JP2022502045A - ロード可能な検出分子を使用したハイスループットのエピトープ同定及びt細胞受容体特異性決定 - Google Patents
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Abstract
Description
i.少なくとも1つのペプチドフリーMHCクラスI分子及び少なくとも1つの検出可能な標識を含むロード可能な検出分子を用意すること、
ii.少なくとも1つの抗原ペプチドを用意すること、
iii.ロード可能な検出分子を少なくとも1つの抗原ペプチドと接触させて、少なくとも1つのペプチド−MHC(pMHC)クラスI分子を含むロード済み検出分子を形成すること、
iv.ロード済み検出分子を試料と接触させること、並びに
v.ロード済み検出分子の1つ又は複数の抗原ペプチド応答性T細胞への結合を検出することを含み、
少なくとも1つの抗原ペプチドはそれぞれ、
−少なくとも2つの異なる検出可能な標識、又は
−核酸標識である少なくとも1つの検出可能な標識
によって表される。
(a)少なくとも1つのペプチドフリーMHCクラスI分子及び核酸標識を含む少なくとも2つのロード可能な検出分子、又は
(b)各ロード可能な検出分子が異なる検出可能な標識を含み、少なくとも3つの少なくとも1つのペプチドフリーMHCクラスI分子及び少なくとも1つの検出可能な標識を含むロード可能な検出分子を含む。
i.本明細書に記載の少なくとも1つのペプチドフリーMHCクラスI分子及び核酸標識を含むロード可能な検出分子又は組成物、
ii.少なくとも1つの抗原ペプチド、並びに
iii.任意選択で、使用説明書を含む。
i.少なくとも1つのペプチドフリーMHCクラスI分子及び核酸標識を含むロード可能な検出分子を用意すること、
ii.抗原ペプチドのライブラリーを用意すること、
iii.ロード可能な検出分子を抗原ペプチドのライブラリーと接触させて、ペプチド−MHC(pMHC)クラスI分子を含むロード済み検出分子のライブラリーを形成すること、
iv.T細胞受容体(TCR)又は抗原ペプチド応答性T細胞をロード済み検出分子のライブラリーと接触させること、及び
v.T細胞受容体(TCR)又は抗原ペプチド応答性T細胞とロード済み検出分子のライブラリーの結合を検出することを含む。
本発明をさらに詳しく論じる前に、まず以下の用語や慣例(conventions)を定義する。
本発明の文脈では、「検出分子」という用語は、抗原ペプチドと、T細胞受容体(TCR)又は抗原ペプチド応答性T細胞との間の相互作用を検出するために使用され得る実体を指す。
本発明の文脈では、「MHC」という用語は主要組織適合性複合体を指し、その主な機能が、病原体に由来する抗原ペプチドと結合し、それらを適切なT細胞による認識のために細胞表面に提示することあるタンパク質複合体である。
本発明の文脈では、「ペプチドフリーMHCクラスI分子」という用語は、抗原ペプチドが結合していないMHCクラスI分子を指す。「ペプチドフリーMHCクラスI分子」、「空のMHCクラスI分子」及び「ペプチド受容性MHCクラスI分子」という用語は、本明細書において互換的に使用される。
本発明の文脈では、「pMHC」という用語は、抗原ペプチドに結合している上記で定義されたMHC分子を指す。「pMHC」という用語は、抗原ペプチドに結合している野生型MHC又はCys変異体MHCのいずれかを指しうる。
本発明の文脈では、「変異体システイン残基」という用語は、MHCクラスI分子の重鎖に人為的に導入されたシステイン残基を指す。したがって、変異体システイン残基は、対応する野生型MHCクラスI分子の重鎖には存在しない。
本発明の文脈では、「抗原ペプチド」という用語は、主要組織適合性複合体(MHC)分子に結合してペプチド−MHC(pMHC)複合体を形成できるペプチドを指す。pMHC複合体は、抗原ペプチドを免疫細胞に提示して、T細胞受容体依存性の免疫応答を誘発することができる。MHC分子はMHCクラスI分子でありうる。
本発明の文脈では、「エピトープ」という用語は、T細胞のTCR又は医薬候補物質などの別の結合相手によって認識される抗原決定基を意味する。pMHCによって提示されるエピトープは、いかなる異物に対しても高い特異性をもち、TCRとの相互作用は、ペプチド−MHC−指向性方式での特異的なT細胞の効果的な増殖及び機能的な刺激を確実にする。
本発明の文脈では、「ライブラリー」という用語は、複数の実体を指す。したがって、ライブラリーは、異なる抗原ペプチド又は核酸標識の複数(又はコレクション)であることができる。
本発明の文脈では、「検出可能な標識」という用語は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、又は化学的手段によって検出可能な部位を指す。検出可能な標識は、試料中の結合した検出可能な部分の量を定量するために使用できる、蛍光シグナル、放射性シグナル、発色性シグナルなどの測定可能なシグナルを生成することができる。検出可能な標識はまた、核酸標識などの、シークエンシングによって解読されうる分子コード化標識であってもよい。
本発明の文脈では、「試料」という用語は、T細胞の集団を含む任意の溶液又は固体画分を指す。T細胞集団には、異なる特異性をもつT細胞が入っている可能性がある。
本発明の文脈では、「コネクター分子」という用語は、検出分子の一部であり、1つ又は複数のMHC分子に結合している分子実体を指す。コネクター分子は、MHC分子上に位置するアフィニティータグに非共有結合的に結合することができる。
本発明の文脈では、「アフィニティータグ」という用語は、MHC分子上に位置する部位を指す。アフィニティータグは、コネクター分子に非共有相互作用で非常に特異的に結合する。アフィニティータグの例としては、ビオチン、抗体エピトープ、Hisタグ、ストレプトアビジン、ストレプトタクチン、ポリヒスチジン、ペプチド、ハプテン、及び金属イオンキレートなどが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の文脈では、「非共有相互作用」という用語は、共有結合以外の相互作用を介した任意の結合を意味する。非共有結合は、例えば疎水性相互作用、親水性相互作用、イオン相互作用、ファンデルウォール力、水素結合、及びそれらの組み合わせによって形成されうる。
本発明の文脈では、「バーコード領域」という用語は、核酸標識の一部を形成する領域を指す。バーコード領域は、増幅及び/又はシーケンシングの際に、核酸標識が付いた検出分子を識別するために使用できるコードとして機能する多数の連続した核酸を含む。
本発明の文脈では、「ユニークな分子識別子(UMI)領域」という用語は、増幅に続いて特定の配列のオリゴヌクレオチドソースの初期数を決定するために使用できる核酸標識の領域を指す。UMI領域は、2〜4、4〜6、6〜8、又は8〜10個のヌクレオチド塩基を含みうるランダムな配列である。非常に大きなライブラリーの場合、UMI領域は10個より多い塩基を含むこともある。
本発明の文脈では、「固体基材」という用語は、検出分子が結合できる任意の種類の不溶性材料を指す。検出分子は、固体基材に共有結合又は可逆的に結合することができる。固体基材に結合している検出分子は、過剰な試薬又は溶媒から(濾過、クロマトグラフィー、遠心分離などによって)容易に分離することができる。
本発明の文脈では、「配列同一性」という用語は、ここでは、遺伝子又はタンパク質間の、それぞれヌクレオチド、塩基又はアミノ酸レベルでの配列同一性として定義される。具体的には、DNA配列の転写物が同一のRNA配列に転写されうる場合、DNA配列とRNA配列は同一であるとみなされる。
ペプチド−主要組織適合複合体(pMHC)クラスI及びII分子のT細胞媒介認識は、細胞内病原体及び癌がんの制御、並びに効率的な細胞傷害性応答の刺激及び維持に極めて重要である。そのような相互作用はまた、自己免疫疾患の発症にも関与している可能性がある。この機構への新しい洞察は、疾患発症を理解し、新しい治療戦略を確立するために極めて重要である。Altman et al. (1996)による最初の報告が、pMHCクラスI分子の四量体化はT細胞受容体(TCR)−pMHC相互作用に十分な安定性をもたらし、フローサイトメトリーを用いたMHCマルチマー結合T細胞の検出を可能にすることを示して以来、MHCマルチマーが抗原応答性T細胞の検出に使用されてきた。pMHC−TCR相互作用のスクリーニングのための迅速で信頼性の高いプラットフォームを提供することを目的として、数多くの方法が開発されてきた。MHCマルチマーに基づいたさまざまな種類の標識を含む検出分子が検討されてきた。
i.少なくとも1つのペプチドフリーMHCクラスI分子及び少なくとも1つの検出可能な標識を含むロード可能な検出分子を用意すること、
ii.少なくとも1つの抗原ペプチドを用意すること、
iii.ロード可能な検出分子を少なくとも1つの抗原ペプチドと接触させて、少なくとも1つのペプチド−MHC(pMHC)クラスI分子を含むロード済み検出分子を形成すること、
iv.ロード済み検出分子を試料と接触させること、並びに
v.ロード済み検出分子の1つ又は複数の抗原ペプチド応答性T細胞への結合を検出することを含み、
少なくとも1つの抗原ペプチドがそれぞれ、
−少なくとも2つの異なる検出可能な標識、又は
−核酸標識である少なくとも1つの検出可能な標識
によって表される方法に関する。
(a)配列番号1、又は
(b)(a)の配列と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含み、
そのアミノ酸配列が、アルファ−1ドメインに配置された変異体システイン残基とアルファ−2ドメインに配置された変異体システイン残基を含む本明細書に記載の方法に関する。
(a)配列番号1、又は
(b)(a)の配列と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、若しくは少なくとも99%の配列同一性などの(a)の配列と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含み、又はその配列からなり、
前記(said)アミノ酸配列が、アルファ−1ドメインに配置された変異体システイン残基とアルファ−2ドメインに配置された変異体システイン残基を含む本明細書に記載の方法に関する。
(a)配列番号12若しくは配列番号13のいずれか1つ、又は
(b)(a)の配列のいずれか1つと少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む本明細書に記載の方法に関する。
(a)配列番号2〜13のいずれか1つ、又は
(b)(a)の配列のいずれか1つと少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列を含み、
そのアミノ酸配列が、アルファ−1ドメインに配置された変異体システイン残基とアルファ−2ドメインに配置された変異体システイン残基を含む本明細書に記載の方法に関する。
(a)配列番号2〜13のいずれか1つ、又は
(b)(a)の配列のいずれか1つと少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、若しくは少なくとも99%の配列同一性などの(a)の配列のいずれか1つと少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含み、又はその配列からなり、
そのアミノ酸配列が、アルファ−1ドメインに配置された変異体システイン残基とアルファ−2ドメインに配置された変異体システイン残基を含む本明細書に記載の方法に関する。
(a)配列番号2〜11のいずれか1つ、又は
(b)(a)の配列のいずれか1つと少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む本明細書に記載の方法に関する。
(a)配列番号2〜6のいずれか1つ、又は
(b)(a)の配列のいずれか1つと少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む本明細書に記載の方法に関する。
(a)配列番号2、又は
(b)(a)の配列と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む本明細書に記載の方法に関する。
(a)配列番号2、又は
(b)(a)の配列と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、若しくは少なくとも99%の配列同一性などの(a)の配列と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む、又はその配列からなる本明細書に記載の方法に関する。
(a)配列番号15、又は
(b)(a)の配列と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む本明細書に記載の方法に関する。
(a)配列番号16、又は
(b)(a)の配列と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む本明細書に記載の方法に関する。
(a)配列番号14、又は
(b)(a)の配列と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む本明細書に記載の方法に関する。
さらに、核酸標識は、特定の配列のオリゴヌクレオチドソースの初期数を推定するために使用することができる領域を含んでいてもよい。したがって、本発明の一実施形態は、少なくとも1つの検出可能な標識が、
i.5’第1のプライマー領域(フォワード)、バーコード領域及び3’第2のプライマー領域(リバース)、並びに
ii.ランダムヌクレオチド塩基からなるユニークな分子識別子(UMI)領域を含む核酸標識であり、
そのバーコード領域が、検出分子の識別タグとして機能するユニークなバーコードである本明細書に記載の方法に関する。
i.少なくとも1つのペプチドフリーMHCクラスI分子及び少なくとも1つの検出可能な標識を含むロード可能な検出分子を用意すること、
ii.少なくとも1つの抗原ペプチドを用意すること、
iii.ロード可能な検出分子を少なくとも1つの抗原ペプチドと接触させて、少なくとも1つのペプチド−MHC(pMHC)クラスI分子を含むロード済み検出分子を形成すること、
iv.ロード済み検出分子を試料と接触させること、並びに
v.ロード済み検出分子の1つ又は複数の抗原ペプチド応答性T細胞への結合を検出することを含み、
少なくとも1つの抗原ペプチドがそれぞれ、少なくとも2つの異なる検出可能な標識によって表される方法に関する。他の態様のいずれか1つの文脈で記載された実施形態及び特徴はすべて、この特定の態様にも適用される。
i.少なくとも1つのペプチドフリーMHCクラスI分子及び少なくとも1つの核酸標識を含むロード可能な検出分子を用意すること、
ii.少なくとも1つの抗原ペプチドを用意すること、
iii.ロード可能な検出分子を少なくとも1つの抗原ペプチドと接触させて、少なくとも1つのペプチド−MHC(pMHC)クラスI分子を含むロード済み検出分子を形成すること、
iv.ロード済み検出分子を試料と接触させること、並びに
v.ロード済み検出分子の1つ又は複数の抗原ペプチド応答性T細胞への結合を検出することを含む方法に関する。
i.少なくとも1つのペプチドフリーMHCクラスI分子及び少なくとも1つの核酸標識を含むロード可能な検出分子を用意すること、
ii.少なくとも1つの抗原ペプチドを用意すること、
iii.ロード可能な検出分子を少なくとも1つの抗原ペプチドと接触させて、少なくとも1つのペプチド−MHC(pMHC)クラスI分子を含むロード済み検出分子を形成すること、
iv.ロード済み検出分子を試料と接触させること、
v.ロード済み検出分子の1つ又は複数の抗原ペプチド応答性T細胞への結合を検出すること、並びに
vi.少なくとも1つのpMHCクラスI分子の同一性を決定することを含む方法に関する。
(a)配列番号1、又は
(b)(a)の配列と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、若しくは少なくとも99%の配列同一性などの(a)の配列と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含み、又はその配列からなり、
前記アミノ酸配列が、アルファ−1ドメインに配置された変異体システイン残基とアルファ−2ドメインに配置された変異体システイン残基を含む本明細書に記載のロード可能な検出分子に関する。
(a)配列番号2〜13のいずれか1つ、又は
(b)(a)の配列と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、若しくは少なくとも99%の配列同一性などの(a)の配列と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含み、
そのアミノ酸配列は、アルファ−1ドメインに配置された変異体システイン残基とアルファ−2ドメインに配置された変異体システイン残基を含む本明細書に記載のロード可能な検出分子に関する。
i.5’第1のプライマー領域(フォワード)、バーコード領域及び3’第2のプライマー領域(リバース)、並びに
ii.ランダムヌクレオチド塩基からなるユニークな分子識別子(UMI)領域を含む核酸標識であり、
そのバーコード領域は、検出分子の識別タグとして機能するユニークなバーコードである。
(a)少なくとも2つの本明細書に記載のロード可能な検出分子、又は
(b)少なくとも3つの、少なくとも1つの本明細書に記載のペプチドフリーMHCクラスI分子及び少なくとも1つの検出可能な標識を含むロード可能な検出分子
を含み、各ロード可能な検出分子は異なる検出可能な標識を含む。
i.本発明に記載のロード可能な検出分子又は本明細書に記載の組成物、
ii.少なくとも1つの抗原ペプチド、及び
iii.任意選択で、使用説明書
を含む。
i.本明細書に記載のロード可能な検出分子を用意すること、
ii.抗原ペプチドのライブラリーを用意すること、
iii.ロード可能な検出分子を抗原ペプチドのライブラリーと接触させて、ペプチド−MHC(pMHC)クラスI分子を含むロード済み検出分子のライブラリーを形成すること、
iv.T細胞受容体(TCR)又は抗原ペプチド応答性T細胞を、ロード済み検出分子のライブラリーと接触させること、及び
v.T細胞受容体(TCR)又は抗原ペプチド応答性T細胞とロード済み検出分子のライブラリーとの結合を検出することを含む。
ここでは、wt(野生型)MHCクラスI分子とCys変異体MHCクラスI分子の作製法と本発明による検出分子を作る方法について説明する。この実施例では、野生型MHC及びジスルフィドで安定化したCys変異体MHCの両方を用意し、検出分子の組み立てに使用する。
この実施例では、検出分子を用いて健常なドナーのPBMCから抗原特異的CD8+T細胞を検出する方法を詳述し、検出分子はCys変異体MHC分子を用いて調製される。Cys変異体MHC分子を用いて調製した検出分子は、検出されたすべての抗原特異的T細胞特異性に関して、野生型MHCモノマーから調製した検出分子と比較して、染色指数として算出して有意に明るい染色が得られる。これは、異なる色のフルオロフォアでも一貫して見られた。図1では、フローサイトメトリーのデータを用いて、健常なドナーPBMC試料での抗原特異的T細胞検出について、野生型及びCys変異体MHCモノマーでそれぞれ調製した検出分子を比較している。
この実施例では、試料中の複数のT細胞特異性を検出するために、コンビコーディングと呼ばれる検出分子の組み合わせ設定を適用する利点を示す。コンビコーディングは、従来の野生型MHC検出分子と比較して、Cys変異体MHC検出分子に特に有利である。複数の抗原を検出するために、1つのフルオロフォアタグが、1つの抗原のみに特異的な第2のフルオロフォアタグと組み合わせて使用され、それによって各抗原特異性に対してユニークな2色の組み合わせが形成すされる組み合わせ設定において、Cys変異体/野生型検出分子のより良好な染色指数比が見られることが示されている。大きなペプチドライブラリーをコンビコーディングによってスクリーニングするとき、検出分子陽性T細胞の明確な分離は、特に抗原特異的T細胞が希で、所与の抗原ペプチドとMHCの組み合わせに対する親和性が低い場合に、大きな細胞プールからのより良好な同定を容易にする。コンビコーディング技術は、Hadrup et al. (2009)及び国際公開第2010/060439A1号によって以前に記載されている。
この実施例は、大きな抗原ライブラリーをスクリーニングして抗原特異的なCD8T細胞を同定するために、Cys変異体MHCを用いて検出分子を作製する迅速な方法を示す。野生型MHC分子と違って、Cys変異体MHC分子は安定性が高く、ペプチドを受容する性質があるので、これらの空のモノマーは迅速に検出可能な分子に変換することができる(図6A)。この方法は、−20℃で保存できるロード可能な検出分子を生成することを含む。これらのロード可能な検出分子は、ワンステップのインキュベーションによって、選択した抗原ペプチドをロードすることができる。この実施例は、このプロセスがわずか1分で達成でき、そのような抗原ペプチド特異的検出分子はT細胞検出において機能的に活性を有することを示している。
この実施例は、Cys変異体MHC検出分子が野生型MHC検出分子と比較して非常に安定していることを示す。抗原特異的MHC検出分子のより高い安定性は、特に低親和性の抗原に対して、T細胞検出のためのコンビコーディング法やバーコーディング法を用いた場合にT細胞検出が向上する。
この実施例では、バーコード付きのCys変異体MHC分子と野生型MHC分子の検出分子を用いた抗原特異的T細胞の検出を記載する。バーコード法は、各種類のpMHC検出分子に結合したユニークな短い核酸配列をバーコードとして利用する。この方法は、核酸バーコード付きT細胞検出分子を用いて、数千の抗原ペプチドをシングルポットアッセイでスクリーニングすることができる。この技術は、Bentzen et al. (2016)及び国際公開第2015/188839A2号において以前に記載されている。
この実施例では、T細胞受容体(TCR)のフィンガープリントを決定するためのCys変異体MHC分子の使用を記載する。TCRフィンガープリントは、TCR−pMHC相互作用の詳細及びT細胞認識における各残基の重要性を提供する。この実施例は、Cys変異体MHC分子が、野生型MHC分子を用いて同定したTCRフィンガープリントと同等に、TCRフィンガープリントを同定することを示す。
Hadrup et al. (2009), Nat. Methods. 6, 520−526
国際公開第2010/060439A1号
Bentzen et al. (2016), Nat. Biotechnol. 34, 1037−1045
国際公開第2015/188839A2号
Altman et al. (1996), Science, 274, 94−96
Claims (20)
- 試料中の1つ又は複数の抗原ペプチド応答性T細胞を検出するための方法であって、以下のステップ:
i.少なくとも1つのペプチドフリーMHCクラスI分子及び少なくとも1つの検出可能な標識を含むロード可能な検出分子を用意すること、
ii.少なくとも1つの抗原ペプチドを用意すること、
iii.ロード可能な検出分子を少なくとも1つの抗原ペプチドと接触させて、少なくとも1つのペプチド−MHC(pMHC)クラスI分子を含むロード済み検出分子を形成すること、
iv.前記ロード済み検出分子を前記試料と接触させること、並びに
v.前記ロード済み検出分子の前記1つ又は複数の抗原ペプチド応答性T細胞への結合を検出すること
を含み、
少なくとも1つの抗原ペプチドがそれぞれ、
−少なくとも2つの異なる検出可能な標識、又は
−核酸標識である少なくとも1つの検出可能な標識、
によって表され、
前記ペプチドフリーMHCクラスI分子が、ジスルフィド架橋によって連結されたアルファ−1ドメイン及びアルファ−2ドメインを含む重鎖を含み、前記重鎖が、
(a)配列番号1、又は
(b)(a)の配列と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含み、
変異体システイン残基が前記アルファ−1ドメインにおいてアミノ酸残基84又は85に配置され、かつ変異体システイン残基がアルファ−2ドメインにおいてアミノ酸残基139に配置される方法。 - 前記ペプチドフリーMHCクラスI分子が、コネクター分子と前記ペプチドフリーMHCクラスI分子上のアフィニティータグとの間の非共有相互作用によって前記コネクター分子に結合する請求項1に記載の方法。
- 前記コネクター分子がストレプトアビジンであり、前記アフィニティータグがビオチンである請求項2に記載の方法。
- 前記ロード可能な検出分子が、少なくとも3つのペプチドフリーMHCクラスI分子など、少なくとも2つのペプチドフリーMHCクラスI分子、好ましくは4つのペプチドフリーMHCクラスI分子を含む請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ロード可能な検出分子が、ストレプトアビジンと各ペプチドフリーMHCクラスI分子上のビオチン標識との間の非共有相互作用を介してストレプトアビジンに結合した4つのペプチドフリーMHCクラスI分子を含む請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの検出可能な標識が前記コネクター分子に結合している請求項2〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、少なくとも10個、少なくとも15個、少なくとも20個、少なくとも25個、少なくとも50個、少なくとも100個の異なる抗原ペプチドなどの、少なくとも2つの異なる抗原ペプチドがステップii)で用意される請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの抗原ペプチドが少なくとも2つの異なる検出可能な標識によって表され、前記ロード済み検出分子の前記1つ又は複数の抗原ペプチド応答性T細胞への結合が、前記ロード済み検出分子を通して抗原応答性T細胞に結合された前記少なくとも2つの異なる検出可能な標識の存在を検出することによって検出される請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも2つの異なる検出可能な標識が、蛍光マーカー、放射性同位体、磁気マーカー及び金属標識からなる群より選択される請求項8に記載の方法。
- 前記少なくとも2つの異なる検出可能な標識が蛍光マーカーである請求項8及び9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも2つの異なる検出可能な標識が金属標識である請求項8及び9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの検出可能な標識が、
i.5’第1のプライマー領域(フォワード)、バーコード領域及び3’第2のプライマー領域(リバース)、並びに
ii.ランダムヌクレオチド塩基からなるユニークな分子識別子(UMI)領域
を含む核酸標識であり、
前記バーコード領域が、前記検出分子の識別タグとして機能するユニークなバーコードである
請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。 - 少なくとも1つのペプチドフリーMHCクラスI分子及び核酸標識を含むロード可能な検出分子であって、
前記ペプチドフリーMHCクラスI分子が、ジスルフィド架橋によって連結されたアルファ−1ドメイン及びアルファ−2ドメインを含む重鎖を含み、前記重鎖が、
(a)配列番号1、又は
(b)(a)の配列と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含み、
変異体システイン残基が前記アルファ−1ドメインにおいてアミノ酸残基84又は85に配置され、かつ変異体システイン残基がアルファ−2ドメインにおいてアミノ酸残基139に配置されるロード可能な検出分子。 - 前記核酸標識が請求項12に画定されている通りである請求項13に記載のロード可能な検出分子。
- 前記ロード可能な検出分子が、ストレプトアビジンと各ペプチドフリーMHCクラスI分子上のビオチン標識との間の非共有相互作用を介してストレプトアビジンに結合した4つのペプチドフリーMHCクラスI分子を含む前述の請求項13及び14のいずれか一項に記載のロード可能な検出分子。
- 試料中の1つ又は複数の抗原ペプチド応答性T細胞を検出するための組成物であって、
(a)請求項13〜15のいずれか一項に記載の少なくとも2つのロード可能な検出分子、又は
(b)各ロード可能な検出分子が異なる検出可能な標識を含み、それぞれが少なくとも1つのペプチドフリーMHCクラスI分子及び少なくとも1つの検出可能な標識を含む少なくとも3つのロード可能な検出分子
を含み、
前記ペプチドフリーMHCクラスI分子が、ジスルフィド架橋によって連結されたアルファ−1ドメイン及びアルファ−2ドメインを含む重鎖を含み、前記重鎖が、
(a)配列番号1、又は
(b)(a)の配列と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含み、
変異体システイン残基が前記アルファ−1ドメインにおいてアミノ酸残基84又は85に配置され、かつ変異体システイン残基がアルファ−2ドメインにおいてアミノ酸残基139に配置される組成物。 - 試料中の1つ又は複数の抗原ペプチド応答性T細胞を検出するための、請求項13〜15のいずれか一項に記載のロード可能な検出分子又は請求項16に記載の組成物の使用。
- 試料中の1つ又は複数の抗原ペプチド応答性T細胞を検出するためのキットであって、
i.請求項13〜15のいずれか一項に記載のロード可能な検出分子又は請求項16に記載の組成物、
ii.少なくとも1つの抗原ペプチド、及び
iii.任意選択で、使用説明書
を含むキット。 - T細胞受容体(TCR)又は抗原ペプチド応答性T細胞と抗原ペプチドのライブラリーの間の相互作用を決定するための方法であって、以下のステップ:
i.請求項13〜15のいずれか一項に記載のロード可能な検出分子を用意すること、
ii.抗原ペプチドのライブラリーを用意すること、
iii.前記ロード可能な検出分子を前記抗原ペプチドのライブラリーと接触させて、ペプチド−MHC(pMHC)クラスI分子を含むロード済み検出分子のライブラリーを形成すること、
iv.前記T細胞受容体(TCR)又は抗原ペプチド応答性T細胞を前記ロード済み検出分子のライブラリーと接触させること、及び
v.前記T細胞受容体(TCR)又は抗原ペプチド応答性T細胞と前記ロード済み検出分子のライブラリーの結合を検出すること
含む方法。 - T細胞受容体(TCR)又は抗原ペプチド応答性T細胞と抗原ペプチドのライブラリーの間の相互作用を決定するための請求項13〜15のいずれか一項に記載のロード可能な検出分子の使用。
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