DE10353419B3 - Verfahren zur Untersuchung von Cytosin-Methylierungen in DNA-Sequenzen mittels hemimethylierungssensitiver Restriktionsenzyme - Google Patents

Verfahren zur Untersuchung von Cytosin-Methylierungen in DNA-Sequenzen mittels hemimethylierungssensitiver Restriktionsenzyme Download PDF

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Abstract

Die folgende Erfindung betrifft ein enzymatisches Verfahren zur Untersuchung von Cytosin-Methylierungen in DNA-Sequenzen. Dabei wird die zu untersuchende DNA an Oligonukleotide hybridisiert. Die Hybride werden mit Restriktionsenzymen umgesetzt, die in der Lage sind, hemimethylierte DNA-Doppelstränge entweder von unmethylierten oder homomethylierten DNA-Doppelsträngen zu unterscheiden. Über unterschiedliche Detektionsmöglichkeiten kann der Methylierungsstatus der zu untersuchenden Cytosin-Positionen bestimmt werden. Das Verfahren eignet sich insbesondere zur Diagnose von Krebserkrankungen und anderer mit einer Veränderung des Methylierungsstatus assoziierten Krankheiten sowie zur Prognose unerwünschter Arzneimittelwirkungen.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Untersuchung von Cytosinmethylierungen in DNA-Sequenzen.
  • Hintergrund der Erfindung
  • 5-Methylcytosin ist die häufigste kovalent modifizierte Base in der DNA eukaryontischer Zellen. Sie spielt eine wichtige biologische Rolle, u.a. bei der Transkriptionsregulation, beim genetischen Imprinting und in der Tumorgenese (zur Übersicht: Millar et al.: Five not four: History and significance of the fifth base. In: The Epigenome, S. Beck and A. Olek, eds.: The Epigenome. Wiley-VCH Verlag Weinheim 2003, S. 3-20). Die Identifizierung von 5-Methylcytosin als Bestandteil genetischer Information ist daher von erheblichen Interesse. Ein Nachweis der Methylierung ist allerdings schwierig, da Cytosin und 5-Methylcytosin das gleiche Basenpaarungsverhalten aufweisen. Viele der herkömmlichen, auf Hybridisierung beruhenden Nachweisverfahren vermögen daher nicht zwischen Cytosin und Methylcytosin zu unterscheiden. Zudem geht die Methylierungsinformation bei einer PCR-Amplifikation vollständig verloren.
  • Die gebräuchlichen Methoden zur Methylierungsanalyse arbeiten im wesentlichen nach zwei unterschiedlichen Prinzipien. Zum einen erfolgt eine selektive chemische Umwandlung von nicht-methylierten Cytosinen in Uracil (Bisulfit-Behandlung), zum anderen werden methylierungsspezifische Restriktionsenzyme benutzt. Die enzymatisch oder chemisch vorbehandelte DNA wird dann meist amplifiziert und kann auf unterschiedliche Weise analysiert werden (zur Übersicht: WO 02/072880 S. 1 ff).
    •
  • Die herkömmlichen Verfahren leiden unter mehreren Nachteilen. So ist die Bisulfitbehandlung zeit- und arbeitsaufwendig. Zudem besteht die Möglichkeit, dass die DNA nur unvollständig umgesetzt und außerdem zum Teil degradiert wird. Eine Quantifizierung ist sowohl bei der chemisch wie bei der enzymatisch vorbehandelten DNA schwierig. Erforderlich hierzu ist eine Amplifikation, meist eine PCR. Dieser zusätzliche Arbeitsschritt ist mit mehreren Problemen verbunden, etwa der Gefahr einer bevorzugten Amplifikation bestimmter Sequenzen (sog. „Bias").
  • Das erfindungsgemäße Verfahren erfordert dagegen keine Amplifikation und erlaubt so eine schnellere und einfachere Analyse als die herkömmliche Methodik. Es ermöglicht zudem eine Quantifizierung. Im erfindungsgemäßen Verfahren wird die zu untersuchende DNA mit Oligonukleotiden eines definierten Methylierungszustandes hybridisiert. Dabei entstehen je nach Methylierungsstatus der zu untersuchenden DNA und der Oligonukleotide Hybride, die auf beiden DNA-Strängen entweder den gleichen oder einen unterschiedlichen Methylierungszustand besitzen. Anschließend werden die Hybride mit Restriktionsenzymen umgesetzt, wobei die Restriktion von dem Methylierungszustand der Hybride abhängig ist. Über unterschiedliche Detektionsmöglichkeiten kann dann auf den Methylierungsstatus der DNA geschlossen werden.
  • Eine Hybridbildung und eine anschließende, unterschiedliche Restriktion der unterschiedlich methylierten Hybride wird auch bei dem sog. Genomic Mismatch Scanning (GMS) benutzt. Hierbei handelt es sich um ein Verfahren zur Detektion von Polymorphismen. Dabei werden die DNA-Stränge zweier unterschiedlicher Individuuen miteinander hybridisiert, wobei die DNA eines Individuums zuvor durch Einsatz von Enzymen künstlich methyliert wurde. Die entstandenen Homohybride werden dann anschließend enzymatisch verdaut, während die Heterohybride weiter analysiert werden (siehe etwa: Nelson et al.: Genomic mismatch scanning: a new approach to genetic linkage mapping. Nat Genet. 1993 May;4(1):11-8). Die künstliche Methylierung und die anschließende Restriktion dienen hier also der Isolierung der Heterohybride. Eine Nutzung der unterschiedlichen Restriktion unterschiedlich methylierter DNA-Hybride zur quantitativen Analyse der natürlichen DNA-Methylierungsmuster ist bisher noch nicht beschrieben.
  • J.P. Jost et al. („Mechanisms of DNA Demethylation in Chicken Embryos. Purification and properties of 5-methylcytosine-DNA glycosylase", Journal of Biological Chemistry, 1995; Volume 270, Nr. 17, Seiten 9734-9739) beschreiben die Verwendung eines hemimethylierten DNA-Dopplestranges, bestehend aus einem synthetischen, methylierten Oligonukleotid und einem unmethylierten Oligonukleotid, als Substrat zum Nachweis einer Endonuklease-Aktivität.
  • Synthetische, methylierte Oligonukleotide werden auch von X. Yao et al. („A methylated oligonucleotide inhibits IGF2 expression and enhances survival in a model of hepatocellular carcinoma", Journal of Clinical Investigations, 2003, Volume 111, Nr. 2, Seiten 265-273) beschrieben. Sie dienen dort als antisence Oligonukleotide zur Aktivierung von DNMT1.
  • Die WO 03/025215 A1 beschreibt die Verwendung der methylierungs-sensitiven Restriktionsenzyme AscI, HinPI, ClaI oder NruI zur Bestimmung von Methylierungsprofilen.
  • Die WO 03/027640 A2 beschreibt Verfahren zur Detektion von Polymorphismen, wobei D-Loops ausgebildet werden. In einem Beispiel werden Restriktionsenzyme beschreiben, die zur Spaltung des D-Loops eingesetzt, die zu einer Unterscheidung von methylierten und nicht-methylierten Targets verwendet werden können.
  • J. Kaput und T. W. Sneider („Methylation of somatic vs germ cell DNAs analyzed by restriction endonuclease digestions", Nucleic Acids Research, 1979, Volume 7, Nr. 8, Seiten 2303-2322) verwenden methylierungs-sensitive Restriktionsenzyme zur Untersuchung des Methylierungssta tus, wobei auch eine Hemimethylierungs-Sensitivität bekannt ist.
  • Y. Grünbaum et al. („Restriction enzyme digestion of hemimethylated DNA", Nucleic Acids Research, 1981, Volume 9, Nr. 11, Seiten 2509-2515) zeigt den Nachweis der Hermimethylierungs-Sensitivität von verschieden Restriktionsenzymen.
  • Die WO 02/00842 A2 beschreibt den Einsatz methylierungssensitiver Restriktionsenzyme zur Gewinnung von Zentromer-DNA.
  • Im erfindungsgemäßen Verfahren wird die zu untersuchende DNA mit Oligonukleotiden eines definierten Methylierungsstatus hybridisiert und anschließend mit bestimmten Restriktionsenzymen umgesetzt. Die Restriktionsenzyme sind in der Lage, CpG-Sequenzen zu erkennen und zudem hemimethylierte DNR-Doppelstränge entweder von unmethylierten oder von homomethylierten DNA-Doppelsträngen zu unterscheiden. Diese Restriktionsenzyme werden im folgenden als hemimethylierungssensitiv bezeichnet. Die Begriffe hemimethyliert, homomethyliert, unmethyliert und definierter Methylierungsstatus sind wie folgt zu verstehen: Sind die Cytosine in den zu untersuchenden CpG-Position methyliert, so bilden sie mit Oligonukleotiden, deren entsprechende CpG-Position nicht methyliert ist, Doppelstränge, bei denen diese spezielle CpG-Position nur auf einem Strang methyliert (hemimethyliert) ist. Das gleiche gilt für Hybride aus entsprechend methylierten Oligonukleotiden und unmethylierter zu untersuchender DNA. Sind dagegen sowohl Oligonukleotid wie auch DNA an der CpG-Position methyliert, so resultiert ein auf beiden Seiten methylierter Doppelstrang (Homomethylierung). Umgekehrt entstehen, wenn die CpG-Positionen sowohl in der zu untersuchenden DNA wie auch im Oligonukleotid unmethyliert sind, unmethylierte Doppelstränge. Die Begriffe hemimethyliert, homomethyliert und unmethyliert beschreiben im folgenden also nicht den Gesamt-Methylierungszustand der DNA, sondern nur den Zustand an einzelnen CpG-Positionen innerhalb der DNA. Unter einem definierten Methylierungsstatus ist zu verstehen, dass die Cytosine der eingesetzten Oligonukleotide in den CpG-Positionen, die den zu untersuchenden CpG-Positionen in der DNA entsprechen, entweder unmethyliert oder an der 5-Position methyliert vorliegen.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren zur Methylierungsanalyse besteht aus folgenden vier Schritten:
    • a) die zu untersuchende DNA wird an Oligonukleotide eines definierten Methylierungsstatus hybridisiert,
    • b) die Hybride werden mit mindestens einem hemimethylierungssensitiven Restriktionsenzym umgesetzt,
    • c) es wird detektiert, ob eine Restriktion stattgefunden hat,
    • d) es wird auf den Methylierungszustand der untersuchten DNA geschlossen.
  • Im ersten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die zu untersuchende DNA an Oligonukleotide hybridisiert. Dies kann sowohl in Lösung wie auch an einer Festphase erfolgen. Die zu untersuchende DNA kann aus unterschiedlichen Quellen stammen. Für diagnostische Zwecke können als Ausgangsmaterial u.a. Gewebeproben, aber auch Körperflüssigkeiten, insbesondere Serum, dienen. Denkbar ist auch, die DNA aus Sputum, Stuhl, Urin oder Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit zu verwenden. Bevorzugt wird die DNA aus den biologischen Proben isoliert. Die DNA-Extraktion erfolgt nach Standardmethoden, aus Blut etwa unter Verwendung des Qiagen UltraSens DNA Extraktions-Kits. Die isolierte DNA wird dann etwa durch Umsatz mit herkömmlichen (nicht hemimethylierungssensitiven) Restriktionsenzymen fragmentiert. Die Reaktionsbedingungen und die in Frage kommenden Enzyme sind dem Fachmann bekannt und ergeben sich etwa aus den von den Herstellern mitgelieferten Protokollen.
  • Je nach dem später zu verwendenden Restriktionsenzym sind die Oligonukleotide an den Cytosin-Positionen, die von dem Restriktionsenzym erkannt werden, unmethyliert oder an der 5-Position methyliert. Für eine quantitative Analyse werden sowohl methylierte wie auch unmethylierte Oligonukleotide eingesetzt (s.u.). Die Synthese von entsprechend unmethylierten und methylierten Oligonukleotiden gehört zum Stand der Technik. In einer weiteren bevorzugten Variante werden mehrere Oligonukleotide unterschiedlicher Sequenz verwendet, so dass eine Untersuchung mehrerer Methylierungspositionen gleichzeitig möglich ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform tragen die Oligonukleotide zudem mindestens eine nachweisbare Markierung. Dabei ist dem Fachmann eine Vielzahl möglicher Markierungen bekannt. So können etwa Farbstoffe, Fluoreszenzmarkierungen, Radionuklide, elektrische Ladungsträger oder im Massenspektrometer nachweisbare Markierungen eingesetzt werden. Denkbar sind auch Peptid-Markierungen, die indirekt durch Bindung eines anders markierten Antikörpers nachgewiesen werden. Es sind auch chemische Markierungen möglich, die durch nachfolgende Umsetzung mit einem anders markierten Markermolekül sichtbar gemacht werden. Viele andere Markierungsmöglichkeiten gehören ebenfalls zum Stand der Technik. Bevorzugt tragen die Oligonukleotide unterschiedlicher Sequenz oder unterschiedlichen Methylierungsstatus unterschiedliche Markierungen.
  • In einer besonders bevorzugten Variante trägt das Oligonukleotid auf der einen Seite der Restriktionsstelle einer Fluoreszenzfarbstoff und auf der anderen Seite einen sog. „Quencher". Erfolgt eine Restriktion, so werden Farbstoff und Quencher getrennt, so dass das Farbstoffsignal detektiert werden kann (1). Einsetzbare Farbstoffe und Quencher sind dem Fachmann bekannt.
  • Die Oligonukleotide sind bevorzugt an eine Festphase gebunden. Die Art der Festphase und der Festphasenkopplung sind Stand der Technik. So kann es sich bei den Festphasen etwa um funktionalisierte Polymere, Metalle, Glas oder Halbleiter wie Silicium handeln. Das Anbinden der O ligonukleotide kann u.a. über bifunktionale Linkermoleküle erfolgen, die an eine silanisierte Oberfläche gebunden werden oder etwa über Thioate oder Thiolmodifikationen im Oligonukleotid an Bromacetyl-derivatisierte Oberflächen oder Gold. Bevorzugt sind die Oligonukleotide unterschiedlicher Sequenz oder unterschiedlichen Methylierungsstatus räumlich soweit voneinander entfernt, dass eine getrennte Detektion möglich ist.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden die Oligonukleotide auf eine sensitive Oberfläche aufgebracht, deren physikalische oder chemische Eigenschaften sich bei einer Restriktion meßbar verändern. Zu diesen meßbaren Eigenschaften gehören etwa die Leitfähigkeit, die Eigenfrequenz oder die Oberflächenspannung. In einer besonders bevorzugten Variante besteht diese Oberfläche aus einem Piezo-Kristall. Die Anbindung von DNA an Piezo-Kristalle ist dem Fachmann bekannt (zur Übersicht: Skladal: Piezoelectric Quartz Crystal Sensors Applied for Bioanalytical Assays and Characterisation of Affinity Interactions. J. Braz. Chem. Soc., Vol.14, Nr.4, 491-502, 2003).
  • Die Hybrisierung der Oligonukleotide mit der zu untersuchenden DNA erfolgt unter Standardbedingungen.
  • Im zweiten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Hybride mit hemimethylierungssensitiven Restriktionsenzymen umgesetzt. Die Auswahl der Restriktionsenzyme erfolgt nach der Sequenzspezifität der Enyzme und nach der zu untersuchenden diagnostischen oder wissenschaftlichen Fragestellung. Bevorzugt werden dabei Enzyme einge setzt, die unmethylierte und hemimethylierte DNA bevorzugt gegenüber homomethylierter DNA schneiden. Geht man in diesem Fall von methylierten Oligonukleotiden aus, so können methylierte und unmethylierte Cytosinpositionen in der zu untersuchenden DNA unterschieden werden. Denn die methylierte DNA bildet mit den methylierten Oligonukleotiden homomethylierte Hybride, die von dem Restriktionsenzym nicht geschnitten werden. Bei unmethylierter DNA entstehen dagegen hemimethylierte Hybride, die vom dem Restriktionsenzym erkannt und umgesetzt werden. Geht man dagegen von unmethylierten Oligonukleotiden aus, so entstehen mit der methylierten DNA hemimethylierte Hybride und mit der unmethylierten DNA unmethylierte Hybride. Beide Hybride werden von dem Enzym geschnitten, so dass eine Unterscheidung zwischen methylierter und unmethylierter DNA bei Verwendung nicht-methylierter Oligos in diesem Fall nicht möglich ist. Der Einsatz der nicht-methylierten Oligonukleotide neben dem Einsatz methylierter Oligonukleotide derselben Sequenz erlaubt jedoch eine Quantifizierung des Verfahrens. Aus dem Verhältnis beider Signale läßt sich das Verhältnis zwischen Gesamt DNA und methylierter DNA berechnen. Eine solche Quantifizierung ist einfach möglich, etwa wenn methylierte und unmethylierte Oligonukleotide mit unterschiedlichen Markierungen versehen oder wenn sie räumlich getrennt an eine Festphase gebunden sind (2). Dem Fachmann ist bekannt, wie er Angaben zu Enzymen erhält, die in dieser Ausführungsform einsetzbar sind. Insbesondere bietet die REBASE-Datenbank (http://rebase.neb.com/) vielfältige Informationen zu hemimethylierungssensitiven Restriktionsenzymen. Bevorzugt ist die Verwendung der folgender Enyzme: AcsiI; Adel; AscI; HinPI; ClaI; EciI; HinP1I; Hpy99I; NruI; RsrII; SalI. Die Restriktionsstellen dieser Enzyme sind im Anhang aufgeführt. Reaktionsbedingungen der enzymatischen Umsetzung sind Stand der Technik und ergeben sich etwa aus den von den Herstellern gelieferten Protokollen.
  • In einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden Enzyme eingesetzt, die bevorzugt unmethylierte DNA gegenüber hemimethylierter und homomethylierter DNA schneiden. Erforderlich ist dann die Verwendung unmethylierter Oligonukleotide (bzw. zur Quantifizierung zusätzlich der Einsatz methylierter Oligonukleotide). Nähere Informationen zu einsetzbaren Enzymen sind über die oben genannten Quellen verfügbar.
  • Sofern entsprechende Enzyme zur Verfügung stehen, ist es prinzipiell auch denkbar, mit Enzymen zu arbeiten, die keine unmethylierte, aber hemimethylierte und homomethylierte DNA bzw. keine unmethylierte und hemimethylierte, aber homomethylierte DNA schneiden.
  • Es ist naheliegend, dass für das erfindungsgemäße Verfahren auch biologisch aktive Fragmente oder Modifikationen der Enzyme eingesetzt werden können. Mit zunehmendem Erfolg des Enzymdesigns ist auch die Verwendung speziell zum Zwecke dieser Erfindung konstruierter Enzyme denkbar.
  • Erfindungsgemäß ist es auch, mehrere unterschiedliche Restriktionsenzyme gleichzeitig oder nacheinander in Kombination mit verschiedenen Oligonukleotiden einzusetzen, um so den Methylierungszustand mehrerer unterschiedlicher Cytosinpositionen zu untersuchen.
  • Im dritten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Detektion. Dieser Schritt erfolgt je nach Versuchsansatz nach dem Stand der Technik. Werden markierte Oligonukleotide eingesetzt, so können die Markierungen entweder der ungeschnittenen Oligonukleotide oder der Restriktionsfragmente detektiert werden. Bei einer Festphasenanwendung ist es zudem möglich, die Restriktionsfragmente nachzuweisen, die sich in Lösung befinden oder die Fragmente, die an der Festphase gebunden sind (etwa bei Verwendung eines Quenchers). Bei Kopplung der Oligonukleotide an eine sensitive Oberfläche werden die sich durch die Restriktion verändernden chemischen oder physikalischen Eigenschaften gemessen.
  • Aus dem detektierten Signal wird dann im vierten Schritt auf den Methylierungsstatus der DNA geschlossen und der Anteil der methylierter DNA bestimmt.
  • Werden krankheitsspezifische Cytosinpositionen untersucht, so eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren insbesondere auch zur Diagnose von Krebserkrankungen oder anderen mit einer Veränderung des Methylierungsstatus assoziierten Krankheiten. Hierzu gehören u.a. CNS-Fehlfunktionen, Aggressionssymptome oder Verhaltensstörungen; klinische, psychologische und soziale Konsequenzen von Gehirnschädigungen; psychotische Störungen und Persönlichkeitsstörungen; Demenz und/oder assoziierte Syndrome; kardiovaskuläre Krankheit, Fehlfunktion und Schädigung; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des gastrointestinalen Traktes; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Atmungssystems; Verletzung, Entzündung, Infektion, Immunität und/oder Rekonvaleszenz; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Körpers als Abweichung im Entwicklungsprozess; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit der Haut, der Muskeln, des Bindegewebes oder der Knochen; endokrine und metabolische Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit; Kopfschmerzen oder sexuelle Fehlfunktion. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich außerdem zur Vorhersage von unerwünschten Arzneimittelwirkungen und zur Unterscheidung von Zelltypen oder Geweben oder zur Untersuchung der Zelldifferenzierung.
  • Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung hemimethylierungssensitiver Restriktionsenzyme zur Methylierungsanalyse und zum Nachweis der oben genannten, mit einer Veränderung des Methylierungsstatus assoziierten Krankheiten, insbesondere die Verwendung der Enzyme: AcsiI; Adel; AscI; HinPI; ClaI; EciI; HinP1I; Hpy99I; NruI; RsrII; SalI zu den oben genannten Zwecken.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung besteht in einen Teststreifen, auf dem Oligonukleotide mit einem unterschiedlichen Methylierungsstatus und/oder einer unterschiedlichen Sequenz immobilisiert sind. Dieser Teststreifen wird in einer temperierten Minikammer mit der zu untersuchenden DNA hybridisiert. Restriktion und Detektion erfolgen anschließend in einem Schritt, etwa in einer Küvette, in der die Absorbtionsspektren der verwendeten Farbstoffe gemessen werden (3). In einer anderen bevorzugten Ausführungsform diffundieren die Restriktionsfragmente zu einer weiteren Phase und führen dort zu nachweisbaren Folgereaktionen.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Kit, bestehend aus unterschiedlichen, immobilisierten Oligonukleotiden, mindestens einem hemimethylierungssensitiven Restriktionsenzym und den erforderlichen Restriktionspuffern.
    •
  • Anwendungsbeispiel
  • Das folgende Beispiel soll die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Charakterisierung von Tumoren veranschaulichen. Ein Tumor tritt in zwei unterschiedlichen Typen (A und B) auf, die jeweils eine unterschiedliche Behandlung erfordern. Die beiden Typen sind jedoch nicht ohne weiteres aufgrund morphologischer Merkmale zu diagnostizieren; sie unterscheiden sich aber durch ihren Methylierungsstatus: ein CpG-Basenpaar, das innerhalb der Basenfolge GCGC in der Mitte eines bekannten Sequenzkontextes liegt, ist in Tumortyp A methyliert, während es im Typ B nicht methyliert vorliegt. Zur Untersuchung wird die DNA aus dem Tumorgewebe mit einem kommerziell erhältlichen Kit extrahiert. Es erfolgt eine thermische Denaturierung der DNA und eine anschließende Hybridisierung mit einer exakten 1:1 Mischung der beiden synthetischen Oligomere C und D. Diese besitzen die gleiche Basensequenz (komplementär zu der zu untersuchenden DNA), unterscheiden sich jedoch im Methylierungsstatus. Das CpG, das dem CpG entspricht, dessen Methylierung bestimmt werden soll, ist bei C unmethyliert, bei D methyliert. C und D tragen unterschiedliche Fluoreszenz-Farbstoff-Quencher-Kombinationen, wobei sich jeweils an einem Ende des Oligonukleotids der Farbstoff und an dem anderen Ende ein Quencher befindet, der eine Detektion des Farbstoffs verhindert. Nach der Hybrisierung erfolgt eine Restriktion der gebil deten DNA-Oligonukleotid-Hybride. Dazu wird zu der DNA eine hohe Menge des hemimethylierungssensitiven Restriktionsenzyms HinPI hinzugefügt. Dieses Enzymes schneidet im Sequenzkontext GCGC hemimethylierte und unmethylierte DNA, nicht jedoch homomethylierte DNA. Mit Hilfe eines temperierten Fluoreszenzphotometers wird die Zunahme der beiden (nicht mehr durch den Quencher blockierten) Farbstoffe bei Fortschritt der Reaktion mit der Zeit gemessen. Nur die Kombination aus methylierter DNA aus dem Tumorgewebe mit methylierten Oligomeren, in diesem Falle also A und D, führt zu beidseitig methylierter DNA. Diese DNA wird von dem Restriktionsenzym nicht geschnitten, so dass kein Farbstoff freigesetzt wird. Der Anteil der methylierten DNA in der untersuchten Tumorprobe läßt sich durch das Verhältnis der freigesetzten Farbstoff der beiden Oligonukleotide D und C bestimmen. Dieser Wert erlaubt eine Aussage über den Tumortyp und somit eine optimale Behandlung.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1 zeigt eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung unter Verwendung eines Farbstoff-Quencher-Paares. Dabei ist ein methyliertes Oligonukleotid an eine Festphase gebunden. Das Oligonukleotid trägt einen Farbstoff (Fünfeck) und einen Quencher (Viereck). Die zu untersuchende DNA wird an die Oligonukleotide hybridisiert. Anschließend erfolgt der Umsatz mit einem Restriktionsenzym. Ist die zu untersuchende DNA unmethyliert, so wird das Hybrid geschnitten. Farbstoff und Quencher werden getrennt, und ein Signal kann detektiert werden.
  • 2 zeigt eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung. Dabei werden zwei unterschiedliche Typen von Oligonukleotiden verwandt. Beide Oligonukleotide haben die gleiche Basensequenz. Sie unterscheiden sich allerdings in ihrem Methylierungsstatus und tragen unterschiedliche Farbstoffe (Kreis bzw. Fünfeck). An die Oligonukleotide wird die zu untersuchende DNA hybridisiert. Anschließend erfolgt eine Restriktion. Aus dem Verhältnis der Farbstoffsignale läßt sich der Methylierungsgrad der Probe (M) bestimmen.
  • 3 zeigt schematisch eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung. Dabei wird der Methylierungsstatus ein Tumorprobe mittels eines Teststreifens untersucht. Dazu wird die aus der Probe extrahierte DNA an auf einen Teststreifen fixierte Oligonukleotide hybridisiert (Schritt 1). Anschließend erfolgt eine Restriktion mit einem hemimethylierungssensitiven Restriktionsenzym. (Schritt 2). Je nach Methylierungsstatus der zu untersuchenden DNA ergeben sich unterschiedliche Farbmuster (A, B und C, Schritt 3). Aus früheren Experimenten ist bekannt, welche Methylierungsmuster mit bestimmten Typen des Tumors assoziiert sind (4). Durch Vergleich mit diesen Daten lässt sich eine Aussage über eine erfolgversprechende Tumortherapie herleiten.
  • Anhang: Hemimethylierungssensitive Restriktionsenzyme
  • Die unten aufgeführten Enzyme zeigen eine Auswahl von möglichen, im erfindungsgemäßen Verfahren einsetzbaren Enzymen. Die Restriktionsstellen sind der REBASE-Datenbank entnommen. Die auf der linken Seite dargestellten Konformationen werden geschnitten. In der Mitte ist die Restriktion verlangsamt und auf der rechten Seite ganz blockiert.
  • Tabelle 1
    Figure 00180001
  • Figure 00190001
  • Figure 00200001
  • Figure 00210001

Claims (20)

  1. Verfahren zur Untersuchung von Cytosinmethylierungen in DNA-Sequenzen, dadurch gekennzeichnet, dass a) die zu untersuchende DNA an Oligonukleotide eines definierten Methylierungsstatus hybridisiert wird, b) die Hybride mit mindestens einem hemimethylierungssensitiven Restriktionsenzym umgesetzt werden, c) detektiert wird, ob eine Restriktion stattgefunden hat, d) auf den Methylierungszustand der untersuchten DNA geschlossen wird.
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Oligonukleotide an eine feste Phase gebunden sind.
  3. Verfahren gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Oligonukleotide mindestens eine nachweisbare Markierung tragen.
  4. Verfahren gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Oligonukleotide mit einem Farbstoff und einem Quencher markiert sind, die bei einer Restriktion getrennt werden.
  5. Verfahren gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass gleichzeitig sowohl methylierte wie auch unmethylierte Oligonukleotide derselben Sequenz verwendet werden.
  6. Verfahren gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die methy lierten und unmethylierten Oligonukleotide unterschiedliche Markierungen tragen.
  7. Verfahren gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Oligonukleotide unterschiedlicher Sequenz verwendet werden.
  8. Verfahren gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Oligonukleotide an einer sensitiven Oberfläche immobilisiert sind, deren physikalische oder chemische Eigenschaften sich bei einer Restriktion messbar verändern.
  9. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den veränderbaren Eigenschaften um Leitfähigkeit, Eigenfrequenz oder Oberflächenspannung handelt.
  10. verfahren gemäß einem der Ansprüche 8 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Oberfläche um einen Piezo-Kristall handelt.
  11. Verfahren gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein Restriktionsenzym verwandt wird, das unmethylierte und hemimethylierte DNA bevorzugt gegenüber homomethylierter DNA schneidet.
  12. Verfahren gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym folgender Gruppe entnommen ist: AcsiI; AdeI; AscI; HinPI; ClaI; EciI; HinP1I; Hpy99I; NruI; RsrII; SalI.
  13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass ein Restriktionsenzym verwandt wird, dass unmethylierte DNA bevorzugt gegenüber hemimethylierter und homomethylierter DNA schneidet.
  14. Verfahren gemäß 9 einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere unterschiedliche Restriktionsenzyme gleichzeitig oder nacheinander eingesetzt werden.
  15. Verwendung der Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 14 zur Diagnose von Krebserkrankungen oder anderen mit einer Veränderung des Cytosin-Methylierungsstatus assoziierten Krankheiten, zur Vorhersage von unerwünschten Arzneimittelwirkungen und zur Unterscheidung von Zelltypen oder Geweben oder zur Untersuchung der Zelldifferenzierung.
  16. Verwendung von hemimethylierungssensitiven Restriktionsenzymen in einem Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 14 zur Methylierungsanalyse.
  17. Verwendung von hemimethylierungssensitiven Restriktionsenzymen in einem Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 14 zur Diagnose von Krebserkrankungen oder anderen mit einer Veränderung des Cytosin-Methylierungsstatus assoziierten Krankheiten und zur Vorhersage von unerwünschten Arzneimittelwirkungen.
  18. Verwendung gemäß Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, dass eines der folgenden Restriktionsenzyme verwendet wird: AcsiI; AdeI; AscI; HinPI; ClaI; EciI; HinP1I; Hpy99I; NruI; RsrII; SalI.
  19. Ein Teststreifen zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, auf dem Oligonukleotide mit einem unterschiedlichen Methylierungsstatus und/oder einer unterschiedlichen Sequenz immobilisiert sind, und der Restriktion und Detektion in einem Schritt erlaubt.
  20. Ein Kit zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, bestehend aus immobilisierten Oligonukleotiden, mindestens einem hemimethylierungssensitiven Restriktionsenzym und den erforderlichen Restriktionspuffern.
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