JP2004208586A - Ｈｌａの検出 - Google Patents
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Abstract
【課題】簡便かつ正確な、ＨＬＡ遺伝子の検査のためのプローブおよび方法の提供。
【解決手段】本発明によれば、ＨＬＡ−Ｂ抗原、ＨＬＡ−Ｃ抗原、ＨＬＡ−ＤＲ抗原およびＨＬＡ−ＤＱ抗原の遺伝子のタイピングに用いられるプローブ、プローブセット、およびタイピング方法が提供される。これらにより、臓器移植等の現場において、より迅速かつ精度の高いＨＬＡ遺伝子の検査が可能となる。
【選択図】 なし
【解決手段】本発明によれば、ＨＬＡ−Ｂ抗原、ＨＬＡ−Ｃ抗原、ＨＬＡ−ＤＲ抗原およびＨＬＡ−ＤＱ抗原の遺伝子のタイピングに用いられるプローブ、プローブセット、およびタイピング方法が提供される。これらにより、臓器移植等の現場において、より迅速かつ精度の高いＨＬＡ遺伝子の検査が可能となる。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の背景】
発明の分野
本発明は、ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）（Ｈｕｍａｎ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ）のタイピングに用いられるプローブに関する。さらに詳しくは、本発明はＨＬＡのうちＢ抗原、Ｃ抗原、ＤＲ抗原および／またはＤＱ抗原を遺伝子型にタイピングするのに有用なプローブに関する。
【０００２】
従来技術
近時、臓器移植の分野は長足の進歩を遂げ、その成功率も徐々に上がってきている。移植の成功率は、臓器の提供者と患者の間でＨＬＡの型がどれだけ一致しているかに大きく依存する。ヒトの主要組織適合性抗原であるＨＬＡは、免疫系において自己・非自己の識別に重要な役割を果たしている分子であり、機能を持つ蛋白質の中で最も高度な多型性を示すものである。ＨＬＡ分子をコードしている遺伝子は第６番染色体上にあり、主な遺伝子座として、クラスＩ抗原であるＨＬＡ−Ａ座、ＨＬＡ−Ｂ座およびＨＬＡ−Ｃ座と、クラスＩＩ抗原であるＨＬＡ−ＤＲ座およびＨＬＡ−ＤＱ座とが存在する。それぞれの遺伝子座について数十から数百種類の対立遺伝子が報告されており、非血縁者間において各遺伝子座の対立遺伝子がすべて一致する確率は非常に低い。したがって、移植を成功させるためには、より正確かつ迅速にＨＬＡの型をタイピングできることが重要である。
【０００３】
従来、ＨＬＡのタイピングは抗体を用いて行われてきた。しかしながら、抗体はその供給源が経済的にほぼ限られている上、モノクローナル抗体を得ることが困難なこともある。このため、優れた品質の抗体を安定して十分量得ることは困難なことがある。この問題はＨＬＡの中でも特にクラスＩＩ抗原について顕著である。
【０００４】
抗体を用いる検査法に代わって、特異性の面で安定的であり、かつ、検査用の試薬の供給が制限されない、遺伝子によるタイピング法が研究され、種々の方法が提案されている。また日本骨髄バンク等のような、世界中で骨髄や腎臓を中心として臓器移植ネットワークが徐々に規模を拡大してきている。そのため、試薬による量的制限のない遺伝子タイピング法であって、大量の検体を低コストでタイピングできるものが求められている。
【０００５】
遺伝子タイピング法としては、例えば、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＯ法、ＰＣＲ−ＳＳＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法等が提案されている（例えば、今日の移植ＶＯＬ．７ ＳＵＰＰＬ １９９４（非特許文献１）参照）。また、単一クラスＩＩ ＨＬＡ遺伝子座のＤＮＡ配列に対して実質的に相補的である標識されたＤＮＡ配列を含んでなる、ＨＬＡタイプ分け用の、該遺伝子座に対して特異的なＤＮＡプローブからなる試薬が提案されている（例えば、特許第２８５９８７４号公報（特許文献１）参照）。
さらに、ＨＬＡ−ＤＰ遺伝子型を決定する方法およびプローブに関する技術（例えば、特開平６−７８８００号公報（特許文献２）参照）、および、ＨＬＡ−ＤＱＢ１タイピングを決定するためのヌクレオチドプローブに関する技術（例えば、特表２０００−５１１４３０号公報（特許文献３）参照）も報告されている。
【０００６】
上記種々の提案にもかかわらず、より簡便かつ精度の高い方法への希求が依然として存在している。骨髄バンク事業等におけるスクリーニングにおいて、不可欠な条件としては、例えば下記の事項が挙げられる：
（１）操作が簡易で、かつ大量検体処理に適していること、
（２）対象の集団に見られるほぼ全てのタイプを検出できること、
（３）分類のレベルが適当で、最終検査の実施対象を実用上支障のない程度の数に絞り込むこと、および
（４）作業量、試薬のコスト等とのバランスが取れていること。
【０００７】
本発明者らは先に、１６種類のプローブを用いたＨＬＡ−ＤＲ抗原のタイピング法を提案している（例えば、特開平８−３０８５９６号公報（特許文献４）参照）。
【０００８】
なお上記記載中で挙げられた文献を下記に列記する。
【０００９】
【非特許文献１】
今日の移植 ＶＯＬ．７ ＳＵＰＰＬ １９９４
【特許文献１】
特許第２８５９８７４号公報
【特許文献２】
特開平６−７８８００号公報
【特許文献３】
特表２０００−５１１４３０号公報
【特許文献４】
特開平８−３０８５９６号公報
【００１０】
【発明の概要】
本発明者らは、今般、先に提案したＨＬＡ−ＤＲ抗原のタイピングに有用なプローブよりも、さらに特異性が改善された２種類のプローブ、ＨＬＡ−Ｂ抗原のタイピングに有用な２種類のプローブ、ＨＬＡ−Ｃ抗原のタイピングに有用な２種類のプローブ、ＨＬＡ−ＤＱ抗原のタイピングに有用な２種類のプローブ、またはこれらの相補鎖を組み合わせて用いることにより、ＨＬＡ−Ｂ抗原、ＨＬＡ−Ｃ抗原、ＨＬＡ−ＤＲ抗原、および／またはＨＬＡ−ＤＱ抗原のより精度の高いタイピングが可能であることを見出した。本発明はかかる知見に基づくものである。
【００１１】
よって、本発明は、簡便かつ大量の検体を正確に検査することができるタイピング方法であって、ＨＬＡ−Ｂ抗原、ＨＬＡ−Ｃ抗原、ＨＬＡ−ＤＲ抗原、および／またはＨＬＡ−ＤＱ抗原のタイピングが可能なプローブの提供をその目的としている。
【００１２】
本発明によるＨＬＡ−Ｂ抗原の遺伝子のタイピングに用いられるプローブは、下記の配列Ｂ１０および／またはＢ１９で示されるオリゴヌクレオチドおよび／またはその相補鎖の一部分または全部を含んでなるものである：
配列Ｂ１０：ＡＣＡＣＡＴＡＴＣＴＧＣＡＡＧＡＣＣＣＡＧ （配列番号１）
配列Ｂ１９：ＧＣＧＧＣＣＣＧＴＧＴＧＧＣＧＧＣＣＣＡＧ （配列番号２）。
【００１３】
本発明によるＨＬＡ−Ｃ抗原の遺伝子のタイピングに用いられるプローブは、下記の配列Ｃ５および／またはＣ１０で示されるオリゴヌクレオチドおよび／またはその相補鎖の一部分または全部を含んでなるものである：
配列Ｃ５：ＡＧＴＣＣＧＡＧＡＧＡＡＧＡＧＣＣＣＣＧＧ （配列番号３）
配列Ｃ１０：ＣＴＣＣＡＧＴＧＧＡＴＧＴＴＴＧＧＡＴＧＣ （配列番号４）。
【００１４】
本発明によるＨＬＡ−ＤＲ抗原の遺伝子のタイピングに用いられるプローブは、下記の配列ＤＲ１４および／またはＤＲ２２で示されるオリゴヌクレオチドおよび／またはその相補鎖の一部分または全部を含んでなるものである：
配列ＤＲ１４：ＧＡＣＡＴＣＣＴＴＧＡＡＧＡＣＧＡＧＣＧＧ （配列番号５）
配列ＤＲ２２：ＧＧＡＣＣＴＣＣＴＴＧＡＴＧＡＣＡＧＧＣＧ （配列番号６）。
【００１５】
本発明によるＨＬＡ−ＤＱ抗原の遺伝子のタイピングに用いられるプローブは、下記の配列ＤＱ８および／またはＤＱ１７で示されるオリゴヌクレオチドおよび／またはその相補鎖の一部分または全部を含んでなるものである：
配列ＤＱ８：ＣＴＧＧＴＧＣＣＧＣＣＴＧＣＣＴＣＣＧＡＧ （配列番号７）
配列ＤＱ１７：ＣＣＧＣＴＧＴＧＧＣＣＴＣＣＴＧＡＣＧＣＣ （配列番号８）。
【００１６】
本発明の一つの態様によるプローブセットは、下記（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれか２以上のグループからそれぞれ選択されるプローブを含んでなるものである：
（ｉ）前記のＨＬＡ−Ｂ抗原の遺伝子のタイピングに用いられるプローブ、
（ｉｉ）前記のＨＬＡ−Ｃ抗原の遺伝子のタイピングに用いられるプローブ、
（ｉｉｉ）前記のＨＬＡ−ＤＲ抗原の遺伝子のタイピングに用いられるプローブ、および
（ｉｖ）前記のＨＬＡ−ＤＱ抗原の遺伝子のタイピングに用いられるプローブ。
【００１７】
本発明によるＨＬＡ−Ｂ抗原、Ｃ抗原、ＤＲ抗原およびＤＱ抗原の遺伝子タイピング用プローブを用いることによって、従来に比べてさらに迅速かつ精度の高いＨＬＡ遺伝子の検査を行うことができる。
【００１８】
【発明の具体的説明】
前記したように、本発明によるＨＬＡ−Ｂ抗原遺伝子のタイピングに用いるプローブは、
配列Ｂ１０および／またはＢ１９で示される、オリゴヌクレオチド、および／または
その相補鎖であって下記配列Ｂ１０ａおよび／またはＢ１９ａで示される、オリゴヌクレオチド
の一部または全部を含んでなる：
配列Ｂ１０ａ：ＣＴＧＧＧＴＣＴＴＧＣＡＧＡＴＡＴＧＴＧＴ （配列番号９）
配列Ｂ１９ａ：ＣＴＧＧＧＣＣＧＣＣＡＣＡＣＧＧＧＣＣＧＣ （配列番号１０）。
【００１９】
本発明によるＨＬＡ−Ｃ抗原遺伝子のタイピングに用いるプローブは、
配列Ｃ５および／またはＣ１０で示される、オリゴヌクレオチド、および／または
その相補鎖であって下記配列Ｃ５ａおよび／またはＣ１０ａで示される、オリゴヌクレオチド
の一部または全部を含んでなる：
配列Ｃ５ａ：ＣＣＧＧＧＧＣＴＣＴＴＣＴＣＴＣＧＧＡＣＴ （配列番号１１）
配列Ｃ１０ａ：ＧＣＡＴＣＣＡＡＡＣＡＴＣＣＡＣＴＧＧＡＧ （配列番号１２）。
【００２０】
本発明によるＨＬＡ−ＤＲ抗原遺伝子のタイピングに用いるプローブは、
配列ＤＲ１４および／またはＤＲ２２で示される、オリゴヌクレオチド、および／または
その相補鎖であって下記配列ＤＲ１４ａおよび／またはＤＲ２２ａで示される、オリゴヌクレオチド
の一部または全部を含んでなる：
配列ＤＲ１４ａ：ＣＣＧＣＴＣＧＴＣＴＴＣＡＡＧＧＡＴＧＴＣ （配列番号１３）
配列ＤＲ２２ａ：ＣＧＣＣＴＧＴＣＡＴＣＡＡＧＧＡＧＧＴＣＣ （配列番号１４）。
【００２１】
本発明によるＨＬＡ−ＤＱ抗原遺伝子のタイピングに用いるプローブは、
配列ＤＤＱ８および／またはＤＱ１７で示される、オリゴヌクレオチド、および／または
その相補鎖であって下記配列ＤＱ８ａおよび／またはＤＱ１７ａで示される、オリゴヌクレオチド
の一部または全部を含んでなる：
配列ＤＱ８ａ：ＣＴＣＧＧＡＧＧＣＡＧＧＣＧＧＣＡＣＣＡＧ （配列番号１５）
配列ＤＱ１７ａ：ＧＧＣＧＴＣＡＧＧＡＧＧＣＣＡＣＡＧＣＧＧ （配列番号１６）。
【００２２】
これらプローブの配列は、いずれも人工的に変異が加えられたものであり、それぞれＨＬＡ−Ｂ抗原、ＨＬＡ−Ｃ抗原、ＨＬＡ−ＤＲ抗原およびＨＬＡ−ＤＱ抗原の遺伝子にそのタイプに対応してハイブリダイズする。すなわち、被験者由来のＤＮＡ、好ましくは白血球より抽出されたＤＮＡと、上記配列のいずれがハイブリダイズするかにより、ＨＬＡ抗原のタイピングを行うことができる。
【００２３】
具体的には、例えばＨＬＡ−Ｂ抗原タイピングを行う場合には、前記した本発明によるＨＬＡ−Ｂ抗原遺伝子のタイピングに用いるプローブ以外に任意の２２プローブを用いられる。同様に、ＨＬＡ−Ｃ抗原タイピングを行う場合には、前記した本発明によるＨＬＡ−Ｃ抗原遺伝子のタイピングに用いるプローブ以外に任意の２１プローブが用いられる。ＨＬＡ−ＤＲ抗原タイピングを行う場合には、前記した本発明によるＨＬＡ−ＤＲ抗原遺伝子のタイピングに用いるプローブ以外に任意の２２プローブが用いられる。また、ＨＬＡ−ＤＱ抗原タイピングを行う場合には、前記した本発明によるＨＬＡ−ＤＱ抗原遺伝子のタイピングに用いるプローブ以外に任意の１５プローブが用いられる。
これらの任意のプローブは、いずれも公知のＨＬＡ抗原の遺伝子配列表（データーベース；ＵＲＬアドレス ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｇｔ／ｈｌａ／）から適宜選定することができる。
【００２４】
したがって、検定に使用する本発明によるプローブと同じタイプのＨＬＡ抗原遺伝子のタイピングに用いられる任意のプローブを、前記データベース等を利用して所定の数選定して入手し、これらを本発明によるプローブと併せてプローブセットとする。このプローブセットを用いて、予め既知のサンプルにより判定表を作成しておく。そしてこのプローブセットと、核酸試料とをハイブリダイズさせ、プローブセット中の各プローブと核酸試料との間におけるハイブリダイゼーションの有無を確認し、その結果を該判定表によって評価する。これより、核酸試料のＨＬＡ抗原のタイプを判定することができる。
【００２５】
このような本発明によるプローブと任意のプローブとからなるプローブセットの好ましい例、および、それに対応する判定表の例を示すと下記のとおりである。
【００２６】
具体的には、ＨＬＡ−Ｂ抗原の遺伝子のタイピングに用いられるプローブセットとしては、下記の配列Ｂ１〜Ｂ２４で示されるオリゴヌクレオチドからなるものが挙げられる：
配列Ｂ１： ＴＡＴＴＴＣＴＡＣＡＣＣＧＣＣＡＴＧＴＣＣ （配列番号１７）
配列Ｂ２： ＡＧＴＣＣＧＡＧＧＡＡＧＧＡＧＣＣＧＣＧＧ （配列番号１８）
配列Ｂ３： ＡＧＴＣＣＧＡＧＧＡＣＧＧＡＧＣＣＣＣＧＧ （配列番号１９）
配列Ｂ４： ＡＧＴＣＣＧＡＧＡＧＡＧＧＡＧＣＣＧＣＧＧ （配列番号２０）
配列Ｂ５： ＧＣＧＣＣＧＴＧＧＧＴＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧ （配列番号２１）
配列Ｂ６： ＡＣＡＣＡＧＡＴＣＴＣＣＡＡＧＡＣＣＣＡＧ （配列番号２２）
配列Ｂ７： ＧＡＣＣＧＧＡＡＣＡＣＡＣＡＧＡＴＣＴＡＣ （配列番号２３）
配列Ｂ８： ＣＡＧＡＡＧＴＡＣＡＡＧＣＧＣＣＡＧＧＣＡ （配列番号２４）
配列Ｂ９： ＣＡＧＡＴＣＴＡＣＡＡＧＧＣＣＣＡＧＧＣＡ （配列番号２５）
配列Ｂ１０： ＡＣＡＣＡＴＡＴＣＴＧＣＡＡＧＡＣＣＣＡＧ （配列番号１）
配列Ｂ１１： ＡＣＡＣＡＧＡＴＣＴＴＣＡＡＧＡＣＣＣＡＧ （配列番号２６）
配列Ｂ１２： ＧＣＡＣＡＧＡＣＴＴＡＣＣＧＡＧＡＧＡＧＣ （配列番号２７）
配列Ｂ１３： ＣＧＧＡＡＣＣＴＧＣＧＣＧＧＣＴＡＣＴＡＣ （配列番号２８）
配列Ｂ１４： ＣＴＧＣＴＣＣＧＣＴＡＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧ （配列番号２９）
配列Ｂ１５： ＣＡＣＡＣＴＴＧＧＣＡＧＡＣＧＡＴＧＴＡＣ （配列番号３０）
配列Ｂ１６： ＣＴＣＣＡＧＡＧＧＡＴＧＴＡＣＧＧＣＴＧＣ （配列番号３１）
配列Ｂ１７： ＣＡＴＡＡＣＣＡＧＴＡＣＧＣＣＴＡＣＧＡＣ （配列番号３２）
配列Ｂ１８： ＣＡＴＧＡＣＣＡＧＴＴＣＧＣＣＴＡＣＧＡＣ （配列番号３３）
配列Ｂ１９： ＧＣＧＧＣＣＣＧＴＧＴＧＧＣＧＧＣＣＣＡＧ （配列番号２）
配列Ｂ２０： ＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＧＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧ （配列番号３４）
配列Ｂ２１： ＣＴＧＧＡＧＧＧＣＣＴＧＴＧＣＧＴＧＧＡＧ （配列番号３５）
配列Ｂ２２： ＣＴＧＧＡＧＧＧＣＧＡＧＴＧＣＧＴＧＧＡＧ （配列番号３６）
配列Ｂ２３： ＴＧＧＣＴＣＣＧＣＡＧＡＣＡＣＣＴＧＧＡＧ （配列番号３７）
配列Ｂ２４： ＣＴＣＣＡＧＧＴＧＡＴＧＴＡＴＧＧＣＴＧＣ （配列番号３８）
【００２７】
このプローブセットに対応する判定表（ＨＬＡ−Ｂ抗原の判定表）は、下記表の通りである。なおここでは、日本人で報告されたアリルのみ記載されている。
【００２８】
【表１】
【００２９】
よって、本発明の一つの好ましい態様によれば、配列Ｂ１〜Ｂ２４で示されるオリゴヌクレオチドおよび／またはその相補鎖の一部分または全部からなる、ＨＬＡ−Ｂ抗原の遺伝子のタイピングに用いられるプローブセットが提供される。
【００３０】
ＨＬＡ−Ｃ抗原の遺伝子のタイピングに用いられるプローブセットとしては、下記の配列Ｃ１〜Ｃ２３で示されるオリゴヌクレオチドからなるものが挙げられる：
配列Ｃ１： ＡＡＧＴＡＴＴＴＣＴＴＣＡＣＡＴＣＣＧＴＧ （配列番号３９）
配列Ｃ２： ＡＧＡＧＣＧＡＧＧＣＣＡＧＴＴＡＧＴＧＡＣ （配列番号４０）
配列Ｃ３： ＴＣＣＡＣＡＴＣＣＧＴＧＴＣＣＴＧＧＣＣＣ （配列番号４１）
配列Ｃ４： ＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧＡＡＡＣＴＧＣＧＣ （配列番号４２）
配列Ｃ５： ＡＧＴＣＣＧＡＧＡＧＡＡＧＡＧＣＣＣＣＧＧ （配列番号３）
配列Ｃ６： ＴＧＣＡＧＣＧＣＧＣＡＧＧＴＡＣＣＡＧＧＧ （配列番号４３）
配列Ｃ７： ＧＣＧＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＡＧＣＣＴＡＣ （配列番号４４）
配列Ｃ８： ＧＣＧＧＡＧＣＡＧＣＴＧＡＧＡＧＣＣＴＡＣ （配列番号４５）
配列Ｃ９： ＡＣＣＧＣＴＧＣＧＧＡＣＡＣＧＧＣＧＧＣＴ （配列番号４６）
配列Ｃ１０： ＣＴＣＣＡＧＴＧＧＡＴＧＴＴＴＧＧＡＴＧＣ （配列番号４）
配列Ｃ１１： ＣＡＴＧＡＣＣＡＧＴＴＡＧＣＣＴＡＣＧＡＣ （配列番号４７）
配列Ｃ１２： ＧＧＧＴＡＴＧＡＣＣＡＧＴＡＣＧＣＣＴＡＣ （配列番号４８）
配列Ｃ１３： ＧＧＧＴＡＴＡＡＣＣＡＧＴＴＣＧＣＣＴＡＣ （配列番号４９）
配列Ｃ１４： ＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＣＣＧＧＴＧＡＧＴＧＡ （配列番号５０）
配列Ｃ１５： ＡＧＧＴＣＴＣＡＣＡＴＣＣＴＣＣＡＧＡＧＧ （配列番号５１）
配列Ｃ１６： ＡＡＣＧＧＧＡＡＧＡＡＧＡＣＧＣＴＧＣＡＧ （配列番号５２）
配列Ｃ１７： ＣＴＧＧＡＧＡＡＣＡＧＧＡＡＧＡＡＧＡＣＧ （配列番号５３）
配列Ｃ１８： ＧＣＧＧＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＡＧＣＣＴＡＣ （配列番号５４）
配列Ｃ１９： ＣＧＣＴＴＣＡＴＣＴＣＡＧＴＧＧＧＣＴＡＣ （配列番号５５）
配列Ｃ２０： ＧＣＣＧＣＧＡＧＴＣＣＧＡＧＡＧＧＧＧＡＧ （配列番号５６）
配列Ｃ２１： ＧＣＣＧＣＧＡＧＴＣＣＡＡＧＡＧＧＧＧＡＧ （配列番号５７）
配列Ｃ２２： ＣＴＧＧＡＧＧＧＣＧＡＧＴＧＣＧＴＧＧＡＧ （配列番号５８）
配列Ｃ２３： ＴＴＣＴＡＣＡＣＣＧＣＴＧＴＧＴＣＣＣＧＧ （配列番号５９）
【００３１】
このプローブセットに対応する判定表（ＨＬＡ−Ｃ抗原の判定表）は、下記表の通りである。なおここでは、日本人で報告されたアリルのみ記載されている。
【００３２】
【表２】
【００３３】
よって、本発明の一つの好ましい態様によれば、配列Ｃ１〜Ｃ２３で示されるオリゴヌクレオチドおよび／またはその相補鎖の一部分または全部からなる、ＨＬＡ−Ｃ抗原の遺伝子のタイピングに用いられるプローブセットが提供される。
【００３４】
ＨＬＡ−ＤＲ抗原の遺伝子のタイピングに用いられるプローブセットとしては、下記の配列ＤＲ１〜ＤＲ２４で示されるオリゴヌクレオチドからなるものが挙げられる：
配列ＤＲ１： ＴＴＧＣＴＧＧＡＡＡＧＡＴＧＣＡＴＣＴＡＴ （配列番号６０）
配列ＤＲ２： ＴＧＧＣＡＧＣＣＴＡＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＴ （配列番号６１）
配列ＤＲ３： ＧＡＧＴＡＣＴＣＴＡＣＧＴＣＴＧＡＧＴＧＴ （配列番号６２）
配列ＤＲ４： ＴＴＧＧＡＧＣＡＧＧＴＴＡＡＡＣＡＴＧＡＧ （配列番号６３）
配列ＤＲ５： ＴＣＴＡＣＧＧＧＴＧＡＧＴＧＴＴＡＴＴＴＣ （配列番号６４）
配列ＤＲ６： ＴＧＧＣＡＧＧＧＴＡＡＧＴＡＴＡＡＧＴＧＴ （配列番号６５）
配列ＤＲ７： ＴＴＧＡＡＧＣＡＧＧＡＴＡＡＧＴＴＴＧＡＡ （配列番号６６）
配列ＤＲ８： ＴＴＧＧＡＧＧＡＧＧＴＴＡＡＧＴＴＴＧＡＧ （配列番号６７）
配列ＤＲ９： ＣＧＧＴＴＡＣＴＧＧＡＧＡＧＡＣＡＣＡＴＣ （配列番号６８）
配列ＤＲ１０： ＣＡＧＡＧＡＧＴＧＴＣＴＴＴＧＧＧＧＣＴＣ （配列番号６９）
配列ＤＲ１１： ＣＧＧＣＣＴＧＡＴＧＡＧＧＡＧＴＡＣＴＧＧ （配列番号７０）
配列ＤＲ１２： ＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＣＧＧＡＧＣＡＣＴＧＧ （配列番号７１）
配列ＤＲ１３： ＣＧＧＧＧＣＣＧＧＧＴＧＧＡＣＡＡＣＴＡＣ （配列番号７２）
配列ＤＲ１４： ＧＡＣＡＴＣＣＴＴＧＡＡＧＡＣＧＡＧＣＧＧ （配列番号５）
配列ＤＲ１５： ＣＧＧＣＧＧＧＣＣＣＴＧＧＴＧＧＡＣＡＣＣ （配列番号７３）
配列ＤＲ１６： ＡＣＧＴＣＴＧＡＧＴＧＴＣＡＡＴＴＣＴＴＣ （配列番号７４）
配列ＤＲ１７： ＧＡＧＣＡＧＡＧＧＣＧＧＧＣＣＧＣＣＧＧＴ （配列番号７５）
配列ＤＲ１８： ＣＧＧＴＴＧＣＴＧＧＡＡＡＧＡＴＧＣＡＴＣ （配列番号７６）
配列ＤＲ１９： ＴＡＴＣＡＣＣＡＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＴＧ （配列番号７７）
配列ＤＲ２０： ＡＣＣＡＡＧＡＧＧＡＧＴＣＣＧＴＧＣＧＣＴ （配列番号７８）
配列ＤＲ２１： ＣＧＴＴＴＣＴＴＧＧＡＧＴＡＣＴＣＴＡＣＧ （配列番号７９）
配列ＤＲ２２： ＧＧＡＣＣＴＣＣＴＴＧＡＴＧＡＣＡＧＧＣＧ （配列番号６）
配列ＤＲ２３： ＧＴＧＣＧＧＴＡＴＣＴＧＣＡＣＡＧＡＧＧＣ （配列番号８０）
配列ＤＲ２４： ＣＡＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＴＧＣＧＣＴＴＣ （配列番号８１）
【００３５】
このプローブセットに対応する判定表（ＨＬＡ−ＤＲ抗原の判定表）は、下記表の通りである。なおここでは、日本人で報告されたアリルのみ記載されている。
【００３６】
【表３】
【００３７】
よって、本発明の一つの好ましい態様によれば、配列ＤＲ１〜ＤＲ２４で示されるオリゴヌクレオチドおよび／またはその相補鎖の一部分または全部からなる、ＨＬＡ−ＤＲ抗原の遺伝子のタイピングに用いられるプローブセットが提供される。
【００３８】
ＨＬＡ−ＤＱ抗原の遺伝子のタイピングに用いられるプローブセットとしては、下記の配列ＤＱ１〜ＤＱ１７で示されるオリゴヌクレオチドからなるものが挙げられる：
配列ＤＱ１： ＧＡＧＧＧＧＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＴＧ （配列番号８２）
配列ＤＱ２： ＣＧＴＴＡＴＧＴＧＡＣＣＡＧＡＴＡＣＡＴＣ （配列番号８３）
配列ＤＱ３： ＣＧＴＣＴＴＧＴＡＡＣＣＡＧＡＣＡＣＡＴＣ （配列番号８４）
配列ＤＱ４： ＣＧＴＣＴＴＧＴＧＡＣＣＡＧＡＴＡＣＡＴＣ （配列番号８５）
配列ＤＱ５： ＧＧＧＣＧＧＣＣＴＧＴＴＧＣＣＧＡＧＴＡＣ （配列番号８６）
配列ＤＱ６： ＣＣＧＣＴＧＧＧＧＣＧＧＣＴＴＧＡＣＧＣＣ （配列番号８７）
配列ＤＱ７： ＡＧＣＣＡＧＡＡＧＧＡＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧ （配列番号８８）
配列ＤＱ８： ＣＴＧＧＴＧＣＣＧＣＣＴＧＣＣＴＣＣＧＡＧ （配列番号７）
配列ＤＱ９： ＣＴＴＧＴＧＡＧＣＡＧＡＡＧＣＡＴＣＴＡＴ （配列番号８９）
配列ＤＱ１０： ＧＧＧＣＧＧＣＣＴＧＡＴＧＣＣＧＡＧＴＡＣ （配列番号９０）
配列ＤＱ１１： ＧＧＧＡＣＣＧＡＧＣＴＣＧＴＧＣＧＧＧＧＴ （配列番号９１）
配列ＤＱ１２： ＣＴＴＧＴＡＡＣＣＡＧＡＴＡＣＡＴＣＴＡＴ （配列番号９２）
配列ＤＱ１３： ＧＧＧＧＴＧＴＡＴＣＧＧＧＣＧＧＴＧＡＣＧ （配列番号９３）
配列ＤＱ１４： ＧＧＧＡＣＣＧＡＧＣＧＣＧＴＧＣＧＧＧＧＴ （配列番号９４）
配列ＤＱ１５： ＧＧＧＧＴＧＴＡＣＣＧＧＧＣＧＧＴＧＡＣＧ （配列番号９５）
配列ＤＱ１６： ＧＧＧＣＧＧＣＣＴＡＧＣＧＣＣＧＡＧＴＡＣ （配列番号９６）
配列ＤＱ１７： ＣＣＧＣＴＧＴＧＧＣＣＴＣＣＴＧＡＣＧＣＣ （配列番号８）
【００３９】
このプローブセットに対応する判定表（ＨＬＡ−ＤＱ抗原の判定表）は、下記表の通りである。なおここでは、日本人で報告されたアリルのみ記載されている。
【００４０】
【表４】
【００４１】
よって、本発明の一つの好ましい態様によれば、配列ＤＱ１〜ＤＱ１７で示されるオリゴヌクレオチドおよび／またはその相補鎖の一部分または全部からなる、ＨＬＡ−ＤＱ抗原の遺伝子のタイピングに用いられるプローブセットが提供される。
【００４２】
したがって、これらプローブセットとそれに対応する判定表とを用いることによって、核酸試料のＨＬＡ抗原のタイプを判定することができる。
なお、本発明によるプローブまたはプローブセットのプローブと、核酸試料とのハイブリダイゼーションの有無は、通常用いられる条件下において確認することができる。
【００４３】
よって、本発明によるＨＬＡ−Ｂ抗原の遺伝子のタイピング法は、核酸試料と、本発明によるＨＬＡ−Ｂ抗原遺伝子のタイピングに用いるプローブまたはプローブセットにおけるプローブとの相補性の有無を検出することを含んでなる。
【００４４】
同様に、本発明によるＨＬＡ−Ｃ抗原の遺伝子のタイピング法は、核酸試料と、本発明によるＨＬＡ−Ｃ抗原遺伝子のタイピングに用いるプローブまたはプローブセットにおけるプローブとの相補性の有無を検出することを含んでなる。
本発明によるＨＬＡ−ＤＲ抗原の遺伝子のタイピング法は、核酸試料と、本発明によるＨＬＡ−ＤＲ抗原遺伝子のタイピングに用いるプローブまたはプローブセットにおけるプローブとの相補性の有無を検出することを含んでなる。
また、本発明によるＨＬＡ−ＤＱ抗原の遺伝子のタイピング法は、核酸試料と、本発明によるＨＬＡ−ＤＱ抗原遺伝子のタイピングに用いるプローブまたはプローブセットにおけるプローブとの相補性の有無を検出することを含んでなる。
【００４５】
本発明の好ましい態様によれば、前記プローブは、特開平５−１９２１９８号公報に記載の方法によって、固相、好ましくはマイクロタイタープレートに一本鎖核酸として固定化してタイピングに利用することが好ましい。このとき固定化される核酸は前記プローブ配列以外の任意の配列をさらに含んでいてもよい。
【００４６】
固相に固定化する一本鎖核酸を用意する方法の具体例に示せば下記の通りである。
前記したプローブの配列を１またはそれ以上繰り返し（好ましくはタンデムに）含む配列を得て、それを例えばＭ１３ファージ、ファージとプラスミドの複合ベクター（例えばｐＵＣ１１８、ｐＢＳＭ１３＋、ＰＵＣｆ１等）に組み込み、一本鎖核酸を得る。上記配列を５〜２００コピー導入したベクターから得られる一本鎖核酸を用いるのが好ましい。
【００４７】
これらの一本鎖核酸を固定化する担体としては、核酸が非特異的に吸着しうるもの、または、官能基が導入できその官能基と核酸との間で共有結合できるものであれば、いずれの材質またはいずれの形状のものであっても利用可能である。具体例としては、いわゆるポリマー製のマイクロプレート、チューブ、ビーズ形状のものが挙げられる。マイクロプレートを用いるのが、その機械化の容易性から好ましい。
【００４８】
前記した一本鎖核酸をこれらの担体に固定化する方法としては、まず化学結合法が挙げられる〔Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １５， ５３７３−５３９０ （１９８７）〕。化学結合によって核酸を固定化する方法の具体例としては、アミノ基を導入した担体と核酸をグルタルアルデヒドのような架橋剤を用いて両者を結合させる方法が挙げられる。また、核酸に官能基（例えばトランスアミネーション反応により１級のアミノ基）を導入し、適当な架橋剤を用いて担体上に導入された官能基と結合させることも有効である。
【００４９】
また、吸着などの非特異的結合によって核酸を直接担体に固定することもできる。担体がマイクロプレートである場合は、紫外線照射または塩化マグネシウムの添加により吸着効率をあげることが可能である（特開昭６１−２１９４００号公報）。さらに、核酸とタンパク質を適当な方法によって化学結合または非特異的に吸着させ、そのタンパク質と担体との非特異的吸着を利用して固定化する方法なども有効である。
【００５０】
本発明において、前記固相に固定化された配列と核酸試料とのハイブリダイゼーション反応の条件は適宜選択することができる。例えば、本工程におけるハイブリダイゼーション反応は、基本的に、従来の膜を用いるハイブリダイゼーションと同様に行なうことができる〔Ｂ． Ｄ． Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｓ． Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ （１９８５） 〕。
【００５１】
核酸試料としては、ヒト白血球由来のＤＮＡが好ましい。この試料の検出される目的配列は、前記配列とのハイブリダイズを検出可能なように標識されていることが好ましい。
標識化の方法としては、例えば、
（Ａ）目的核酸に標識物を直接導入する方法、
（Ｂ）標識化されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用して目的核酸に相当する核酸あるいは目的核酸と相補的な核酸を合成する方法、および
（Ｃ）標識化された単位核酸の存在下、オリゴヌクレオチドプライマーを使用して目的核酸に相当する核酸あるいは目的核酸と相補的な核酸を合成する方法
などが挙げられる。
【００５２】
前記（Ａ）の目的核酸に標識物を直接導入する方法としては、目的核酸に光反応でビオチン誘導体を導入し酵素を結合したストレプトアビジンで検出する方法〔Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １３， ７４５ （１９８５）〕、目的核酸をスルホン化し酵素標識抗スルホン化抗体を用いて検出する方法〔Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８１， ３４６６−３４７０ （１９８４）〕などが、操作の簡便性、迅速性の点から好ましい。
【００５３】
一方、前記（Ｂ）および（Ｃ）の方法としては、特定の核酸配列を増幅する方法〔ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ， ８， ２９１ （１９９０） 〕を利用することができる。これらの方法は目的核酸を増幅するという点で特に注目されているが、それのみならず、比較的簡単に目的核酸に相当する合成核酸または目的核酸と相補的な合成核酸を標識化できる点でも利用価値が高い。例えば、ＰＣＲ法〔Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３０， １３５０−１３５４ （１９８５）〕にあっては、標識したプライマーを利用するか、あるいは、標識したモノヌクレオチドトリリン酸を利用することにより、標識された伸長生成物または増幅生成物を得ることができる。また、Ｑβレプリカーゼを利用する増幅法〔ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ， ６， １１９７ （１９８８）〕にあっては、同様に標識したモノヌクレオチドトリリン酸を利用することによって標識された伸長生成物または増幅生成物を得ることができる。また、前述した以外の核酸増幅法においても、伸長反応または増幅反応によって取り込まれるモノヌクレオチドトリリン酸やオリゴヌクレオチドを標識しておくことによって伸長生成物または増幅生成物を標識することができる。本発明にあっては、前記（Ｂ）の方法が特に好ましい。
【００５４】
ここで使用する標識物質とは、ハイブリダイゼーション操作後にこの物質を検出し得るものであるならば、放射性、非放射性を問わない。取扱いの容易性、保存性、廃棄処理等から、また本発明の効果を最もよく享有するものとして、非放射性の標識物質が好ましい。
【００５５】
非放射性の標識物質としては、例えば、ビオチン、２，４‐ジニトロフェニル基、ジゴキシゲニン等のハプテン、フルオレセインおよびその誘導体〔例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）等〕、ローダミンおよびその誘導体〔例えば、テトラメチルローダミンイソチオシネート（ＴＲＩＴＣ）、テキサスレッド等〕、４‐フルオロ‐７‐ニトロベンゾフラン（ＮＢＤＦ）およびダンシルなどの蛍光物質あるいはアクリジン等の化学発光物質が挙げられる。これらによりオリゴヌクレオチドを標識する場合は、いずれも公知手段（特開昭５９−９３０９８号、特開昭５９−９３０９９号各公報参照）により、標識化を行うことができる。また、ヌクレオチド三リン酸を標識する場合は公知手段〔Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８０， ４０４５ （１９８３） 、特開昭６３−１５２３６４公報〕に準じて行うか、市販品を利用することができる。
【００５６】
本発明の好ましい態様によれば、この核酸試料の標識は標識化されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用し、ＰＣＲ法によって増幅と同時に行われるのが好ましい。
本発明のさらに好ましい態様によれば、標識されたプライマーとして下記配列を用いるのが好ましい：
配列ＰＢ−ａ：ＡＧＣＧＡＧＧＧＧＡＣＣＧＣＡＧＧＣＧＧＧ （配列番号９７）
配列ＰＢ−ｂ：ＣＧＴＡＣＧＴＧＧＧＧＧＡＴＧＧＧＧＡＧＴ （配列番号９８）
配列ＰＢ−ｃ：ＣＣＧＧＣＧＡＧＡＧＣＣＣＣＡＧＧＣＧＣＧ （配列番号９９）
配列ＰＢ−ｄ：ＡＧＧＣＣＡＴＣＣＣＣＧＧＣＧＡＣＣＴＡＴ （配列番号１００）
配列ＰＣ−ａ：ＣＧＡＧＧＧＧＣＣＣＧＣＣＣＧＧＣＧＡＧＧ （配列番号１０１）
配列ＰＣ−ｂ：ＣＧＴＣＣＧＴＧＧＧＧＧＡＴＧＧＧＧＡＧＧ （配列番号１０２）
配列ＰＣ−ｃ：ＧＡＧＴＣＴＣＣＣＧＧＴＣＴＧＡＧＡＴＣＣ （配列番号１０３）
配列ＰＣ−ｄ：ＡＧＡＴＧＧＧＧＡＡＧＧＣＴＣＣＣＣＡＣＴ （配列番号１０４）
配列ＰＤＲ−ａ：ＴＣＧＴＧＴＣＣＣＣＡＣＡＧＣＡＣＧＴ （配列番号１０５）
配列ＰＤＲ−ｂ：ＣＣＧＣＴＧＣＡＣＴＧＴＧＡＡＧＣＴＣＴ （配列番号１０６）
配列ＰＤＲ−ｃ：ＧＧＴＧＧＧＴＧＣＴＧＴＴＧＡＡＧＧＴＡ （配列番号１０７）
配列ＰＤＲ−ｄ：ＴＧＣＧＧＧＡＡＡＡＣＣＣＣＴＴＣＴＣＡ （配列番号１０８）
配列ＰＤＱ−ａ：ＧＴＧＣＴＡＣＴＴＣＡＣＣＡＡＣＧＧＧＡＣ （配列番号１０９）
配列ＰＤＱ−ｂ：ＧＡＧＧＡＴＣＣＣＧＣＧＧＴＡＣＧＣＣＡＣ （配列番号１１０）
配列ＰＤＱ−ｃ：ＡＡＧＧＴＣＧＴＧＣＧＧＡＧＣＴＣＣＡＡＣ （配列番号１１１）。
【００５７】
前記配列の内、配列ＰＢ−ａ、ＰＢ−ｂ、ＰＢ−ｃ、およびＰＢ−ｄからなるプライマーの使用によりＨＬＡ−Ｂ抗原をコードする遺伝子のみを増幅することができる。したがって、本発明の好ましい態様によれば、ＨＬＡ−Ｂ抗原の遺伝子のタイピング法において、核酸試料は、配列ＰＢ−ａ、ＰＢ−ｂ、ＰＢ−ｃおよびＰＢ−ｄで表されるオリゴヌクレオチドをプライマーとして増幅されたものである。
【００５８】
配列ＰＣ−ａ、ＰＣ−ｂ、ＰＣ−ｃ、およびＰＣ−ｄからなるプライマーの使用によりＨＬＡ−Ｃ抗原をコードする遺伝子のみを増幅することができる。したがって、本発明の好ましい態様によれば、ＨＬＡ−Ｃ抗原の遺伝子のタイピング法において、核酸試料は、配列ＰＣ−ａ、ＰＣ−ｂ、ＰＣ−ｃ、およびＰＣ−ｄで表されるオリゴヌクレオチドをプライマーとして増幅されたものである。
【００５９】
配列ＰＤＲ−ａ、ＰＤＲ−ｂ、ＰＤＲ−ｃ、およびＰＤＲ−ｄからなるプライマーの使用によりＨＬＡ−ＤＲ抗原をコードする遺伝子のみを増幅することができる。したがって、本発明の好ましい態様によれば、ＨＬＡ−ＤＲ抗原の遺伝子のタイピング法において、核酸試料は、配列ＰＤＲ−ａ、ＰＤＲ−ｂ、ＰＤＲ−ｃ、およびＰＤＲ−ｄで表されるオリゴヌクレオチドをプライマーとして増幅されたものである。
【００６０】
配列ＰＤＱ−ａ、ＰＤＱ−ｂ、およびＰＤＱ−ｃからなるプライマーの使用によりＨＬＡ−ＤＱ抗原をコードする遺伝子のみを増幅することができる。したがって、本発明の好ましい態様によれば、ＨＬＡ−ＤＱ抗原の遺伝子のタイピング法において、核酸試料は、配列ＰＤＱ−ａ、ＰＤＱ−ｂ、およびＰＤＱ−ｃで表されるオリゴヌクレオチドをプライマーとして増幅されたものである。
【００６１】
本発明において、前記配列と核酸試料とのハイブリダイズの有無を検出する操作は、存在する標識の種類に応じて適宜選択され、決定されてよい。
【００６２】
ここで、目的核酸に存在する標識が直接検出可能なものである場合、すなわち標識が例えばラジオアイソトープ、蛍光物質、色素などである場合には、標識核酸が固相に結合した状態で検出操作を行うかまたは標識物を核酸と結合したまま、あるいは標識物を核酸から切り放した状態で溶液中に遊離させた後、その標識に応じた方法によって検出操作を行なう。また、標識が間接的に検出可能なものである場合、すなわち標識が例えばビオチン，ハプテンなどの特異的結合反応のリガンドである場合、一般的にそれらの検出に用いられているように、直接信号を発生する標識あるいは信号を発生する反応を触媒する酵素を結合した受容体（たとえばアビジンまたは抗体）を使用して検出操作を行う。
【００６３】
本発明の別の態様によれば、下記（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される少なくとも２種以上のタイピング方法を実施することを含んでなる、ＨＬＡの検出方法が提供される：
（ａ）前記したＨＬＡ−Ｂ抗原の遺伝子のタイピング法、
（ｂ）前記したＨＬＡ−Ｃ抗原の遺伝子のタイピング法、
（ｃ）前記したＨＬＡ−ＤＲ抗原の遺伝子のタイピング法、および
（ｄ）前記したＨＬＡ−ＤＱ抗原の遺伝子のタイピング法。
【００６４】
本発明の別の態様によれば、
ＨＬＡ−Ｂ抗原の遺伝子タイピング用キットであって、
固相担体と、標識プライマーとを含んでなり、前記固相担体には、本発明によるＨＬＡ−Ｂ抗原遺伝子のタイピングに用いるプローブまたはプローブセットにおけるプローブを含む一本鎖核酸が固定されてなり、該プローブのオリゴヌクレオチドおよびその相補鎖のそれぞれは１またはそれ以上繰り返していてもよく、前記標識プライマーが前記配列ＰＢ−ａ、ＰＢ−ｂ、ＰＢ−ｃおよびＰＢ−ｄで表される配列を含んでなるプライマーであることを特徴とするキットが提供される。
【００６５】
同様に本発明の別の態様によれば、
ＨＬＡ−Ｃ抗原の遺伝子タイピング用キットであって、
固相担体と、標識プライマーとを含んでなり、前記固相担体には本発明によるＨＬＡ−Ｃ抗原遺伝子のタイピングに用いるプローブまたはプローブセットにおけるプローブを含む一本鎖核酸が固定されてなり、該プローブのオリゴヌクレオチドおよびその相補鎖のそれぞれは１またはそれ以上繰り返していてもよく、
前記標識プライマーが前記配列ＰＣ−ａ、ＰＣ−ｂ、ＰＣ−ｃおよびＰＣ−ｄで表される配列を含んでなるプライマーであることを特徴とするキットが提供される。
【００６６】
また本発明の別の態様によれば、
ＨＬＡ−ＤＲ抗原の遺伝子タイピング用キットであって、
固相担体と、標識プライマーとを含んでなり、前記固相担体には本発明によるＨＬＡ−ＤＲ抗原遺伝子のタイピングに用いるプローブまたはプローブセットにおけるプローブを含む一本鎖核酸が固定されてなり、該プローブのオリゴヌクレオチドおよびその相補鎖のそれぞれは１またはそれ以上繰り返していてもよく、前記標識プライマーが前記配列ＰＤＲ−ａ、ＰＤＲ−ｂ、ＰＤＲ−ｃおよびＰＤＲ−ｄで表される配列を含んでなるプライマーであることを特徴とするキットが提供される。
【００６７】
本発明の別の態様によれば、
ＨＬＡ−ＤＱ抗原の遺伝子タイピング用キットであって、
固相担体と、標識プライマーとを含んでなり、前記固相担体には本発明によるＨＬＡ−ＤＱ抗原遺伝子のタイピングに用いるプローブまたはプローブセットにおけるプローブを含む一本鎖核酸が固定されてなり、該プローブのオリゴヌクレオチドおよびその相補鎖のそれぞれは１またはそれ以上繰り返していてもよく、前記標識プライマーが前記配列ＰＤＱ−ａ、ＰＤＱ−ｂ、およびＰＤＱ−ｃで表される配列を含んでなるプライマーであることを特徴とするキットが提供される。
【００６８】
本発明のさらに別の態様によれば、本発明によるプローブまたは本発明によるプローブセットを含んでなる、ＨＬＡ抗原の遺伝子タイピング用キットが提供される。
【００６９】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
【００７０】
例１： ＨＬＡ−Ｂ抗原遺伝子の検出
前記配列Ｂ１〜Ｂ２４で示されるオリゴヌクレオチドプローブを、マイクロタイタープレートに次のようにして固定した。
まず、０．７５Ｍ塩化ナトリウム、０．１５Ｍトリス−塩酸、および０．１５Ｍ塩化マグネシウムからなる溶液（ｐＨ８．０）に前記オリゴヌクレオチドプローブをそれぞれ溶解させ、３００μＭ溶液を調製した。このオリゴヌクレオチド溶液をマイクロタイタープレートに、１ウェルあたり５０μｌずつ加えた。プレートに蓋をして３７℃で１６時間放置した後、洗浄緩衝液（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム、および０．０５％ツイーン２０）を用いて３回洗浄した。
【００７１】
所定のヒト検体由来のヒト白血球より抽出したＤＮＡをサンプル（ＷＡＫ１、ＷＡＫ１８およびＷＡＫ１６０）とし、５’側にビオチン標識した配列ＰＢ−ａ、ＰＢ−ｂ、ＰＢ−ｃおよびＰＢ−ｄをプライマーとして用いて、ＨＬＡ−Ｂ遺伝子のエクソン２およびエクソン３を含む領域をＰＣＲ法によって４０サイクルの増幅を実施した。得られた増幅物９０μｌを０．２％水酸化ナトリウム３００μｌと混和させ、室温下で５分間放置して変性させた。変性後、それに９００μｌのハイブリダイゼーション溶液（０．２％塩酸、１００ｍＭ塩化ナトリウム、および１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を加えて混和させ、これを前記したオリゴヌクレオチドを固定化したウェルに５０μｌずつ加えた。プレートに蓋をして３７℃で１時間放置した。ウェル内の液を棄てた後、各ウェルを酵素希釈液（０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．１Ｍトリス−塩酸、２ｍＭ塩化マグネシウム、および０．０５％ツイーン２０）（ｐＨ７．５）３００μｌを用いて３回洗浄した。液を除去した後、酵素希釈液で１０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識アビジン（ベクター社製）を５０μｌ加え、３７℃で１５分間放置した。この液を除去した後、酵素希釈液３００μｌを用いて３回洗浄した。そこに、発色基質液（１．５ｍＭ ２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホニックアシッド）ジアンモニウム、および０．０１％過酸化水素を含有する０．２Ｍ酒石酸緩衝液（ｐＨ４．４））を加えて、１５分間３７℃で反応させた後、４１５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００７２】
各配列に対応する吸光度は下記の表に示される通りであった。得られた値から、各サンプルのＨＬＡ−Ｂ遺伝子のタイプを判定した。
結果は下記の表５に示される通りであった。
【００７３】
【表５】
【００７４】
例２： ＨＬＡ−Ｃ抗原遺伝子の検出
前記配列Ｃ１〜Ｃ２３で示されるオリゴヌクレオチドプローブを、マイクロタイタープレートに次のようにして固定した。
まず、０．７５Ｍ塩化ナトリウム、０．１５Ｍトリスー塩酸、および０．１５Ｍ塩化マグネシウムからなる溶液（ｐＨ８．０）に前記オリゴヌクレオチドプローブをそれぞれ溶解させ、３００μＭ溶液を調製した。このオリゴヌクレオチド溶液をマイクロタイタープレートに、１ウェルあたり５０μｌずつ加えた。プレートに蓋をして３７℃で１６時間放置した後、洗浄緩衝液（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム、および０．０５％ツイーン２０）を用いて３回洗浄した。
【００７５】
所定のヒト検体由来のヒト白血球より抽出したＤＮＡをサンプル（ＷＡＫ１、ＷＡＫ１８およびＷＡＫ１６０）とし、５’側にビオチン標識した配列ＰＣ−ａ、ＰＣ−ｂ、ＰＣ−ｃおよびＰＣ−ｄをプライマーとして、ＨＬＡ−Ｃ遺伝子のエクソン２およびエクソン３を含む領域をＰＣＲ法によって４０サイクルの増幅を実施した。得られた増幅物９０μｌを０．２％水酸化ナトリウム３００μｌと混和させ、室温下で５分間放置して変性させた。変性後、それに９００μｌのハイブリダイゼーション溶液を加えて混和させ、これを前記したオリゴヌクレオチドを固定化したウェルに５０μｌずつ加えた。プレートに蓋をして３７℃で１時間放置した。ウェル内の液を棄てた後、各ウェルを酵素希釈液（０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．１Ｍトリスー塩酸、２ｍＭ塩化マグネシウム、および０．０５％ツイーン２０）（ｐＨ７．５）３００μｌを用いて３回洗浄した。液を除去した後、酵素希釈液で１０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識アビジン（ベクター社製）を５０μｌ加え、３７℃で１５分間放置した。この液を除去した後、酵素希釈液３００μｌで３回洗浄した。発色基質液（１．５ｍＭ ２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホニックアシッド）ジアンモニウム、および０．０１％過酸化水素を含有する０．２Ｍ酒石酸緩衝液（ｐＨ４．４））を加えて、１５分間３７℃で反応させた後、４１５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００７６】
各配列に対応する吸光度は下記の表に示される通りであった。得られた値から、各サンプルのＨＬＡ−Ｃ遺伝子のタイプを判定した。
結果は下記の表６に示される通りであった。
【００７７】
【表６】
【００７８】
例３： ＨＬＡ−ＤＲ抗原遺伝子の検出
前記配列ＤＲ１〜ＤＲ２４で示されるオリゴヌクレオチドプローブを、マイクロタイタープレートに次のようにして固定した。
まず、０．７５Ｍ塩化ナトリウム、０．１５Ｍトリスー塩酸、および０．１５Ｍ塩化マグネシウムからなる溶液（ｐＨ８．０）に前記オリゴヌクレオチドプローブをそれぞれ溶解させ、３００μＭ溶液を調製した。このオリゴヌクレオチド溶液をマイクロタイタープレートに、１ウェルあたり５０μｌずつ加えた。プレートに蓋をして３７℃で１６時間放置した後、洗浄緩衝液（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム、および０．０５％ツイーン２０）を用いて３回洗浄した。
【００７９】
所定のヒト検体由来のヒト白血球より抽出したＤＮＡをサンプル（ＷＡＫ１、ＷＡＫ１８およびＷＡＫ１６０）とし、５’側にビオチン標識した配列ＰＤＲ−ａ、ＰＤＲ−ｂ、ＰＤＲ−ｃおよびＰＤＲ−ｄをプライマーとして、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のイントロン１およびエクソン２を含む領域を、ＰＣＲ法によって４０サイクルの増幅を実施した。得られた増幅物９０μｌを０．２％水酸化ナトリウム３００μｌと混和させ、室温下で５分間放置して変性させた。変性後、それに９００μｌのハイブリダイゼーション溶液を加えて混和させ、これを前記したオリゴヌクレオチドを固定化したウェルに５０μｌずつ加えた。プレートに蓋をして３７℃で１時間放置した。ウェル内の液を棄てた後、各ウェルを酵素希釈液（０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．１Ｍトリスー塩酸、２ｍＭ塩化マグネシウム、および０．０５％ツイーン２０）（ｐＨ７．５）３００μｌを用いて３回洗浄した。液を除去した後、酵素希釈液で１０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識アビジン（ベクター社製）を５０μｌ加え、３７℃で１５分間放置した。この液を除去した後、酵素希釈液３００μｌを用いて３回洗浄した。発色基質液（１．５ｍＭ ２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホニックアシッド）ジアンモニウム、および０．０１％過酸化水素を含有する０．２Ｍ酒石酸緩衝液（ｐＨ４．４））を加えて、１５分間３７℃で反応させた後、４１５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００８０】
各配列に対応する吸光度は下記の表に示される通りであった。得られた値から、各サンプルのＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のタイプを判定した。
結果は下記の表７に示される通りであった。
【００８１】
【表７】
【００８２】
例４： ＨＬＡ−ＤＱ抗原遺伝子の検出
前記配列ＤＱ１〜ＤＱ１７で示されるオリゴヌクレオチドプローブを、マイクロタイタープレートに次のようにして固定した。
まず、０．７５Ｍ塩化ナトリウム、０．１５Ｍトリスー塩酸、および０．１５Ｍ塩化マグネシウムからなる溶液（ｐＨ８．０）に前記オリゴヌクレオチドプローブをそれぞれ溶解させ、３００μＭ溶液を調製した。このオリゴヌクレオチド溶液をマイクロタイタープレートに、１ウェルあたり５０μｌずつ加えた。プレートに蓋をして３７℃で１６時間放置した後、洗浄緩衝液（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム、および０．０５％ツイーン２０）を用いて３回洗浄した。
【００８３】
所定のヒト検体由来のヒト白血球より抽出したＤＮＡをサンプル（ＷＡＫ１、ＷＡＫ１８およびＷＡＫ１６０）とし、５’側にビオチン標識した配列ＰＤＱ−ａ、ＰＤＱ−ｂおよびＰＤＱ−ｃをプライマーとして、ＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子のエクソン２を含む領域を、ＰＣＲ法によって４０サイクルの増幅を実施した。得られた増幅物９０μｌを０．２％水酸化ナトリウム３００μｌと混和させ、室温下で５分間放置して変性させた。変性後、それに９００μｌのハイブリダイゼーション溶液を加えて混和させ、これを前記したオリゴヌクレオチドを固定化したウェルに５０μｌずつ加えた。プレートに蓋をして３７℃で１時間放置した。ウェル内の液を棄てた後、各ウェルを酵素希釈液（０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．１Ｍトリスー塩酸、２ｍＭ塩化マグネシウム、および０．０５％ツイーン２０）（ｐＨ７．５）３００μｌを用いて３回洗浄した。液を除去した後、酵素希釈液で１０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識アビジン（ベクター社製）を５０μｌ加え、３７℃で１５分間放置した。この液を除去した後、酵素希釈液３００μｌを用いて３回洗浄した。発色基質液（１．５ｍＭ ２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホニックアシッド）ジアンモニウム、および０．０１％過酸化水素を含有する０．２Ｍ酒石酸緩衝液（ｐＨ４．４））を加えて、１５分間３７℃で反応させた後、４１５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００８４】
各配列に対応する吸光度は下記の表に示される通りであった。得られた値から、各サンプルのＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のタイプを判定した。
結果は下記の表８に示される通りであった。
【００８５】
【表８】
【００８６】
【配列表】
【発明の背景】
発明の分野
本発明は、ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）（Ｈｕｍａｎ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ）のタイピングに用いられるプローブに関する。さらに詳しくは、本発明はＨＬＡのうちＢ抗原、Ｃ抗原、ＤＲ抗原および／またはＤＱ抗原を遺伝子型にタイピングするのに有用なプローブに関する。
【０００２】
従来技術
近時、臓器移植の分野は長足の進歩を遂げ、その成功率も徐々に上がってきている。移植の成功率は、臓器の提供者と患者の間でＨＬＡの型がどれだけ一致しているかに大きく依存する。ヒトの主要組織適合性抗原であるＨＬＡは、免疫系において自己・非自己の識別に重要な役割を果たしている分子であり、機能を持つ蛋白質の中で最も高度な多型性を示すものである。ＨＬＡ分子をコードしている遺伝子は第６番染色体上にあり、主な遺伝子座として、クラスＩ抗原であるＨＬＡ−Ａ座、ＨＬＡ−Ｂ座およびＨＬＡ−Ｃ座と、クラスＩＩ抗原であるＨＬＡ−ＤＲ座およびＨＬＡ−ＤＱ座とが存在する。それぞれの遺伝子座について数十から数百種類の対立遺伝子が報告されており、非血縁者間において各遺伝子座の対立遺伝子がすべて一致する確率は非常に低い。したがって、移植を成功させるためには、より正確かつ迅速にＨＬＡの型をタイピングできることが重要である。
【０００３】
従来、ＨＬＡのタイピングは抗体を用いて行われてきた。しかしながら、抗体はその供給源が経済的にほぼ限られている上、モノクローナル抗体を得ることが困難なこともある。このため、優れた品質の抗体を安定して十分量得ることは困難なことがある。この問題はＨＬＡの中でも特にクラスＩＩ抗原について顕著である。
【０００４】
抗体を用いる検査法に代わって、特異性の面で安定的であり、かつ、検査用の試薬の供給が制限されない、遺伝子によるタイピング法が研究され、種々の方法が提案されている。また日本骨髄バンク等のような、世界中で骨髄や腎臓を中心として臓器移植ネットワークが徐々に規模を拡大してきている。そのため、試薬による量的制限のない遺伝子タイピング法であって、大量の検体を低コストでタイピングできるものが求められている。
【０００５】
遺伝子タイピング法としては、例えば、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＯ法、ＰＣＲ−ＳＳＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法等が提案されている（例えば、今日の移植ＶＯＬ．７ ＳＵＰＰＬ １９９４（非特許文献１）参照）。また、単一クラスＩＩ ＨＬＡ遺伝子座のＤＮＡ配列に対して実質的に相補的である標識されたＤＮＡ配列を含んでなる、ＨＬＡタイプ分け用の、該遺伝子座に対して特異的なＤＮＡプローブからなる試薬が提案されている（例えば、特許第２８５９８７４号公報（特許文献１）参照）。
さらに、ＨＬＡ−ＤＰ遺伝子型を決定する方法およびプローブに関する技術（例えば、特開平６−７８８００号公報（特許文献２）参照）、および、ＨＬＡ−ＤＱＢ１タイピングを決定するためのヌクレオチドプローブに関する技術（例えば、特表２０００−５１１４３０号公報（特許文献３）参照）も報告されている。
【０００６】
上記種々の提案にもかかわらず、より簡便かつ精度の高い方法への希求が依然として存在している。骨髄バンク事業等におけるスクリーニングにおいて、不可欠な条件としては、例えば下記の事項が挙げられる：
（１）操作が簡易で、かつ大量検体処理に適していること、
（２）対象の集団に見られるほぼ全てのタイプを検出できること、
（３）分類のレベルが適当で、最終検査の実施対象を実用上支障のない程度の数に絞り込むこと、および
（４）作業量、試薬のコスト等とのバランスが取れていること。
【０００７】
本発明者らは先に、１６種類のプローブを用いたＨＬＡ−ＤＲ抗原のタイピング法を提案している（例えば、特開平８−３０８５９６号公報（特許文献４）参照）。
【０００８】
なお上記記載中で挙げられた文献を下記に列記する。
【０００９】
【非特許文献１】
今日の移植 ＶＯＬ．７ ＳＵＰＰＬ １９９４
【特許文献１】
特許第２８５９８７４号公報
【特許文献２】
特開平６−７８８００号公報
【特許文献３】
特表２０００−５１１４３０号公報
【特許文献４】
特開平８−３０８５９６号公報
【００１０】
【発明の概要】
本発明者らは、今般、先に提案したＨＬＡ−ＤＲ抗原のタイピングに有用なプローブよりも、さらに特異性が改善された２種類のプローブ、ＨＬＡ−Ｂ抗原のタイピングに有用な２種類のプローブ、ＨＬＡ−Ｃ抗原のタイピングに有用な２種類のプローブ、ＨＬＡ−ＤＱ抗原のタイピングに有用な２種類のプローブ、またはこれらの相補鎖を組み合わせて用いることにより、ＨＬＡ−Ｂ抗原、ＨＬＡ−Ｃ抗原、ＨＬＡ−ＤＲ抗原、および／またはＨＬＡ−ＤＱ抗原のより精度の高いタイピングが可能であることを見出した。本発明はかかる知見に基づくものである。
【００１１】
よって、本発明は、簡便かつ大量の検体を正確に検査することができるタイピング方法であって、ＨＬＡ−Ｂ抗原、ＨＬＡ−Ｃ抗原、ＨＬＡ−ＤＲ抗原、および／またはＨＬＡ−ＤＱ抗原のタイピングが可能なプローブの提供をその目的としている。
【００１２】
本発明によるＨＬＡ−Ｂ抗原の遺伝子のタイピングに用いられるプローブは、下記の配列Ｂ１０および／またはＢ１９で示されるオリゴヌクレオチドおよび／またはその相補鎖の一部分または全部を含んでなるものである：
配列Ｂ１０：ＡＣＡＣＡＴＡＴＣＴＧＣＡＡＧＡＣＣＣＡＧ （配列番号１）
配列Ｂ１９：ＧＣＧＧＣＣＣＧＴＧＴＧＧＣＧＧＣＣＣＡＧ （配列番号２）。
【００１３】
本発明によるＨＬＡ−Ｃ抗原の遺伝子のタイピングに用いられるプローブは、下記の配列Ｃ５および／またはＣ１０で示されるオリゴヌクレオチドおよび／またはその相補鎖の一部分または全部を含んでなるものである：
配列Ｃ５：ＡＧＴＣＣＧＡＧＡＧＡＡＧＡＧＣＣＣＣＧＧ （配列番号３）
配列Ｃ１０：ＣＴＣＣＡＧＴＧＧＡＴＧＴＴＴＧＧＡＴＧＣ （配列番号４）。
【００１４】
本発明によるＨＬＡ−ＤＲ抗原の遺伝子のタイピングに用いられるプローブは、下記の配列ＤＲ１４および／またはＤＲ２２で示されるオリゴヌクレオチドおよび／またはその相補鎖の一部分または全部を含んでなるものである：
配列ＤＲ１４：ＧＡＣＡＴＣＣＴＴＧＡＡＧＡＣＧＡＧＣＧＧ （配列番号５）
配列ＤＲ２２：ＧＧＡＣＣＴＣＣＴＴＧＡＴＧＡＣＡＧＧＣＧ （配列番号６）。
【００１５】
本発明によるＨＬＡ−ＤＱ抗原の遺伝子のタイピングに用いられるプローブは、下記の配列ＤＱ８および／またはＤＱ１７で示されるオリゴヌクレオチドおよび／またはその相補鎖の一部分または全部を含んでなるものである：
配列ＤＱ８：ＣＴＧＧＴＧＣＣＧＣＣＴＧＣＣＴＣＣＧＡＧ （配列番号７）
配列ＤＱ１７：ＣＣＧＣＴＧＴＧＧＣＣＴＣＣＴＧＡＣＧＣＣ （配列番号８）。
【００１６】
本発明の一つの態様によるプローブセットは、下記（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれか２以上のグループからそれぞれ選択されるプローブを含んでなるものである：
（ｉ）前記のＨＬＡ−Ｂ抗原の遺伝子のタイピングに用いられるプローブ、
（ｉｉ）前記のＨＬＡ−Ｃ抗原の遺伝子のタイピングに用いられるプローブ、
（ｉｉｉ）前記のＨＬＡ−ＤＲ抗原の遺伝子のタイピングに用いられるプローブ、および
（ｉｖ）前記のＨＬＡ−ＤＱ抗原の遺伝子のタイピングに用いられるプローブ。
【００１７】
本発明によるＨＬＡ−Ｂ抗原、Ｃ抗原、ＤＲ抗原およびＤＱ抗原の遺伝子タイピング用プローブを用いることによって、従来に比べてさらに迅速かつ精度の高いＨＬＡ遺伝子の検査を行うことができる。
【００１８】
【発明の具体的説明】
前記したように、本発明によるＨＬＡ−Ｂ抗原遺伝子のタイピングに用いるプローブは、
配列Ｂ１０および／またはＢ１９で示される、オリゴヌクレオチド、および／または
その相補鎖であって下記配列Ｂ１０ａおよび／またはＢ１９ａで示される、オリゴヌクレオチド
の一部または全部を含んでなる：
配列Ｂ１０ａ：ＣＴＧＧＧＴＣＴＴＧＣＡＧＡＴＡＴＧＴＧＴ （配列番号９）
配列Ｂ１９ａ：ＣＴＧＧＧＣＣＧＣＣＡＣＡＣＧＧＧＣＣＧＣ （配列番号１０）。
【００１９】
本発明によるＨＬＡ−Ｃ抗原遺伝子のタイピングに用いるプローブは、
配列Ｃ５および／またはＣ１０で示される、オリゴヌクレオチド、および／または
その相補鎖であって下記配列Ｃ５ａおよび／またはＣ１０ａで示される、オリゴヌクレオチド
の一部または全部を含んでなる：
配列Ｃ５ａ：ＣＣＧＧＧＧＣＴＣＴＴＣＴＣＴＣＧＧＡＣＴ （配列番号１１）
配列Ｃ１０ａ：ＧＣＡＴＣＣＡＡＡＣＡＴＣＣＡＣＴＧＧＡＧ （配列番号１２）。
【００２０】
本発明によるＨＬＡ−ＤＲ抗原遺伝子のタイピングに用いるプローブは、
配列ＤＲ１４および／またはＤＲ２２で示される、オリゴヌクレオチド、および／または
その相補鎖であって下記配列ＤＲ１４ａおよび／またはＤＲ２２ａで示される、オリゴヌクレオチド
の一部または全部を含んでなる：
配列ＤＲ１４ａ：ＣＣＧＣＴＣＧＴＣＴＴＣＡＡＧＧＡＴＧＴＣ （配列番号１３）
配列ＤＲ２２ａ：ＣＧＣＣＴＧＴＣＡＴＣＡＡＧＧＡＧＧＴＣＣ （配列番号１４）。
【００２１】
本発明によるＨＬＡ−ＤＱ抗原遺伝子のタイピングに用いるプローブは、
配列ＤＤＱ８および／またはＤＱ１７で示される、オリゴヌクレオチド、および／または
その相補鎖であって下記配列ＤＱ８ａおよび／またはＤＱ１７ａで示される、オリゴヌクレオチド
の一部または全部を含んでなる：
配列ＤＱ８ａ：ＣＴＣＧＧＡＧＧＣＡＧＧＣＧＧＣＡＣＣＡＧ （配列番号１５）
配列ＤＱ１７ａ：ＧＧＣＧＴＣＡＧＧＡＧＧＣＣＡＣＡＧＣＧＧ （配列番号１６）。
【００２２】
これらプローブの配列は、いずれも人工的に変異が加えられたものであり、それぞれＨＬＡ−Ｂ抗原、ＨＬＡ−Ｃ抗原、ＨＬＡ−ＤＲ抗原およびＨＬＡ−ＤＱ抗原の遺伝子にそのタイプに対応してハイブリダイズする。すなわち、被験者由来のＤＮＡ、好ましくは白血球より抽出されたＤＮＡと、上記配列のいずれがハイブリダイズするかにより、ＨＬＡ抗原のタイピングを行うことができる。
【００２３】
具体的には、例えばＨＬＡ−Ｂ抗原タイピングを行う場合には、前記した本発明によるＨＬＡ−Ｂ抗原遺伝子のタイピングに用いるプローブ以外に任意の２２プローブを用いられる。同様に、ＨＬＡ−Ｃ抗原タイピングを行う場合には、前記した本発明によるＨＬＡ−Ｃ抗原遺伝子のタイピングに用いるプローブ以外に任意の２１プローブが用いられる。ＨＬＡ−ＤＲ抗原タイピングを行う場合には、前記した本発明によるＨＬＡ−ＤＲ抗原遺伝子のタイピングに用いるプローブ以外に任意の２２プローブが用いられる。また、ＨＬＡ−ＤＱ抗原タイピングを行う場合には、前記した本発明によるＨＬＡ−ＤＱ抗原遺伝子のタイピングに用いるプローブ以外に任意の１５プローブが用いられる。
これらの任意のプローブは、いずれも公知のＨＬＡ抗原の遺伝子配列表（データーベース；ＵＲＬアドレス ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｇｔ／ｈｌａ／）から適宜選定することができる。
【００２４】
したがって、検定に使用する本発明によるプローブと同じタイプのＨＬＡ抗原遺伝子のタイピングに用いられる任意のプローブを、前記データベース等を利用して所定の数選定して入手し、これらを本発明によるプローブと併せてプローブセットとする。このプローブセットを用いて、予め既知のサンプルにより判定表を作成しておく。そしてこのプローブセットと、核酸試料とをハイブリダイズさせ、プローブセット中の各プローブと核酸試料との間におけるハイブリダイゼーションの有無を確認し、その結果を該判定表によって評価する。これより、核酸試料のＨＬＡ抗原のタイプを判定することができる。
【００２５】
このような本発明によるプローブと任意のプローブとからなるプローブセットの好ましい例、および、それに対応する判定表の例を示すと下記のとおりである。
【００２６】
具体的には、ＨＬＡ−Ｂ抗原の遺伝子のタイピングに用いられるプローブセットとしては、下記の配列Ｂ１〜Ｂ２４で示されるオリゴヌクレオチドからなるものが挙げられる：
配列Ｂ１： ＴＡＴＴＴＣＴＡＣＡＣＣＧＣＣＡＴＧＴＣＣ （配列番号１７）
配列Ｂ２： ＡＧＴＣＣＧＡＧＧＡＡＧＧＡＧＣＣＧＣＧＧ （配列番号１８）
配列Ｂ３： ＡＧＴＣＣＧＡＧＧＡＣＧＧＡＧＣＣＣＣＧＧ （配列番号１９）
配列Ｂ４： ＡＧＴＣＣＧＡＧＡＧＡＧＧＡＧＣＣＧＣＧＧ （配列番号２０）
配列Ｂ５： ＧＣＧＣＣＧＴＧＧＧＴＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧ （配列番号２１）
配列Ｂ６： ＡＣＡＣＡＧＡＴＣＴＣＣＡＡＧＡＣＣＣＡＧ （配列番号２２）
配列Ｂ７： ＧＡＣＣＧＧＡＡＣＡＣＡＣＡＧＡＴＣＴＡＣ （配列番号２３）
配列Ｂ８： ＣＡＧＡＡＧＴＡＣＡＡＧＣＧＣＣＡＧＧＣＡ （配列番号２４）
配列Ｂ９： ＣＡＧＡＴＣＴＡＣＡＡＧＧＣＣＣＡＧＧＣＡ （配列番号２５）
配列Ｂ１０： ＡＣＡＣＡＴＡＴＣＴＧＣＡＡＧＡＣＣＣＡＧ （配列番号１）
配列Ｂ１１： ＡＣＡＣＡＧＡＴＣＴＴＣＡＡＧＡＣＣＣＡＧ （配列番号２６）
配列Ｂ１２： ＧＣＡＣＡＧＡＣＴＴＡＣＣＧＡＧＡＧＡＧＣ （配列番号２７）
配列Ｂ１３： ＣＧＧＡＡＣＣＴＧＣＧＣＧＧＣＴＡＣＴＡＣ （配列番号２８）
配列Ｂ１４： ＣＴＧＣＴＣＣＧＣＴＡＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧ （配列番号２９）
配列Ｂ１５： ＣＡＣＡＣＴＴＧＧＣＡＧＡＣＧＡＴＧＴＡＣ （配列番号３０）
配列Ｂ１６： ＣＴＣＣＡＧＡＧＧＡＴＧＴＡＣＧＧＣＴＧＣ （配列番号３１）
配列Ｂ１７： ＣＡＴＡＡＣＣＡＧＴＡＣＧＣＣＴＡＣＧＡＣ （配列番号３２）
配列Ｂ１８： ＣＡＴＧＡＣＣＡＧＴＴＣＧＣＣＴＡＣＧＡＣ （配列番号３３）
配列Ｂ１９： ＧＣＧＧＣＣＣＧＴＧＴＧＧＣＧＧＣＣＣＡＧ （配列番号２）
配列Ｂ２０： ＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＧＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧ （配列番号３４）
配列Ｂ２１： ＣＴＧＧＡＧＧＧＣＣＴＧＴＧＣＧＴＧＧＡＧ （配列番号３５）
配列Ｂ２２： ＣＴＧＧＡＧＧＧＣＧＡＧＴＧＣＧＴＧＧＡＧ （配列番号３６）
配列Ｂ２３： ＴＧＧＣＴＣＣＧＣＡＧＡＣＡＣＣＴＧＧＡＧ （配列番号３７）
配列Ｂ２４： ＣＴＣＣＡＧＧＴＧＡＴＧＴＡＴＧＧＣＴＧＣ （配列番号３８）
【００２７】
このプローブセットに対応する判定表（ＨＬＡ−Ｂ抗原の判定表）は、下記表の通りである。なおここでは、日本人で報告されたアリルのみ記載されている。
【００２８】
【表１】
よって、本発明の一つの好ましい態様によれば、配列Ｂ１〜Ｂ２４で示されるオリゴヌクレオチドおよび／またはその相補鎖の一部分または全部からなる、ＨＬＡ−Ｂ抗原の遺伝子のタイピングに用いられるプローブセットが提供される。
【００３０】
ＨＬＡ−Ｃ抗原の遺伝子のタイピングに用いられるプローブセットとしては、下記の配列Ｃ１〜Ｃ２３で示されるオリゴヌクレオチドからなるものが挙げられる：
配列Ｃ１： ＡＡＧＴＡＴＴＴＣＴＴＣＡＣＡＴＣＣＧＴＧ （配列番号３９）
配列Ｃ２： ＡＧＡＧＣＧＡＧＧＣＣＡＧＴＴＡＧＴＧＡＣ （配列番号４０）
配列Ｃ３： ＴＣＣＡＣＡＴＣＣＧＴＧＴＣＣＴＧＧＣＣＣ （配列番号４１）
配列Ｃ４： ＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧＡＡＡＣＴＧＣＧＣ （配列番号４２）
配列Ｃ５： ＡＧＴＣＣＧＡＧＡＧＡＡＧＡＧＣＣＣＣＧＧ （配列番号３）
配列Ｃ６： ＴＧＣＡＧＣＧＣＧＣＡＧＧＴＡＣＣＡＧＧＧ （配列番号４３）
配列Ｃ７： ＧＣＧＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＡＧＣＣＴＡＣ （配列番号４４）
配列Ｃ８： ＧＣＧＧＡＧＣＡＧＣＴＧＡＧＡＧＣＣＴＡＣ （配列番号４５）
配列Ｃ９： ＡＣＣＧＣＴＧＣＧＧＡＣＡＣＧＧＣＧＧＣＴ （配列番号４６）
配列Ｃ１０： ＣＴＣＣＡＧＴＧＧＡＴＧＴＴＴＧＧＡＴＧＣ （配列番号４）
配列Ｃ１１： ＣＡＴＧＡＣＣＡＧＴＴＡＧＣＣＴＡＣＧＡＣ （配列番号４７）
配列Ｃ１２： ＧＧＧＴＡＴＧＡＣＣＡＧＴＡＣＧＣＣＴＡＣ （配列番号４８）
配列Ｃ１３： ＧＧＧＴＡＴＡＡＣＣＡＧＴＴＣＧＣＣＴＡＣ （配列番号４９）
配列Ｃ１４： ＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＣＣＧＧＴＧＡＧＴＧＡ （配列番号５０）
配列Ｃ１５： ＡＧＧＴＣＴＣＡＣＡＴＣＣＴＣＣＡＧＡＧＧ （配列番号５１）
配列Ｃ１６： ＡＡＣＧＧＧＡＡＧＡＡＧＡＣＧＣＴＧＣＡＧ （配列番号５２）
配列Ｃ１７： ＣＴＧＧＡＧＡＡＣＡＧＧＡＡＧＡＡＧＡＣＧ （配列番号５３）
配列Ｃ１８： ＧＣＧＧＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＡＧＣＣＴＡＣ （配列番号５４）
配列Ｃ１９： ＣＧＣＴＴＣＡＴＣＴＣＡＧＴＧＧＧＣＴＡＣ （配列番号５５）
配列Ｃ２０： ＧＣＣＧＣＧＡＧＴＣＣＧＡＧＡＧＧＧＧＡＧ （配列番号５６）
配列Ｃ２１： ＧＣＣＧＣＧＡＧＴＣＣＡＡＧＡＧＧＧＧＡＧ （配列番号５７）
配列Ｃ２２： ＣＴＧＧＡＧＧＧＣＧＡＧＴＧＣＧＴＧＧＡＧ （配列番号５８）
配列Ｃ２３： ＴＴＣＴＡＣＡＣＣＧＣＴＧＴＧＴＣＣＣＧＧ （配列番号５９）
【００３１】
このプローブセットに対応する判定表（ＨＬＡ−Ｃ抗原の判定表）は、下記表の通りである。なおここでは、日本人で報告されたアリルのみ記載されている。
【００３２】
【表２】
よって、本発明の一つの好ましい態様によれば、配列Ｃ１〜Ｃ２３で示されるオリゴヌクレオチドおよび／またはその相補鎖の一部分または全部からなる、ＨＬＡ−Ｃ抗原の遺伝子のタイピングに用いられるプローブセットが提供される。
【００３４】
ＨＬＡ−ＤＲ抗原の遺伝子のタイピングに用いられるプローブセットとしては、下記の配列ＤＲ１〜ＤＲ２４で示されるオリゴヌクレオチドからなるものが挙げられる：
配列ＤＲ１： ＴＴＧＣＴＧＧＡＡＡＧＡＴＧＣＡＴＣＴＡＴ （配列番号６０）
配列ＤＲ２： ＴＧＧＣＡＧＣＣＴＡＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＴ （配列番号６１）
配列ＤＲ３： ＧＡＧＴＡＣＴＣＴＡＣＧＴＣＴＧＡＧＴＧＴ （配列番号６２）
配列ＤＲ４： ＴＴＧＧＡＧＣＡＧＧＴＴＡＡＡＣＡＴＧＡＧ （配列番号６３）
配列ＤＲ５： ＴＣＴＡＣＧＧＧＴＧＡＧＴＧＴＴＡＴＴＴＣ （配列番号６４）
配列ＤＲ６： ＴＧＧＣＡＧＧＧＴＡＡＧＴＡＴＡＡＧＴＧＴ （配列番号６５）
配列ＤＲ７： ＴＴＧＡＡＧＣＡＧＧＡＴＡＡＧＴＴＴＧＡＡ （配列番号６６）
配列ＤＲ８： ＴＴＧＧＡＧＧＡＧＧＴＴＡＡＧＴＴＴＧＡＧ （配列番号６７）
配列ＤＲ９： ＣＧＧＴＴＡＣＴＧＧＡＧＡＧＡＣＡＣＡＴＣ （配列番号６８）
配列ＤＲ１０： ＣＡＧＡＧＡＧＴＧＴＣＴＴＴＧＧＧＧＣＴＣ （配列番号６９）
配列ＤＲ１１： ＣＧＧＣＣＴＧＡＴＧＡＧＧＡＧＴＡＣＴＧＧ （配列番号７０）
配列ＤＲ１２： ＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＣＧＧＡＧＣＡＣＴＧＧ （配列番号７１）
配列ＤＲ１３： ＣＧＧＧＧＣＣＧＧＧＴＧＧＡＣＡＡＣＴＡＣ （配列番号７２）
配列ＤＲ１４： ＧＡＣＡＴＣＣＴＴＧＡＡＧＡＣＧＡＧＣＧＧ （配列番号５）
配列ＤＲ１５： ＣＧＧＣＧＧＧＣＣＣＴＧＧＴＧＧＡＣＡＣＣ （配列番号７３）
配列ＤＲ１６： ＡＣＧＴＣＴＧＡＧＴＧＴＣＡＡＴＴＣＴＴＣ （配列番号７４）
配列ＤＲ１７： ＧＡＧＣＡＧＡＧＧＣＧＧＧＣＣＧＣＣＧＧＴ （配列番号７５）
配列ＤＲ１８： ＣＧＧＴＴＧＣＴＧＧＡＡＡＧＡＴＧＣＡＴＣ （配列番号７６）
配列ＤＲ１９： ＴＡＴＣＡＣＣＡＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＴＧ （配列番号７７）
配列ＤＲ２０： ＡＣＣＡＡＧＡＧＧＡＧＴＣＣＧＴＧＣＧＣＴ （配列番号７８）
配列ＤＲ２１： ＣＧＴＴＴＣＴＴＧＧＡＧＴＡＣＴＣＴＡＣＧ （配列番号７９）
配列ＤＲ２２： ＧＧＡＣＣＴＣＣＴＴＧＡＴＧＡＣＡＧＧＣＧ （配列番号６）
配列ＤＲ２３： ＧＴＧＣＧＧＴＡＴＣＴＧＣＡＣＡＧＡＧＧＣ （配列番号８０）
配列ＤＲ２４： ＣＡＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＴＧＣＧＣＴＴＣ （配列番号８１）
【００３５】
このプローブセットに対応する判定表（ＨＬＡ−ＤＲ抗原の判定表）は、下記表の通りである。なおここでは、日本人で報告されたアリルのみ記載されている。
【００３６】
【表３】
よって、本発明の一つの好ましい態様によれば、配列ＤＲ１〜ＤＲ２４で示されるオリゴヌクレオチドおよび／またはその相補鎖の一部分または全部からなる、ＨＬＡ−ＤＲ抗原の遺伝子のタイピングに用いられるプローブセットが提供される。
【００３８】
ＨＬＡ−ＤＱ抗原の遺伝子のタイピングに用いられるプローブセットとしては、下記の配列ＤＱ１〜ＤＱ１７で示されるオリゴヌクレオチドからなるものが挙げられる：
配列ＤＱ１： ＧＡＧＧＧＧＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＴＧ （配列番号８２）
配列ＤＱ２： ＣＧＴＴＡＴＧＴＧＡＣＣＡＧＡＴＡＣＡＴＣ （配列番号８３）
配列ＤＱ３： ＣＧＴＣＴＴＧＴＡＡＣＣＡＧＡＣＡＣＡＴＣ （配列番号８４）
配列ＤＱ４： ＣＧＴＣＴＴＧＴＧＡＣＣＡＧＡＴＡＣＡＴＣ （配列番号８５）
配列ＤＱ５： ＧＧＧＣＧＧＣＣＴＧＴＴＧＣＣＧＡＧＴＡＣ （配列番号８６）
配列ＤＱ６： ＣＣＧＣＴＧＧＧＧＣＧＧＣＴＴＧＡＣＧＣＣ （配列番号８７）
配列ＤＱ７： ＡＧＣＣＡＧＡＡＧＧＡＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧ （配列番号８８）
配列ＤＱ８： ＣＴＧＧＴＧＣＣＧＣＣＴＧＣＣＴＣＣＧＡＧ （配列番号７）
配列ＤＱ９： ＣＴＴＧＴＧＡＧＣＡＧＡＡＧＣＡＴＣＴＡＴ （配列番号８９）
配列ＤＱ１０： ＧＧＧＣＧＧＣＣＴＧＡＴＧＣＣＧＡＧＴＡＣ （配列番号９０）
配列ＤＱ１１： ＧＧＧＡＣＣＧＡＧＣＴＣＧＴＧＣＧＧＧＧＴ （配列番号９１）
配列ＤＱ１２： ＣＴＴＧＴＡＡＣＣＡＧＡＴＡＣＡＴＣＴＡＴ （配列番号９２）
配列ＤＱ１３： ＧＧＧＧＴＧＴＡＴＣＧＧＧＣＧＧＴＧＡＣＧ （配列番号９３）
配列ＤＱ１４： ＧＧＧＡＣＣＧＡＧＣＧＣＧＴＧＣＧＧＧＧＴ （配列番号９４）
配列ＤＱ１５： ＧＧＧＧＴＧＴＡＣＣＧＧＧＣＧＧＴＧＡＣＧ （配列番号９５）
配列ＤＱ１６： ＧＧＧＣＧＧＣＣＴＡＧＣＧＣＣＧＡＧＴＡＣ （配列番号９６）
配列ＤＱ１７： ＣＣＧＣＴＧＴＧＧＣＣＴＣＣＴＧＡＣＧＣＣ （配列番号８）
【００３９】
このプローブセットに対応する判定表（ＨＬＡ−ＤＱ抗原の判定表）は、下記表の通りである。なおここでは、日本人で報告されたアリルのみ記載されている。
【００４０】
【表４】
よって、本発明の一つの好ましい態様によれば、配列ＤＱ１〜ＤＱ１７で示されるオリゴヌクレオチドおよび／またはその相補鎖の一部分または全部からなる、ＨＬＡ−ＤＱ抗原の遺伝子のタイピングに用いられるプローブセットが提供される。
【００４２】
したがって、これらプローブセットとそれに対応する判定表とを用いることによって、核酸試料のＨＬＡ抗原のタイプを判定することができる。
なお、本発明によるプローブまたはプローブセットのプローブと、核酸試料とのハイブリダイゼーションの有無は、通常用いられる条件下において確認することができる。
【００４３】
よって、本発明によるＨＬＡ−Ｂ抗原の遺伝子のタイピング法は、核酸試料と、本発明によるＨＬＡ−Ｂ抗原遺伝子のタイピングに用いるプローブまたはプローブセットにおけるプローブとの相補性の有無を検出することを含んでなる。
【００４４】
同様に、本発明によるＨＬＡ−Ｃ抗原の遺伝子のタイピング法は、核酸試料と、本発明によるＨＬＡ−Ｃ抗原遺伝子のタイピングに用いるプローブまたはプローブセットにおけるプローブとの相補性の有無を検出することを含んでなる。
本発明によるＨＬＡ−ＤＲ抗原の遺伝子のタイピング法は、核酸試料と、本発明によるＨＬＡ−ＤＲ抗原遺伝子のタイピングに用いるプローブまたはプローブセットにおけるプローブとの相補性の有無を検出することを含んでなる。
また、本発明によるＨＬＡ−ＤＱ抗原の遺伝子のタイピング法は、核酸試料と、本発明によるＨＬＡ−ＤＱ抗原遺伝子のタイピングに用いるプローブまたはプローブセットにおけるプローブとの相補性の有無を検出することを含んでなる。
【００４５】
本発明の好ましい態様によれば、前記プローブは、特開平５−１９２１９８号公報に記載の方法によって、固相、好ましくはマイクロタイタープレートに一本鎖核酸として固定化してタイピングに利用することが好ましい。このとき固定化される核酸は前記プローブ配列以外の任意の配列をさらに含んでいてもよい。
【００４６】
固相に固定化する一本鎖核酸を用意する方法の具体例に示せば下記の通りである。
前記したプローブの配列を１またはそれ以上繰り返し（好ましくはタンデムに）含む配列を得て、それを例えばＭ１３ファージ、ファージとプラスミドの複合ベクター（例えばｐＵＣ１１８、ｐＢＳＭ１３＋、ＰＵＣｆ１等）に組み込み、一本鎖核酸を得る。上記配列を５〜２００コピー導入したベクターから得られる一本鎖核酸を用いるのが好ましい。
【００４７】
これらの一本鎖核酸を固定化する担体としては、核酸が非特異的に吸着しうるもの、または、官能基が導入できその官能基と核酸との間で共有結合できるものであれば、いずれの材質またはいずれの形状のものであっても利用可能である。具体例としては、いわゆるポリマー製のマイクロプレート、チューブ、ビーズ形状のものが挙げられる。マイクロプレートを用いるのが、その機械化の容易性から好ましい。
【００４８】
前記した一本鎖核酸をこれらの担体に固定化する方法としては、まず化学結合法が挙げられる〔Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １５， ５３７３−５３９０ （１９８７）〕。化学結合によって核酸を固定化する方法の具体例としては、アミノ基を導入した担体と核酸をグルタルアルデヒドのような架橋剤を用いて両者を結合させる方法が挙げられる。また、核酸に官能基（例えばトランスアミネーション反応により１級のアミノ基）を導入し、適当な架橋剤を用いて担体上に導入された官能基と結合させることも有効である。
【００４９】
また、吸着などの非特異的結合によって核酸を直接担体に固定することもできる。担体がマイクロプレートである場合は、紫外線照射または塩化マグネシウムの添加により吸着効率をあげることが可能である（特開昭６１−２１９４００号公報）。さらに、核酸とタンパク質を適当な方法によって化学結合または非特異的に吸着させ、そのタンパク質と担体との非特異的吸着を利用して固定化する方法なども有効である。
【００５０】
本発明において、前記固相に固定化された配列と核酸試料とのハイブリダイゼーション反応の条件は適宜選択することができる。例えば、本工程におけるハイブリダイゼーション反応は、基本的に、従来の膜を用いるハイブリダイゼーションと同様に行なうことができる〔Ｂ． Ｄ． Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｓ． Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ （１９８５） 〕。
【００５１】
核酸試料としては、ヒト白血球由来のＤＮＡが好ましい。この試料の検出される目的配列は、前記配列とのハイブリダイズを検出可能なように標識されていることが好ましい。
標識化の方法としては、例えば、
（Ａ）目的核酸に標識物を直接導入する方法、
（Ｂ）標識化されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用して目的核酸に相当する核酸あるいは目的核酸と相補的な核酸を合成する方法、および
（Ｃ）標識化された単位核酸の存在下、オリゴヌクレオチドプライマーを使用して目的核酸に相当する核酸あるいは目的核酸と相補的な核酸を合成する方法
などが挙げられる。
【００５２】
前記（Ａ）の目的核酸に標識物を直接導入する方法としては、目的核酸に光反応でビオチン誘導体を導入し酵素を結合したストレプトアビジンで検出する方法〔Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １３， ７４５ （１９８５）〕、目的核酸をスルホン化し酵素標識抗スルホン化抗体を用いて検出する方法〔Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８１， ３４６６−３４７０ （１９８４）〕などが、操作の簡便性、迅速性の点から好ましい。
【００５３】
一方、前記（Ｂ）および（Ｃ）の方法としては、特定の核酸配列を増幅する方法〔ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ， ８， ２９１ （１９９０） 〕を利用することができる。これらの方法は目的核酸を増幅するという点で特に注目されているが、それのみならず、比較的簡単に目的核酸に相当する合成核酸または目的核酸と相補的な合成核酸を標識化できる点でも利用価値が高い。例えば、ＰＣＲ法〔Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３０， １３５０−１３５４ （１９８５）〕にあっては、標識したプライマーを利用するか、あるいは、標識したモノヌクレオチドトリリン酸を利用することにより、標識された伸長生成物または増幅生成物を得ることができる。また、Ｑβレプリカーゼを利用する増幅法〔ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ， ６， １１９７ （１９８８）〕にあっては、同様に標識したモノヌクレオチドトリリン酸を利用することによって標識された伸長生成物または増幅生成物を得ることができる。また、前述した以外の核酸増幅法においても、伸長反応または増幅反応によって取り込まれるモノヌクレオチドトリリン酸やオリゴヌクレオチドを標識しておくことによって伸長生成物または増幅生成物を標識することができる。本発明にあっては、前記（Ｂ）の方法が特に好ましい。
【００５４】
ここで使用する標識物質とは、ハイブリダイゼーション操作後にこの物質を検出し得るものであるならば、放射性、非放射性を問わない。取扱いの容易性、保存性、廃棄処理等から、また本発明の効果を最もよく享有するものとして、非放射性の標識物質が好ましい。
【００５５】
非放射性の標識物質としては、例えば、ビオチン、２，４‐ジニトロフェニル基、ジゴキシゲニン等のハプテン、フルオレセインおよびその誘導体〔例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）等〕、ローダミンおよびその誘導体〔例えば、テトラメチルローダミンイソチオシネート（ＴＲＩＴＣ）、テキサスレッド等〕、４‐フルオロ‐７‐ニトロベンゾフラン（ＮＢＤＦ）およびダンシルなどの蛍光物質あるいはアクリジン等の化学発光物質が挙げられる。これらによりオリゴヌクレオチドを標識する場合は、いずれも公知手段（特開昭５９−９３０９８号、特開昭５９−９３０９９号各公報参照）により、標識化を行うことができる。また、ヌクレオチド三リン酸を標識する場合は公知手段〔Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８０， ４０４５ （１９８３） 、特開昭６３−１５２３６４公報〕に準じて行うか、市販品を利用することができる。
【００５６】
本発明の好ましい態様によれば、この核酸試料の標識は標識化されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用し、ＰＣＲ法によって増幅と同時に行われるのが好ましい。
本発明のさらに好ましい態様によれば、標識されたプライマーとして下記配列を用いるのが好ましい：
配列ＰＢ−ａ：ＡＧＣＧＡＧＧＧＧＡＣＣＧＣＡＧＧＣＧＧＧ （配列番号９７）
配列ＰＢ−ｂ：ＣＧＴＡＣＧＴＧＧＧＧＧＡＴＧＧＧＧＡＧＴ （配列番号９８）
配列ＰＢ−ｃ：ＣＣＧＧＣＧＡＧＡＧＣＣＣＣＡＧＧＣＧＣＧ （配列番号９９）
配列ＰＢ−ｄ：ＡＧＧＣＣＡＴＣＣＣＣＧＧＣＧＡＣＣＴＡＴ （配列番号１００）
配列ＰＣ−ａ：ＣＧＡＧＧＧＧＣＣＣＧＣＣＣＧＧＣＧＡＧＧ （配列番号１０１）
配列ＰＣ−ｂ：ＣＧＴＣＣＧＴＧＧＧＧＧＡＴＧＧＧＧＡＧＧ （配列番号１０２）
配列ＰＣ−ｃ：ＧＡＧＴＣＴＣＣＣＧＧＴＣＴＧＡＧＡＴＣＣ （配列番号１０３）
配列ＰＣ−ｄ：ＡＧＡＴＧＧＧＧＡＡＧＧＣＴＣＣＣＣＡＣＴ （配列番号１０４）
配列ＰＤＲ−ａ：ＴＣＧＴＧＴＣＣＣＣＡＣＡＧＣＡＣＧＴ （配列番号１０５）
配列ＰＤＲ−ｂ：ＣＣＧＣＴＧＣＡＣＴＧＴＧＡＡＧＣＴＣＴ （配列番号１０６）
配列ＰＤＲ−ｃ：ＧＧＴＧＧＧＴＧＣＴＧＴＴＧＡＡＧＧＴＡ （配列番号１０７）
配列ＰＤＲ−ｄ：ＴＧＣＧＧＧＡＡＡＡＣＣＣＣＴＴＣＴＣＡ （配列番号１０８）
配列ＰＤＱ−ａ：ＧＴＧＣＴＡＣＴＴＣＡＣＣＡＡＣＧＧＧＡＣ （配列番号１０９）
配列ＰＤＱ−ｂ：ＧＡＧＧＡＴＣＣＣＧＣＧＧＴＡＣＧＣＣＡＣ （配列番号１１０）
配列ＰＤＱ−ｃ：ＡＡＧＧＴＣＧＴＧＣＧＧＡＧＣＴＣＣＡＡＣ （配列番号１１１）。
【００５７】
前記配列の内、配列ＰＢ−ａ、ＰＢ−ｂ、ＰＢ−ｃ、およびＰＢ−ｄからなるプライマーの使用によりＨＬＡ−Ｂ抗原をコードする遺伝子のみを増幅することができる。したがって、本発明の好ましい態様によれば、ＨＬＡ−Ｂ抗原の遺伝子のタイピング法において、核酸試料は、配列ＰＢ−ａ、ＰＢ−ｂ、ＰＢ−ｃおよびＰＢ−ｄで表されるオリゴヌクレオチドをプライマーとして増幅されたものである。
【００５８】
配列ＰＣ−ａ、ＰＣ−ｂ、ＰＣ−ｃ、およびＰＣ−ｄからなるプライマーの使用によりＨＬＡ−Ｃ抗原をコードする遺伝子のみを増幅することができる。したがって、本発明の好ましい態様によれば、ＨＬＡ−Ｃ抗原の遺伝子のタイピング法において、核酸試料は、配列ＰＣ−ａ、ＰＣ−ｂ、ＰＣ−ｃ、およびＰＣ−ｄで表されるオリゴヌクレオチドをプライマーとして増幅されたものである。
【００５９】
配列ＰＤＲ−ａ、ＰＤＲ−ｂ、ＰＤＲ−ｃ、およびＰＤＲ−ｄからなるプライマーの使用によりＨＬＡ−ＤＲ抗原をコードする遺伝子のみを増幅することができる。したがって、本発明の好ましい態様によれば、ＨＬＡ−ＤＲ抗原の遺伝子のタイピング法において、核酸試料は、配列ＰＤＲ−ａ、ＰＤＲ−ｂ、ＰＤＲ−ｃ、およびＰＤＲ−ｄで表されるオリゴヌクレオチドをプライマーとして増幅されたものである。
【００６０】
配列ＰＤＱ−ａ、ＰＤＱ−ｂ、およびＰＤＱ−ｃからなるプライマーの使用によりＨＬＡ−ＤＱ抗原をコードする遺伝子のみを増幅することができる。したがって、本発明の好ましい態様によれば、ＨＬＡ−ＤＱ抗原の遺伝子のタイピング法において、核酸試料は、配列ＰＤＱ−ａ、ＰＤＱ−ｂ、およびＰＤＱ−ｃで表されるオリゴヌクレオチドをプライマーとして増幅されたものである。
【００６１】
本発明において、前記配列と核酸試料とのハイブリダイズの有無を検出する操作は、存在する標識の種類に応じて適宜選択され、決定されてよい。
【００６２】
ここで、目的核酸に存在する標識が直接検出可能なものである場合、すなわち標識が例えばラジオアイソトープ、蛍光物質、色素などである場合には、標識核酸が固相に結合した状態で検出操作を行うかまたは標識物を核酸と結合したまま、あるいは標識物を核酸から切り放した状態で溶液中に遊離させた後、その標識に応じた方法によって検出操作を行なう。また、標識が間接的に検出可能なものである場合、すなわち標識が例えばビオチン，ハプテンなどの特異的結合反応のリガンドである場合、一般的にそれらの検出に用いられているように、直接信号を発生する標識あるいは信号を発生する反応を触媒する酵素を結合した受容体（たとえばアビジンまたは抗体）を使用して検出操作を行う。
【００６３】
本発明の別の態様によれば、下記（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される少なくとも２種以上のタイピング方法を実施することを含んでなる、ＨＬＡの検出方法が提供される：
（ａ）前記したＨＬＡ−Ｂ抗原の遺伝子のタイピング法、
（ｂ）前記したＨＬＡ−Ｃ抗原の遺伝子のタイピング法、
（ｃ）前記したＨＬＡ−ＤＲ抗原の遺伝子のタイピング法、および
（ｄ）前記したＨＬＡ−ＤＱ抗原の遺伝子のタイピング法。
【００６４】
本発明の別の態様によれば、
ＨＬＡ−Ｂ抗原の遺伝子タイピング用キットであって、
固相担体と、標識プライマーとを含んでなり、前記固相担体には、本発明によるＨＬＡ−Ｂ抗原遺伝子のタイピングに用いるプローブまたはプローブセットにおけるプローブを含む一本鎖核酸が固定されてなり、該プローブのオリゴヌクレオチドおよびその相補鎖のそれぞれは１またはそれ以上繰り返していてもよく、前記標識プライマーが前記配列ＰＢ−ａ、ＰＢ−ｂ、ＰＢ−ｃおよびＰＢ−ｄで表される配列を含んでなるプライマーであることを特徴とするキットが提供される。
【００６５】
同様に本発明の別の態様によれば、
ＨＬＡ−Ｃ抗原の遺伝子タイピング用キットであって、
固相担体と、標識プライマーとを含んでなり、前記固相担体には本発明によるＨＬＡ−Ｃ抗原遺伝子のタイピングに用いるプローブまたはプローブセットにおけるプローブを含む一本鎖核酸が固定されてなり、該プローブのオリゴヌクレオチドおよびその相補鎖のそれぞれは１またはそれ以上繰り返していてもよく、
前記標識プライマーが前記配列ＰＣ−ａ、ＰＣ−ｂ、ＰＣ−ｃおよびＰＣ−ｄで表される配列を含んでなるプライマーであることを特徴とするキットが提供される。
【００６６】
また本発明の別の態様によれば、
ＨＬＡ−ＤＲ抗原の遺伝子タイピング用キットであって、
固相担体と、標識プライマーとを含んでなり、前記固相担体には本発明によるＨＬＡ−ＤＲ抗原遺伝子のタイピングに用いるプローブまたはプローブセットにおけるプローブを含む一本鎖核酸が固定されてなり、該プローブのオリゴヌクレオチドおよびその相補鎖のそれぞれは１またはそれ以上繰り返していてもよく、前記標識プライマーが前記配列ＰＤＲ−ａ、ＰＤＲ−ｂ、ＰＤＲ−ｃおよびＰＤＲ−ｄで表される配列を含んでなるプライマーであることを特徴とするキットが提供される。
【００６７】
本発明の別の態様によれば、
ＨＬＡ−ＤＱ抗原の遺伝子タイピング用キットであって、
固相担体と、標識プライマーとを含んでなり、前記固相担体には本発明によるＨＬＡ−ＤＱ抗原遺伝子のタイピングに用いるプローブまたはプローブセットにおけるプローブを含む一本鎖核酸が固定されてなり、該プローブのオリゴヌクレオチドおよびその相補鎖のそれぞれは１またはそれ以上繰り返していてもよく、前記標識プライマーが前記配列ＰＤＱ−ａ、ＰＤＱ−ｂ、およびＰＤＱ−ｃで表される配列を含んでなるプライマーであることを特徴とするキットが提供される。
【００６８】
本発明のさらに別の態様によれば、本発明によるプローブまたは本発明によるプローブセットを含んでなる、ＨＬＡ抗原の遺伝子タイピング用キットが提供される。
【００６９】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
【００７０】
例１： ＨＬＡ−Ｂ抗原遺伝子の検出
前記配列Ｂ１〜Ｂ２４で示されるオリゴヌクレオチドプローブを、マイクロタイタープレートに次のようにして固定した。
まず、０．７５Ｍ塩化ナトリウム、０．１５Ｍトリス−塩酸、および０．１５Ｍ塩化マグネシウムからなる溶液（ｐＨ８．０）に前記オリゴヌクレオチドプローブをそれぞれ溶解させ、３００μＭ溶液を調製した。このオリゴヌクレオチド溶液をマイクロタイタープレートに、１ウェルあたり５０μｌずつ加えた。プレートに蓋をして３７℃で１６時間放置した後、洗浄緩衝液（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム、および０．０５％ツイーン２０）を用いて３回洗浄した。
【００７１】
所定のヒト検体由来のヒト白血球より抽出したＤＮＡをサンプル（ＷＡＫ１、ＷＡＫ１８およびＷＡＫ１６０）とし、５’側にビオチン標識した配列ＰＢ−ａ、ＰＢ−ｂ、ＰＢ−ｃおよびＰＢ−ｄをプライマーとして用いて、ＨＬＡ−Ｂ遺伝子のエクソン２およびエクソン３を含む領域をＰＣＲ法によって４０サイクルの増幅を実施した。得られた増幅物９０μｌを０．２％水酸化ナトリウム３００μｌと混和させ、室温下で５分間放置して変性させた。変性後、それに９００μｌのハイブリダイゼーション溶液（０．２％塩酸、１００ｍＭ塩化ナトリウム、および１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を加えて混和させ、これを前記したオリゴヌクレオチドを固定化したウェルに５０μｌずつ加えた。プレートに蓋をして３７℃で１時間放置した。ウェル内の液を棄てた後、各ウェルを酵素希釈液（０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．１Ｍトリス−塩酸、２ｍＭ塩化マグネシウム、および０．０５％ツイーン２０）（ｐＨ７．５）３００μｌを用いて３回洗浄した。液を除去した後、酵素希釈液で１０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識アビジン（ベクター社製）を５０μｌ加え、３７℃で１５分間放置した。この液を除去した後、酵素希釈液３００μｌを用いて３回洗浄した。そこに、発色基質液（１．５ｍＭ ２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホニックアシッド）ジアンモニウム、および０．０１％過酸化水素を含有する０．２Ｍ酒石酸緩衝液（ｐＨ４．４））を加えて、１５分間３７℃で反応させた後、４１５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００７２】
各配列に対応する吸光度は下記の表に示される通りであった。得られた値から、各サンプルのＨＬＡ−Ｂ遺伝子のタイプを判定した。
結果は下記の表５に示される通りであった。
【００７３】
【表５】
例２： ＨＬＡ−Ｃ抗原遺伝子の検出
前記配列Ｃ１〜Ｃ２３で示されるオリゴヌクレオチドプローブを、マイクロタイタープレートに次のようにして固定した。
まず、０．７５Ｍ塩化ナトリウム、０．１５Ｍトリスー塩酸、および０．１５Ｍ塩化マグネシウムからなる溶液（ｐＨ８．０）に前記オリゴヌクレオチドプローブをそれぞれ溶解させ、３００μＭ溶液を調製した。このオリゴヌクレオチド溶液をマイクロタイタープレートに、１ウェルあたり５０μｌずつ加えた。プレートに蓋をして３７℃で１６時間放置した後、洗浄緩衝液（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム、および０．０５％ツイーン２０）を用いて３回洗浄した。
【００７５】
所定のヒト検体由来のヒト白血球より抽出したＤＮＡをサンプル（ＷＡＫ１、ＷＡＫ１８およびＷＡＫ１６０）とし、５’側にビオチン標識した配列ＰＣ−ａ、ＰＣ−ｂ、ＰＣ−ｃおよびＰＣ−ｄをプライマーとして、ＨＬＡ−Ｃ遺伝子のエクソン２およびエクソン３を含む領域をＰＣＲ法によって４０サイクルの増幅を実施した。得られた増幅物９０μｌを０．２％水酸化ナトリウム３００μｌと混和させ、室温下で５分間放置して変性させた。変性後、それに９００μｌのハイブリダイゼーション溶液を加えて混和させ、これを前記したオリゴヌクレオチドを固定化したウェルに５０μｌずつ加えた。プレートに蓋をして３７℃で１時間放置した。ウェル内の液を棄てた後、各ウェルを酵素希釈液（０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．１Ｍトリスー塩酸、２ｍＭ塩化マグネシウム、および０．０５％ツイーン２０）（ｐＨ７．５）３００μｌを用いて３回洗浄した。液を除去した後、酵素希釈液で１０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識アビジン（ベクター社製）を５０μｌ加え、３７℃で１５分間放置した。この液を除去した後、酵素希釈液３００μｌで３回洗浄した。発色基質液（１．５ｍＭ ２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホニックアシッド）ジアンモニウム、および０．０１％過酸化水素を含有する０．２Ｍ酒石酸緩衝液（ｐＨ４．４））を加えて、１５分間３７℃で反応させた後、４１５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００７６】
各配列に対応する吸光度は下記の表に示される通りであった。得られた値から、各サンプルのＨＬＡ−Ｃ遺伝子のタイプを判定した。
結果は下記の表６に示される通りであった。
【００７７】
【表６】
例３： ＨＬＡ−ＤＲ抗原遺伝子の検出
前記配列ＤＲ１〜ＤＲ２４で示されるオリゴヌクレオチドプローブを、マイクロタイタープレートに次のようにして固定した。
まず、０．７５Ｍ塩化ナトリウム、０．１５Ｍトリスー塩酸、および０．１５Ｍ塩化マグネシウムからなる溶液（ｐＨ８．０）に前記オリゴヌクレオチドプローブをそれぞれ溶解させ、３００μＭ溶液を調製した。このオリゴヌクレオチド溶液をマイクロタイタープレートに、１ウェルあたり５０μｌずつ加えた。プレートに蓋をして３７℃で１６時間放置した後、洗浄緩衝液（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム、および０．０５％ツイーン２０）を用いて３回洗浄した。
【００７９】
所定のヒト検体由来のヒト白血球より抽出したＤＮＡをサンプル（ＷＡＫ１、ＷＡＫ１８およびＷＡＫ１６０）とし、５’側にビオチン標識した配列ＰＤＲ−ａ、ＰＤＲ−ｂ、ＰＤＲ−ｃおよびＰＤＲ−ｄをプライマーとして、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のイントロン１およびエクソン２を含む領域を、ＰＣＲ法によって４０サイクルの増幅を実施した。得られた増幅物９０μｌを０．２％水酸化ナトリウム３００μｌと混和させ、室温下で５分間放置して変性させた。変性後、それに９００μｌのハイブリダイゼーション溶液を加えて混和させ、これを前記したオリゴヌクレオチドを固定化したウェルに５０μｌずつ加えた。プレートに蓋をして３７℃で１時間放置した。ウェル内の液を棄てた後、各ウェルを酵素希釈液（０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．１Ｍトリスー塩酸、２ｍＭ塩化マグネシウム、および０．０５％ツイーン２０）（ｐＨ７．５）３００μｌを用いて３回洗浄した。液を除去した後、酵素希釈液で１０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識アビジン（ベクター社製）を５０μｌ加え、３７℃で１５分間放置した。この液を除去した後、酵素希釈液３００μｌを用いて３回洗浄した。発色基質液（１．５ｍＭ ２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホニックアシッド）ジアンモニウム、および０．０１％過酸化水素を含有する０．２Ｍ酒石酸緩衝液（ｐＨ４．４））を加えて、１５分間３７℃で反応させた後、４１５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００８０】
各配列に対応する吸光度は下記の表に示される通りであった。得られた値から、各サンプルのＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のタイプを判定した。
結果は下記の表７に示される通りであった。
【００８１】
【表７】
例４： ＨＬＡ−ＤＱ抗原遺伝子の検出
前記配列ＤＱ１〜ＤＱ１７で示されるオリゴヌクレオチドプローブを、マイクロタイタープレートに次のようにして固定した。
まず、０．７５Ｍ塩化ナトリウム、０．１５Ｍトリスー塩酸、および０．１５Ｍ塩化マグネシウムからなる溶液（ｐＨ８．０）に前記オリゴヌクレオチドプローブをそれぞれ溶解させ、３００μＭ溶液を調製した。このオリゴヌクレオチド溶液をマイクロタイタープレートに、１ウェルあたり５０μｌずつ加えた。プレートに蓋をして３７℃で１６時間放置した後、洗浄緩衝液（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム、および０．０５％ツイーン２０）を用いて３回洗浄した。
【００８３】
所定のヒト検体由来のヒト白血球より抽出したＤＮＡをサンプル（ＷＡＫ１、ＷＡＫ１８およびＷＡＫ１６０）とし、５’側にビオチン標識した配列ＰＤＱ−ａ、ＰＤＱ−ｂおよびＰＤＱ−ｃをプライマーとして、ＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子のエクソン２を含む領域を、ＰＣＲ法によって４０サイクルの増幅を実施した。得られた増幅物９０μｌを０．２％水酸化ナトリウム３００μｌと混和させ、室温下で５分間放置して変性させた。変性後、それに９００μｌのハイブリダイゼーション溶液を加えて混和させ、これを前記したオリゴヌクレオチドを固定化したウェルに５０μｌずつ加えた。プレートに蓋をして３７℃で１時間放置した。ウェル内の液を棄てた後、各ウェルを酵素希釈液（０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．１Ｍトリスー塩酸、２ｍＭ塩化マグネシウム、および０．０５％ツイーン２０）（ｐＨ７．５）３００μｌを用いて３回洗浄した。液を除去した後、酵素希釈液で１０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識アビジン（ベクター社製）を５０μｌ加え、３７℃で１５分間放置した。この液を除去した後、酵素希釈液３００μｌを用いて３回洗浄した。発色基質液（１．５ｍＭ ２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホニックアシッド）ジアンモニウム、および０．０１％過酸化水素を含有する０．２Ｍ酒石酸緩衝液（ｐＨ４．４））を加えて、１５分間３７℃で反応させた後、４１５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００８４】
各配列に対応する吸光度は下記の表に示される通りであった。得られた値から、各サンプルのＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のタイプを判定した。
結果は下記の表８に示される通りであった。
【００８５】
【表８】
【配列表】
Claims (23)
- 下記の配列Ｂ１０および／またはＢ１９で示されるオリゴヌクレオチドおよび／またはその相補鎖の一部分または全部を含んでなる、ＨＬＡ−Ｂ抗原の遺伝子のタイピングに用いられるプローブ。
配列Ｂ１０：ＡＣＡＣＡＴＡＴＣＴＧＣＡＡＧＡＣＣＣＡＧ （配列番号１）
配列Ｂ１９：ＧＣＧＧＣＣＣＧＴＧＴＧＧＣＧＧＣＣＣＡＧ （配列番号２） - 下記の配列Ｃ５および／またはＣ１０で示されるオリゴヌクレオチドおよび／またはその相補鎖の一部分または全部を含んでなる、ＨＬＡ−Ｃ抗原の遺伝子のタイピングに用いられるプローブ。
配列Ｃ５：ＡＧＴＣＣＧＡＧＡＧＡＡＧＡＧＣＣＣＣＧＧ （配列番号３）
配列Ｃ１０：ＣＴＣＣＡＧＴＧＧＡＴＧＴＴＴＧＧＡＴＧＣ （配列番号４） - 下記の配列ＤＲ１４および／またはＤＲ２２で示されるオリゴヌクレオチドおよび／またはその相補鎖の一部分または全部を含んでなる、ＨＬＡ−ＤＲ抗原の遺伝子のタイピングに用いられるプローブ。
配列ＤＲ１４：ＧＡＣＡＴＣＣＴＴＧＡＡＧＡＣＧＡＧＣＧＧ （配列番号５）
配列ＤＲ２２：ＧＧＡＣＣＴＣＣＴＴＧＡＴＧＡＣＡＧＧＣＧ （配列番号６） - 下記の配列ＤＱ８および／またはＤＱ１７で示されるオリゴヌクレオチドおよび／またはその相補鎖の一部分または全部を含んでなる、ＨＬＡ−ＤＱ抗原の遺伝子のタイピングに用いられるプローブ。
配列ＤＱ８：ＣＴＧＧＴＧＣＣＧＣＣＴＧＣＣＴＣＣＧＡＧ （配列番号７）
配列ＤＱ１７：ＣＣＧＣＴＧＴＧＧＣＣＴＣＣＴＧＡＣＧＣＣ （配列番号８） - 下記の配列Ｂ１〜Ｂ２４で示されるオリゴヌクレオチドおよび／またはその相補鎖の一部分または全部からなる、ＨＬＡ−Ｂ抗原の遺伝子のタイピングに用いられるプローブセット。
配列Ｂ１： ＴＡＴＴＴＣＴＡＣＡＣＣＧＣＣＡＴＧＴＣＣ （配列番号１７）
配列Ｂ２： ＡＧＴＣＣＧＡＧＧＡＡＧＧＡＧＣＣＧＣＧＧ （配列番号１８）
配列Ｂ３： ＡＧＴＣＣＧＡＧＧＡＣＧＧＡＧＣＣＣＣＧＧ （配列番号１９）
配列Ｂ４： ＡＧＴＣＣＧＡＧＡＧＡＧＧＡＧＣＣＧＣＧＧ （配列番号２０）
配列Ｂ５： ＧＣＧＣＣＧＴＧＧＧＴＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧ （配列番号２１）
配列Ｂ６： ＡＣＡＣＡＧＡＴＣＴＣＣＡＡＧＡＣＣＣＡＧ （配列番号２２）
配列Ｂ７： ＧＡＣＣＧＧＡＡＣＡＣＡＣＡＧＡＴＣＴＡＣ （配列番号２３）
配列Ｂ８： ＣＡＧＡＡＧＴＡＣＡＡＧＣＧＣＣＡＧＧＣＡ （配列番号２４）
配列Ｂ９： ＣＡＧＡＴＣＴＡＣＡＡＧＧＣＣＣＡＧＧＣＡ （配列番号２５）
配列Ｂ１０： ＡＣＡＣＡＴＡＴＣＴＧＣＡＡＧＡＣＣＣＡＧ （配列番号１）
配列Ｂ１１： ＡＣＡＣＡＧＡＴＣＴＴＣＡＡＧＡＣＣＣＡＧ （配列番号２６）
配列Ｂ１２： ＧＣＡＣＡＧＡＣＴＴＡＣＣＧＡＧＡＧＡＧＣ （配列番号２７）
配列Ｂ１３： ＣＧＧＡＡＣＣＴＧＣＧＣＧＧＣＴＡＣＴＡＣ （配列番号２８）
配列Ｂ１４： ＣＴＧＣＴＣＣＧＣＴＡＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧ （配列番号２９）
配列Ｂ１５： ＣＡＣＡＣＴＴＧＧＣＡＧＡＣＧＡＴＧＴＡＣ （配列番号３０）
配列Ｂ１６： ＣＴＣＣＡＧＡＧＧＡＴＧＴＡＣＧＧＣＴＧＣ （配列番号３１）
配列Ｂ１７： ＣＡＴＡＡＣＣＡＧＴＡＣＧＣＣＴＡＣＧＡＣ （配列番号３２）
配列Ｂ１８： ＣＡＴＧＡＣＣＡＧＴＴＣＧＣＣＴＡＣＧＡＣ （配列番号３３）
配列Ｂ１９： ＧＣＧＧＣＣＣＧＴＧＴＧＧＣＧＧＣＣＣＡＧ （配列番号２）
配列Ｂ２０： ＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＧＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧ （配列番号３４）
配列Ｂ２１： ＣＴＧＧＡＧＧＧＣＣＴＧＴＧＣＧＴＧＧＡＧ （配列番号３５）
配列Ｂ２２： ＣＴＧＧＡＧＧＧＣＧＡＧＴＧＣＧＴＧＧＡＧ （配列番号３６）
配列Ｂ２３： ＴＧＧＣＴＣＣＧＣＡＧＡＣＡＣＣＴＧＧＡＧ （配列番号３７）
配列Ｂ２４： ＣＴＣＣＡＧＧＴＧＡＴＧＴＡＴＧＧＣＴＧＣ （配列番号３８） - 下記の配列Ｃ１〜Ｃ２３で示されるオリゴヌクレオチドおよび／またはその相補鎖の一部分または全部からなる、ＨＬＡ−Ｃ抗原の遺伝子のタイピングに用いられるプローブセット。
配列Ｃ１： ＡＡＧＴＡＴＴＴＣＴＴＣＡＣＡＴＣＣＧＴＧ （配列番号３９）
配列Ｃ２： ＡＧＡＧＣＧＡＧＧＣＣＡＧＴＴＡＧＴＧＡＣ （配列番号４０）
配列Ｃ３： ＴＣＣＡＣＡＴＣＣＧＴＧＴＣＣＴＧＧＣＣＣ （配列番号４１）
配列Ｃ４： ＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧＡＡＡＣＴＧＣＧＣ （配列番号４２）
配列Ｃ５： ＡＧＴＣＣＧＡＧＡＧＡＡＧＡＧＣＣＣＣＧＧ （配列番号３）
配列Ｃ６： ＴＧＣＡＧＣＧＣＧＣＡＧＧＴＡＣＣＡＧＧＧ （配列番号４３）
配列Ｃ７： ＧＣＧＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＡＧＣＣＴＡＣ （配列番号４４）
配列Ｃ８： ＧＣＧＧＡＧＣＡＧＣＴＧＡＧＡＧＣＣＴＡＣ （配列番号４５）
配列Ｃ９： ＡＣＣＧＣＴＧＣＧＧＡＣＡＣＧＧＣＧＧＣＴ （配列番号４６）
配列Ｃ１０： ＣＴＣＣＡＧＴＧＧＡＴＧＴＴＴＧＧＡＴＧＣ （配列番号４）
配列Ｃ１１： ＣＡＴＧＡＣＣＡＧＴＴＡＧＣＣＴＡＣＧＡＣ （配列番号４７）
配列Ｃ１２： ＧＧＧＴＡＴＧＡＣＣＡＧＴＡＣＧＣＣＴＡＣ （配列番号４８）
配列Ｃ１３： ＧＧＧＴＡＴＡＡＣＣＡＧＴＴＣＧＣＣＴＡＣ （配列番号４９）
配列Ｃ１４： ＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＣＣＧＧＴＧＡＧＴＧＡ （配列番号５０）
配列Ｃ１５： ＡＧＧＴＣＴＣＡＣＡＴＣＣＴＣＣＡＧＡＧＧ （配列番号５１）
配列Ｃ１６： ＡＡＣＧＧＧＡＡＧＡＡＧＡＣＧＣＴＧＣＡＧ （配列番号５２）
配列Ｃ１７： ＣＴＧＧＡＧＡＡＣＡＧＧＡＡＧＡＡＧＡＣＧ （配列番号５３）
配列Ｃ１８： ＧＣＧＧＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＡＧＣＣＴＡＣ （配列番号５４）
配列Ｃ１９： ＣＧＣＴＴＣＡＴＣＴＣＡＧＴＧＧＧＣＴＡＣ （配列番号５５）
配列Ｃ２０： ＧＣＣＧＣＧＡＧＴＣＣＧＡＧＡＧＧＧＧＡＧ （配列番号５６）
配列Ｃ２１： ＧＣＣＧＣＧＡＧＴＣＣＡＡＧＡＧＧＧＧＡＧ （配列番号５７）
配列Ｃ２２： ＣＴＧＧＡＧＧＧＣＧＡＧＴＧＣＧＴＧＧＡＧ （配列番号５８）
配列Ｃ２３： ＴＴＣＴＡＣＡＣＣＧＣＴＧＴＧＴＣＣＣＧＧ （配列番号５９） - 下記の配列ＤＲ１〜ＤＲ２４で示されるオリゴヌクレオチドおよび／またはその相補鎖の一部分または全部からなる、ＨＬＡ−ＤＲ抗原の遺伝子のタイピングに用いられるプローブセット。
配列ＤＲ１： ＴＴＧＣＴＧＧＡＡＡＧＡＴＧＣＡＴＣＴＡＴ （配列番号６０）
配列ＤＲ２： ＴＧＧＣＡＧＣＣＴＡＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＴ （配列番号６１）
配列ＤＲ３： ＧＡＧＴＡＣＴＣＴＡＣＧＴＣＴＧＡＧＴＧＴ （配列番号６２）
配列ＤＲ４： ＴＴＧＧＡＧＣＡＧＧＴＴＡＡＡＣＡＴＧＡＧ （配列番号６３）
配列ＤＲ５： ＴＣＴＡＣＧＧＧＴＧＡＧＴＧＴＴＡＴＴＴＣ （配列番号６４）
配列ＤＲ６： ＴＧＧＣＡＧＧＧＴＡＡＧＴＡＴＡＡＧＴＧＴ （配列番号６５）
配列ＤＲ７： ＴＴＧＡＡＧＣＡＧＧＡＴＡＡＧＴＴＴＧＡＡ （配列番号６６）
配列ＤＲ８： ＴＴＧＧＡＧＧＡＧＧＴＴＡＡＧＴＴＴＧＡＧ （配列番号６７）
配列ＤＲ９： ＣＧＧＴＴＡＣＴＧＧＡＧＡＧＡＣＡＣＡＴＣ （配列番号６８）
配列ＤＲ１０： ＣＡＧＡＧＡＧＴＧＴＣＴＴＴＧＧＧＧＣＴＣ （配列番号６９）
配列ＤＲ１１： ＣＧＧＣＣＴＧＡＴＧＡＧＧＡＧＴＡＣＴＧＧ （配列番号７０）
配列ＤＲ１２： ＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＣＧＧＡＧＣＡＣＴＧＧ （配列番号７１）
配列ＤＲ１３： ＣＧＧＧＧＣＣＧＧＧＴＧＧＡＣＡＡＣＴＡＣ （配列番号７２）
配列ＤＲ１４： ＧＡＣＡＴＣＣＴＴＧＡＡＧＡＣＧＡＧＣＧＧ （配列番号５）
配列ＤＲ１５： ＣＧＧＣＧＧＧＣＣＣＴＧＧＴＧＧＡＣＡＣＣ （配列番号７３）
配列ＤＲ１６： ＡＣＧＴＣＴＧＡＧＴＧＴＣＡＡＴＴＣＴＴＣ （配列番号７４）
配列ＤＲ１７： ＧＡＧＣＡＧＡＧＧＣＧＧＧＣＣＧＣＣＧＧＴ （配列番号７５）
配列ＤＲ１８： ＣＧＧＴＴＧＣＴＧＧＡＡＡＧＡＴＧＣＡＴＣ （配列番号７６）
配列ＤＲ１９： ＴＡＴＣＡＣＣＡＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＴＧ （配列番号７７）
配列ＤＲ２０： ＡＣＣＡＡＧＡＧＧＡＧＴＣＣＧＴＧＣＧＣＴ （配列番号７８）
配列ＤＲ２１： ＣＧＴＴＴＣＴＴＧＧＡＧＴＡＣＴＣＴＡＣＧ （配列番号７９）
配列ＤＲ２２： ＧＧＡＣＣＴＣＣＴＴＧＡＴＧＡＣＡＧＧＣＧ （配列番号６）
配列ＤＲ２３： ＧＴＧＣＧＧＴＡＴＣＴＧＣＡＣＡＧＡＧＧＣ （配列番号８０）
配列ＤＲ２４： ＣＡＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＴＧＣＧＣＴＴＣ （配列番号８１） - 下記の配列ＤＱ１〜ＤＱ１７で示されるオリゴヌクレオチドおよび／またはその相補鎖の一部分または全部からなる、ＨＬＡ−ＤＱ抗原の遺伝子のタイピングに用いられるプローブセット。
配列ＤＱ１： ＧＡＧＧＧＧＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＴＧ （配列番号８２）
配列ＤＱ２： ＣＧＴＴＡＴＧＴＧＡＣＣＡＧＡＴＡＣＡＴＣ （配列番号８３）
配列ＤＱ３： ＣＧＴＣＴＴＧＴＡＡＣＣＡＧＡＣＡＣＡＴＣ （配列番号８４）
配列ＤＱ４： ＣＧＴＣＴＴＧＴＧＡＣＣＡＧＡＴＡＣＡＴＣ （配列番号８５）
配列ＤＱ５： ＧＧＧＣＧＧＣＣＴＧＴＴＧＣＣＧＡＧＴＡＣ （配列番号８６）
配列ＤＱ６： ＣＣＧＣＴＧＧＧＧＣＧＧＣＴＴＧＡＣＧＣＣ （配列番号８７）
配列ＤＱ７： ＡＧＣＣＡＧＡＡＧＧＡＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧ （配列番号８８）
配列ＤＱ８： ＣＴＧＧＴＧＣＣＧＣＣＴＧＣＣＴＣＣＧＡＧ （配列番号７）
配列ＤＱ９： ＣＴＴＧＴＧＡＧＣＡＧＡＡＧＣＡＴＣＴＡＴ （配列番号８９）
配列ＤＱ１０： ＧＧＧＣＧＧＣＣＴＧＡＴＧＣＣＧＡＧＴＡＣ （配列番号９０）
配列ＤＱ１１： ＧＧＧＡＣＣＧＡＧＣＴＣＧＴＧＣＧＧＧＧＴ （配列番号９１）
配列ＤＱ１２： ＣＴＴＧＴＡＡＣＣＡＧＡＴＡＣＡＴＣＴＡＴ （配列番号９２）
配列ＤＱ１３： ＧＧＧＧＴＧＴＡＴＣＧＧＧＣＧＧＴＧＡＣＧ （配列番号９３）
配列ＤＱ１４： ＧＧＧＡＣＣＧＡＧＣＧＣＧＴＧＣＧＧＧＧＴ （配列番号９４）
配列ＤＱ１５： ＧＧＧＧＴＧＴＡＣＣＧＧＧＣＧＧＴＧＡＣＧ （配列番号９５）
配列ＤＱ１６： ＧＧＧＣＧＧＣＣＴＡＧＣＧＣＣＧＡＧＴＡＣ （配列番号９６）
配列ＤＱ１７： ＣＣＧＣＴＧＴＧＧＣＣＴＣＣＴＧＡＣＧＣＣ （配列番号８） - 下記（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれか２以上のグループからそれぞれ選択されるプローブを含んでなる、プローブセット：
（ｉ）請求項１に記載のプローブ、
（ｉｉ）請求項２に記載のプローブ、
（ｉｉｉ）請求項３に記載のプローブ、および
（ｉｖ）請求項４に記載のプローブ。 - 核酸試料と、請求項１または５に記載のオリゴヌクレオチドおよび／またはその相補鎖の一部または全部との相補性の有無を検出することを含んでなる、ＨＬＡ−Ｂ抗原の遺伝子のタイピング法。
- 核酸試料が、下記の配列ＰＢ−ａ、ＰＢ−ｂ、ＰＢ−ｃおよびＰＢ−ｄ：
配列ＰＢ−ａ：ＡＧＣＧＡＧＧＧＧＡＣＣＧＣＡＧＧＣＧＧＧ （配列番号９７）
配列ＰＢ−ｂ：ＣＧＴＡＣＧＴＧＧＧＧＧＡＴＧＧＧＧＡＧＴ （配列番号９８）
配列ＰＢ−ｃ：ＣＣＧＧＣＧＡＧＡＧＣＣＣＣＡＧＧＣＧＣＧ （配列番号９９）
配列ＰＢ−ｄ：ＡＧＧＣＣＡＴＣＣＣＣＧＧＣＧＡＣＣＴＡＴ （配列番号１００）
で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーとして増幅されたものである、請求項１０に記載のＨＬＡ−Ｂ抗原の遺伝子のタイピング法。 - 核酸試料と、請求項２または６に記載のオリゴヌクレオチドおよび／またはその相補鎖の一部または全部との相補性の有無を検出することを含んでなる、ＨＬＡ−Ｃ抗原の遺伝子のタイピング法。
- 核酸試料が、下記の配列ＰＣ−ａ、ＰＣ−ｂ、ＰＣ−ｃおよびＰＣ−ｄ：
配列ＰＣ−ａ：ＣＧＡＧＧＧＧＣＣＣＧＣＣＣＧＧＣＧＡＧＧ （配列番号１０１）
配列ＰＣ−ｂ：ＣＧＴＣＣＧＴＧＧＧＧＧＡＴＧＧＧＧＡＧＧ （配列番号１０２）
配列ＰＣ−ｃ：ＧＡＧＴＣＴＣＣＣＧＧＴＣＴＧＡＧＡＴＣＣ （配列番号１０３）
配列ＰＣ−ｄ：ＡＧＡＴＧＧＧＧＡＡＧＧＣＴＣＣＣＣＡＣＴ （配列番号１０４）
で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーとして増幅されたものである、請求項１２に記載のＨＬＡ−Ｃ抗原の遺伝子のタイピング法。 - 核酸試料と、請求項３または７に記載のオリゴヌクレオチドおよび／またはその相補鎖の一部または全部との相補性の有無を検出することを含んでなる、ＨＬＡ−ＤＲ抗原の遺伝子のタイピング法。
- 核酸試料が、下記の配列ＰＤＲ−ａ、ＰＤＲ−ｂ、ＰＤＲ−ｃおよびＰＤＲ−ｄ：
配列ＰＤＲ−ａ：ＴＣＧＴＧＴＣＣＣＣＡＣＡＧＣＡＣＧＴ （配列番号１０５）
配列ＰＤＲ−ｂ：ＣＣＧＣＴＧＣＡＣＴＧＴＧＡＡＧＣＴＣＴ （配列番号１０６）
配列ＰＤＲ−ｃ：ＧＧＴＧＧＧＴＧＣＴＧＴＴＧＡＡＧＧＴＡ （配列番号１０７）
配列ＰＤＲ−ｄ：ＴＧＣＧＧＧＡＡＡＡＣＣＣＣＴＴＣＴＣＡ （配列番号１０８）
で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーとして増幅されたものである、請求項１４に記載のＨＬＡ−ＤＲ抗原の遺伝子のタイピング法。 - 核酸試料と、請求項４または８に記載のオリゴヌクレオチドおよび／またはその相補鎖の一部または全部との相補性の有無を検出することを含んでなる、ＨＬＡ−ＤＱ抗原の遺伝子のタイピング法。
- 核酸試料が、下記の配列ＰＤＱ−ａ、ＰＤＱ−ｂ、およびＰＤＱ−ｃ：
配列ＰＤＱ−ａ：ＧＴＧＣＴＡＣＴＴＣＡＣＣＡＡＣＧＧＧＡＣ （配列番号１０９）
配列ＰＤＱ−ｂ：ＧＡＧＧＡＴＣＣＣＧＣＧＧＴＡＣＧＣＣＡＣ （配列番号１１０）
配列ＰＤＱ−ｃ：ＡＡＧＧＴＣＧＴＧＣＧＧＡＧＣＴＣＣＡＡＣ （配列番号１１１）
で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーとして増幅されたものである、請求項１６に記載のＨＬＡ−ＤＱ抗原の遺伝子のタイピング法。 - 下記（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される少なくとも２種以上のタイピング方法を実施することを含んでなる、ＨＬＡの検出方法：
（ａ）請求項１０または１１に記載のＨＬＡ−Ｂ抗原の遺伝子のタイピング法、（ｂ）請求項１２または１３に記載のＨＬＡ−Ｃ抗原の遺伝子のタイピング法、（ｃ）請求項１４または１５に記載のＨＬＡ−ＤＲ抗原の遺伝子のタイピング法、および
（ｄ）請求項１６または１７に記載のＨＬＡ−ＤＱ抗原の遺伝子のタイピング法。 - ＨＬＡ−Ｂ抗原の遺伝子タイピング用キットであって、
固相担体と、標識プライマーとを含んでなり、前記固相担体には、請求項１または５に記載のオリゴヌクレオチドおよび／またはその相補鎖の一部または全部を含む一本鎖核酸が固定されてなり、該オリゴヌクレオチドおよびその相補鎖のそれぞれは１またはそれ以上繰り返していてもよく、
前記標識プライマーが請求項１１に記載の配列ＰＢ−ａ、ＰＢ−ｂ、ＰＢ−ｃおよびＰＢ−ｄで表される配列を含んでなるプライマーであることを特徴とする、キット。 - ＨＬＡ−Ｃ抗原の遺伝子タイピング用キットであって、
固相担体と、標識プライマーとを含んでなり、前記固相担体には、請求項２または６に記載のオリゴヌクレオチドおよび／またはその相補鎖の一部または全部を含む一本鎖核酸が固定されてなり、該オリゴヌクレオチドおよびその相補鎖のそれぞれは１またはそれ以上繰り返していてもよく、
前記標識プライマーが請求項１２に記載の配列ＰＣ−ａ、ＰＣ−ｂ、ＰＣ−ｃおよびＰＣ−ｄで表される配列を含んでなるプライマーであることを特徴とする、キット。 - ＨＬＡ−ＤＲ抗原の遺伝子タイピング用キットであって、
固相担体と、標識プライマーとを含んでなり、前記固相担体には、請求項３または７に記載のオリゴヌクレオチドおよび／またはその相補鎖の一部または全部を含む一本鎖核酸が固定されてなり、該オリゴヌクレオチドおよびその相補鎖のそれぞれは１またはそれ以上繰り返していてもよく、
前記標識プライマーが請求項１３に記載の配列ＰＤＲ−ａ、ＰＤＲ−ｂ、ＰＤＲ−ｃおよびＰＤＲ−ｄで表される配列を含んでなるプライマーであることを特徴とする、キット。 - ＨＬＡ−ＤＱ抗原の遺伝子タイピング用キットであって、
固相担体と、標識プライマーとを含んでなり、前記固相担体には、請求項４または８に記載のオリゴヌクレオチドおよび／またはその相補鎖の一部または全部を含む一本鎖核酸が固定されてなり、該オリゴヌクレオチドおよびその相補鎖のそれぞれは１またはそれ以上繰り返していてもよく、
前記標識プライマーが請求項１４に記載の配列ＰＤＱ−ａ、ＰＤＱ−ｂ、およびＰＤＱ−ｃで表される配列を含んでなるプライマーであることを特徴とする、キット。 - 請求項１〜４のいずれか一項記載のプローブまたは請求項５〜８のいずれか一項に記載のプローブセットを含んでなる、ＨＬＡ抗原の遺伝子タイピング用キット。
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