JP2001515362A

JP2001515362A - ｍＲＮＡをクローニングする方法および差次的に発現された転写物のディスプレイ（ＤＯＤＥＴ）

Info

Publication number: JP2001515362A
Application number: JP54871398A
Authority: JP
Inventors: ヴァートー，ペーター・ロルフ
Original assignee: ディスプレイ・システムズ・バイオテック・アクティーゼルスカブ
Priority date: 1997-05-13
Filing date: 1998-05-13
Publication date: 2001-09-18
Also published as: DE69801749D1; DE69801749T2; ES2163271T3; ATE205879T1; EP1138764A2; DK0981609T3; PT981609E; WO1998051789A3; EP0981609B1; WO1998051789A2; EP1138764A3; AU7206498A; EP0981609A2; WO1998051789A9

Abstract

(57)【要約】本発明は、サンプル中に含まれるｍＲＮＡのコード化領域から増幅されたｃＤＮＡ断片の標準化された細別化ライブラリーの調製方法に関する。本発明の課題は、細胞内、特に真核細胞内の発現パターンを研究する新規方法および新規手段を提供することである。このような研究の結果を、薬物の開発、遺伝子の発見、疾患の診断などに用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】ｍＲＮＡをクローニングする方法および差次的に発現された転写物のディスプレイ（ＤＯＤＥＴ）発明の背景ヒトの体は主として、器官および組織を構成する種々の生理機能を行う分化した細胞からなる。すべてのヒト細胞は、遺伝子として知られる一連のサブユニットに配列されているＤＮＡを含む。ヒトゲノムには約１００，０００遺伝子が存在すると見積もられている。遺伝子はタンパク質の青写真である。タンパク質は種々の広範な生物学的機能を果たし、例えば伝達子、触媒およびセンサーとして働く。この化合物はヒトおよび他のすべての生物におけるほとんどの生理的および生物学的機能の統御を請け負う。ここ数十年にわたって、多くの主要な疾患が遺伝的基礎を有するものであるという認識が発達してきた。現在、遺伝子は、ガン、心臓血管疾患、精神障害、肥満および代謝疾患において重要な役割を果たすことが十分に立証されている。特定の遺伝子のヌクレオチド配列およびその予想されるタンパク質産物が、健康な細胞または組織ならびに機能不全の細胞または組織におけるその機能の理解を導くという見解に基づくゲノムの研究に大きな財源が集中している。この理解は、その後、遺伝子およびそれが発現するタンパク質に関する分子標的に焦点を合わせた治療および診断的アプローチを導くことが期待される。このような応用を開発する方法の第一段階は、種々のカテゴリーの疾患に特異的に関与する遺伝子の同定である。この知識を適用すれば、主要な疾患を生じさせる領域を同定し、診断的および治療的利益のために用いることができる新規かつ価値のあるマーカーを作成することができる。ヒトゲノムの高度な複雑さに直面し、多くのアプローチは遺伝子の一次構造と機能の関連を解明するのに用いられている。１つの周知のアプローチは、ヒトゲノムマッピングプロジェクトに具体化されており、ここでは、全ヒトゲノムにおけるすべての個々の遺伝子の配列が労をおしまずに決定されている。しかし現在、同定された遺伝子の機能に関する情報を直接引き出すことはほとんどできず、まして、発生途上の生物または成熟した生物の時間的および空間的な発現パターンを直接引き出すことはほとんどできない。ランダムｃＤＮＡ配列決定のような他のアプローチは生物のある組織または発生段階で発現されたすべての遺伝子の配列を決定することを含む。たくさんの他のストラテジーと同様に、これには時間がかかり、多くの問題を抱えがちである。大規模な配列決定プログラムから得られる氾濫するデータは、科学界にとって巨大な利益であるが、「ショットガン」アプローチが直面しているような主要な問題の１つは、より重大な労力を費やすことなしに引き出すことができる、それぞれの個々の遺伝子の生物学に関する具体的な情報の欠如である。分子生物学者は、特定の生物学的過程の遺伝的背景に関するより具体的な情報を得るためにいくつかの他のアプローチをとってきた。このようなアプローチは普遍的概念に依存している。１つの遺伝子または１サブセットの遺伝子のスイッチをオンにし、器官または細胞タイプの健康状態、病的状態または発生状態を開始させる。たくさんの実験系において、その差次的発現(differential expression)に基づく遺伝子の単離は首尾よく適用されてきた。ｃＤＮＡライブラリーの差異(差次)スクリーニング（differential screening）および差し引きハイブリダイゼーション（subtractive hybridisation）は十分に確立している。Zimmerman et al．(1980)and Davis et al．(1979)参照。差異ライブラリースクリーニングは高度に発現されている遺伝子に対して行う場合には十分に機能するが、少量のｍＲＮＡを単離するのは困難である。差し引きハイブリダイゼーションはより感度のよいスクリーニングを提供するが、大量のＲＮＡを必要とする。より最近では、これらのツールにＲＮＡフィンガープリント法（しばしば、ディファレンシャルディスプレイまたはＤＤ／ＲＴＰＣＲと称される）が加えられ、遺伝子を単離するための新規の興味深い特徴を提供する。ＲＮＡフィンガープリント法はＰＣＲに基づくものであり、それゆえ実験のために大量のＲＮＡを必要としない。これに加えてＲＮＡフィンガープリント法では、特定のｍＲＮＡ群について多数のＲＮＡプールを同時にスクリーニングすることができる。広範な病原性発生段階の研究およびその制御が可能であるだろう。今日までに、２つのＲＮＡフィンガープリント法が遺伝子の単離に有用であることが証明されている。Welshら（1 992）のプロトコルが発表された直後、１９９２年にLiangらはプロトコルを公表した（米国特許第５，２６２，３１１号）。両方法は、第一および第二鎖の合成を開始するための少なくとも１つの任意のプライマーを用いて、ＲＮＡからｃＤＮＡを合成することから開始される。 Welshら（1992）は、第一および第二鎖の合成に同じ任意の２０量体オリゴを用いるプロトコルを設計した。任意のプライマーを用い、唯一のサブセットのｍＲＮＡ群をｃＤＮＡに転写する。次いでｃＤＮＡプールを、同じプライマーを用いる標準的ＰＣＲ用に用いる。ＰＡＧＥを用いるＰＣＲ断片の視覚化のため、ＰＣＲ混合物中のｄＮＴＰ群の１つは放射性ラベル（³⁵Ｓまたは³²Ｐ）を含む。Li angおよびWelsh法は、特異的ｃＤＮＡ群の選択用の少なくとも１つの小さな任意のプライマーに依存する。結果として、アニーリング温度は低く（〜４０℃）、すべての増幅されたｃＤＮＡ断片はある程度のミスマッチプライマー結合から開始されたものである。後にいくつかのグループが洗練および最適化を行い、この方法の有用性を記載するたくさんの論文が発表された（Bauer and Warthoe et a l．1993;Warthoe et al．1995;Liang and Warthoe et al．1995;Rohde and Wart hoe et al．1996）。発明の課題細胞、特に真核細胞における発現パターンを研究する新規方法および手段を提供することが本発明の課題である。このような研究の結果は、薬物の開発、遺伝子の発見、疾患の診断などに用いることができ、それゆえこの改良された方法は非常に望ましいものである。発明の要旨最も広い範囲では、本発明は、サンプル中に含まれるｍＲＮＡのコード化領域から増幅されたｃＤＮＡ断片の細別化されたライブラリーを調製する方法であって、以下の工程を含むものに関する：（ａ）一般式：５’−Ｃｏｎ₁−ｄＴ_n2−Ｖ_n3−Ｎ_n4−３’ ［式中、Ｃｏｎ₁は１−１００ヌクレオチドの範囲の任意の配列であり、ｄＴはデオキシチミジニルであり、ＶはＡ、ＧまたはＣであり、ＮはＡ、Ｇ、Ｃまたはで示される少なくとも１つのｃＤＮＡプライマーを用いて、サンプル由来のｍＲＮＡを逆転写し、ｃＤＮＡ断片の第一の鎖を得、（ｂ）ＤＮＡｐｏｌＩ酵素またはＤＮＡｐｏｌＩ酵素のクレノー断片、４つすべてのデオキシリボヌクレオシド三リン酸を含み、標準的な緩衝液および温度条件の適当な酵素／緩衝溶液中、第一鎖ＤＮＡ断片を鋳型として用い、一般式：５’−Ｃｏｎ₂−Ｎ_x−３’ ［式中、Ｃｏｎ₂は１−１００ヌクレオチドの範囲の任意の配列であり、ｃｏｎ₁ と異なるか、あるいは同じであり得、Ｎ_xはＡ、Ｇ、ＴまたはＣであり、ｘはで示される第二のｃＤＮＡプライマーを用いて、第一鎖ｃＤＮＡ断片と相補的な第二鎖ｃＤＮＡを合成し、二重鎖ｃＤＮＡ断片を得、（ｃ）工程（ｂ）で得られたｃＤＮＡ断片を、一般式：５’−Ｃｏｎ₃−Ｎ_n1−３’ Ｉ［式中、Ｃｏｎ₃はＣｏｎ₁またはＣｏｎ₂あるいは両方と同一の配列であり、Ｎで示される１セットの増幅プライマーであって、少なくとも１つのセットのプライマーがｎ＞０である一般式Ｉで示され、該少なくとも１つのセットが、Ｃｏｎ₁ またはＣｏｎ₂とその５’末端が相補的な任意のヌクレオチド配列の増幅をプライミング（開始）することができる１セットの増幅プライマーを用いる分子増幅手法にかけ、増幅されたｃＤＮＡ断片を得る。この方法は非常に少量のＲＮＡを増幅するのに有益である。本発明の方法を用いて、総ＲＮＡが１０^-9グラムに等しい１００個の細胞（ＲＮＡ１０ｐｇ／細胞）より少量から、遺伝子プロファイル分析を行うことが可能である。さらなる側面では、本発明は、サンプル中に含まれる（原核生物、始原細菌または真核生物起源であり得る）ｍＲＮＡのコード化領域から増幅されたｃＤＮＡ断片の細別されたライブラリーを製造する方法であって、以下の工程を含むものに関する：（ａ）少なくとも１つのｃＤＮＡプライマーを用いてサンプル由来のｍＲＮＡを逆転写し、第一鎖ｃＤＮＡ断片を得、（ｂ）第一鎖ＤＮＡ断片を鋳型として用いて、第一鎖ｃＤＮＡ断片と相補的な第二鎖ｃＤＮＡを合成し、二重鎖ｃＤＮＡ断片を得、（ｃ）二重鎖ｃＤＮＡ断片を少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼで消化し、開裂されたｃＤＮＡ断片を得、（ｄ）工程（ｃ）で得られた開裂されたｃＤＮＡ断片に少なくとも２つのアダプター断片を連結し、連結されたｃＤＮＡ断片を得、ならびに、（ｅ）工程（ｄ）で得られた連結されたｃＤＮＡ断片を、工程（ｄ）で用いたアダプター断片に対する、一般式：５’−Ｃｏｍ−Ｎ_n1−３’ ＩＩ［式中、Ｃｏｍは少なくとも開裂されたｃＤＮＡ断片の３’末端に連結されているアダプター断片の５’末端に対して相補的な配列であり、ＮはＡ、Ｇ、Ｔまたで示される１セットの増幅プライマーであって、少なくとも１つのセットのプライマーはｎ１＞０である一般式ＩＩで示され、該少なくとも１つのセットが、Ｃｏｍに対してその５’末端が相補的なアダプター断片に対して、その３’末端で連結された任意のヌクレオチド配列の増幅をプライム（開始）することができるセットの増幅プライマーを用いる分子増幅手法に付し、増幅されたｃＤＮＡ断片を得る。先行技術と比べて本発明の総合的な利点は、得られたｃＤＮＡ断片のライブラリーが工程（ａ）で製造されたｃＤＮＡのすべての部分由来の核酸配列を含むことである。ポリｄＴｃＤＮＡプライミングに依存する先行技術では、ｍＲＮＡの長い非翻訳領域由来の断片を生ずるのみである傾向を有する。さらに本発明の方法では、各工程における条件の細かい調節によって、ｍＲＮＡ、さらには比較的少量しか存在しないｍＲＮＡ中に存在する配列情報が高度に特異的に再現される。さらに、エンドヌクレアーゼ（群）の最適な組成を選択することによって、関連する細胞中において転写された遺伝子総数の非常に高いパーセンテージからＤＮＡ断片を得ることができる。本発明の方法は、関心ある遺伝子の配列に対応するプライマーの組み合わせを用いて、既知の遺伝子の標的化された視覚化を可能にする。これは、本手法および生物系のすべての工程を容易に証明することができるという利点を有する。また、非常に高い相同性を有する関連する遺伝子に対し、ハイブリダイゼーション技術を用いても達成できなかった非常に特異的な発現分析を行うことができる。簡単には、本発明のさらなる工程は、ゲルから関心あるバンドを単離し、クローニングし、配列決定することを含む。この配列情報により、適当な３−４ヌクレオチドエクステンション（extensions）を有するプライマーを用いて、個々のバンドを再増幅することが可能になる。ゲル上、これらの反応物を泳動すると、レーン当たり１つまたはほんの２、３のバンドが認められ、バンドの同一性が明白に決定される。本発明の技術は視覚化に末端ラベル化プライマーを用いるため、本技術は、放射能を用いる標準的技術とともに、または蛍光ラベル化プライマーとともに、さらに最適化する必要なしに用いることができる。本発明はまた、種々の条件に付された細胞における発現量の差異の検出方法、疾患の診断方法、および上記方法の産物と、十分に定義された核酸ストレッチへの対応処理のコンピューターシミュレーションによって得られるデータを組み合わせて用いる「バイオ情報科学」に関する方法に関する。本発明の別の部分は、逆転写を行う新規方法であって、かなり質の高い逆転写産物を生じさせる方法に関する。また、この本発明の別の部分を実施する手段を開示する。以下に、本特許出願中で用いる用語について短い論考を示す：本明細書中、「増幅されたｃＤＮＡ断片の細別されたライブラリー」とは、たくさんのプールに分離された、増幅されたｃＤＮＡ断片のライブラリーであって、各プールが増幅された断片の末端の配列によって規定されているライブラリーである。例えば、あるプールは、すべて一方の鎖に配列５’−Ｃｏｍ−ＡＧＣ− を有することで特徴付けられる増幅された断片を含むが、一方もう１つのプールは、一方の鎖に配列５’−Ｃｏｍ−ＡＡＴを有する増幅された断片を含む。「Cｏｎ」および「Ｃｏｍ」の意味に関する論考については、以下を参照。「標準化ライブラリー(normalized library)」とは、実質的に等量の各ｍＲＮＡを含む、すなわちおよそ同じコピー数の各ｍＲＮＡを含むライブラリーである。「逆転写」は、当分野におけるその通常の意味を有し、すなわちＲＮＡを鋳型として用い、逆転写酵素活性を有する酵素によって行われるＤＮＡの合成である。「アダプター断片」とは、次の分子増幅手法、例えばＰＣＲにおいて、プライマーに対する鋳型として用いることができる既知の配列を含む核酸配列を意味することを意図したものである。アダプター断片はさらに、工程（ｃ）において、制限エンドヌクレアーゼで前もって開裂されたｃＤＮＡ断片の末端に統合されるその能力によって特徴付けられる。ほとんどの場合、制限エンドヌクレアーゼは「接着末端」を有する断片を残し、これに対してアダプター断片は容易にアニーリングし、次いでアダプター断片はＤＮＡリガーゼの働きによってｃＤＮＡに連結される。発明の詳細な説明以下では、各工程の効果（impact）を詳細に説明する。（図１および図７を参照）。工程（ａ）工程（ａ）の目的は、後の工程を行うため、その組成を最適化した第一鎖ｃＤＮＡ断片の混合物を製造することである。たくさんの要件が考慮される：まず第一に、「バックグラウンドノイズ」を減少させるため、工程（ａ）におけるｃＤＮＡプライマーとＲＮＡとのアニーリングは高度に厳密な条件下、すなわち５０℃以上の温度で行い、ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡ中に導入されるミスマッチを確実に最小にするのが好ましい。第二に、ｍＲＮＡの翻訳される部分に関する情報を得るため、ｍＲＮＡのすべての部分由来の配列のコピーを得るのが望ましい。先行技術において真核生物物質を逆転写する方法では、しばしばポリｄＴをｃＤＮＡプライマーとして利用した。しかし、このストラテジーは、最も効率的に逆転写された物質が関心ある遺伝子の非翻訳部分に位置するという不利益を有する。したがって、例えばＰＣＲ手法の後に「目に見える」ｍＲＮＡの唯一の部分は、このＲＮＡの非翻訳領域由来であることが非常に多くなる。その理由として２つのことが影響している。まず第一に、ポリｄＴのアプローチによれば、逆転写の開始部位が問題となるオペロンに関して、例えば出発コドンから非常に離れて位置する結果となる。第二に、ｍＲＮＡは、逆転写をブロックする構造（例えば鎖内塩基対形成による「ヘアピン」構造）を含むことがあり、常に遺伝子の１つの末端で逆転写が開始されることによって、該構造は統計学的にたくさんの翻訳領域の逆転写をブロックすることである。本発明では、工程（ａ）において、翻訳領域を含む遺伝子全体を表すｃＤＮＡ群を確実に製造することが好ましい。これをたくさんの方法によって得ることができる。ボリｄＴプライマー化（またはそのバリエーション）を用いる場合、高い温度、例えば約４５℃〜約９５℃ の範囲で逆転写を行い、該温度で逆転写酵素活性を有する酵素を用いるのが好ましい。一般には、この温度は４５℃以上、例えば少なくとも５０℃、またはさらに高い温度、例えば少なくとも５５℃、少なくとも６０℃、少なくとも６５℃またはさらに高い温度、例えば少なくとも７０℃である。このアプローチは、高い温度が逆転写工程の間に、例えばヘアピン構造を「伸ばし」、該構造の上流の逆転写される断片の欠如を確実に回避するという効果を有する。このような高い温度で逆転写酵素活性を有する既知の酵素は、好熱性ユーバクテリア由来のＤＮＡポリメラーゼ、例えばポリメラーゼＴａｑ（Thermus aquati cus）、Ｓｔｏｆｆｅｌ（Thermus aquaticus）、Ｔｈｔ（Thermus thermophilus ）、Ｔｆｌ／Ｔｕｂ（Thermus flavus）、Ｔｒｕ（Thermus Ruber）、Ｔｃａ（T hermus caldophilus）、Ｔｆｉｌ（Thermus filiformis）、Ｔｂｒ（Thermus Br ockianus）、Ｂｓｔ（B．Stearothermophilus）、Ｂｃａ（B．Caldotenax YT-G ）、Ｂｃａｖ（B．Caldovelox YT-F）、ＦｊＳＳ３−Ｂ．１（Thermotoga FjSS3 -B.1）、Ｔｍａ（Thermus Maritima）、ＵＩＴｍａ（T．Maritima）、Ｔｌｉ（T ．Litoralis）、Ｔｌｉｅｘｏ−（T．Litoralis）、９°Ｎ−７（Thermococcus sp.）、ＢＧ−Ｄ（Pyrococcus sp.）、Ｐｆｕ（P． furiosus）、Ｐｗｏ（P．woesei）、Ｓａｃ（S．Acidocaldarius）、ＳｓｏＩ（ S．Solfataricus）、Ｔａｃ（T．Acidophi-lum）およびＭｔｈ（Methananococcu s Voltae）からなる群から選択される酵素である。これらの熱安定酵素を用いることの１つの小さな不利益は、これらが「伝統的な」熱安定でない逆転写酵素と比べて比較的効率的でない傾向を有することである。したがって、特に逆転写のプライミングがポリｄＴプライマーの使用に限定されないならば、本発明にしたがい、熱安定でない逆転写酵素を使用することができる。したがって、他の好ましい態様では、約２５℃〜約５５℃の範囲の温度において、該温度で逆転写酵素活性を有する酵素を使用して逆転写を行う。一般に、この温度は５０℃を超えず、通常はより低く、例えば最大４７℃、最大４５ ℃、最大４３℃、最大４０℃ならびに最大３５℃である。逆転写酵素は例えば、ＡＭＶ（Avian Myeloblastosis Virus）、Ｍ−ＭｕＬＶ（murine M-MuLV pol ge ne）およびＨＩＶ−１（HIV virus）由来の逆転写酵素からなる群から選択され得る。本発明では、工程（ａ）を実行する最も好ましい方法は、次の２工程による逆転写である：第一の工程は熱安定でない酵素に関して上で記載した温度条件で逆転写を行うことを特徴とし、第二の工程は、熱安定な酵素に関して上で記載した温度条件で逆転写を行うことを特徴とする。特に第二の工程に移行するときに導入される温度の上昇によって、熱安定でない酵素は不活化されるため、これは一般に逆転写反応に２つの非同一の酵素を存在させることによって達成される。もちろん、各反応工程の間にこの酵素を加えることができるが、両酵素は反応の開始から存在するのが好ましい。第一の工程において活性な酵素の活性が、第二の工程において（例えば、この酵素の温度変性の結果として）実質的に完全に破壊されるか、あるいは、第二の工程において、第一の工程で用いられた酵素が実質的に不活性であることが特に好ましい。一般に、各工程で用いられる酵素は、他の酵素が用いられる温度範囲におけるより、関連する温度範囲で実質的に活性であるのが好ましい。好ましい態様では、サンプルを含む反応混合物はサンプル中に存在する標的ＲＮＡに対してハイブリダイズし、該標的ＲＮＡと相補的な一本鎖ｃＤＮＡ分子の合成を開始するのに十分に相補的であるｃＤＮＡプライマーを含み、さらにこの反応混合物は、４つすべてのデオキシリボヌクレオシド三リン酸およびＭｇ²⁺およびＭｎ²⁺の群から選択される二価のカチオンを０．１〜５ｍＭの濃度で含有する適当な緩衝液を含む。実際には、逆転写を行うための上記ストラテジーは、異なる最適温度を有する２つの酵素であって、一方がＲＮＡの妨害構造を「伸ばす」最適温度を有する酵素を使用することにより、本来的に新規であり、発明性のあるものと考えられる。本発明のこの態様における酵素の好ましい組み合わせは、第一の工程で逆転写を行う酵素がＭＭｕＬＶ、ＡＭＶ、ＨＩＶ−１であり、ならびに／あるいは第二の工程で逆転写を行う酵素がＴｔｈまたはＴａｑであるものである。本発明の方法の目的は生産されたｃＤＮＡの細別物(subdivision)を得ることである。真核生物系からｍＲＮＡを得る場合、少なくとも１つのｃＤＮＡプライマーは５’末端にオリゴｄＴ尾部またはポリｄＴ尾部を含み、一般式：５’−ｄＴ_n2−Ｖ_n3−Ｎ_n4−３’ ［式中、ｄＴはデオキシチミジニルであり、ＶはＡ、ＧまたはＣであり、ＮはＡ、の整数である。］で示される。ｎ３およびｎ４が両方とも０である場合、このプライマーは通常のポリｄＴまたはオリゴｄＴｃＤＮＡプライマーであることが明らかである。しかし、ｎ３が１である場合、このプライマーは事実上、ポリＡ尾部を有する任意のｍＲＮＡの逆転写をプライマー化することができるプライマー組成物である。元になるＲＮＡサンプルを細別し、各サブプールを、上記式（式中、ｎ３は１である）で示される可能なプライマーの１つを用いる逆転写に付すると、５’末端が互いに異なるたくさんの一本鎖ｃＤＮＡプールを生じる。例えば、ｎ３が１である場合、３×４ⁿ⁴群のｃＤＮＡプライマーが用いられ、構造：−Ｖ_n3−Ｎ_n4−に関し、各群は他のどの群ともはっきり区別される。この態様では、ｍＲＮＡのプールを３×４ⁿ⁴部分に都合よく細別し、これをそれぞれ別々に、３×４ⁿ⁴群のｃＤＮＡプライマーのうち１つを用いる工程（ａ）に付し、これにより３×４ⁿ⁴の別々のプール中へ第一鎖ｃＤＮＡを細別したものを得る。一般に、ｎ４は０または１であり、その結果、それぞれ３または１２プールが調製される。出発物質が真核生物由来でない場合、あるいは転写された遺伝子の、翻訳出発コドンから最も遠い部分から出発することを必ずしも意図しない場合、少なくとも１つのｃＤＮＡプライマーが５’末端にポリｄＴ尾部またはオリゴｄＴ尾部を含まないか、あるいは別法として、少なくとも１つが５’末端にポリｄＴ尾部またはオリゴｄＴ尾部を含み、少なくとももう１つが５’末端にポリｄＴ尾部またはオリゴｄＴ尾部を含まない少なくとも２つのｃＤＮＡプライマーを用いる。好ましくは、５’末端にポリｄＴ尾部またはオリゴｄＴ尾部を含まないｃＤＮＡプライマーは以下の構造を有する：５’−Ｎ_xＴＴΛ−３’または５’−Ｎ_xＣＴＡ−３’または５’−Ｎ_xＴＣＡ− ３’れが任意の翻訳終止コドンから出発するｃＤＮＡプライミングに対応することは明らかである。１つのポリｄＴ尾部プライマーまたはオリゴｄＴ尾部プライマーを用いる上記態様に関して、終止コドンに先行する任意の可能な配列に対応させるために基：Ｎ_xで示されるすべての可能な順列を有するプライマーを製造することによって、プライマーを作成し、これにより、その配列中に終止コドンを有するすべての配列を確実にプライミングすることが可能である。工程（ｂ）この工程は当分野に周知の方法によって行われる。しかし工程（ｂ）は、第一のｃＤＮＡ鎖と第二のｃＤＮＡ鎖のヌクレオチド間のミスマッチの形成を最小にする条件下で行うのが好ましい。Sambrook et al．(1989)に記載の標準的方法にしたがい、二重鎖ｃＤＮＡ手法を行うことができる。しかし標準的ポリメラーゼでは二次構造を含む、あるいは高いＧＣ含量を有する領域の合成が困難であり得るため、熱安定性ＲＮアーゼＨ（Hybridase Thermostable RNase H，US 5,268,2 89）およびBacillus stearothermophilus由来の熱安定性ｒＢｓｔＤＮＡポリメラーゼを用いて、標準的ポリメラーゼ（低温ポリメラーゼ）が被る制限のいくつかを克服する。工程（ｃ）本発明の１つの態様では、増幅されたｃＤＮＡ断片を得るため、工程（ｂ）で得られた、連結されたｃＤＮＡ断片を、以下の一般式で示される１セットの増幅プライマーを用いる分子増幅手法に付する：５’−Ｃｏｎ₃−Ｎ_n1−３’ Ｉ［式中、Ｃｏｎ₃はＣｏｎ₁またはＣｏｎ₂のどちらかあるいは両方と同一の配列なくとも１つのセットのプライマーは、ｎ＞０である一般式Ｉで示され、該少なくとも１つのセットは、Ｃｏｎ₁またはＣｏｎ₂とその５’末端が相補的な任意のヌクレオチド配列の増幅をプライム（開始）することができるものである。］もう１つの態様では、ｍＲＮＡの製造および場合により細別化の後に、ｃＤＮＡの種々のプールをそれぞれ、少なくとも１つの制限酵素で消化し、適当なサイズフラクション化（サイズ分画）法を用いて分離できるサイズの断片を調製する。制限酵素の選択は、与えられたｃＤＮＡプール中の開裂部位の頻度に大きく依存する。各ｃＤＮＡ断片中の開裂部位があまりにも多い場合には、あまりにも小さな断片を生じ、その逆もある。最適には、少なくとも１つの酵素がすべてのｃＤＮＡを開裂させ、所望のサイズの断片を生じさせるべきである。統計学的に、すべてのｃＤＮＡを開裂させることは不可能であるが、適当な酵素または酵素の組み合わせを選択することによって非常に高いパーセンテージのｃＤＮＡを開裂させることができる。本発明の方法は少なくとも１つの制限酵素を利用して、少なくとも６０％のｃＤＮＡを確実に開裂させるのが好ましいが、より高いパーセンテージ、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％または少なくとも８５％でさえあるのがより好ましい。好ましくは、工程（ｄ）におけるアダプター断片の導入を大きく促進するために、本発明は、工程（ｃ）の消化後、該ＤＮＡの末端に突き出した末端（接着末端）を生じさせる制限酵素を用いるべきである。上記からわかるように、制限エンドヌクレアーゼが開裂させる頻度が重要である。それぞれの完全なｃＤＮＡを平均約３つの断片に開裂させるような少なくとも１つの制限酵素を選択するのが好ましい。先行工程から得られたｃＤＮＡのいくつかは全く切断されない（制限酵素（群）を慎重に選択した場合、これはまれにしか起こらないが）のに対して、他のものは高頻度で切断される場合のあることが理解されよう。少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼとして、微量４塩基カッター（a rare 4 base cutter）(例えば、４塩基カッターＡｃｉＩ、ＡｌｕＩ、ＢｆａＩ、ＢｓｔＵＩ、Ｃｓｐ６Ｉ、ＤｐｎＩ、ＤｐｎＩＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、ＨｐａＩＩ、ＭｂｏＩ、ＭｎｌＩ、ＭｓｅＩ、ＭｓｐＩ、ＮｌａＩＩＩ、ＲｓａＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、ＴａｉＩ、ＴａｑＩおよびＴｓｐ５０９Ｉ)を用いることによって本発明方法の最適な実行が確実になることがわかった。このような微量４塩基カッターを用いることにより、工程（ｃ）では制限酵素１つだけの使用で十分であり、よりすぐれた産出物を生じる。別法として、例えば６塩基カッターおよび４塩基カッターをつり合わせ、断片サイズの妥当な分布を確実にする制限エンドヌクレアーゼの組み合わせを用いることができる。例えば、統計学的にｍＲＮＡサンプル由来の完全なｃＤＮＡの少なくとも２０％を２つのサブ断片に開裂させる第一の制限酵素（例えば６塩基カッター）、ならびに統計学的に少なくとも５０％の該サブ断片を３つのさらなるサブ断片に開裂させる第二の制限酵素（例えば４塩基カッター）を使用することにより、後のサイズフラクション化に適当な一連の断片が得られる。工程（ｄ）次に、工程（ｃ）で得られた混合物（群）を、得られた二重鎖ｃＤＮＡ断片の両端にアダプター断片を加える反応に付する。上述のように、突き出した末端に対して適合する、前もって設計されたアダプター断片は容易に製造することができるので、手法のこの部分は、突き出した「接着」末端を有する、開裂されたｃＤＮＡ断片によって大きく促進される。次の工程における「無秩序中の秩序」を得るため、開裂された断片にアダプター（またはアンカー）断片を加える。開裂された断片の末端に既知の配列を加えることによって、アダプター断片を伴う配列を増幅させる目的で特別に設計することができる特異的な増幅プライマーの標的を創出する。連結されたアダプター配列と相補的なプライマーを用いて、このように得られた物質（第一の鋳型）を前もって増幅させ、第二の鋳型を得ることができる。第一の鋳型を前もって増幅させることにより、繰り返し単離する必要なしに、１つのＲＮＡ調製物から製造される事実上無制限の量の鋳型を得ることができる。したがってアダプター配列は、例えばＰＣＲ反応におけるＤＮＡ重合の出発点として働くように選択される。アダプター配列は、該アダプターの連結後に特異的エンドヌクレアーゼ部位が再生されることがないように構築する。好ましい態様では、少なくとも１つの終結断片(termination fragment)であって、該少なくとも１つの終結断片から出発する５’→３’方向のＤＮＡ重合に対するブロック（阻害）を導入し、分子増幅手法中、工程（ｅ）における少なくとも２つのプライマーセットのいずれのプライマーともアニーリングし得ない、少なくとも１つの終結断片をも一本鎖の開裂されたｃＤＮＡ断片の３’末端に連結する。増幅工程において、プライマーペアの１つのメンバーのみがラベルされており、他方はアダプター断片に近接するその塩基組成にしたがって増幅された産物を分離するように設計されているラベル化プライマーによって行う検出の使用と組合せた場合、上記手法は非常に重要な手法である。１つの重要な特徴は、終結断片を与えられた一本鎖ｃＤＮＡ断片は、そのような断片が鋳型である第一ラウンドの重合の産物に対してアニーリングすることができるプライマーが存在しないため、増幅されないことである。図７参照。第二に、このアプローチは、次の検出段階でバックグラウンド「ノイズ」を除去する可能性を柘くことになる。一般に、少なくとも１つの終結断片は、化学的に修飾されたヌクレオチド配列、例えば３’末端にジデオキシヌクレオチドを含むヌクレオチド配列であるか、あるいはそれを含み、この終結技術は、例えばSangerの鎖終結配列決定法（the chain-termination sequencing technique）から周知である。一般的な環境下、本発明では、増幅の次のラウンドの間にジデオキシヌクレオチドが喪失するのを回避するため、ジデオキシヌクレオチドはヌクレオチド鎖に共有結合しているべきである。ジデオキシヌクレオチドがリン酸化されている場合、優れた安定化が達成される。上述のように、工程（ｄ）では、工程（ｃ）の開裂から得られたｃＤＮＡの接着末端とアダプター断片をアニーリングし、この生成物を、ＤＮＡリガーゼ活性を有する酵素の作用に付することによって、開裂されたｃＤＮＡ断片に対するアダプターおよび／または終結断片の連結を都合よく達成する。当分野に既知の任意の適当なＤＮＡリガーゼを用いることができる。工程（ｅ）本発明の方法の工程（ｅ）は、工程（ｄ）から得られた修飾ｃＤＮＡ断片を最終的に分類する。本発明の最も広い態様では、工程（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）をまとめるので、工程（ｅ）は上記本態様の工程（ｃ）に対応する。工程（ｂ）で得られた合成の二重鎖ｃＤＮＡ断片または工程（ｄ）で得られたあらかじめ定められたサブセットのアダプター化断片を選択的に増幅するため、式Ｉ（工程ｃ）またはＩＩ（工程ｅ）の構造を有するプライマーを設計する。これを行うことができるたくさんの方法を構想することができるが、主要なストラテジーは、１つの反応における１つのプライマーのヌクレオチド配列が、その反応で増幅された生成物が他のいずれの反応から得られたものとも異なること、およびすべての反応が工程（ｂ）または（ｄ）それぞれから得られたすべての断片の増幅を導くことを確実にするようなやり方で一連の別々の反応において増幅を開始させることである。式Ｉまたは式ＩＩで示される少なくとも１つの七ットの増幅プライマーにおいヌクレオチド伸展物をカバーするために反応に用いられるたくさんのプライマー断片を容易に管理できるので、該プライマーの１つにおいてはｎ１＝１、ｎ１＝２、ｎ１＝３またはｎ１＝４であるのが好ましい。例えば、ｎ１＝５である場合、関連するアダプター断片に近接するすべての可能なヌクレオチド配列を増幅させるためには４⁵＝１０２４の異なるプライマーを用いる必要があり、そして本発明の好ましい態様では、各プライマーを各反応において用いることを必要とするため、関与する作業量が問題になる。また、増幅された断片の決定を促進するために、プライマーの１つでは、ｎ＝０であるのが好ましく、そしてこのプライマーはラベルされているのが特に好ましい。したがって、本発明の最も好ましい態様では、（すべての反応において通常は同一である）ラベルされたプライマーおよびｎ＞１の上記プライマーセットの一員である少なくとも１つのラベルされていないプライマーを用い、多数の別個の反応において、アダプター化されたｃＤＮＡ断片を増幅する。ｎ１＞０である式Ｉまたは式ＩＩで示されるこのセットの増幅プライマーは、基：Ｎ_n1中、Ａ、Ｇ、ＴおよびＣのすべての可能な組み合わせおよび配列を含み、このセットにより、すべての可能なｃＤＮＡ断片を確実に増幅することができるのが好ましい。したがって、工程（ｅ）での分子増幅の前に、連結されたｃＤＮＡ断片をたくさんのプールに細別化し、増幅プライマーセットのサブセットを用いて各プールを増幅し、最も好ましい態様では工程（ｄ）で得られる連結されたｃＤＮＡ断片を、４ⁿ¹プールに細別し、これをそれぞれ別々に、上記１つのラベル化増幅プライマー（ｎ１＝０）および上記増幅プライマーセット由来の１つのプライマー（ｎ＞０）であって、他の任意のプールを増幅するのに用いられるいずれのプライマーとも区別できるものを用いる工程（ｅ）に付する。このアプローチを用いることによって、初めに逆転写され、開裂されたｃＤＮＡ断片を、それぞれさらなる工程に付することができる４ⁿ¹プールに細別される。さらなる工程および適用現在、上記一連の反応から得られた物質をたくさんの方法で利用することができる。一般に、分子増幅手法から得られた、増幅された断片のさらなる分離工程を行う。これにより、例えば、サイズ分離、ゲル電気泳動での移動度または任意の適当なクロマトグラフィー法によって分離された増幅断片の混合物を生じる。さらに、（例えば、これらの分離された断片の視覚化による）同定工程は一般に「帳簿目的(book-keeping purposes)」で行い；一般に、分離された断片の混合物を、同じ細胞タイプまたはもう１つの細胞タイプ由来の物質であり得るある種の参照物と比較する。上記のように、増幅反応のプライマーの１つをラベルすることによって分離された断片の視覚化を達成できるが、他の方法ももちろん利用可能である。例えば、アダプター配列の１つに結合した特定のラベル化プローブは断片を視覚化するし、また増幅手順（例えばＰＣＲ）の間に断片に編入されたラベル化ヌクレオチドはもちろん（例えばＰＣＲ中に、Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｔ、ＵまたはＧである、放射能または蛍光アルファｄＮＴＰをｃＤＮＡ断片に包含させることによって）適当な検出手段になる。しかし、放射能ラベルまたは蛍光ラベルされた、アダプターと相同なプライマーを用いて特定のＲＮＡ由来の断片群（ＲＤＦｓ）を視覚化するのが好ましい。好ましく用いられる比較的高いアニーリング温度（６５℃から５６℃までタッチダウン、touch-down from 65℃ to 56℃）により、アダプター配列および近接する選択的塩基への完全なプライマー結合から重合イベントを支配的に確実に開始させる。バンドの強度はたいてい初期の鋳型濃度の関数であるのに対し、オリジナルの差異ディスプレイ法（the original Differential Display methods）のバンドの強度は個々の鋳型とプライマーの間の調和の質に依存する。本発明の方法を用いる稀少ｍＲＮＡの視覚化が、高度に豊富なｍＲＮＡ群のシグナルが過剰に現れることによって妨げられることはより少ない。任意プライミングの場合、ミスマッチ増幅および豊富なＲＤＦｓは常に、稀少断片塩基対の完全な増幅に拮抗し、打ち負かす。私たちの実験は、与えられた鋳型中、１００ほどの少ない分子を繰り返し検出することができることを示す。これは元の組織中、細胞あたり１個より少ない転写物に相当する。本発明の１つの興味深い部分は生物情報科学における上記方法の使用に関する。手短に言えば、既知のＤＮＡ配列をコンピューターデータベースに入力し、この配列に基づいて、上記方法の現実の実行と比較することができる。このようにして、本発明の方法から得られたゲル上のバンドを、配列、起源および機能に関してさえ、はっきりと同定することができる。したがって、本発明のこの部分は、細胞または細胞群中の発現産物の存在を測定する方法であって、細胞または細胞群由来のＲＮＡ含有サンプルを調製し、このサンプルを上記方法に付し、その後、このように同定された増幅ｃＤＮＡ断片を、以下のように調製される、既知の配列の制限ＤＮＡ断片の分子量のコンピューター生成リストを含むデータベース出力と比較することを含む方法に関する：ＤＮＡ配列データを仮想ＤＮＡ配列（virtual DNA sequences）(これらは関連する生物または細胞タイプ由来の遺伝子配列についての情報を含む任意のデータベースから定期的に得られ、更新される)としてデータベースに入力および保存し、次いで少なくとも１つの制限ヌクレアーゼでの仮想ＤＮＡ配列の開裂をシミュレートし、得られたシミュレーション開裂産物を仮想開裂ＤＮＡ断片として保存し（非常にたくさんの制限酵素の認識パターンおよび開裂パターンがすでに既知であるので、このようなシミュレーションは比較的単純である）、仮想開裂断片に対する少なくとも２つのアダプター断片の連結をシミュレートし、この結果を仮想連結ＤＮＡ断片として保存し（再び、これは単に、現実の方法で用いられるアダプター断片の構造について入力することを必要とするだけである）、工程（ｅ）で用いられるプライマーの個々の組み合わせそれぞれについて、同じグループ中の該プライマーの組み合わせによって増幅されやすい仮想連結ＤＮＡ断片をグループ化し、各グループ中の、それぞれの仮想連結ＤＮＡ断片の絶対的および／または相対的な分子量を測定し、ならびに、各グループの内容物を、このグループ中の仮想連結断片の絶対的および／または相対的な分子量を含むリストの形で出力する。出力リストの各メンバーとそれらのメンバーが由来する元の配列の間のリンクを維持するのが好ましい。例えば入力ＤＮＡ配列データをこのＤＮＡ配列データの遺伝的起源と関係するデータおよび場合によりこの遺伝的起源に関係する機能的特徴と関係するデータとリンクさせ、その後、該配列に対するこの系のポインターバックとして情報を維持することによってこれを行うことができる。したがって、この出力の表示はさらに、仮想連結ＤＮＡ断片の遺伝的起源についての情報、および場合によりこの遺伝的起源と関連する機能的特徴についての情報を含むのが都合がよい。このような生物情報科学系の使用を容易にするためには、１）同定された増幅ｃＤＮＡ断片を、データベース出力との自動的な比較を可能にする形式で入力することによって比較を行うか、あるいは２）データベース出力を、分離された増幅ｃＤＮＡ断片とデータベース出力の直接比較を可能にする形式で出力するかすることが一般に必要である。例えば、工程（ｅ）由来の視覚化および分離されたｃＤＮＡ断片をゲル上に流した場合、ゲルパターンのデジタル再生をコンピューターに読み込み、コンピューターにこの入力をコンピューター生成パターンと比較させるか、あるいはコンピューター生成パターンを、それが電気泳動ゲルパターンと似ているように出力することが可能である。本発明のもう１つの部分は、種々の細胞における発現レベルを比較するための本発明の方法の使用に関する。これを行う１つの方法は、第二のセットの条件に付された参照細胞または参照細胞群中の発現と比較して、該細胞または細胞群の発現パターンに影響する第一のセットの条件に付された細胞または細胞群内の発現産物の発現の変化を測定する方法であって、細胞または細胞群由来のＲＮＡ含有サンプルを調製し、このサンプルを本発明の細別化方法に付し、それにより、このサンプル由来の増幅されたｃＤＮＡ断片を記載するデータを得、一方、参照細胞または参照細胞群由来のＲＮＡ含有参照サンプルを本発明の方法に付することによつて増幅ｃＤＮＡ断片を記載する参照データを予め調製しておき、次いで本データと参照データの比較を行い、この２つのデータセット中、異なるレベルで発現されたｃＤＮＡ断片を同定し、その後、異なって発現されたｃＤＮＡ断片を用いて、どの発現産物の発現レベルが変化したかを測定することを含む方法である。言い換えれば、異なる条件に付された細胞由来の２つの異なるＲＮＡサンプルに基づいて本発明の方法を２回行う。一般に、増幅されたＤＮＡ断片の見かけの分子量、増幅されたＤＮＡ断片のＭｒ、増幅されたＤＮＡ断片の絶対量および増幅されたＤＮＡ断片の相対量からなる群からデータおよび参照データを選択する。さらに上記定義の参照データ、および場合により参照物由来の増幅されたｃＤＮＡ断片それぞれの遺伝的起源に関するさらなる情報を含むデータベースから参照データを抽出できる。上記に関連して、本発明は、少なくとも１つの細胞タイプにおける少なくとも１つの発現産物の発現レベルが基準からはずれている（増加あるいは減少している）ことによって特徴付けられる疾患の診断方法であって、少なくとも１つの細胞タイプ由来のＲＮＡ含有サンプルを調製し、このサンプルを本発明の方法に付することによって、このサンプル由来の増幅されたｃＤＮＡ断片を記載するデータを得、疾患を患っていない対象の同じタイプの細胞由来のＲＮＡ含有参照サンプルから得られる増幅ｃＤＮＡ断片を記載する参照データを、参照サンプルを前もって本発明に記載の方法に付することによって調製し、次いで疾患に関連することが知られているｃＤＮＡ断片に関し、本データと参照データの比較を行い、発現産物の発現レベルが基準から逸脱しているか否かを確定するために、本データと参照データの間に有意な相違が存在するかどうかを評価することを含む方法を可能にする。上記態様に関しても、増幅されたＤＮＡ断片の見かけの分子量、増幅されたＤＮＡ断片のＭ_r、増幅されたＤＮＡ断片の絶対量および増幅されたＤＮＡ断片の相対量からなる群からデータおよび参照データを選択し、また、上記定義の参照データおよび場合により参照物由来の増幅されたｃＤＮＡ断片それぞれの遺伝的起源に関するさらなる情報を含むデータベースから参照データを抽出する。さらに、本発明は少なくとも１つの細胞タイプの少なくとも１つの発現産物の発現レベルが基準から逸脱している（増加または減少している）ことによって特徴付けられる疾患の処置方法であって、少なくとも１つの細胞タイプ由来のＲＮＡ含有サンプルを調製し、このサンプルを本発明の方法に付することによってこのサンプル由来の増幅されたｃＤＮＡ断片を記載するデータを得、疾患を患っていない対象の同じタイプの細胞由来のＲＮＡを含有する参照サンプルから得られる増幅されたｃＤＮＡ断片を記載する参照データを、参照サンプルを前もって本発明に記載の方法に付することによって調製し、次いで疾患に関連することが知られているかあるいは関連すると思われるｃＤＮＡ断片に関して、本データと参照データの比較を行い、発現産物の発現レベルが基準から逸脱しているか否かを確定するため、本データと参照データ間に有意な相違が存在するかどうかを評価することを含む方法を提供する。発現産物が減少している場合、発現産物をデリバリーすることによって疾患を処置することができ；発現産物が増加している場合、発現産物に対する阻害剤（例えば抗体）をデリバリーすることによって疾患を処置することができる。本発明の範囲には、本発明の方法によって同定される発現産物それ自体、ならびに本発明の方法によって提供される疾患の処置方法が含まれる。また、本発明の方法の工程（ｅ）から得られた増幅断片の混合物をｃＤＮＡ断片で覆われた表面（チップ）の調製のために用いることもできる。これは以下のように行うことができる：ＲＮＡ含有サンプルを、分離工程を含む本発明の細別化方法に付し、ならびに、分離された増幅ｃＤＮＡ断片を、その空間的な相対分布パターンを維持しながら、分離された増幅ｃＤＮＡ断片と安定に結合するようにしたチップ表面に移す。別法として、このようなチップを以下のように製造できる：ＲＮＡ含有サンプルを、分離を行わない本発明の方法に付し、その後、このように得られた増幅ｃＤＮＡ断片を、電気泳動後の相対的な分布パターンを維持しながら、分離された増幅ｃＤＮＡ断片と安定に結合するようにした特定の表面上で電気泳動によって分離する。この態様では、電気泳動はマイクロ電気泳動形態であるのが好ましい。電気泳動ブロッティング技術および／または周知の光活性化有機または無機化学カップリング技術によって表面へ移すのが好ましい。また本発明は、上述の調製方法によって得ることができる表面に関する。既知の「ＤＮＡチップ」は既知の構造の核酸断片の配置（アレイ：array）を具体的に導入することに依存するのに対し、本発明は、図８に記載のように、特定の細胞タイプに対して特定の「状態」を特徴付けるｃＤＮＡ断片を含む「半配置（セミアレイ：semi-array）」を提供するため、このような表面は新規かつ発明的であると考えられる。ある遺伝子ファミリー内の遺伝子のスクリーニングにこのような表面を用いることができる。「配置チップ」を調製し、その後、（遺伝子ファミリーを代表する）ラベルしたプローブを、低度に厳重な、すなわちBD Hames & S J Higgins， IRL Pressによって編集された"Nucleic acid hybridisation．A practical appr oach"の９４−１０６ページに記載の条件下、該チップとハイブリダイズさせる。チップとカップリングしたたくさんの断片はプローブとハイブリダイズし、次いで同じ遺伝子ファミリーの代表物であるかどうかを決定するために、これらの断片を同定し、単離し、配列決定／特徴付けする。また、第一の細胞または細胞タイプと第二の細胞または細胞タイプの間の発現パターンの相違を測定するために、該「半配置」を用いる。この方法は、第一および第二の細胞または細胞タイプ由来のラベルしたＲＮＡまたはｃＤＮＡのサンプルを調製し、次いでこれらのサンプルそれぞれを上記チップ表面と接触させ、次いで各サンプル由来の結合したラベル化ＲＮＡまたはｃＤＮＡの量および分布を検出することを含む。すべての環境下で、例えばＥＰ−０６５４０６１に記載の方法により、ｃＤＮＡが結合したチップ表面を作成することができる。本発明のさらにもう１つの部分は、前もって選択されたタンパク質とポリペプチド間の相互作用についてのスクリーニング方法であって、工程（ｅ）から得られた増幅ｃＤＮＡ断片の細別化ライブラリーを調製し、場合によりベクターへの挿入を容易にするためにライブラリーのメンバーの末端にアダプターを付け、この断片をベクターに挿入し、このベクターで適当な宿主細胞集団を形質転換し、宿主細胞が正しく挿入されたｃＤＮＡ断片を発現することを可能にする条件下でこの宿主細胞を培養し、次いで挿入されたｃＤＮＡ断片によってコードされるポリペプチド断片を、前もって選択されたタンパク質との相互作用についてアッセイすることを含む方法に関する。このことを達成する１つの都合のよい方法は、２ハイブリッド技術であり、ここに、宿主細胞は、前もって選択されたタンパク質をコードする核酸物質で交配され、あるいはトランスフェクトされ、首尾よく交配／トランスフェクトされれば、前もって選択されたタンパク質とポリペプチド断片の間の相互作用が検出可能なシグナルを生じる真核生物細胞（例えば真菌細胞、特に酵母細胞）である。最近、このような方法は、引用により本明細書中に包含されるFromont Racine et al.，Nature Genetics 16，277-282（1997）に開示された結果、大きな注目を集めている。検出可能なシグナルを提供する１つの都合のよい系は、ＥＰ−Ａ−０５６９１７０に開示されている緑色蛍光タンパク質の使用によるものであり、ここでは相互作用による蛍光スペクトルの変化をレポーターとして用いる。最後に、本発明はＲＮＡの逆転写に用いる組成物であって、以下のもの含む組成物に関する：ａ）５５℃を超えない温度で逆転写酵素活性を有する第一の酵素ｂ）４５℃〜９５℃の範囲の高い温度（特に高い温度で逆転写を行うための上記温度）で逆転写酵素活性を有する第二の酵素（該第二の酵素は、該高い温度で逆転写を触媒することに関し、該第一の酵素より実質的に高い活性を有する）。第一の酵素は、５５℃を超えない温度で逆転写を触媒することに関し、第二の酵素より実質的に高い活性を有するのが好ましく、また第二の酵素は、４５℃を超える温度で逆転写を触媒することに関し、第一の酵素より実質的に高い活性を有することが好ましい。好ましい態様の説明まず、図面を簡単に説明する。図１差次的に発現される転写物のディスプレー（Display Of Differentially Expr essed Transcripts）の基礎図２アンカーおよびＰＣＲプライマーの設計図３実施例１に記載の細胞性セットアップを用いるＤＯＤＥＴゲルのオートラジオグラム；ラットクロム親和細胞腫ＰＣ１２細胞を神経生長因子（ＮＧＦ）および上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）で刺激した。レーン１−２４、ポリＴアンカープライマー５’−Ｔ₂₅ＡＡ−３’を用いる逆転写レーン２５−４８、ポリＴアンカープライマー５’−Ｔ₂₅ＧＣ−３’を用いる逆転写レーン１、５、９、１３、１７、２１、２５、２９、３３、３７、４１、４５は未処理のＰＣ１２細胞を表す。レーン２、６、１０、１４、１８、２２、２６、３０、３４、３８、４２および４６はＮＧＦ因子で６０分間処理されたＰＣ１２細胞を表す。レーン３、７、１１、１５、１９、２３、２７、３１、３５、３９、４３および４７はＮＧＦ因子で９０分間処理されたＰＣ１２細胞を表す。レーン４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４および４８はＥＧＦ因子で９０分間処理されたＰＣ１２細胞を表す。レーン１−４８、前ＰＣＲ増幅用に以下のペアを用いる：ＴａｑＩ前増幅プライマー：５’−ＣＡＧＣＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＣＣＧＡＢｃｌＩ前増幅プライマー：５’−ＣＴＣＧＴＡＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＧＡＴＣＡ第二のＰＣＲ増幅用に以下のプライマーペアを用いた：レーン１−４５’−ＣＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＣＣＧＡＡ５’−ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＧＡＴＣＡＡ（５’末端をラベル）レーン５−８５’−ＣＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＣＣＧＡＡ５’−ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＧＡＴＣＡＣ（５’末端をラベル）レーン９−１２５’−ＣＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＣＣＧＡＡ５’−ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＧＡＴＣＡＧ（５’末端をラベル）レーン１３−１６５’−ＣＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＣＣＧＡＡ５’−ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＧＡＴＣＡＴ（５’末端をラベル）レーン１７−２０５’−ＣＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＣＣＧＡＣ５’−ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＧＡＴＣＡＡ（５’末端をラベル）レーン２１−２４５’−ＣＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＣＣＧＡＣ５’−ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＧＡＴＣＡＣ（５’末端をラベル）レーン２５−４８レーン１−２４のプライマーの組み合わせを繰り返したもの図４ａ細胞性Total ＲＮＡ由来のＲＤＦ０１配列のノザンブロット。ａ）未処理のＰＣ１２細胞、ｂ）６０分間のＮＧＦ処理、ｃ）９０分間のＮＧＦ処理、ならびにｄ）９０分間のＥＧＦ処理。図４ｂコントロールのロードＲＮＡ抽出物を、臭化エチジウムを含む１．２％アガロースゲル上で電気泳動し、各レーンのＲＮＡの相対濃度を測定するためのコントロールとして用いた。ａ、ｂ、ｃ、ｄは図４ａと同じである。図４ｃ細胞性Total ＲＮＡ由来のＲＤＦ０２配列のノザンブロット。ａ）未処理のＰＣ１２細胞、ｂ）６０分間のＮＧＦ処理、ｃ）９０分間のＮＧＦ処理、ならびにｄ）９０分間のＥＧＦ処理。図４ｄコントロールのロードＲＮＡ抽出物を、臭化エチジウムを含む１．２％アガロースゲル上で電気泳動し、各レーンのＲＮＡの相対濃度を測定するためのコントロールとして用いた。ａ、ｂ、ｃ、ｄは図４ｃと同じである。図５生長因子によって調節された遺伝子の調査レーン１ｂｐ単位のサイズマーカー（150bp，200bp，250bp）レーン２−６増幅プライマー５’−Ｃｏｍ−Ｎ_n1−３’ （式中、Ｎ_n1はＧＡＡである）レーン７−１１増幅プライマー５’−Ｃｏｍ−Ｎ_n1−３’ （式中、Ｎ_n1はＧＡＣである）レーン１２−１６増幅プライマー５’−Ｃｏｍ−Ｎ_n1−３’ （式中、Ｎ_n1はＧＡＧである）レーン１７−２１増幅プライマー５’−Ｃｏｍ−Ｎ_n1−３’ （式中、Ｎ_n1はＧＡＴである）レーン２２−２６増幅プライマー５’−Ｃｏｍ−Ｎ_n1−３’ （式中、Ｎ_n1はＧＣＡである）レーン１１では処理６日後にダウンレギュレーションが観察されるが、レーン１６では処理６日後にアップレギュレーションが観察される。レギュレーションは活性な生長因子が存在するときにのみ認められるため、両調節（モジュレーション）は生長因子に起因する。図６細菌耐性に関与する遺伝子の調査レーン１ｂｐ単位のサイズマーカー（150bp，200bp，250bp， 300bp）レーン２−５増幅プライマー５’−Ｃｏｍ−Ｎ_n1−３’ （式中、Ｎ_n1はＧＡＡである）レーン６−９増幅プライマー５’−Ｃｏｍ−Ｎ_n1−３’ （式中、Ｎ_n1はＧＡＣである）レーン１０−１３増幅プライマー５’−Ｃｏｍ−Ｎ_n1−３’ （式中、Ｎ_n1はＧＡＧである）レーン１４−１７増幅プライマー５’−Ｃｏｍ−Ｎ_n1−３’ （式中、Ｎ_n1はＧＡＴである）レーン１８−２１増幅プライマー５’−Ｃｏｍ−Ｎ_n1−３’ （式中、Ｎ_n1はＧＣＡである）レーン２２−２５増幅プライマー５’−Ｃｏｍ−Ｎ_n1−３’ （式中、Ｎ_n1はＧＣＣである）レーン８−９ではダウンレギュレーションが観察されるが、レーン２０−２１ではアップレギュレーションが観察される。両遺伝子調節物はバクテリアマイシン(Bacteriamycin)、イノシン（Inosin）に対する耐性に関与する潜在遺伝子である。図７実施例４および５で用いられる技術の原理ｄｓ−ｃＤＮＡの合成後、１つの４塩基対エンドヌクレアーゼでＤＮＡを消化し、アンカーをｄｓ−ｃＤＮＡの末端に連結する。特別に設計したプライマーを用い、種々の発現ウインドウ（サブフラクション）のｍＲＮＡを増幅することによって発現プロファイルを得る。発現ウインドウの数はサンプルの複雑さに依存し、すなわち真核生物では６４発現ウインドウである。図８遺伝子発見ＤＮＡ表面（ＤＮＡチップ）の原理ＤＮＡ断片をサイズ分離した後、電気泳動原理を用いて、このＤＮＡ断片をナイロン膜に移す。本発明の原理を用いて製造した複合のＤＮＡプローブとこの膜をハイブリダイズさせる。別法として、この膜を単一の遺伝子とハイブリダイズさせ、特定の遺伝子ファミリーの新規メンバーを同定することができる。図７に記載の原理にしたがい、この膜を、ｘ座標では６４個の発現ウインドウに分け、ｙ座標では塩基対サイズ（５０塩基対から１２００塩基対）で分ける。図９３’末端ｃＤＮＡ群の６４プールの製造原理工程１５’−ｃｏｎ₁−Ｔ_nＶオリゴヌクレオチド（ｃｏｎ₁は１〜１００ヌクレオチドの範囲のオリゴヌクレオチドであり、ｎは５〜４０の範囲であり、ＶはＡ、ＣおよびＧの混合物である）を用いる一本鎖ｃＤＮＡの製造。工程２５’Ｃｏｎ₂Ｎ_x（ｃｏｎ₂は１〜１００ヌクレオチドの範囲のオリゴヌクレオチドであり、ｘは１〜１０の範囲であり、ＮはＡ、Ｃ、ＴおよびＧの混合物である）を用いて二本鎖ｃＤＮＡ合成を行う。上記オリゴヌクレオチドを用い、クレノー（Klenow）酵素によってｄｓ−ｃＤＮＡを合成する。工程３二重鎖ｃＤＮＡを増幅するための二重鎖ｃＤＮＡの前増幅ｃｏｎ₁およびｃｏｎ₂プライマーを組み合わせて用い、ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅する。工程４ＰＣＲ増幅手法において、ラベル化ｃｏｎ₁および６４ｃｏｎ₂ＮＮＮプライマー（ここに、ＮＮＮはヌクレオチドＡ、Ｔ、ＧおよびＣを用いる６４の異なる様式で組み合わされたものである）を組み合わせて用い、前増幅されたｃＤＮＡをさらに増幅し、６４プールに分離する。工程５Ｐａｇｅ電気泳動原理を用いて６４プールそれぞれを分離する。実施例本発明の機能性を立証するため、発生中の真核生物細胞系、クロム親和細胞腫ＰＣ１２を用いた実施例を以下に記載する。神経生長因子（ＮＧＦ）は、インビトロＰＣ１２細胞系において、生長停止（ growth arrest）およびニューロン発芽後成長（neurone outgrowth）を誘導する。他の生長因子（growth factors）、例えば、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）は生存を援助し、生長を刺激する。ＮＧＦ誘導遺伝子には、ｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｍｙｃのような転写因子をコードする即時型初期遺伝子（immediate early genes ）が含まれる。この即時型初期遺伝子の産物は、ニューロンの表現型に関連する遺伝子、例えばニューロフィラメント、ペリフェリン（peripherin）、ＧＡＰ４３およびトランシン（transin）の発現を制御することに関与すると考えられる。ニューロンの分化および増殖に関与する新規初期遺伝子を同定するために、以下のＤＯＤＥＴ法を用いる。以下の実施例では、上記細胞系に対して、本発明の方法をどのように効率的に適用できるかを示す。実施例１文献記載（Saltiel et al．1996）の培養条件下、神経生長因子（ＮＧＦ）および上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）の存在および不存在下でラットクロム親和細胞腫ＰＣ１２細胞を培養（インビトロ）した。 Sambrook et al 1989にしたがい、ChomczynskiおよびSacchiによる標準的単一工程法を用いてすべてのＲＮＡ(Total RNA)を単離した。 TotalＲＮＡ濃度を分光光度測定により決定し、次いで０．２μｇ／μＬに調節した。このＲＮＡを直接ノザン分析に用いた。ＤＯＤＥＴのため、各プール中、プライマー：５’−Ｔ₂₅ＡＡ−３’を用いて TotalＲＮＡ４×０．５μｇを逆転写した。５’−Ｔ₂₅ＧＣ−３’ポリｄＴアンカー化プライマーを用いて同じ手法を行い、総量２×４×０．５μｇのＲＮＡを得た。第一鎖合成２０．０μＬＲＮＡ０．３から１．０μｇの範囲の総ＲＮＡ量３．０μＬ５’−Ｔ₂₅ＡＡ−３’濃縮物１００ｎｇ／μＬまたは５’−Ｔ ₂₅ＧＣ−３’濃縮物１００ｎｇ／μＬ５．０μＬ１０×ｃＤＮＡ緩衝液（緩衝液Ｂ、Epicentre Technologies # R19250）２．０μＬｄＮＴＰｓ（２５ｍＭ、Pharmacia Biotech）１．０μＬＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ１１ＲＴ（２００Ｕ／μＬ）（Gibco BRL # 18064-014）５．０μＬＲｅｔｒｏｔｈｅｒｍＲＴ（１Ｕ／μＬ）(Epicentre Techno logies ♯Rl9250) １４．０μＬＨ₂Ｏ高い特異性を得るため、ｃＤＮＡ反応物を５０℃で３０分間、７０℃で１時間インキュベートした。第二鎖合成第一鎖合成反応物に、以下の成分を加えた：１５．０μＬ１０×ｃＤＮＡ緩衝液３．０μＬハイブリダーゼ熱安定性ＲＮアーゼ（１Ｕ／μＬ）（Epicentre Technologies ♯H39050）１．０μＬｒＢｓｔ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（１Ｕ／μＬ）（Epicentre Technologies ♯BH1100）８１．０μＬＨ₂Ｏ。６５℃で１時間インキュベート得られた二重鎖ｃＤＮＡをフェノール抽出し、沈殿させ、Ｈ₂Ｏ２０μＬに再懸濁した。この半量をゲルでチェックし；１００ｂｐから３０００ｂｐの範囲のバンドが観察された場合、残りのｃＤＮＡをＤＯＤＥＴの鋳型生産のために用いた。各１０Ｕの熱安定性制限酵素ＴａｑＩおよびＢｃｌＩを用い、得られたｃＤＮＡ群を５０℃で２時間消化した。この混合物に、ＤＯＤＥＴのアダプターを加え、Ｔ₄ＤＮＡリガーゼ（１Ｕ）を用いて制限断片の末端に連結し、第一の鋳型を得た。ＤＯＤＥＴアダプターに対して相補的なプライマーを用い、少量（１／１０^th容量）の第一の鋳型で８−１５サイクルの非放射能前増幅を行った（９４℃変性；３０ｓ、５６℃アニーリング；３０ｓ、７２℃重合；１分間）。また、増幅産物（第二の鋳型と称する）を１．５％アガロースゲル上でチェックした。予想されたように、断片サイズはほとんどが１００ｂｐから１０００ｂｐの範囲であった。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用い、ＰＥ−９６００熱サイクラー（両者ともPerkin Elmer Corp．Norwalk，CT，USA）ですべての増幅反応を行った。次いで、最終の鋳型をＨ₂Ｏで１０倍希釈した。制限断片に連結されたアダプター、前増幅プライマーおよび活性ＰＣＲプライマーを以下に記載する：ＴａｑＩアダプター：５’−ＣＡＧＣＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＣＴＡＣＴＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣ−５’ ＴａｑＩ前増幅プライマー：５’−ＣＡＧＣＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＣＣＧＡＴａｑＩ増幅プライマー：５’−ＣＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＣＣＧＡＮ（Ｎ＝ＡまたはＣまたはＧまたはＴ）ＢｃｌＩアダプター：５’−ＣＴＣＧＴＡＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＡＴＧＧＣＴＡＧ−５’ ＢｃｌＩ前増幅プライマー：５’−ＣＴＣＧＴＡＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＧＡＴＣＡＢｃｌＩ増幅プライマー：５’−ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＧＡＴＣＡＮ（Ｎ＝ＡまたはＣまたはＧまたはＴ）ＰＣＲ用には、１つの伸張部分（上記Ｎで表す）に関するすべての異なる組み合わせが利用可能であり、総数４²個のプライマーの組み合わせが生じた。すべてのオリゴヌクレオチドはDNA Technology（Aarhus，Denmark）から得た。１ＵのＴ₄ポリヌクレオチドキナーゼを用いてＢｃｌＩプライマーを放射能ラベルした。本質的に上記記載のとおりであるが、３５サイクルで、１１サイクルのタッチダウンを含む熱サイクルを行った。（１１サイクルの間、アニーリング温度を６５℃から５６℃に０．７℃ずつ下げ、次いで２３サイクルの間、５６℃ で維持した）。次いで、染料および５０％ホルムアミドを加えた後、サンプルを煮沸し、５％ポリアクリルアミド配列決定タイプゲル（GIBCO BRL Life Technol ogies Inc.，Gaithersburg，MD，USA）上で分離した。標準条件で、７０ｂｐマーカーがゲルの底から３ｃｍであり、７０−８００ｂｐ間の良好な分離を生じさせるようにすべてのゲルを電気泳動した。次いで、平面ゲルドライヤーで直接Wh atman 3M paper上へゲルを乾燥した。ラベルされたＤＮＡ断片をオートラジオグラフィーによって視覚化した。展開前に、ゲルおよびフィルムを位置でマークした。１塩基の選択的付加部分を経験的に選択し、レーン当たり約５０個の放射能ラベルされた断片を生じさせた。オートラジオグラム上で関心あるものとして同定されたバンドは、フィルムおよび脱水されたゲル上のマーキングと列を形成しており、これを切り取った。切り取られた断片を活性についてモニターした。このゲル断片をGENECLEAN（BIO10 1，California USA）を用いて単離した。次いで製造元の推奨にしたがい、ＤＮＡを回収した。次いで最初のＰＣＲで用いられたものと同じＰＣＲ条件およびプライマーを用いてＤＮＡ断片を再増幅することができる；しかし、概して、１５サイクルで十分なクローニング用の産物が得られた。未精製ＰＣＲ産物およびベクターディスプレイーｐ１２３Ｔ（Display Systems Biotech，USA）を用いてクローニングを行った。製造元が推奨する条件を用いた。実施例２図３は、ＰＣ１２細胞をＮＧＦまたはＥＧＦで処理して得られた鋳型の増幅によって製造された典型的ＤＯＤＥＴゲルを示す。５’−Ｔ₂₅ＡＡ−３’およびＴ₂₅ＧＣ−３’ポリｄＴアンカー化プライマーを用いてTotalＲＮＡを逆転写し、アンカー連結後、ＢｃｌＩおよびＴａｑＩ前増幅プライマーペアを用いて前増幅を行った。各制限酵素部位に１個の選択的塩基を用いた、１６個の可能なプライマーの組み合わせのうち６個を示す（図３）。視覚化された最も大きな産物（図３）は、サイズが約１０００ｂｐであり、ゲルの下端は約１００ｂｐに相当する。このサイズのウインドウでは、それぞれのプライマーの組み合わせについて平均５０個のバンドを表すことができる。図３では、種々の発現パターンを検出できる。主にＤＯＤＥＴで可能な厳重な条件のせいで、バックグラウンドのレベルは許容可能なレベルで維持されつつ、バンドパターンの分解能は高い（図３）。さらに、処理時間にわたって個々のバンドの強度がかなり急進的に変化しても、同じレーンの他のバンドのパターンに影響しないと思われる。したがって、ＰＣＲは反応物中の個々の基質の濃度から比較的独立したままであると結論することが可能である。個々のＲＤＦｓの単離、再増幅およびクローニングについての上記の標準的プロトコルの最適化された組み合わせを用いると、分化および増殖イベントに関連するたくさんの転写物の同定が可能になる。さらなる分析に関して、４個のＲＤＦｓを単離する。図３、バンドａ、ｂ、ｃおよびｄ。図３に示すように、配列分析ではＲＤＦａ＝ＲＤＦｂおよびＲＤＦｃ＝ＲＤＦｄであることが示された。すべての場合において、ＰＣＲで用いられる正しい１個の選択的塩基付加部分を有する適当な末端配列を回収することができ、系の厳重さおよび忠実さが証明された（データは示していない）。実施例３種々のプライマーペアを用いて、ＮＧＦまたはＥＧＦで処理されたＰＣ１２細胞系をスキャンする間に、ＮＧＦ処理時に差次的発現を示す（ＲＤＦ０１およびＲＤＦ０２と表される）２個のＲＤＦｓを単離した（図３中、ＲＤＦ０１＝ＲＤＦａ＝ＲＤＦｂならびにＲＤＦ０２＝ＲＤＦｃ＝ＲＤＦｄ）。再増幅、サブクローニングおよびＤＮＡ配列決定後のさらなるＤＮＡ分析により、ＰＣ１２細胞系において６０分間のＮＧＦ処理または９０分間のＥＧＦ処理後に、アップレギュレートされた２個の未知のＲＤＦｓが明らかになった。ＲＤＦ０１およびＲＤＦ０２両者のヌクレオチド配列は、ＧｅｎｅＢａｎｋまたはＥＭＢＬデータベース中に存在するいずれの遺伝子に対しても１０％より低い相同性を示す。ＲＤＦ０１およびＲＤＦ０２の発現を、ノザンブロットを用いてさらに分析した（図４ａ−４ｄ）。ここで、ＰＣ１２細胞をＮＧＦで６０分間またはＥＧＦで９０分間処理した時点で、はっきりと転写物が検出され、図３で示されるＤＯＤＥＴ法を用いて得られた結果を確認することができた。全長のＲＤＦ０１およびＲＤＦ０２をクローニングする実験、およびＰＣ１２細胞系の、分化および増殖に関与する生物学的特徴は現在調査中である。実施例４生長因子によってモジュレートされた遺伝子の検索ヒトセルラインを生長因子で処理し、以下に示す種々の時点でＲＮＡを単離した：１未処理の細胞（レーン２、７、１２、１７、２２）２ヘルパー物質（helper agent）で１日処理した細胞（レーン３、８、１３、１８、２３）３ヘルパー物質および生長因子で１日処理した細胞（レーン４、９、１４、１９、２４）４ヘルパー物質で６日間処理した細胞（レーン５、１０、１５、２０、２５）５ヘルパー物質および生長因子で６日間処理した細胞（レーン６、１１、１６、２１、２６）。ヒトＲＮＡを単離し、図３の説明文に本質的に記載の遺伝子発見分析を行った。それぞれヒトセルラインのｍＲＮＡプールのある部分をカバーする、６４個の増幅プライマーのうちの５個を図５に示す。Ｃｙ５ラベルを用い、Pharmacia Bi otechの自動断片分析装置であるＡＬＦｅｘｐｒｅｓｓで発現分析を行った。レーン１１では、処理６日後にダウンレギュレーションが観察される。レーン１６では、処理６日後にアップレギュレーションが観察される。レギュレーションは活性な生長因子の存在下でのみ観察されるので、両調節は生長因子に起因する。実施例５抗生物質に対する細菌の耐性に関与する遺伝子の検索 Listeria monocylogia株をバクテリアマイシン、イノシンで処理した。イノシン耐性株由来のＲＮＡをさらに調査した。１．未処理の細菌クローン１（レーン２、６、１０、１４、１８）２．未処理の細菌クローン２（レーン３、７、１１、１５、１９）３．イノシン耐性の細菌クローン３（レーン４、８、１２、１６、２０）４．イノシン耐性の細菌クローン４（レーン５、９、１３、１７，２１）標準的技術によって細菌ＲＮＡを単離し、第一鎖合成に５’−ＮＮＮＮＮＮＹＹＡプライマーを用いることを除き、実施例４および図５にしたがって、遺伝子発見分析を行った。それぞれ原核生物細胞系のｍＲＮＡプールのある部分をカバーする、６４個の増幅プライマーのうちの６個を図６に示す。Ｃｙ５ラベルを用い、Pharmacia Bi otechの自動断片分析装置であるＡＬＦｅｘｐｒｅｓｓで発現分析を行った。レーン８およびレーン９では、ダウンレギュレーションが観察され、レーン２０および２１ではアップレギュレーションが観察される。両遺伝子の調節物はイノシン耐性に関与する潜在遺伝子である。

【手続補正書】【提出日】平成１３年４月３日（２００１．４．３）【補正内容】 I．請求の範囲別紙のとおり II．明細書の補正（1）第４頁下から２行に記載の「始原細菌」を「始原細菌（古細菌）」と訂正する。（2）第５頁２１行に記載の「手法」を「手法（手順）」と訂正する。（3）第７頁１３行に記載の「接着末端」を「付着末端」と訂正する。（4）第１３頁４行および１０行に記載の「微量」を「稀少」と訂正する。（5）第１３頁２１行に記載の「突き出した末端」を「突出末端」と訂正する。（6）第１３頁２３行に記載の「突き出した「接着」末端」を「突出「付着」末端」と訂正する。（7）第１４頁末行〜１５頁１行に記載の「接着末端」を「付着末端」と訂正する。（8）第１８頁１３行に記載の「グループ化」を「グループ分け（グループ化）」と訂正する。（9）第１８頁１５行に記載の「測定」を「決定」と訂正する。（10）第１８頁１６行に記載の「内容物」を「内容」と訂正する。（11）第２０頁４行に記載の「ｃＤＮＡ断片」を「ｃＤＮＡ断片群」と訂正する。（別紙）請求の範囲１．サンプル中に含まれるｍＲＮＡのコード化領域から増幅されたｃＤＮＡ断片群の標準化された細別化ライブラリーを調製する方法であって、以下の工程を含む方法：（ａ）少なくとも１つのｃＤＮＡプライマーを用いてサンプル由来のｍＲＮＡを逆転写して第一鎖ｃＤＮＡ断片を得、（ｂ）第一鎖ＤＮＡ断片を鋳型として用いて、第一鎖ｃＤＮＡ断片と相補的な第二鎖ｃＤＮＡを合成して二重鎖ｃＤＮＡ断片を得、（ｃ）消化後にＤＮＡの末端に類似サイズの突出末端（付着末端）を生じさせる１つの制限エンドヌクレアーゼで二重鎖ｃＤＮＡ断片を消化して開裂されたｃＤＮＡ断片を得、（ｄ）工程（ｃ）で得られた開裂された断片に、工程（ｃ）において作製した付着末端に特異的に結合することができる、既知の配列を含む少なくとも２つのアダプター断片であって、第１のアダプター断片は工程（ｅ）において式Ｉで示されるプライマーにアニーリングすることができるものであり、第２のアダプター断片は５’→３’方向のＤＮＡ重合に対するブロックを導入する終結断片であり、該終結断片は分子増幅手順の間、工程（ｅ）における少なくとも２つのプライマーセットのいずれのプライマーともアニーリングし得ないものである、を付加して連結されたｃＤＮＡ断片を得、ールに細別化し、（ｆ）工程（ｅ）で得られた連結されたｃＤＮＡ断片の各プールを、工程（ｄ）で用いたアダプター断片に対する、一般式：５’−Ｃｏｍ−Ｎ_n1−３’ Ｉ［式中、Ｃｏｍは少なくとも、開裂されたｃＤＮＡ断片の３’末端に連結されているアダプター断片の５’末端に対して相補的な配列であり、ＮはＡ、Ｇ、ＴまたはＣであり、１つのプライマーは式Ｉにおいてｎ１＝０で表され、第２のプラ末端がＣｏｍと相補的なアダプター断片に対して、その３’末端で連結されている任意のヌクレオチド配列の増幅を開始することができる］で示される１セットの増幅プライマーを用いる分子増幅手法に付すことにより増幅されたｃＤＮＡ断片を得る。２．工程ｃ）における制限エンドヌクレアーゼが、完全なｃＤＮＡを平均約３個の断片に開裂させるように選択された稀少４塩基カッターである、請求項１に記載の方法。３．稀少４塩基カッターが、ＡｃｉＩ、ＡｌｕＩ、ＢｆａＩ、ＢｓｔＵＩ、Ｃｓｐ６Ｉ、ＤｐｎＩ、ＤｐｎＩＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、ＨｐａＩＩ、ＭｂｏＩ、ＭｎｌＩ、ＭｓｅＩ、ＭｓｐＩ、ＮｌａＩＩＩ、ＲｓａＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、ＴａｉＩ、ＴａｑＩおよびＴｓｐ５０９Ｉからなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。４．工程ｄ）における終結断片が化学修飾されたヌクレオチド配列であるか、あるいはそれを含むものであり、該化学修飾されたヌクレオチド配列はヌクレオチド鎖の３’末端に共有結合しているジデオキシヌクレオチドである、請求項１ −３のいずれかに記載の方法。 ₁ に関し、Ａ、Ｇ、ＴおよびＣのすべての可能な組み合わせおよび順列を含むものである、請求項１−４のいずれかに記載の方法。６．式Ｉ中、ｎ１＝０の増幅プライマーのセットがラベルされている、請求項１−５のいずれかに記載の方法。れるものである、請求項１−６のいずれかに記載の方法。８．工程（ｆ）の分子増幅手法により得られた、増幅された断片を分離するさらなる工程を含む、請求項１−７のいずれかに記載の方法。９．ゲル電気泳動またはクロマトグラフィーによって該分離を行う請求項８に記載の方法。１０．さらに、分離された増幅断片を同定する工程を含む請求項８または９に記載の方法。１１．視覚化によって該同定を行う請求項１０に記載の方法。１２．プローブまたは増幅断片の一部であるラベルされたヌクレオチドを視覚化する請求項１１に記載の方法。１３．該ラベルされたヌクレオチドが請求項６で規定するラベルされたプライマーの一部である請求項１２に記載の方法。１４．ＰＣＲ中に、放射活性なまたは蛍光アルファｄＮＴＰ（Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｔ、ＵまたはＧ）をｃＤＮＡ断片に包含させることによって該視覚化を行う請求項１３に記載の方法。１５．第一および第二のｃＤＮＡ鎖のヌクレオチド間のミスマッチを最小にする条件下で工程（ｂ）を行う上記請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。１６．ｍＲＮＡが真核生物、始原細菌または原核生物起源である請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。１７．細胞または細胞群中の発現産物の存在を測定する方法であって、細胞または細胞群由来のＲＮＡ含有サンプルを調製し、このサンプルを請求項１−１６のいずれかに記載の方法に付し、その後、このように同定された増幅ｃＤＮＡ断片を、以下のようにして作成される、既知の配列の制限ＤＮＡ断片の分子量のコンピューター生成リストを含むデータベース出力と比較することを含む方法：ＤＮＡ配列データを仮想ＤＮＡ配列としてデータベースに入力および保存し、次いで少なくとも１つの制限ヌクレアーゼでの仮想ＤＮＡ配列の開裂をシミュレートし、得られたシミュレーション開裂産物を仮想開裂ＤＮＡ断片として保存し、仮想開裂断片に対する少なくとも２つのアダプター断片の連結をシミュレートし、この結果を仮想連結ＤＮＡ断片として保存し、工程（ｆ）で用いられるプライマーの個々の組み合わせそれぞれについて、同じグループ中の該プライマーの組み合わせによって増幅されやすい仮想連結ＤＮＡ断片をグループ分けし、各グループ中の、それぞれの仮想連結ＤＮＡ断片の絶対的および／または相対的な分子量を決定し、ならびに、各グループの内容を、該グループ中の仮想連結断片の絶対的および／または相対的な分子量を含むリストの形態で出力する。１８．入力ＤＮＡ配列データを、このＤＮＡ配列データの遺伝的起源に関するデータ、および場合によりこの遺伝的起源に関する機能的特徴に関するデータとリンクさせる請求項１７に記載の方法。１９．該出力の表示内容が、仮想的に連結されたＤＮＡ断片の遺伝的起源についての情報、および場合によりこの遺伝的起源に関連する機能的特徴についての情報をさらに含む請求項１７に記載の方法。２０．同定された増幅ｃＤＮＡ断片を、データベース出力との自動的な比較を可能にする形式で入力することによって比較を行うか、あるいは別法として、データベース出力を、分離された増幅ｃＤＮＡ断片とデータベース出力間の直接比較を可能にする形式で出力することによって比較を行う請求項１７−１９のいずれかに記載の方法。２１．第二のセットの条件に付された参照細胞または参照細胞群中の発現と比較して、細胞または細胞群の発現パターンに影響する第一のセットの条件に付された細胞または細胞群内の発現産物の発現の変化を測定する方法であって、細胞または細胞群由来のＲＮＡ含有サンプルを調製し、このサンプルを請求項１０− １４のいずれかに記載の方法に付し、それにより、このサンプル由来の増幅されたｃＤＮＡ断片を記載するデータを得、一方、参照細胞または参照細胞群由来のＲＮＡ含有参照サンプルを請求項１０−１４のいずれかに記載の方法に付することによって増幅ｃＤＮＡ断片を記載する参照データを予め調製しておき、次いで本データと参照データの比較を行ってこれら２つのデータセット中、異なるレベルで発現されたｃＤＮＡ断片を同定し、その後、異なって発現されたｃＤＮＡ断片を用いて、どの発現産物の発現レベルが変化したかを決定することを含む方法。２２．該本データおよび参照データが、増幅されたＤＮＡ断片の見かけの分子量、増幅されたＤＮＡ断片のＭ_r、増幅されたＤＮＡ断片の絶対量および増幅されたＤＮＡ断片の相対量からなる群から選択される請求項２１に記載の方法。２３．該参照データが、請求項２２で規定される参照データ、および場合により参照物由来の増幅されたｃＤＮＡ断片それぞれの遺伝的起源に関するさらなる情報を含むデータベースから抽出される請求項２２に記載の方法。２４．少なくとも１つの細胞タイプにおける少なくとも１つの発現産物の発現レベルが基準からはずれていることによって特徴付けられる、対象における疾患の診断方法であって、少なくとも１つの細胞タイプ由来のＲＮＡ含有サンプルを調製し、このサンプルを請求項１０−１４のいずれかに記載の方法に付することによって、このサンプル由来の増幅されたｃＤＮＡ断片を記載するデータを得、疾患を患っていない対象の同じタイプの細胞由来のＲＮＡ含有参照サンプルから得られる増幅ｃＤＮＡ断片を記載する参照データを、参照サンプルを前もって請求項１０−１４のいずれかに記載の方法に付することによって調製し、次いで該疾患に関連することが知られているｃＤＮＡ断片群に関し、本データと参照データの比較を行い、発現産物の発現レベルが基準から逸脱しているか否かを確定するために、本データと参照データ間に有意な相違が存在するかどうかを評価することを含む方法。２５．該データおよび参照データが、増幅されたＤＮＡ断片の見かけの分子量、増幅されたＤＮＡ断片のＭｒ、増幅されたＤＮＡ断片の絶対量および増幅されたＤＮＡ断片の相対量からなる群から選択される請求項２４に記載の方法。２６．該参照データが、請求項２５で規定される参照データ、および場合により参照物由来の増幅されたｃＤＮＡ断片それぞれの遺伝的起源に関するさらなる情報を含むデータベースから抽出される請求項２４に記載の方法。２７．第一鎖ｃＤＮＡの合成方法であって、ｍＲＮＡを含むサンプルを、５５ ℃を超えない温度で行われる第一工程では、該５５℃を超えない温度で実質的に逆転写酵素活性を有する第一の酵素を用い、４５℃から９５℃の範囲の高い温度で行われる第二工程では、該第一の酵素が実質的に不活性である該高い温度で実質的に逆転写酵素活性を有する第二の酵素を用いて、逆転写反応に付することを含む方法。２８．両酵素が両工程に存在する請求項２７に記載の方法。２９．５５℃を超えない温度で逆転写を触媒することに関し、該第一の酵素が該第二の酵素より実質的に高い活性を有する請求項２７に記載の方法。３０．該高められた温度で逆転写を触媒することに関し、該第二の酵素が該第一の酵素より実質的に高い活性を有する触媒である請求項２８または２９に記載の方法。３１．該第一の酵素が、熱安定でない逆転写酵素からなる群から選択され、該第二の酵素が、逆転写酵素活性を有する熱安定ＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択される請求項２７−３０のいずれかに記載の方法。３２．該第一の酵素が、ＡＭＶ(Avian Mveloblastosis Virus)、Ｍ−ＭｕＬＶ（murine M-MuLV pol gene）またはＨＩＶ−１（HIV virus）由来の熱安定でない逆転写酵素からなる群から選択される逆転写酵素である請求項３１に記載の方法。３３．該第二の酵素が、Ｔａｑ(Thermus aquaticus)、Ｓｔｏｆｆｅｌ(Thermu s aquaticus)、Ｔｈｔ(Thermus thermophilus)、Ｔｆｌ／Ｔｕｂ(Thermus flavu s)、Ｔｒｕ(Thermus Ruber)、Ｔｃａ(Thermus caldophilus)、Ｔｆｉｌ(rrhermu s fihfornlis)、Ｔｂｒ(Thermus Brockianus)、Ｂｓｔ(B.Stearothermophilus) 、Ｂｃａ(B.Caldotenax YT-G)、Ｂｃａｖ(B.Caldovelox YT-F)、ＦｊＳＳ３−Ｂ．１(Thermotoga FjSS3-B.1)、Ｔｍａ(Thermus Maritima)、ＵＩＴｍａ(T.Marit ima)、Ｔｌｉ(T.Litorahs)、Ｔｌｉｅｘｏ−(T.Litorahs)、９°Ｎ−７(Thermo coccus sp.)、ＢＧ−Ｄ(Pyrococcus sp.)、Ｐｆｕ(Pfuriosus)、Ｐｗｏ(P.woese i)、Ｓａｃ(S.Acidocaldarius)、ＳｓｏＩ（S．Solfataricus）、Ｔａｃ（T．Ac idophilum）およびＭｔｈ（Methananococcus Voltae）のような好熱性ユーバクテリア由来の逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択される熱安定性酵素である請求項３１に記載の方法。３４．第一工程において逆転写を行う酵素がＭＭｕＬＶ、ＡＭＶまたはＨＩＶ −１であり、ならびに／あるいは第二工程において逆転写を行う酵素がＴｔｈまたはＴａｑである請求項２７−３３のいずれかに記載の方法。３５．ＲＮＡの逆転写に用いられる組成物であって、ａ）５５℃を超えない温度で逆転写酵素活性を有する第一の酵素ｂ）４５℃〜９５℃の範囲の高い温度で逆転写酵素活性を有する第二の酵素を含み、該第二の酵素が、該高い温度で逆転写を触媒することに関し、該第一の酵素より実質的に高い活性を有する組成物。３６．該第一の酵素が、５５℃を超えない温度で逆転写を触媒することに関し、該第二の酵素より実質的に高い活性を有する請求項３５に記載の組成物。３７．予め逆転写酵素活性を有するもう１つの酵素によってインビトロで逆転写されたＲＮＡの逆転写に用いるための組成物の調製における、逆転写酵素活性を有する熱安定な酵素の使用。３８．ｃＤＮＡ断片でコーティングされた表面（チップ）の製造方法であって、以下の工程を含む方法：ＲＮＡ含有サンプルを請求項８−１４のいずれかに記載の方法に付し、ならびに、分離された増幅ｃＤＮＡ断片を、その空間的な相対分布パターンを維持しながら、分離された増幅ｃＤＮＡ断片と安定に結合するようにしたチップ表面に移す。３９．ｃＤＮＡ断片でコーティングされた表面（チップ）の製造方法であって、以下の工程を含む方法：ＲＮＡ含有サンプルを請求項１−７のいずれかに記載の方法に付し、このようにして得られた増幅ｃＤＮＡ断片を、電気泳動後の相対的な分布パターンを維持しながら、分離された増幅ｃＤＮＡ断片と安定に結合するようにした特定の表面上で電気泳動によって分離する。４０．該電気泳動がマイクロ電気泳動形態である請求項３９に記載の方法。４１．電気泳動ブロッティング技術によって移動を行う請求項３８−４０のいずれかに記載の方法。４２．光活性化有機または無機化学技術によって移動を行う請求項３８−４０のいずれかに記載の方法。４３．請求項３８−４２のいずれかに記載の方法によって得ることができる、それに安定に結合したｃＤＮＡを有してなる表面。４４．ある遺伝子ファミリーの範囲内の遺伝子についてのスクリーニング方法であって、表面に安定に結合したｃＤＮＡが、検出可能にラベルされた、遺伝子ファミリーの代表物である核酸と低度に厳重な条件下でハイブリダイズする請求項４３に記載の表面を調製し、次いで、ハイブリダイゼーションが生じたチップの断片を、そのような断片が同じ遺伝子ファミリーに関連するかどうかを決定するために分析することを含む方法。４５．第一の細胞または細胞タイプと第二の細胞または細胞タイプ間の発現パターンの相違を測定する方法であって、第一および第二の細胞または細胞タイプ由来のラベルされたＲＮＡまたはｃＤＮＡのサンプルを調製し、次いでこれらのサンプルそれぞれを請求項４３に記載の表面と接触させ、次いで各サンプル由来の結合したラベル化ＲＮＡまたはｃＤＮＡの量および分布を検出することを含む方法。４６．前もって選択されたタンパク質とポリペプチド断片の間の相互作用についてのスクリーニング方法であって、請求項１−１４のいずれかに記載の方法にしたがって、増幅されたｃＤＮＡ断片の細別化ライブラリーを調製し、場合によりベクターへの挿入を容易にするためにライブラリーのメンバーの末端にアダプターを付け、この断片をベクターに挿入し、このベクターで適当な宿主細胞集団を形質転換し、宿主細胞が正しく挿入されたｃＤＮＡ断片を発現することを可能にする条件下でこの宿主細胞を培養し、次いで挿入されたｃＤＮＡ断片によってコードされるポリペプチド断片を、前もって選択されたタンパク質との相互作用についてアッセイすることを含む方法。４７．前もって選択されたタンパク質をコードする核酸物質で交配またはトランスフェクトされ、首尾よく交配／トランスフェクトされれば、前もって選択されたタンパク質とポリペプチド断片の間の相互作用が検出可能なシグナルを生じる細胞または細胞群となる真核生物細胞を宿主細胞とする、２−ハイブリッド技術によってポリペプチド断片のアッセイを行う請求項４６に記載の方法。４８．真菌、例えば酵母細胞を交配／トランスフェクションに用いる請求項４７に記載の方法。４９．検出可能なシグナルが緑色蛍光タンパク質によって提供される請求項４７または４８に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号０４３２／９８ (32)優先日平成10年３月27日(1998．3．27) (33)優先権主張国デンマーク（ＤＫ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．サンプル中に含まれるｍＲＮＡのコード化領域から増幅されたｃＤＮＡ断片群の標準化された細別化ライブラリーを調製する方法であって、以下の工程を含む方法：（ａ）一般式：５’−Ｃｏｎ₁−ｄＴ_n2−Ｖ_n3−Ｎ_n4−３’ ［式中、Ｃｏｎ₁は１−１００ヌクレオチドの範囲の任意の配列であり、ｄＴはデオキシチミジニルであり、ＶはＡ、ＧまたはＣであり、ＮはＡ、Ｇ、Ｃまたはで示される少なくとも１つのｃＤＮＡプライマーを用いて、サンプル由来のｍＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡ断片の第一の鎖を得、（ｂ）ＤＮＡｐｏｌＩ酵素またはＤＮＡｐｏｌＩ酵素のクレノー断片、４つすべてのデオキシリボヌクレオシド三リン酸を含み、標準的な緩衝液および温度条件の適当な酵素／緩衝溶液中、第一鎖ＤＮＡ断片を鋳型として用い、一般式：５’−Ｃｏｎ₂−Ｎ_x−３’ ［式中、Ｃｏｎ₂は１−１００ヌクレオチドの範囲の任意の配列であり、ｃｏｎ₁ と異なるか、あるいは同じであり得、Ｎ_xはＡ、Ｇ、ＴまたはＣであり、ｘはで示される第二のｃＤＮＡプライマーを用いて、第一鎖ｃＤＮＡ断片と相補的な第二鎖ｃＤＮＡを合成して二重鎖ｃＤＮＡ断片を得、ならびに、（ｃ）工程（ｂ）で得られたｃＤＮＡ断片を、一般式：５’−Ｃｏｎ₃−Ｎ_n1−３’ Ｉ［式中、Ｃｏｎ₃はＣｏｎ₁またはＣｏｎ₂あるいは両方と同一の配列であり、Ｎで示される１セットの増幅プライマーであって、少なくとも１つのセットのプライマーがｎ＞０である一般式Ｉで示され、該少なくとも１つのセットが、Ｃｏｎ₁ またはＣｏｎ₂とその５’末端が相補的な任意のヌクレオチド配列の増幅を開始することができる１セットの増幅プライマーを用いる分子増幅手法にかけ、増幅されたｃＤＮＡ断片を得る。２．サンプル中に含まれるｍＲＮＡのコード化領域から増幅されたｃＤＮＡ断片群の標準化された細別化ライブラリーを調製する方法であって、以下の工程を含む方法：（ａ）少なくとも１つのｃＤＮＡプライマーを用いてサンプル由来のｍＲＮＡを逆転写し、第一鎖ｃＤＮＡ断片を得、（ｂ）第一鎖ＤＮＡ断片を鋳型として用いて、第一鎖ｃＤＮＡ断片と相補的な第二鎖ｃＤＮＡを合成し、二重鎖ｃＤＮＡ断片を得、（ｃ）二重鎖ｃＤＮＡ断片を少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼで消化し、開裂されたｃＤＮＡ断片を得、（ｄ）工程（ｃ）で得られた開裂されたｃＤＮＡ断片に少なくとも２つのアダプター断片を連結し、連結されたｃＤＮＡ断片を得、ならびに、（ｅ）工程（ｄ）で得られた連結されたｃＤＮＡ断片を、工程（ｄ）で用いたアダプター断片に対する、一般式：５’−Ｃｏｍ−Ｎ_n1−３’ ＩＩ［式中、Ｃｏｍは少なくとも開裂されたｃＤＮＡ断片の３’末端に連結されているアダプター断片の５’末端に対して相補的な配列であり、ＮはＡ、Ｇ、Ｔまたで示される１セットの増幅プライマーであって、少なくとも１つのセットのプライマーはｎ１＞０である一般式Ｉで示され、該少なくとも１つのセットが、Ｃｏｍに対してその５’末端が相補的なアダプター断片に対して、その３’末端で連結された任意のヌクレオチド配列の増幅を開始することができる１セットの増幅プライマーを用いる分子増幅手法に付し、増幅されたｃＤＮＡ断片を得る。３．ｍＲＮＡが真核生物、始原細菌または原核生物起源である請求項１または２に記載の方法。４．高度に厳密な条件下で逆転写を行う請求項１−３のいずれかに記載の方法。５．約４５℃から約９５℃の範囲の温度で逆転写酵素活性を有する酵素を用い、該範囲の温度で逆転写を行う先の請求項のいずれかに記載の方法。６．酵素が、例えば、Ｔａｑ（Thermus aquaticus）、Ｓｔｏｆｆｅｌ（Therm us aquaticus）、Ｔｈｔ（Thermus thermophilus）、Ｔｆｌ／Ｔｕｂ（Thermus flavus）、Ｔｒｕ（Thermus Ruber）、Ｔｃａ（Thermus caldophilus）、Ｔｆｉｌ（Thermus filiformis）、Ｔｂｒ（Thermus Brockianus）、Ｂｓｔ（B．Stear othermophilus）、Ｂｃａ（B．Caldotenax YT-G）、Ｂｃａｖ（B．Caldovelox Y T-F）、ＦｊＳＳ３−Ｂ．１（Thermotoga FjSS3-B.1）、Ｔｍａ（Thermus Marit ima）、ＵＩＴｍａ（T．Maritima）、Ｔｌｉ（T．Litoralis）、Ｔｌｉｅｘｏ −（T．Litoralis）、９°Ｎ−７（Thermococcus sp.）、ＢＧ−Ｄ（Pyrococcus sp.）、Ｐｆｕ（P．furiosus）、Ｐｗｏ（P．woesei）、Ｓａｃ（S．Acidocald arius）、Ｓｓｏｌ（S．Solfataricus）、Ｔａｃ（T．Acidophi-lum）およびＭｔｈ（Methananococcus Voltae）のような好熱性ユーバクテリア由来の逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択される熱安定性酵素である請求項５に記載の方法。７．約２５℃から約５５℃の範囲の温度で逆転写酵素活性を有する酵素を用い、該範囲の温度で逆転写を行う請求項１−４のいずれかに記載の方法。８．酵素が、例えばＡＭＶ（Avian Myeloblastosis Virus）、Ｍ−ＭｕＬＶ（ murine M-MuLV pol gene）またはＨＩＶ−１（HIV virus）由来の逆転写酵素からなる群から選択される逆転写酵素である請求項７に記載の方法。９．第一工程は請求項７または８に記載の逆転写を行うことを含み、第二工程は請求項５または６に記載の逆転写を行うことを含む二連続工程で逆転写を行う請求項１−４のいずれかに記載の方法。１０．逆転写酵素活性を有する非同一の酵素を用いて二つの工程で逆転写を行う請求項９に記載の方法。１１．非同一の酵素を各工程において別々に加えるか、あるいは非同一の酵素が両工程において存在する請求項１０に記載の方法。１２．第一工程で活性な酵素の活性が第二工程において実質的に破壊される請求項11に記載の方法。１３．第一工程において逆転写を行う酵素がＭＭｕＬＶ、ＡＭＶまたはＨＩＶ −１であり、ならびに／あるいは第二工程において逆転写を行う酵素がＴｔｈまたはＴａｑである請求項９−１２のいずれかに記載の方法。１４．少なくとも１つのｃＤＮＡプライマーには、その３’末端にオリゴｄＴ尾部またはポリｄＴ尾部が含まれる上記請求項のいずれかに記載の方法。１５．少なくとも１つのｃＤＮＡプライマーが一般式：５’−ｄＴ_n2−Ｖ_n3−Ｎ_n4−３’ ［式中、ｄＴはデオキシチミジニルであり、ＶはＡ、ＧまたはＣであり、ＮはＡ、の整数である。］で示される請求項１４に記載の方法。１６．ｎ３が１である場合、３×４ⁿ⁴群のｃＤＮＡプライマーが用いられ、構造：−Ｖ_n3−Ｎ_n4−に関し、各群は他の群のいずれからも明確に区別される請求項１５に記載の方法。１７．ｍＲＮＡのプールを３×４ⁿ⁴部分に細別し、これをそれぞれ別々に、３ ×４ⁿ⁴群のｃＤＮＡプライマーのうち１つを用いる工程（ａ）に付し、これにより３×４ⁿ⁴の別々のプール中へ第一鎖ｃＤＮＡを細別したものを得る請求項１６に記載の方法。１８．ｎ４が０または１である請求項１６または１７に記載の方法。１９．少なくとも１つのｃＤＮＡプライマーが５’末端にポリｄＴ尾部またはオリゴｄＴ尾部を含まないか、あるいは、少なくとも１つが５’末端にポリｄＴ尾部またはオリゴｄＴ尾部を含み、かつ少なくとももう１つが５’末端にポリｄＴ尾部またはオリゴｄＴ尾部を含まない少なくとも２つのｃＤＮＡプライマーを用いる請求項１−１３のいずれかに記載の方法。２０．５’末端にポリｄＴ尾部またはオリゴｄＴ尾部を含まないｃＤＮＡプライマーが以下の構造を有する請求項１９に記載の方法：５’−Ｎ_xＴＴＡ−３’または５’−Ｎ_xＣＴＡ−３’または５’−Ｎ_xＴＣＡ− ３’ ２１．第一および第二のｃＤＮＡ鎖のヌクレオチド間のミスマッチを最小にする条件下で工程（ｂ）を行う上記請求項のいずれかに記載の方法。２２．少なくとも１つの制限酵素を、確実にｃＤＮＡの少なくとも６０％を開裂させるように選択する上記請求項のいずれかに記載の方法。２３．ｃＤＮＡの開裂時に、接着末端を有する開裂ｃＤＮＡ断片を生じさせる少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼを用いることを含む上記請求項のいずれかに記載の方法。２４．少なくとも１つの制限酵素を、完全なｃＤＮＡ断片それぞれを平均約３個の断片に開裂させるように選択する上記請求項のいずれかに記載の方法。２５．少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼとして微量４塩基カッター、例えば４塩基カッターＡｃｉＩ、ＡｌｕＩ、ＢｆａＩ、ＢｓｔＵＩ、Ｃｓｐ６Ｉ、ＤｐｎＩ、ＤｐｎＩＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎＰＩＩ、ＨｐａＩＩ、ＭｂｏＩ、ＭｎＩＩ、ＭｓｅＩ、ＭｓｐＩ、ＮｌａＩＩＩ、ＲｓａＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、ＴａｉＩ、ＴａｑＩおよびＴｓｐ５０９Ｉを用いることを含む上記請求項のいずれかに記載の方法。２６．１つの制限酵素を用いる上記請求項のいずれかに記載の方法。２７．統計学的に、ｍＲＮＡサンプル由来の完全なｃＤＮＡの少なくとも２０％を２つのサブ断片に開裂させる第一の制限酵素、および統計学的に、該サブ断片の少なくとも５０％を３つのさらなるサブ断片に開裂させる第二の制限酵素を用いることを含む請求項１−２１のいずれかに記載の方法２８．少なくとも１つの終結断片であって、そこから出発する５’→３’方向のＤＮＡ重合に対するブロックを導入し、分子増幅手法中、工程（ｅ）における少なくとも２つのプライマーセットのいずれのプライマーともアニーリングすることができないものを、工程（ｄ）において開裂されたｃＤＮＡ断片の一本鎖の３’末端に連結することを含む、上記請求項のいずれかに記載の方法。２９．少なくとも１つの終結断片が化学修飾されたヌクレオチド配列であるか、あるいはそれを含む請求項２８に記載の方法。３０．化学修飾されたヌクレオチド配列が３’末端にジデオキシヌクレオチドを含む請求項２９に記載の方法。３１．ジデオキシヌクレオチドがヌクレオチド鎖に共有結合している請求項３０に記載の方法。３２．工程（ｄ）において、工程（ｃ）で開裂されたｃＤＮＡ断片の接着末端にアダプター断片をアニーリングさせ、この産物をＤＮＡリガーゼ活性を有する酵素の作用に付することによって、アダプターおよび／または終結断片を開裂ｃＤＮＡ断片に連結する上記請求項のいずれかに記載の方法。プライマーが、ｎ１＝１、ｎ１＝２、ｎ１＝３またはｎ１＝４で示されるものである上記請求項のいずれかに記載の方法。３４．式Ｉまたは式ＩＩで示される少なくとも１つのセットの増幅プライマーにおいて、ｎ１＝０である上記請求項のいずれかに記載の方法。３５．式Ｉまたは式ＩＩ中、ｎ１＝０の増幅プライマーのセットがラベルされている請求項３４に記載の方法。３６．式Ｉまたは式ＩＩ中、ｎ１＞０で示される増幅プライマーのセットが基：Ｎ_n1におけるＡ、Ｇ、ＴおよびＣのすべての可能な組み合わせおよび順列を含む上記請求項のいずれかに記載の方法。３７．工程（ｅ）の分子増幅前に連結されたｃＤＮＡ断片をたくさんのプールに細別し、各プールを増幅プライマーセットのサブセットを用いる増幅に付す、上記請求項のいずれかに記載の方法。３８．各プール用に用いる増幅プライマーのサブセットが請求項３５で規定するプライマーを含む請求項３６に記載の方法。３９．請求項３５で規定する１つの増幅プライマーの使用、および請求項３６で規定する１セットのプライマーの使用を含む上記請求項のいずれかに記載の方法。４０．工程（ｄ）の連結されたｃＤＮＡ断片を４ⁿ¹個のプールに細別し、それぞれを別々に、請求項３５で規定する１つの増幅プライマーおよび請求項３６で規定する増幅プライマーセット由来の１つのプライマーであって、いずれかの他のプールを増幅するために用いられるプライマーのいずれともはっきりと区別される１つのプライマーを用いる工程（ｅ）に付する請求項３９に記載の方法。４１．分子増幅手法から得られた増幅断片を分離するさらなる工程を含む上記請求項のいずれかに記載の方法。４２．ゲル電気泳動またはクロマトグラフィーによって該分離を行う請求項４１に記載の方法。４３．分離された増幅断片を同定する工程をさらに含む請求項４１または４２に記載の方法。４４．視覚化によって該同定を行う請求項４３に記載の方法。４５．プローブまたは増幅断片の一部であるラベルされたヌクレオチドを視覚化する請求項４４に記載の方法。４６．該ラベルされたヌクレオチドが請求項３５で規定するラベルされたプライマーの一部である請求項４５に記載の方法。４７．ＰＣＲ中に、Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｔ、ＵまたはＧである放射能または蛍光アルファｄＮＴＰをｃＤＮＡ断片に包含させることによって該視覚化を行う請求項４６に記載の方法。４８．細胞または細胞群中の発現産物の存在を測定する方法であって、細胞または細胞群由来のＲＮＡ含有サンプルを調製し、このサンプルを請求項１−４７のいずれかに記載の方法に付し、その後、このように同定された増幅ｃＤＮＡ断片を、以下によって作成される、既知の配列の制限ＤＮＡ断片の分子量のコンピューター生成リストを含むデータベース出力と比較することを含む方法：ＤＮＡ配列データを仮想ＤＮＡ配列としてデータベースに入力および保存し、次いで少なくとも１つの制限ヌクレアーゼでの仮想ＤＮＡ配列の開裂をシミュレートし、得られたシミュレーション開裂産物を仮想開裂ＤＮＡ断片として保存し、仮想開裂断片に対する少なくとも２つのアダプター断片の連結をシミュレートし、この結果を仮想連結ＤＮＡ断片として保存し、工程（ｅ）で用いられるプライマーの個々の組み合わせそれぞれについて、同じグループ中の該プライマーの組み合わせによつて増幅されやすい仮想連結ＤＮＡ断片をグループ化し、各グループ中の、それぞれの仮想連結ＤＮＡ断片の絶対的および／または相対的な分子量を測定し、ならびに、各グループの内容物を、このグループ中の仮想連結断片の絶対的および／または相対的な分子量を含むリストの形態で出力する。４９．入力ＤＮＡ配列データを、このＤＮＡ配列データの遺伝的起源に関するデータ、および場合によりこの遺伝的起源に関する機能的特徴に関するデータとリンクさせる請求項４８に記載の方法。５０．該出力の表示内容が、仮想的に連結されたＤＮＡ断片の遺伝的起源についての情報、および場合によりこの遺伝的起源に関連する機能的特徴についての情報をさらに含む請求項４８に記載の方法。５１．同定された増幅ｃＤＮＡ断片を、データベース出力との自動的な比較を可能にする形式で入力することによって比較を行うか、あるいは別法として、データベース出力を、分離された増幅ｃＤＮＡ断片とデータベース出力間の直接比較を可能にする形式で出力することによって比較を行う請求項３８−５０のいずれかに記載の方法。５２．第二のセットの条件に付された参照細胞または参照細胞群中の発現と比較して、細胞または細胞群の発現パターンに影響する第一のセットの条件に付された細胞または細胞群内の発現産物の発現の変化を測定する方法であって、細胞または細胞群由来のＲＮＡ含有サンプルを調製し、このサンプルを請求項４３− ４７のいずれかに記載の方法に付し、それにより、このサンプル由来の増幅されたｃＤＮＡ断片を記載するデータを得、一方、参照細胞または参照細胞群由来のＲＮＡ含有参照サンプルを請求項４３−４７のいずれかに記載の方法に付することによって増幅ｃＤＮＡ断片を記載する参照データを予め調製しておき、次いで本データと参照データの比較を行い、この２つのデータセット中、異なるレベルで発現されたｃＤＮＡ断片を同定し、その後、異なって発現されたｃＤＮＡ断片を用いて、どの発現産物の発現レベルが変化したかを測定することを含む方法。５３．該データおよび参照データが、増幅されたＤＮＡ断片の見かけの分子量、増幅されたＤＮＡ断片のＭｒ、増幅されたＤＮＡ断片の絶対量および増幅されたＤＮＡ断片の相対量からなる群から選択される請求項５２に記載の方法。５４．該参照データが、請求項５３で規定される参照データ、および場合により参照物由来の増幅されたｃＤＮＡ断片それぞれの遺伝的起源に関するさらなる情報を含むデータベースから抽出される請求項５２に記載の方法。５５．少なくとも１つの細胞タイプにおける少なくとも１つの発現産物の発現レベルが基準からはずれていることによって特徴付けられる、対象における疾患の診断方法であって、少なくとも１つの細胞タイプ由来のＲＮＡ含有サンプルを調製し、このサンプルを請求項４３−４７のいずれかに記載の方法に付することによって、このサンプル由来の増幅されたｃＤＮＡ断片を記載するデータを得、疾患を患っていない対象の同じタイプの細胞由来のＲＮＡ含有参照サンプルから得られる増幅ｃＤＮＡ断片を記載する参照データを、参照サンプルを前もって請求項４３−４７のいずれかに記載の方法に付することによって調製し、次いで疾患に関連することが知られているｃＤＮＡ断片に関し、本データと参照データの比較を行い、発現産物の発現レベルが基準から逸脱しているか否かを確定するために、本データと参照データ間に有意な相違が存在するかどうかを評価することを含む方法。５６．該データおよび参照データが、増幅されたＤＮＡ断片の見かけの分子量、増幅されたＤＮＡ断片のＭｒ、増幅されたＤＮＡ断片の絶対量および増幅されたＤＮＡ断片の相対量からなる群から選択される請求項５５に記載の方法。５７．該参照データが、請求項５６で規定される参照データ、および場合により参照物由来の増幅されたｃＤＮＡ断片それぞれの遺伝的起源に関するさらなる情報を含むデータベースから抽出される請求項５５に記載の方法。５８．第一鎖ｃＤＮＡの合成方法であって、ｍＲＮＡを含むサンプルを、５５ ℃を超えない温度で行われる第一工程において、該５５℃を超えない温度で実質的に逆転写酵素活性を有する第一の酵素を用い、４５℃から９５℃の範囲の高い温度で行われる第二工程において、該第一の酵素が実質的に不活性である該高い温度で実質的に逆転写酵素活性を有する第二の酵素を用いる逆転写に付することを含む方法。５９．両酵素が両工程に存在する請求項５８に記載の方法。６０．５５℃を超えない温度で逆転写を触媒することに関し、該第一の酵素が該第二の酵素より実質的に高い活性を有する請求項５８に記載の方法。６１．該高められた温度で逆転写を触媒することに関し、該第二の酵素が該第一の酵素より実質的に高い活性を有する触媒請求項５９または６０に記載の方法。６２．該第一の酵素が、熱安定でない逆転写酵素からなる群から選択され、該第二の酵素が、逆転写酵素活性を有する熱安定なＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択される請求項５８−６１のいずれかに記載の方法。６３．ＲＮＡの逆転写に用いられる組成物であって、ａ）５５℃を超えない温度で逆転写酵素活性を有する第一の酵素ｂ）４５℃〜９５℃の範囲の高い温度で逆転写酵素活性を有する第二の酵素を含み、該第二の酵素が、該高い温度で逆転写を触媒することに関し、該第一の酵素より実質的に高い活性を有する組成物。６４．該第一の酵素が、５５℃を超えない温度で逆転写を触媒することに関し、該第二の酵素より実質的に高い活性を有する請求項６３に記載の組成物。６５．逆転写酵素活性を有するもう１つの酵素により、前もってインビトロで逆転写されたＲＮＡの逆転写に用いるための組成物の調製における、逆転写酵素活性を有する熱安定な酵素の使用。６６．ｃＤＮＡ断片でコーティングされた表面（チップ）の製造方法であって、以下の工程を含む方法：ＲＮＡ含有サンプルを請求項４１−４７のいずれかに記載の方法に付し、ならびに、分離された増幅ｃＤＮＡ断片を、その空間的な相対分布パターンを維持しながら、分離された増幅ｃＤＮＡ断片と安定に結合するようにしたチップ表面に移す。６７．ｃＤＮＡ断片でコーティングされた表面（チップ）の製造方法であって、以下の工程を含む方法：ＲＮＡ含有サンプルを請求項１−４０のいずれかに記載の方法に付し、このように得られた増幅ｃＤＮＡ断片を、電気泳動後の相対的な分布パターンを維持しながら、分離された増幅ｃＤＮＡ断片と安定に結合するようにした特定の表面上で電気泳動によって分離する。６８．該電気泳動がマイクロ電気泳動形態である請求項６７に記載の方法。６９．電気泳動ブロッティング技術によって移動を行う請求項６６−６８のいずれかに記載の方法。７０．光活性化有機または無機化学技術によって移動を行う請求項６６−６８のいずれかに記載の方法。７１．請求項６６−７０のいずれかに記載の方法によって得られる、それに安定に結合したｃＤＮＡを有してなる表面。７２．ある遺伝子ファミリーの範囲内の遺伝子についてのスクリーニング方法であって、表面に安定に結合したｃＤＮＡが、検出可能にラベルされた、遺伝子ファミリーの代表物である核酸と低度に厳重な条件下でハイブリダイズする請求項７１に記載の表面を調製し、次いで、ハイブリダイゼーションが生じたチップの断片を、同じ遺伝子ファミリーに関連するかどうかを決定するために分析することを含む方法。７３．第一の細胞または細胞タイプと第二の細胞または細胞タイプ間の発現パターンの相違を測定する方法であって、第一および第二の細胞または細胞タイプ由来のラベルされたＲＮＡまたはｃＤＮＡのサンプルを調製し、次いでこれらのサンプルそれぞれを請求項７１に記載の表面と接触させ、次いで各サンプル由来の結合したラベル化ＲＮＡまたはｃＤＮＡの量および分布を検出することを含む方法。７４．前もって選択されたタンパク質とポリペプチド断片の間の相互作用についてのスクリーニング方法であって、請求項１−４７のいずれかに記載の方法にしたがって、増幅されたｃＤＮＡ断片の細別化ライブラリーを調製し、場合によりベクターへの挿入を容易にするためにライブラリーのメンバーの末端にアダプターを付け、この断片をベクターに挿入し、このベクターで適当な宿主細胞集団を形質転換し、宿主細胞が正しく挿入されたｃＤＮＡ断片を発現することを可能にする条件下でこの宿主細胞を培養し、次いで挿入されたｃＤＮＡ断片によってコードされるポリペプチド断片を、前もって選択されたタンパク質との相互作用についてアッセイすることを含む方法。７５．２−ハイブリッド技術によってポリペプチド断片のアッセイを行い、ここに宿主細胞が、前もって選択されたタンパク質をコードする核酸物質で交配され、あるいはトランスフェクトされ、首尾よく交配／トランスフェクトされれば、前もって選択されたタンパク質とポリペプチド断片の間の相互作用が検出可能なシグナルを生じる細胞または細胞群となる真核生物細胞である請求項７４に記載の方法。７６．真菌、例えば酵母細胞を交配／トランスフェクションに用いる請求項７５に記載の方法。７７．検出可能なシグナルが緑色蛍光タンパク質によって提供される請求項７５または７６に記載の方法。