DNA für die nicht-selektive MseI/MseI⁺ (M1/M2) Amplifizierung zu erzeu gen. Zwei unterschiedliche MseI-Adapter (M1, M2) werden gewählt, um die Bildung einer Stammschleifenstruktur der MseI-MseI-Fragmente zu vermeiden, die an den Enden eine inverse Wiederholungssequenz haben. Daran schließt sich eine nicht-selektive MseI/MseI⁺ (M1/M2) Amplifizierung der genomischen Restriktionsfragmente an, die eine interne methylierte PstI-Schnittstelle besitzen können. Während dieses PCR-Schritts verlieren die Restriktionsschnittstellen ihre Methylierungskennzeichnung. Ein zweiter Verdau der 'demethylierten' PstI-Schnittstellen, der von der Ligation der PstI-Adapter (P1) gefolgt wird, erzeugt eine Matrizen-DNA für die folgende selektive PstI/MseI-Amplifizierung.
Der Satz der B-Template stellt die Restriktionsfragmente mit nativen methylierten oder nicht-methylierten PstI-Schnittstellen dar, die auf eine ähnliche Weise wie der Satz der A-Template erhalten werden, mit der Ausnahme, dass die genomische DNA nur mit MseI vollständig verdaut wird und die entsprechenden ds (AFLP) MseI-Adapter⁽⁺⁾ (M2) ligiert werden, um Matrizen-DNA für die nicht-selektive MseI/MseI⁺ (M1/M2) Amplifizierung zu erzeugen (siehe 6).
Der Satz der C-Template stellt nur die Restriktionsfragmente mit einer nativen nicht-methylierten PstI-Schnittstellen dar, die gemäß des veröffentlichten AFLP-Verfahrens (Vos, P., Hogers, R., Bleeker, M., Reijans, M., van de Lee, T., Hornes, M., Frijters, A., Pot, J., Peleman, J., Kuiper, M. und Zabeau, M. (1995) Nucl. Acids Res. 23, 4407–4414) auf die in 6 gezeigte Weise erhalten werden: vollständiger Verdau der genomischen DNA mit der EC PstI/MseI und Ligation der entsprechenden ds AFLP-Adapter an die nicht-methylierten PstI-Schnittstellen und MseI-Schnittstellen, um Matrizen-DNA für die selektive PstI/MseI Amplifizierung zu erzeugen.
Abschließend werden die Matrizensätze A, B und C gleichzeitig nach der zwei-stufigen Amplifizierzungs-Verfahrenstrategie selektiv (Prä-Amplifizierung gefolgt von der AFLP-Reaktion), gemäß dem AFLP-Fingerabdruckverfahren für komplexe Genome (Vos, P., Hogers, R., Bleeker, M., Reijans, m., van de Lee, T., Hornes, M., Frijters, A., Pot, J., Peleman, J., Kuiper, M. und Zabeau, M. (1995) Nucl. Acids Res. 23, 4407–4414) amplifiziert und anschließend zusammen in nebeneinanderliegenden Spuren A, B und C eines Methylierungs-AFLP-Fingerabdrucks gezeigt.
Die folgenden Beispiele werden gemäß den oben beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen auf die Weise ausgeführt, dass so wenig verschiedene Adapter und Primer wie möglich verwendet werden. Demzufolge werden insgesamt nur zwei MseI-Adapter (d. h. die oben als "erster" (M1) und "zweiter" (M2) MseI-Adapter bezeichnet wurden) und ihre zwei dazu passenden MseI-Primer (oder Primerkombinationen), und zwei PstI-Adapter (d. h. die oben als "erster" (P1) und "zweiter" (P2) PstI-Adapter bezeichnet wurden) und ihre zwei dazu passenden PstI-Primer (oder Primerkombinationen) verwendet. In den Beispielen und Figuren wird der zweite MseI-Adapter (M2) mit einem (⁺) gekennzeichnet und der erste PstI-Adapter (P1) wird gekennzeichnet, indem ein (^*) verwendet wird, d. h. als MseI⁺ (M2) bzw. PstI^* (P1). Demzufolge werden der entsprechende zweite MseI-Primer- und der entsprechende erste PstI-Primer ebenfalls mit einem (⁺) bzw. einem (^*) gekennzeichnet.
Beispiel 1: Allgemeine Beschreibung und verwendete Versuchsvorschriften.
A. Verwendete genomische DNAs und Enzyme.
Die Quellen für die verwendeten genomischen DNAs und Enzyme waren wie folgt: Tomaten-DNA (Nahezu isogene Linien (NILs) 83M-S und 83M-R bezogen von De Ruiter zonen, die Niederlande; cv. Motelle und Mobox bezogen von INRA, Montfavet, Frankreich; Inzuchtlinie RC10 bezogen von Enza Zaden, die Niederlande; Inzuchtlinie 52201 bezogen von Rijk Zwaan, die Niederlande), Mais-DNA (Inzuchtlinien B73, Mol7 und A7) wurden erhalten von Dr. M. Motto, Instituto Sperimentale per La Cerealicoltura, Bergamo, Italien; Inzuchtlinien D102, DK 105, D107, D118, D140, D503, D44, D01, D403, D406, CO125 und W401 wurden erhalten von Dr. W. G. Polmer, Universität Hohenheim, Stuttgart, Deutschland; 88 rekombinante, aus der Kreuzung von B73 x Mol7 stammende Inzuchtlinien wurden erhalten von Dr. C. W. Stuber, North Carolina State University, Raleigh, NC, USA; Ölsamenraps-DNA (12 Genotypen erhalten von Van der haue, die Niederlande) wurde unter Verwendung eines modifizierten von Stewart und Via beschriebenen CTAB-Verfahrens isoliert (Stewart, C. J., Jr und Via L. E. (1993) Biotechniques 14, 748–750). Bis auf das Restriktionsenzym MseI, das von New England Biolabs Inc. (Beverly, MA, USA) erworben wurde, wurden alle Restriktionsenzyme von Pharmacia (Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Schweden) erworben. TagStart^TM Antikörper wurde von Clontech (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA, USA) bezogen.
T4 DNA-Ligase und T4 Polynukleotid-Kinase wurden ebenfalls von Pharmacia bezogen. Alle PCR-Reagenzien und Verbrauchsgüter wurden von Perkin Elmer Corp. (Norwalk, CT, USA) bezogen. Radioaktive Reagenzien wurden von Amersham (Amersham International plc, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK) oder Isotopchim (Isotopchim SA, Ganagobie, Frankreich) erworben.
B. Verwendete AFLP Primer und Adapter
Alle Oligonukleotide wurden mit einem Biotronic Synostat D DNA-Synthesizer (Eppendorf GmbH, Maintal, Deutschland) oder einem Milligen Expedite 8909 DNA-Synthesizer (Millipore Corp. Bedford, MA, USA) hergestellt. Die Qualität der unbehandelten Oligonukleotide wurde durch eine Endmarkierung mit Polynukleotid-Kinase und [y-³³p]ATP und anschließender Elektophorese in 18% denaturierenden Polyacrylamidgelen (Maxam, A. M. und Gilbert, W. (1980) Methods Enzymol. 65, 499–560) kontrolliert.
Oligonukleotid-Adapter und -Primer für die AFLP^TM-Analyse wurden im allgemeinen ohne weitere Reinigung verwendet, wenn sie nachweislich > 85% der vollen Länge besaßen.
Für die Schnittstelle des Restriktionsenzyms mit selten vorkommenden Schnittstellen wurden zwei unterschiedliche AFLP-Adapter verwendet: 1) Der übliche AFLP-Adapter (AFLP-Adapter genannt) als Zielsequenz für das Anhybridisieren der Primer und 2) einen als Blockierungsmittel dienenden AFLP-Adapter (z. B. PstI-Adapter⁺ (P1) genannt). Beide Adapter bestehen aus einer zentralen Sequenz (CORE) und einer schnittstellen-spezifischen Sequenz (SITE) (Sadri, R. und Hornsby, P. J. (1996) Nucleic Acids Res. 24, 5058-5059). Die Blockierungsadapter unterscheiden sich von den AFLP-Adaptern nur in der zentralen Sequenz. Dies ist nachfolgend für die PstI- und HpaII-Adapter gezeigt.
Die herkömmlichen und die Blockierungsadapter für MspI und ClaI sind identisch zu denen für HpaII.
Für die häufig vorkommende Schnittstelle des Restriktionsenzyms MseI mit häufig vorkommenden Schnittstellen wurden ebenfalls zwei verschiedene AFLP-Adapter verwendet: 1) Ein MseI-Adapter nur für die nicht-selektive Amplifizierung (MseI-Adapter⁺ (M2) genannt) und 2) ein MseI-Adapter (MseI-Adapter genannt) als Zielsequenz für das Anhybridisieren für die weitere nicht-selektive und selektive Amplifizierung. Die MseI-Adapter unterscheiden sich nur in der zentralen Sequenz. Dies ist nachfolgend gezeigt:
Die AFLP-Primer bestehen aus drei Teilen, einer zentralen Sequenz, einer Schnittstellen-spezifischen Sequenz (SITE) und einer selektiven Verlängerung (EXT) (siehe EP-A-O 534 858). Dies ist nachfolgend für die PstI- und HpaII-Primer mit drei selektvien Nukleotiden (gezeigt als NNN) gezeigt:
Die AFLP-Primer für MspI und HpaII haben einen ähnlichen Aufbau. Trotzdem sollte beachtet werden, dass die AFLP-Primer für PstI, HpaII, MspI und ClaI nur für die AFLP-Adapter bestimmt sind.
Die beiden MseI-Primer werden auf die gleiche Weise wie die beiden MseI-Adapter unterschieden: Der MseI-Primer hat den MseI-Adapter als Zielsequenz für die Anhybridisierung, während der MseI-Primer⁺ (M2) den MseI-Adapter⁺ (M2) als Zielsequenz für die Anhybridisierung hat. Der Unterschied zwischen den beiden MseI-Primern ist unten gezeigt:
C. Modifikation der DNA und Herstellung der Matrize
Die nachfolgenden Versuchsvorschriften A, B und C beschreiben die Herstellung der A-, B- und C-Template für AFLP-Reaktionen unter Verwendung der Enzymkombination (EC) PstI/MseI. Versuchsvorschrift C entspricht der Standardversuchsvorschrift für AFLP wie in EP-A-O 534 858 und von Vos et al(Vos, P., Hogers, R., Bleeker, M., Reijans, M., van de Lee, T., Hornes, M., Frijters, A., Pot, J., Peleman, J., Kuiper, M. und Zabeau, M. (1995) Nucl. Acids Res. 23, 4407–4414) beschrieben.
Versuchsvorschrift A:
Genomische DNA (0,5 μg) wird für 1 h bei 37°C mit 5 U PstI und 5 U MseI in 40 μl 10 mM Tris-HAc pH 7,5, 10 mM MgAc, 50 mM KAc, 5 mM DTT und 50 ng/μl BSA (acetyliert) inkubiert. Anschließend wer den 10 μl einer Lösung zugefügt, die 5 pMol PstI-Adapter* (P1), 50 pMol MseI-Adapter , 50 pMol MseI-Adapter+, 1 U T4 DNA-Ligase, 1 mM ATP in 10 mM Tris-HAc pH 7,5, 10 mM MgAc, 50 mM KAc, 5 mM DTT und 50 ng/μl BSA enthält und die Inkubation für 3 h bei 37°C fortgesetzt. Die Adapter werden durch Zugabe äquimolarer Mengen beider Stränge hergestellt; die Adapter sind nicht phosphoryliert. Nach der Ligation wird die Reaktionsmischung auf 250 μl mit 10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA pH 8,0 verdünnt und für die PCR-Amplifizierung verwendet oder bei –20°C gelagert.
Versuchsvorschrift B:
Genomische DNA (0,5 μg) wird für 1 h bei 37°C mit nur 5 U MseI in 40 μl 10 mM Tris-HAc pH 7,5, 10 mM MgAc, 50 mM KAc, 5 mM DTT und 50 ng/μl BSA (acetyliert) inkubiert. Anschließend werden 10 μl einer Lösung zugefügt, die 50 pMol MseI-Adapter, 50 pMol MseI-Adapter+ (M2), 1 U T4 DNA-Ligase, 1 mM ATP in 10 mM Tris-HAc pH 7,5, 10 mM MgAc, 50 mM KAc, 5 mM DTT und 50 ng/μl BSA enthält und die Inkubation für 3 h bei 37°C fortgesetzt. Die Adapter werden wie oben (Versuchsvorschrift A) hergestellt. Nach der Ligation wird die Reaktionsmischung auf 250 μl mit 10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA pH 8,0 verdünnt und für die PCR-Amplifizierung verwendet oder bei –20°C gelagert.
Versuchsvorschrift C:
Genomische DNA (0,5 μg) wird für 1 h bei 37°C mit 5 U PstI und 5 U MseI in 40 μl 10 mM Tris-HAc pH 7,5, 10 mM MgAc, 50 mM KAc, 5 mM DTT und 50 ng/μl BSA (acetyliert) inkubiert. Anschließend werden 10 μl einer Lösung zugefügt, die 5 pMol PstI-Adapter, 50 pMol MseI-Adapter, 1 U T4 DNA-Ligase, 1 mM ATP in 10 mM Tris-HAc pH 7,5, 10 mM MgAc, 50 mM KAc, 5 mM DTT und 50 ng/μl BSA enthält und die Inkubation für 3 h bei 37°C fortgesetzt. Die Adapter werden wie oben (Versuchsvorschrift A) hergestellt. Nach der Ligation wird die Reaktionsmischung auf 500 μl mit 10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA pH 8,0 verdünnt und für die PCR-Amplifizierung verwendet oder bei –20°C gelagert.
D. Synthese von nicht-methylierter DNA mittels nicht-selektiver PCR-Amplifizierung und weitere Modifikation der DNA und Matrizenherstellung
Die Synthese von nicht-methylierten A- und B-Templaten wird mittels nicht-selektiver PCR-Amplifizierung durchgeführt. Diese nicht-selektive PCR-Amplifizierung wird mit folgendem Zyklusprofil für 7 Zyklen durchgeführt: Ein 30 s DNA-Denaturierungsschritt bei 94°C, ein 1 min Anhybridisierungsschritt bei 56°C und ein 2 min EXtensionsschritt bei 72°C. Die Amplifizierungen werden in 20 μl durchgeführt, die 5 μl Matrizen-DNA, 30 ng MseI-Primer, 30 ng MseI-Primer+ (M2), 0,4 U Taq Polymerase, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl und je 0,2 mM aller vier dNTPs enthalten.
Nach der Amplifizierung werden wiederum die Reaktionsmischungen A und B für 1 h bei 37°C mit 5 U PstI in 40 μl 10 mM Tris-HAc pH 7,5, 10 mM MgAc, 50 mM KAc, 5 mM DTT und 50 ng/μl BSA (acetyliert) inkubiert. Anschließend werden 10 μl einer Lösung zugesetzt, die 5 pMol PstI-Adapter, 1 U T4 DNA-Ligase, 1 mM ATP in 10 mM Tris-HAc pH 7,5, 10 mM MgAc, 50 mM KAc, 5 mM DTT und 50 ng/μl BSA(acetyliert) enthält und die Inkubation für 3 h bei 37°C fortgesetzt.
Nach der Ligation wird die Reaktionsmischung auf 1000 μl mit 10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA pH 8,0 verdünnt und für die PCR-Amplifizierung verwendet oder bei –20°C gelagert.
Die Herstellung der A- und B-Template für die AFLP-Reaktionen unter Verwendung methylierungs-sensitiver Restriktionsenzyme mit selten vorkommenden Schnittstellen, die 5'-überhängende Enden (z. B. HpaII, MspI, ClaI) zurücklassen, beinhaltet die Inaktivierung der nach der nicht-selektiven Amplifizierung verbliebenen Taq Polymerase, um nach der Restriktion eine Einlagerung der verbliebenen dNTPs zu vermeiden. Dies wird erreicht, indem man der Amplifizierungsmischung 220 ng TagStart^TM Antikörper/U Taq Polymerase vor weiteren Restriktionen und Ligationen zusetzt.
E. AFLP-Reaktionen
Die Bedingungen für die Amplifizierungsreaktion werden beschrieben für die Verwendung der DNA-Matrizen (A, B und C) mit der EC PstI/MseI. Mit anderen ECs ist das Verfahren identisch, bis auf die Verwendung geeigneter Primer.
Die Erzeugung von AFLP-Fingerabdrücken großer Genome beinhaltet im allgemeinen eine zwei-stufige Amplifizierung. Der erste Schritt dieses Amplifizierungsverfahrens, als Prä-Amplifizierung bezeichnet, verwendet zwei AFLP-Primer, einer auf die PstI-Enden und einer auf die MseI-Enden gerichtet, die jeweils ein einzelnes selektives Nukleotid besitzen. Diese Primer sind nicht radioaktiv markiert. Die Amplifizierungen werden in 20 μl durchgeführt, die 5 μl Matrizen-DNA, 30 ng MseI-Primer, 30 ng PstI-Primer, 0,4 U Taq Polymerase, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl und je 0,2 mM aller vier dNTPs enthalten.
Nach der Prä-Amplifizierung werden die Reaktionsmischungen 10-fach mit 10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA pH 8,0 verdünnt und als Matrizen für die zweite Amplifizierungsreaktion verwendet.
Die zweite Amplifizierungsreaktion verwendet wiederum zwei Oligonukleotid-Primer, einer auf die PstI-Enden und einer auf die MseI-Enden gerichtet, die jeweils zwei oder drei selektive Nukleotide aufweisen. Der PstI-Primer wird unter Verwendung von [y-³³P]ATP und T4 Polynukleotid-Kinase radioaktiv endmarkiert. Die Markierungsreaktionen werden in 50 μl 25 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 0,5 mM Spermidin-3HCl unter Verwendung von 500 ng Oligonukleotid-Primer, 100 μCi [y-³³P]ATP (1000–3000 Ci/mol) und 10 U T4 Polynukleotid-Kinase durchgeführt. Die Amplifizierungen werden in 20 μl durchgeführt, die 5 μl Matrizen-DNA, 5 ng markierten PstI-Primer (0,5 μl der Markierungsreaktionsmischung), 30 ng MseI-Primer, 0,4 U Taq Polymerase, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl und je 0,2 mM aller vier dNTPs enthalten.
AFLP-Prä-Amplifizierungsreaktionen werden für 24 Zyklen (Versuchsvorschriften A und B) und 20 Zyklen (Versuchsvorschrift C) mit dem folgenden Zyklusprofil durchgeführt: ein 30 s DNA Denaturierungsschritt bei 94°C, ein 1 min Anhybridisierungsschritt bei 56°C und ein 1 min Extensionsschritt bei 72°C. Die AFLP-Reaktionen mit Primern, die zwei oder drei selektive Nukleotide haben, werden für 36 Zyklen mit dem folgenden Zyklusprofil durchgeführt: Ein 30 s DNA Denaturierungsschritt bei 94°C, ein 30 s Anhybridisierungsschritt (siehe unten) und ein 1 min Extensionsschritt bei 72°C. Die Anhybridisierungstemperatur im ersten Zyklus beträgt 65°C und wird anschließend bei jedem Zyklus für die nächsten 12 Zyklen um 0,7°C reduziert, und dann für die restlichen 23 Zyklen bei 56°C fortgesetzt. Alle Amplifizierungsreaktionen werden in einem PE-9600 Thermocycler (Perkin Elmer Corp. Norwalk, CT, USA) durchgeführt.
F. Gel-Analyse
Im Anschluß an die Amplifizierung werden die Reaktionsprodukte mit dem gleichen Volumen (20 μl) an Formamidfarbstoff (98% Formamid, 10 mM EDTA pH 8,0 und Bromphenolblau und Xylencyanol als Elektrophorese-Farbmarker) vermischt. Die resultierende Mischung wird für 3 min bei 90°C erhitzt und dann schnell auf Eis gekühlt. Jede Probe (2 μl) wurde auf ein 5% denaturierendes (Sequenzierungs-) Polyacrylamidgel (Maxam, A. M. und Gilbert, W. (1980) Methods Enzymol. 65, 499–560) aufgetragen. Die Gelmatrix wird hergestellt unter Verwendung von 5% Acrylamid, 0,25% Methylenbisacryl und 7,5 M Harnstoff in 50 mM Tris/50 mM Borsäure/1 mM EDTA (pH 8,3). Zu 100 ml Gellösung werden 500 μl von 10% APS und 100 μl TEMED zugesetzt und die Gele unter Verwendung einer SequiGen 38 × 50 cm Gelapparatur (Biorad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA) gegossen. 100 mM Tris/100 mM Borsäure/2 ml EDTA werden als Laufpuffer verwendet. Die Elektrophorese wird bei konstanter Leistung, 110 W, für ungefähr 2 Stunden durchgeführt. Nach der Elektrophorese werden die Gele für 30 Min in 10% Essigsäure fixiert, für 10 Min mit Wasser gewaschen auf Glasplatten getrocknet und für 16 h mit Fujix Phosphorimage Screens in Kontakt gebracht (Autoradiographie). Die Muster der Fingerabdrücke werden unter Verwendung eines Fujix BAS-2000 Phosphorimage Analysegerätes (Fuji Photo Film Company Ltd., Japan) sichtbar gemacht.
Beispiel II: Erzeugung von Methylierungs-AFLP-Fingerabdrücken von großen Genomen.
Erste Experimente zur Erzeugung von Methylierungs-AFLP-Fingerabdrücken genomischer DNA von Pflanzen zeigten, dass die Komplexität der Matrizen-Genbanken die gleiche Größenordnung wie beim Standard-AFLP-Verfahren aufweist. Dennoch ist bei Mais die Anzahl der in der B-Reaktion nachgewiesenen Fragmente (bezogen auf die Fragmente der A- und C-Reaktion zusammen) bei PstI+2/MseI+3-Primerkombinationen (PCs) beträchtlich erhöht, so dass die Feinabstimmung der PCs auf eine etwas höhere Selektivität erstrebenswert ist und kombinierte PstI-PCs zur Folge hat, z. B. PstI+AGW oder PstI+AGS, wobei W gemeinsam für A und T steht und S gemeinsam für C und G steht.
Die 7A und 7B zeigen Methylierungs-AFLP-Fingerabdrücke von genomischen DNAs aus den drei Mais-Inzuchtlinien A7, B73 und Mol7. Die beiden Bilder zeigen PstI/MseI-Fingerabdrücke, die den folgenden PCs entsprechen (von links nach rechts):
I. PstI+AGW/MseI+CTT, und II. PstI+AGS/MseI+CTT. Die Spuren A, B und C bilden die entsprechenden Restriktionsfragmente A, B und C ab, die auf den nativen methylierten Status der Schnittstellen des Restriktionsenzyms mit selten vorkommenden Schnittstellen hinweisen. Der Größenbereich der Molekulargewichte der Finger- abdrücke beträgt 200 bis 500 Nukleotide.
Theoretisch sollte jede Bande, die in Spur A oder Spur C vorhanden ist, auch in Spur B vorhanden sein, da Spur B sowohl die nativen methylierten als auch die nicht-methylierten Schnittstellen des Restriktionsenzyms mit selten vorkommenden Schnittstellen zusammen abbildet. Wie man den 7A und B für PCs I entnehmen kann, trifft dies für mehr als 90% der Fragmente in Spur A und C zu. Dennoch kann in einigen Fällen (z. B. PC II) der Prozentsatz der in Spur B vorhandenen Fragmente in den Spuren A und C gering sein. Eine Erklärung dafür lautet wie folgt: kurze MseI-MseI-Restriktionsfragmente haben einen kompetetiven Vorteil gegenüber den langen MseI-MseI-Restriktionsfragmenten bei der nichtselektiven Amplifizierung. Folglich werden Restriktionsschnittstellen (methyliert oder nicht) der Restriktionsenzyme mit selten vorkommenden Schnittstellen, die durchschnittlich vermehrt auf den lan gen MseI-MseI-Restriktionsfragmenten liegen, einen selektiven Nachteil haben. Die anschließende Restriktion und Ligation der ursprünglichen Fragmente wird eine reduzierte Menge von Matrizen erzeugen.
Wie von den Fingerabdrücken nahegelegt, bestehen die großen Pflanzengenome vorwiegend aus einzigartigen AFLP-Fragmenten, obwohl sich das Vorhandensein von repetetiver DNA durch Fragmente mit mittlerer (Pfeil 1) oder hoher (Pfeil 2) Bandintensität in den 7A und 7B zeigt, in guter Übereinstimmung mit dem Zusammenhang, der zwischen der AFLP-Bandenintensität und der ursprünglichen Anzahl an Restriktionsfragmenten besteht (Vos, P., Hogers, R., Bleeker, M., Reijans, M., van de Lee, T., Hornes, M., Frijters, A., Pot, J., Peleman, J., Kuiper, M. und Zabeau, M. (1995) Nucl. Acids Res. 23, 4407–4414). Da diese Multicopy-Restriktionsfragmente häufiger in Spur A als in Spur C vorhanden sind, kann daraus geschlossen werden, dass mittlere und hoch repetetive Sequenzen stark methyliert sind. Es sollte außerdem beachtet werden, dass die übermäßige Verwendung von Primern bei diesen Multicopy PstI-MseI-Restriktionsfragmenten außerdem zu einer Unterrepräsentierung der Fragmente in Spur B führt.
Beispiel III- Abschätzung des Maßes der ^SmCpNpG wie sie bei PstI-Schnittstellen in einigen großen Pflanzengenomen vorkommt.
Bei Pflanzen ist das modifizierte C an Position 5 (^m5C) nicht nur auf CpG Dinukleotide beschränkt, wie bei Tieren, sondern kommt außerdem bei einer Vielzahl anderer Cytosin enthaltender Dinukleotide vor, die alle ein Teil des grundlegenden CpNpG Trinukleotids sind, wobei N jedes Nukleotid sein kann (Gruenbaum, Y., Naveh-Maney, T., Cedar, H. und Razin, A., 1981, Nature 292, 806–862). Das Restriktionsenzym PstI, das die Erkennungssequenz 5'-CTGCAG-3' aufweist, die zwei CpNpG Trinukleotide enthält, ist empfindlich gegenüber Methylierung am 5'-C und 3'-C (McClelland, M., Nelson, M. und Raschke, E. (1994) Nucl. Acids Res. 22, 3640-3659). Ob die gleichzeitige Methylierung beider C's der PstI-Erkennungssequenz möglich ist, ist nicht klar. Der durchschnittliche Prozentsatz ± Standardabweichung der methylierten PstI-Schnittstellen in der Kern-DNA von Tomate, Mais und Ölsamenraps ist in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1. Durchschnittlicher Prozentsatz ± Standardabweichung methylierter PstI-Schnittstellen und ^5mCpNpG, wie er bei PstI-Schnittstellen in der Kern-DNA von Tomate, Mais und Ölsamenraps vorkommt, und veröffentlichte durchschnittliche Prozentsätze von ^5mC-Resten (ausgedrückt als% ^5mC/^5mC+C) in der Kern-DNA von Tomate und Mais. N = Anzahl der untersuchten Genotypen. n = Gesamtzahl der gezählten PstI/MseI-Restriktionsfragmente.
Aus Tabelle 1 wird ersichtlich, dass die Abweichung des Prozentsatzes der methylierten PstI-Schnittstellen innerhalb einer Spezies sehr gering ist. Die Verwendung des Prozentsatzes der ^5mCpNpG-Schnittstellen, wie bei den PstI-Schnittstellen gezeigt, berechnet als halbe Anzahl der methylierten PstI-Schnittstellen zur Abschätzung des Prozentsatzes der ^5mC-Reste in der Kern-DNA (ausgedrückt als ^5mC/^5mC+C), ergibt für die ^5mC-Reste Prozentsätze, die den veröffentlichten Prozentsätzen sehr ähneln, basierend auf HPLC-Analysen (Messuguer, R., Ganal, M. W., Steffens, J. C., und Tanksley, S. D., 1991, Plant Mol. Bio. 16, 753–770 und Montero, L. M. et al., 192, Nucl. Acids Res. 20, 3207–3210) für Tomate und Mais (siehe Tabelle 1). Deswegen ist die Methylierung von nur einem C-Rest in der PstI-Erkennungssequenz höchstwahrscheinlich.
Beispiel IV: Abschätzung des Maßes der ^5mCpG wie sie bei HpaII-, MspI- und ClaI-Schnittstellen in einigen großen Pflanzengenomen, vorkommt.
MspI und HpaII (Methylierungs-Isoschizomere) haben die gleiche Erkennungsequenz 5'-CCGG-3', enthaltend ein CpG Dinukleotid. Dennoch ist MspI empfindlich gegenüber 5'-^5mC, während HpaII empfindlich gegenüber Methylierung von jedem C an Position 5 ist (Mc-Clelland, M., Nelson, M. und Raschke, E. (1994) Nucl. Acids Res. 22, 3640-3659). Deswegen eignen sich MspI und HpaII für die Abschätzung des Maßes der ^5mCpG. Das Maß der ^5mCpG-Methylierung wird bei Verwendung von HpaII und MspI als methylierungs-sensitiven Restriktionsenzymen mit selten vorkommenden Schnittstellen als die Differenz der gezählten Banden in einem MspI und einem HpaII Fingerabdruck in Spur C bestimmt; die Differenz der gezählten Banden in einem MspI und einem HpaII Fingerabdruck in Spur A muß das gleiche Ergebnis liefern. Die Prozentsätze der ^5mCpG-Schnittstellen in der Kern-DNA von Tomate und Mais, wie sie bei HpaIIund MspI-Schnittstellen vorkommen, werden nur für nur eine(n) Genotyp/Spezies bestimmt, und sind in Tabelle 2 gezeigt.
Ein weiteres methylierungs-sensitives Restriktionsenzym, ClaI, weist die CpG-Dinukleotid enthaltende Erkennungsequenz 5'-ATCGAT- 3' auf, und betroffen von ^5mCpG (McClelland, M., Nelson, M. und Rschke, E. und (1994) Nucl. Acids Res. 22, 3640-3659) wurde außerdem herausgefunden, dass es ein geeignetes Restriktionsenzym mit selten vorkommenden Schnittstellen für den Nachweis der ^5mCpG ist. Die Prozentsätze der ^5mCpG wie sie bei HpaII-, MspII- und ClaI-Schnittstellen in der Kern-DNA von Tomate, Mais und Ölsamenraps vorkommen, werden nur für eine(n) Genotyp/Spezies bestimmt und sind in Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2. Prozentsätze der ^5mCpG in der Kern-DNA von Tomate, Mais und Ölsamenraps, wie sie bei HpaII-, MspI- und ClaI-Schnittstellen vorkommen. n = Gesamtzahl der gezählten Restriktionsfragmente.
Bei Tomate wird im Gegensatz zu Mais ein ähnlicher Prozentsatz an ^5mCpG wie er bei ClaI-Schnittstellen vorkommt ebenso für entweder HpaII- oder MspI-Schnittstellen erhalten. Abschätzungen des Prozentsatzes von ^5mC-Resten wie sie bei ClaI-Schnittstellen in der Kern-DNA von Tomate, Mais und Ölsamenraps vorkommen, sind wesentlich höher als die entsprechenden Prozentsätze von ^5mC-Resten wie sie bei PstI-Schnittstellen vorkommen. Dies kann darauf hinweisen, dass die Mehrzahl der ^5mC-Reste im Tomate-, Mais- und Ölsamenraps-Genom bei CpG-Sequenzen vorliegen.
Beispiel V; ^5mC-Polymorphismus und seine Vererbung.
AFLP deckt vorwiegend Abweichungen der primären DNA-Sequenz auf, entweder Basensubstitutionen oder DNA-Umlagerungen. Durch Methylierung modifizierte Nukleotide werden nicht als Teil der primären Nukleotidsequenz eines Individuums betrachtet. Diese Nukleotidmodifizierung, die sich aus einem post-replikativen Ereignis an definierten, aber nicht allen Zielsequenzen (d. h. CpG und CpNpG) ergibt, verkörpert zwei zusätzliche Formen des DNA-Polymorphismus: (i) Polymorphismus, der die Abweichung der primären Nukleotidsequenz der methylierten Restriktionsschnittstelle und/oder die Abweichung bei der Restriktionsgröße (^mAFLP-Marker) wiedergibt, und (ii) Allel-spezifische Methylierung (^asmAFLP-Marker). Weil die DNA-Methylierung außerdem die einzige Quelle für Allel-Unterschiede zwischen Epiallelen ist, sind ^asmAFLP-Marker Epiallel-Marker. Da Methylierungs-AFLP eine eindeutige Darstellung der nativen methylierten Schnittstellen liefert, kann diese zusätzliche Quelle von DNA-Polymorphismus ausgenutzt werden.
Damit Methylierungs-Polymorphismus genutzt werden kann z. B. bei AFLP-Kartierungsstudien, muss er stabil vererbt werden. 8A zeigt die Auftrennung einer Anzahl von ^mAFLP-Markern bei einer rekombinanten Inzucht (RI) Population, die aus der Kreuzung von B73 × Mo17 stammt. Die Bandenintensitäten teilen sich in zwei unterschiedliche Klassen, eine mit fehlender Homozygotie und eine mit vorhandener Homozygotie, annährend der Mendelschen 1 : 1 Teilung. Um mögliche ^asmAFLP-Markerpaare zu identifizieren, werden folgende Kriterien angewandt: (i) eine AFLP-Bande und eine ^mAFLP-Bande könnten Epiallele sein, wenn sie von unterschiedlichen Eltern mit der geichen PC stammen; (ii) und der AFLP- und ^mAFLP-Marker an den gleichen Genlocus binden (komplementäre Teilung). Die 8A und 8B zeigen die Aufteilung eines ^mAFLP-Marker Paars bei der RI-Population. Die Bandenintensitäten teilen sich in zwei unter schiedliche Klassen, eine mit fehlender Homozygotie und eine mit vorhandener Homozygotie. Von insgesamt 637 kartierten AFLP- + ^mAFLP-Markern, hergestellt mit einem Satz von 14 PstI/MseI PCs, machen die ^mAFLP-Marker 44,6% aus, was in guter Übereinstimmung mit den 50,78% methylierter PstI-Schnittstellen im Mais-Genom ist (Tabelle 1), während sich kaum 1% der Markerallele wie Epiallele verhalten.
Wie aus der oberen Beschreibung und den Beispielen entnommen werden kann, kann das Verfahren der Erfindung als eine DNA-Fingerabdrucktechnik betrachtet werden, die genomische Restriktionsfragmente nachweist und in diesem Punkt der AFLP-Technik gleicht, mit dem großen Unterschied, dass die Methylierungs-AFLP auch native methylierte Schnittstellen anzeigt, aber im allgemeinen nur, wenn sie sich in der Erkennungsequenz des verwendeten methylierungssensitiven Restriktionsenzyms mit selten vorkommenden Schnittstellen befinden. Wie bei AFLP ist die Multiplexrate hoch (50–100 Restriktionsfragmente) und eine Funktion von (i) der Spaltungshäufigkeit des methylierungs-sensitiven Restriktionsenzyms mit selten vorkommenden Schnittstellen und (ii) die Anzahl und Beschaffenheit der selektiven Basen des spezifischen Primersatzes.
Wie in den Beispielen gezeigt, kann das Verfahren der Erfindung außerdem für die Abschätzung des Maßes der ^5mCpNpG bzw. ^5mCpG verwendet werden, wie es bei den PstI- bzw. ClaI-, HpaI- und MspI-Schnittstellen im Genom weniger Feldfrüchte vorkommt. Obwohl eine Verallgemeinerung dieser Abschätzungen auf Prozentsätze von ^5mCpNpG und ^5mCpG im Genom in einigen Fällen nicht vollkommen repräsentativ sein wird, unabhängig von der Erkennungssequenz, da die Methylierung von C durch die Beschaffenheit der C-flankierenden Nukleotide (Erkennungssequenz) oder durch den G + C Gehalt der genomischen Region in der sich C befindet (CG-Inseln) beeinflusst sein kann, wird das Verfahren der Erfindung dem Fachmann immer noch wertvolle Information liefern.
Obwohl die Erfindung bisher im wesentlich hinsichtlich der Verwendung von Methylierungs-AFLP zur Abschätzung des Maßes von ^5mCpG und ^SmCpNpG beschrieben wurde, wie bei einigen Erkennungssequenzen im Genom vorkommend, ist die Erfindung und ihre möglichen Anwendungen nicht darauf beschränkt. Modifikationen von C an anderen Positionen als 5 (z. B. ^m4C) oder andere modifizierte Nukleotide als C (z. B. ^m6A), ob sie in einem symmetrischen oder einem nichtsymmetrischen Dinukleotid (z. B. ^5mCpC) vorhanden sind, werden berichtet ((Gruenbaum, Y., Naveh-Maney, T., Cedar, H. und Razin, A., 1981 Nature 292, 806–862); Selker, E. U. Fritz, D. Y. und Singer, M. J., 1993, Science 262, 1724–1728; und Meyer, P., Niedenhof, I., ten Lohuis, M., 1994, The EMBO Journal 13, 2084–2088).
Methylierungs-AFLP kann ebenfalls vorteilhaft verwendet werden, um die niedrige Verbreitung dieser kleinen Nukleotidmodifikationen, wie sie bei Erkennungssequenzen von methylierungs-sensitiven Restriktionsenzymen mit selten vorkommenden Schnittstellen vorkommen, abzuschätzen und ein Licht auf ihre Verteilung über das Genom zu werfen.
Methylierungs-AFLP erlaubt die Auswertung von zwei zusätzlichen Formen von DNR-Polymorphismus: (i) Polymorphismus, der die Abweichung der primären Nukleotidsequenz der methylierten Restriktionschnittstelle und/oder die Abweichung der Größe des Restriktionsfragments wiedergibt, und (ii) Allel-spezifische Methylierung. Kaum 1% der Markerallele verhalten sich wie Epiallele.
Durch Aufzeichnung der Auftrennung von ^mAFLP- und ^asmAFLP-Markern bei einer RI Population konnte gezeigt werden, dass (i) sich C- Methylierung in perfekter Übereinstimmung mit der primären Zielsequenz auftrennt, während (ii) die wenigen bei den Eltern beobachteten Epiallele sich dem Nachwuchs auf Mendelsche Art vererben.
Wie AFLP-Marker entsprechen die meisten ^mAFLP-Marker einzigartigen Positionen im Genom und können deshalb als Kennzeichnung und als Hilfsmittel zur Verbindung zwischen genetischen und physikalischen Genkarten verwertet werden (Vos, P., Hogers, R., Bleeker, M., Reijans, M., van de Lee, T., Hornes, M., Frijters, A., Pot, J., Peleman, J., Kuiper, M. und Zabeau, M. (1995) Nucl. Acids Res. 23,1 4407–4414). Deshalb kann die Methylierungs-AFLP in der Genomforschung nützlich sein. Native methylierte Schnittstellen sind in klonierten DNA-Abschnitten vorhanden, z. B. künstliche Hefechromosomen (YACs) als nicht-methylierte Schnittstellen. Deshalb können native methylierte Schnittstellen auf einer physikalischen Genkarte nicht von nativen nicht-methylierten Schnittstellen unterschieden werden. Trotzdem hilft es eine physikalische Genkarte mit einer ^mAFLP-Marker enthaltenden Genkarte zu koppeln, um native methylierte Schnittstellen auf der physikalischen Karte zu erkennen.
Mehr als in der Pflanzengenetik sind in der Humangenetik die epigenetischen Auswirkungen der DNA-Methylierung bei CpG-Inseln enthaltenden Promotoren gründlich belegt. Aufgrund ihrer Empfindlichkeit, Zuverlässigkeit und quantitativen Eigenschaft ist die Methylierungs-AFLP ein attraktives Verfahren, um die Methylierungsgrade der DNA an spezifischen Genloci wie Tumor-Suppressorgenen zu bestimmen und gekennzeichnete Gene aufzuspüren.
Anmerkung: AFLP^TM ist ein Markenzeichen von Keygene N. V.

Claims

Verfahren zum Analysieren oder Bestimmen des Methylierungsmusters einer Anfangs-DNA und/oder zum Unterscheiden zwischen methylierten und nichtmethylierten Stellen in einer Anfangs-DNA, umfassend ein Vergleichen einer Kombination von mindestens zwei DNA-Fingerabdrücken, die. erzeugt werden, indem mindestens zwei unterschiedliche DNA-Fingerabdruckverfahren verwendet werden, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: A) ein Verfahren (A) umfassend: A1) Restringieren der Anfangs-DNA mit einem Restriktionsenzym mit häufig vorkommenden Schnittstellen und einem methylierungssensitiven Restriktionsenzym mit selten vorkommenden Schnittstellen; A2) Ligieren der so erhaltenen Restriktionsfragmente mit einem ersten und zweiten Adapter für das. Restriktionsenzym mit häufig vorkommenden Schnittstellen sowie einem ersten Adapter für das Restriktionsenzym mit selten vorkommenden Schnittstellen, wobei die Adapter an die geschnittenen Enden der Restriktionsfragmente ligiert werden können und eine Sequenz umfassen, die komplementär zu einem Primer ist; A3) Amplifizieren der so erhaltenen Mischung unter Verwendung von Primern, die mit dem ersten und zweiten Adapter des Restriktionsenzyms mit häufig vorkommenden Schnittstellen hybridisieren können; A4) Restringieren der so erhaltenen, amplifizierten Fragmente unter Verwendung eines, methylierungssensitiven Restriktionsenzyms mit selten vorkommenden Schnittstellen; A5) Ligieren der so erhaltenen Restriktionsfragmente mit einem zweiten Adapter für das methylierungssensitive Restriktionsenzym mit selten vorkommenden Schnittstellen, der ein AFLP-Adapter ist; A6) Amplifizieren der so erhaltenen Restriktionsfragmente unter Verwendung von auf AFLP beruhenden, selektiven Amplifizie- rungsschritten, umfassend das Verwenden eines AFLP-Primers für den ersten oder zweiten Adapter des Restriktionsenzyms mit häufig vorkommenden Schnittstellen und eines AFLP-Primers für den zweiten Adapter des Restriktionsenzyms mit selten vorkommenden Schnittstellen; A7) Erzeugen eines ersten DNA-Fingerabdrucks, enthaltend Banden, die nur den methylierten Schnittstellen des Restriktionsenzyms mit selten vorkommenden Schnittstellen entsprechen, durch Analysieren der Mischung von amplifizierten Fragmenten beruhend auf dem Unterschied in der Größe oder dem Molekulargewicht der amplifizierten Fragmente und Visualisieren der amplifizierten Fragmente; B) ein Verfahren (B) umfassend: B1) Restringieren der Anfangs-DNA mit einem Restriktionsenzym mit häufig vorkommenden Schnittstellen; B2) Ligieren der so erhaltenen Restriktionsfragmente mit einem dritten und vierten Adapter für das Restriktionsenzym mit häufig vorkommenden Schnittstellen, wobei die Adapter an die geschnittenen Enden der Restriktionsfragmente ligiert werden können und eine Sequenz umfassen, die komplementär. zu einem Primer ist; B3) Amplifizieren der so erhaltenen Mischung unter Verwendung von Primern, die mit dem dritten und vierten Adapter des Restriktionsenzyms mit häufig vorkommenden Schnittstellen hybridisieren können. B4) Restringieren der so erhaltenen, amplifizierten Fragmente unter Verwendung eines methylierungssensitiven Restriktionsenzyms mit selten vorkommenden Schnittstellen. B5) Ligieren der so erhaltenen Restriktionsfragmente mit einem dritten Adapter für das methylierungssensitive Restriktionsenzym mit selten vorkommenden Schnittstellen, der ein AFLP-Adapter ist. B6) Amplifizieren der so erhaltenen Mischung unter Verwendung von auf AFLP beruhenden, selektiven Amplifizierungsschritten unter Verwendung eines AFLP-Primers für den dritten AFLP-Adapter des methylierungssensitiven Restriktionsenzyms mit selten vorkommenden Schnittstellen sowie eines AFLP-Primers für den dritten oder vierten Adapter des Restriktionsenzyms mit häufig vorkommenden Schnittstellen; B7) Erzeugen eines DNA-Fingerabdrucks, enthaltend Banden, die sowohl den relevanten methylierten als auch den relevanten nicht methylierten Schnittstellen entsprechen, durch Analysieren der Mischung von amplifizierten Fragmenten beruhend auf dem Unterschied in der Größe oder dem Molekulargewicht der amplifizierten Fragmente und Visualisieren der amplifizierten Fragmente; C) ein Verfahren (C) umfassend: C1) Restringieren der Anfangs-DNA mit einem Restriktionsenzym mit häufig vorkommenden Schnittstellen und einem methylierungssen sitiven Restriktionsenzym mit selten vorkommenden Schnittstellen; C2) Ligieren der so erhaltenen Restriktionsfragmente mit einem fünften Adapter für das Restriktionsenzym mit häufig vorkommenden Schnittstellen sowie einem vierten Adapter für das methylierungssensitive Restriktionsenzym mit selten vorkommenden Schnittstellen, wobei die Adapter AFLP-Adapter sind; C3) Amplifizieren der so erhaltenen Mischung unter Verwendung von auf AFLP beruhenden, selektiven Amplifizierungsschritten umfassend das Verwenden eines AFLP-Primers für den fünften AFLP-Adapter des Restriktionsenzyms mit häufig vorkommenden Schnittstellen sowie eines AFLP-Primers für den vierten Adapter des methylierungssensitiven Restriktionsenzyms mit selten vorkommenden Schnittstellen; C4) Erzeugen eines DNA-Fingerabdrucks, enthaltend Banden, die nur den nicht methylierten Schnittstellen des Restriktionsenzyms mit selten vorkommenden Schnittstellen entsprechen, durch, Analysieren der Mischung von amplifizierten Fragmenten beruhend auf dem Unterschied in der Größe oder dem Molekulargewicht der amplifizierten Fragmente und Visualisieren der amplifizierten Fragmente.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die aus (A), (B) und/oder (C) erhaltenen Fingerabdrücke in getrennten Spuren desselben Elektrophoresegels aufgetrennt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem der dritte und vierte Adapter des Restriktionsenzyms mit häufig vorkommenden Schnittstellen im Wesentlichen dieselben sind wie der erste und zweite Adapter des Restriktionsenzyms mit häufig vorkommenden Schnittstellen.
Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem der dritte AFLP-Adapter des Restriktionsenzyms mit selten vorkommenden Schnittstellen im Wesentlichen derselbe ist wie der zweite AFLP-Adapter des Restriktionsenzyms mit selten vorkommenden Schnittstellen.
Verfahren zum Herstellen eines AFLP-Fingerabdrucks, enthaltend Banden, die den methylierten Stellen in einer Anfangs-DNA entsprechen, umfassend: 1) Restringieren der Anfangs-DNA mit einem Restriktionsenzym mit häufig vorkommenden Schnittstellen und einem methylierungssensitiven Restriktionsenzym mit selten vorkommenden Schnittstellen; 2) Ligieren der so erhaltenen Restriktionsfragmente mit einem ersten und zweiten Adapter für das Restriktionsenzym mit häufig vorkommenden Schnittstellen sowie einem ersten Adapter für das Restriktionsenzym mit selten vorkommenden Schnittstellen, wobei die Adapter an die geschnittenen Enden der Restriktionsfragmente ligiert werden können und eine Sequenz umfassen, die komplementär zu einem Primer ist; 3) Amplifizieren der so erhaltenen Mischung unter Verwendung von Primern, die mit dem ersten und zweiten Adapter des Restriktionsenzyms mit häufig vorkommenden Schnittstellen hybridisieren können. 4) Restringieren der so erhaltenen, amplifizierten Fragmente unter Verwendung eines methylierungs sensitiven Restriktionsenzyms mit selten vorkommenden Schnittstellen. 5) Ligieren der so erhaltenen Restriktionsfragmente mit einem zweiten Adapter für das methylierungssensitive Restriktionsenzym mit selten vorkommenden Schnittstellen, der ein AFLP-Adapter ist. 6) Amplifizieren der so erhaltenen Restriktionsfragmente unter Verwendung von auf AFLP beruhenden, selektiven Amplifizierungsschritten, umfassend das Verwenden eines AFLP-Primers für den ersten oder zweiten AFLP-Adapter des Restriktionsenzyms mit häufig vorkommenden Schnittstellen und eines AFLP-Primers für den zweiten AFLP-Adapter des Restriktionsenzyms mit selten-vorkommenden Schnittstellen; 7) Erzeugen eines DNA-Fingerabdrucks durch Analysieren der Mischung von amplifizierten Fragmenten beruhend auf Unterschieden in der Größe oder dem Molekulargewicht der amplifizierten Fragmente und Visualisieren der amplifizierten Fragmente.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–5, wobei das Restriktionsenzym mit häufig vorkommenden Schnittstellen ausgewählt ist aus MseI und TagI und das methylierungssensitive Restriktionsenzym mit selten vorkommenden Schnittstellen ausgewählt ist aus PstI, HpaII, MspI, ClaI, HhaI, EcoRII, BbvI, PvuII, XmaI, Smal, NciI, AvaI, HaeII, SalI, XhoI und PvuII.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–6 zur Verwendung beim Unterscheiden zwischen, Identifi- zieren oder Klassifizieren von Individuen, Verschiedenheiten oder Arten auf der Basis ihrer DNA-Methylierung durch Vergleich der Methylie rungsmuster unterschiedlicher individueller Quellen; zum Fingerabdruck erstellen von Genomen und zum Entdecken von Methylierungspolymorphismen; oder zum Entdecken spezifischer Methylierungsmuster, die dem Vorhandensein spezifischer Sequenzen oder genetischer Vererbungsmerkmale entsprechen, sowie vererbter DNA-Methylierung und allelspezifischer Methylierung.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–6 zur Verwendung beim Unterscheiden zwischen transformierten und nicht transformierten Genen oder Sequenzen, beispielsweise bei der Entdeckung von Transgenen; und zum Unterscheiden zwischen replizierter und nicht replizierter DNA in Bakterien.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–6 zur Verwendung beim Untersuchen oder Bestimmen der Regulation der Genexpression in Eukaryonten; insbesondere zum Entdecken von Gen-Silencing oder von Genaktivierung.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–6 zur Verwendung beim Entdecken von genetischen Erkrankungen wie beispielsweise DNA-Methylierung in Verbindung mit genetischen Erkrankungen und „Imprinting" sowie erhöhter Anfälligkeit für Mutagenese und Krebs.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–6 zur Verwendung beim Schätzen des Ausmaßes der Methylierung in einer DNA oder in einem Genom; oder zum Entdecken methylierter DNA-Marker.
Ausstattung zur Verwendung mit dem Verfahren eines der Ansprüche 1–11, wobei die Ausstattung mindestens ein Restriktionsenzym mit häufig vorkommen den Schnittstellen, ein methylierungssensitives Restriktionsenzym mit selten vorkommenden Schnittstellen, (mindestens) einen ersten und zweiten Adapter zur Verwendung mit dem Restriktionsenzym mit häufig vorkommenden Schnittstellen und (mindestens) einen ersten und zweiten Adapter zur Verwendung mit dem Restriktionsenzym mit selten vorkommenden Schnittstellen, wobei der Adapter mit den geschnittenen Enden der Restriktionsfragmente ligiert werden kann und eine Sequenz umfasst, die komplementär zu einem Primer ist, sowie Primer zur Verwendung mit diesen Adaptern und optional weitere Bestandteile für Ausstattungen, die per se bekannt sind, umfasst.