CN102409047B - 一种构建杂交测序文库的方法 - Google Patents

一种构建杂交测序文库的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102409047B
CN102409047B CN201010299269.6A CN201010299269A CN102409047B CN 102409047 B CN102409047 B CN 102409047B CN 201010299269 A CN201010299269 A CN 201010299269A CN 102409047 B CN102409047 B CN 102409047B
Authority
CN
China
Prior art keywords
group
primer
index
label
described
Prior art date
Application number
CN201010299269.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102409047A (zh
Inventor
蒋慧
刘晓
吴仁花
欧阳伟汉
武靖华
吴明枝
赵美茹
Original Assignee
深圳华大基因科技服务有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 深圳华大基因科技服务有限公司 filed Critical 深圳华大基因科技服务有限公司
Priority to CN201010299269.6A priority Critical patent/CN102409047B/zh
Publication of CN102409047A publication Critical patent/CN102409047A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102409047B publication Critical patent/CN102409047B/zh

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1093General methods of preparing gene libraries, not provided for in other subgroups

Abstract

本发明提供了用于核酸测序,特别是序列捕获技术的标签,以及采用PCR方法引入所述标签的方法。本发明还提供了用于封闭接头的接头封闭序列,及其在NimbleGen芯片杂交系统、Agilent液相杂交系统和NimbleGen EZ液相杂交系统中的用途。本发明进一步还提供了使用上述标签和/或接头封闭序列用于构建文库和/或测序的方法,以及通过所述方法构建的文库。

Description

一种构建杂交测序文库的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及核酸测序技术领域,特别是序列捕获技术领域,特别是基于杂交的序列捕获技术。另外,本发明还涉及标签技术,以及实现多个样品在同一反应体系中进行序列捕获的方法。本发明的方法特别适用于第二代测序技术,尤其是SOlexa测序技术。本发明的方法可用于基因组学研究。

背景技术[0002] 以Illumina solexa、AB Solid和Roche 454为代表的第二代测序技术使测序成本大大降低,在近几年得到快速发展,并成为基因组学研究的重要工具。与链终止法的sanger测序技术相比,第二代测序技术采用边合成边测序的技术策略。第二代测序技术最大的特点是高通量,其可对数以亿计的DNA片段同时进行测序,目前一台高通量测序仪一次可产生高达200Gb的数据,相当于将一个人的全基因组测序65次。然而这种高通量的测序技术是通过超声波或其他方法将基因组打断成一系列的小片段,并在小片段的两侧加上接头,然后通过接头引物进行桥式PCR或emotion PCR扩增形成测序的基本单位,再根据接头上的部分序列设计公共测序引物,对基因组DNA进行测序。

[0003] 尽管高通量的测序技术使测序成本大大降低,然而测序一个人的全基因组序列仍需要数万美元,这对于需要对大量样品进行测序的疾病研究等研究项目来说,总测序成本仍然很昂贵,难以大规模推广应用。另一方面,对于研究人类某些疾病的科学家来说,他们并不需要对全基因组进行测序,他们感兴趣的往往只是很小部分的基因组区域,例如全外显子区(相当于I %的人全基因组大小),如果能选择性地对这些区域进行测序,将使测序总成本显著降低同时也能缩短测序时间。序列捕获技术是一种对基因组特定区域进行选择性富集的技术,其通过合适的方法将感兴趣的区域从基因组中分离出来,然后再对该目标区域进行测序,这对于低成本地有针对性的进行基因组学研究有非常重要的意义。

[0004] 目前常用的序列捕获方法主要有三种:PCR法、分子倒置探针法(Molecularinsersion probes,MIP)和杂交法。PCR法具有高灵敏性、高特异性和重复性好等优点。PCR富集法在第二代测序技术平台也有潜在的应用前景,其适合用于捕获一些很小的区域,特别是一些连续的区域。对于较大的非连续的区域,如全外显子,该方法需要合成大量的引物、大规模的PCR反应和高强度的劳动力等。因此,PCR序列捕获方法的适用性受到较大的限制。尽管最近报道的微滴PCR(RainStorm)等PCR技术能在一定程度上缓解上述部分问题,然而实际上这些PCR反应由于在同一反应中使用多种引物,导致大量非特异扩增产物的产生,并且容易出现部分区域无法扩增的情况,此外其扩增的区域大小也有限。

[0005] 分子倒置探针富集法具有样品前期处理简单、样品需求量极小等优点,然而其需要合成价格较高的分子探针、均一性较差、难以对一些区域较大的基因组序列进行捕获等缺点,限制了该技术在第二代测序平台的应用前景。

[0006] 基于杂交的序列捕获技术是目前在第二代测序平台中使用较多的序列富集方法,主要分为芯片杂交和液相杂交两种。芯片杂交序列捕获技术是一种将探针合成在芯片上,并在芯片上进行杂交的高通量序列捕获技术,其可以在一个芯片内捕获整个外显子甚至更大的区域。液相杂交技术是通过将芯片上合成的探针剪切回收之后进行扩增富集而构建用于杂交的目的杂交探针库,液相杂交在动力学上相对固相杂交更具优势,能降低对于样品起始量要求。

[0007] 芯片杂交技术与液相杂交技术属于高通量的序列捕获技术,对于需要对大量样品进行重测序的项目来说,逐一对样品进行杂交与洗脱需要大量的劳动力与时间,同时也增加了成本和操作错误的风险。为了与第二代测序技术平台联合使用,我们需要实现多个样品在同一反应体系中进行杂交洗脱,同时在测序后又能分辨来源不同的样品,这将使工作量与工作时间大大减少,对减少操作错误的风险也有一定的预防作用。

[0008] 最近,国外研究人员报道了多个样品混合杂交的方法(专利号:W02009106308 ;公开号:W02009/106208A2 ;公开日:2009年9月3日),该方法通过连接接头的方法引入代表特定样品的标签序列(共133个标签序列)来区分不同来源的DNA样品。所有标签序列均由11个脱氨核苷酸组成,位于测序引物和DNA样品之间。在构建测序文库时,每个样品接上包括不同标签序列的接头,混合后在NimbleGen芯片杂交系统中进行序列捕获。洗脱后的捕获序列在Roche 454测序平台进行测序,通过测序接头上的标签序列来区分不同来源的样品。

[0009] 然而,该技术在应用范围和效率等多个方面还存在缺陷:

[0010] 1、其通过接头引入标签序列的方法不利于该技术在Solexa等测序平台的应用:一方面,接头连接后加入的标签序列位于测序引物与样品DNA之间,在测序样品DNA之前必须先测序Ilbp的标签序列,这种用同一测序引物对标签序列和样品DNA进行连续测序的方法在测序长度本来就较短的第二代测序技术平台中使用,无疑会进一步缩短样品DNA的有效测序长度;另一方面,基于接头连接的方法引入标签序列会导致样品DNA的两个末端均带上标签序列,这样在Solexa等测序平台进行双末端测序时会导致标签序列被测序两次,造成测序数据的浪费。

[0011] 2、该技术没有使用接头的blocks (也称为封闭序列),这会导致样品在杂交时,由于接头互补序列之间的退火,使样品DNA与探针的结合效率降低,影响序列捕获效果,同时,没有任何关联的样品DNA可能由于接头之间的退火而相连,并级联放大形成“大分子DNA",当探针与靶DNA退火结合后,同时也会把与靶DNA相连的其他非靶DNA —起捕获下来,造成捕获序列中存在大量的非靶序列。

[0012] 3、由于该技术主要针对芯片杂交进行优化,而在液相系统中使用时,由于样品DNA起始量较小,它们通过接头连接在一起后,可能对序列捕获效果产生较大影响,同时也可能捕获大量非靶序列。因此,该技术方案在Agilent液相杂交平台的序列捕获效果可能会较差。

[0013] 4、该技术采用连接带有标签序列接头方式进行文库制备,对于起始量要求较高,不利于大规模推广用于疾病研究领域。 发明内容

[0014] 本发明设计了长度为8bp的一段核酸序列,作为标签(也称为index)序列(如表I所示),用于对不同的样品进行标记。标记后的不同来源样品可以在同一杂交系统中进行序列捕获,捕获的序列在洗脱后通过测序其上的标签序列,即可确定该序列的样品来源。设计的任意两个标签序列之间至少有3个碱基的差异,这种设计使我们可以在测序后对偶然出现的标签序列测序错误有一定的校正功能(能对标签序列中一个喊基的测序错误进行发现与校正)。设计的标签序列不包括与测序引物3’末端有较高相似性的序列和一些包含3个以上连续相同碱基的序列。本发明通过PCR方法为样品引入标签序列,该方法简单有效,同时大大减少了对于样品起始量要求。

[0015] 本发明设计并合成了 2条接头的blocks序列,分别命名为blockl和block2 (如表2中所示),用于接头序列的封闭。这些blocks只封闭DNA单链5’端的接头序列,其中blockl封闭测序芯片接头P5及测序引物I (SPl)区,block2封闭测序引物2(SP2)区、标签区和测序芯片接头P7区。blockl对所有样品都是一样的,所以叫做公用block ;block2是针对不同的标签序列设计的,所以在进行杂交时要为含不同标签序列的样品加入相应的block2。

[0016] 本发明目的在于实现多个样品在同一反应体系中进行序列捕获,该技术方案包括从样品基因组DNA起始到测序结果输出全部实验流程。技术方案主要由以下三部分组成:文库构建、杂交、测序与数据分析。

[0017] 文库构建:将样品基因组DNA通过包括但不限于超声波打断法打断成200~250bp大小的片段,通过末端修复、加“A”碱基、连接等过程为DNA片段加上接头,然后通过PCR方法在不同来源的基因组文库样品DNA的接头末端引入Sbp的标签序列,使每个基因组DNA文库均带上含特定序列的标签。其中标签序列可以位于接头序列末端。PCR产物纯化后即完成文库的构建与不同来源样品DNA的标记。 [0018] 杂交:将上一步纯化获得的需要杂交的样品(是否就是上步纯化的PCR产物)按一定比例(混合比例可根据预计需要数据量确定,例如,如需要数据量均为20X测序深度,则取等量样品进行混合)混合,在95°C变性10分钟后在NimbleGen芯片杂交平台或Agilent液相杂交平台进行杂交,同时在杂交体系中加入接头的blockl和block2以及重复序列block(Cot-1DNA)。Cot-1DNA是基因组中重复比例较高的一部分DNA片段,在杂交时使用能帮助提高杂交效率,Cot-1DNA可得自商品化的产品Human Cot-1 DNA®(invitrogen),可参考:革文新,万大方,赵新泰,蒋惠秋,顾健人.人cot-lDNA的制备[J].《肿瘤》1998年5月(第18卷第3期)(127)。待杂交完毕后,通过变性等方法收集捕获的序列并纯化,得到来自不同样品捕获后的序列混合物。

[0019] 测序与数据分析:将捕获的序列在Solexa或其他测序平台(需要在构建文库时加入相应的接头(比如对于SOLiD测序平台,使用该测序平台提供的短片段文库构建接头)采用边合成边测序的方法进行序列测定。先用测序引物I (SPl)对样品DNA的一端测序,再用测序引物3(SP3)对标签序列测序,最后用测序引物2 (SP2)对样品DNA的另一端进行测序(SP1,SP2,SP3均来自Illumina商业测序试剂盒)。对用SP3测序引物测序得到的数据进行分析可知其上的标签序列,根据此标签序列确定其对应的样品DNA的来源。

[0020]发明的有益.效果

[0021] 本发明的提供的方法中,技术方案采用PCR方法引入特定的标签序列,标签序列引入效率显著提高。该方法可保证只在其中一个接头末端引入标签序列,避免了两次对标签序列进行测序造成的数据浪费,而且能通过PCR方法减少对于样品起始量要求.[0022] 本发明的提供的方法中,标签序列与样品DNA序列的测序采用不同的测序引物,分次进行测序,避免了由于对标签序列测序而导致样品DNA有效测序长度的降低。

[0023] 本发明所提供的方法采用了 8个碱基的标签序列,其中任意两个标签序列之间至少有3个碱基的差异,这种设计可在一定程度上防止样品标签序列由于测序错误(可对标签序列中一个碱基的测序错误进行发现与校正)而引起样品弄混,因此在数据分析时具有一定的校正功能。

[0024] 本发明所提供的方法中引入了接头引物的blocks。这些blocks可封闭接头序列,避免样品DNA由于接头退火连在一起而影响捕获效率和导致非特异序列捕获。

[0025] 本发明所提供的方法中,标签序列与样品DNA序列的测序采用不同的测序引物,分次进行测序,避免了由于对标签序列测序而导致样品DNA有效测序长度的降低。

[0026] 本发明所提供的blocks只封闭单链DNA 5’末端的接头区域,而不封闭其3’末端区域,在保证接头区域有效封闭的同时,又避免了捕获的序列在洗脱后可能残留的blocks在PCR反应中作为引物扩增而导致样品标签序列弄混和样品标签序列丢失。

[0027] 本发明所提供的方法在NimbleGen芯片杂交系统、Agilent液相杂交系统和NimbleGen EZ液相杂交系统中均适用,在相同或接近的测序深度(每个碱基被测序次数)时作为衡量序列捕获效果的目标区域覆盖度和序列捕获特异性指标在单个样品杂交或者多个样品杂交时结果一致。

[0028] 本发明所提供的方法在构建杂交测序文库时,只需要更换为所使用测序平台提供的对应接头引物序列, 即可适用于Roche 454和ABSOLiD等其他的第二代测序平台,有较广的应用前景。

附图说明

[0029] 图1:实验流程图。本发明的技术方案包括从DNA起始到数据输出整套实验流程,在保证序列捕获效率的同时,可实现不同样品在同一反应体系中同时进行序列捕获。

[0030] 图2:构建完成的含特定标签序列的样品DNA文库示意图。其中标签序列通过PCR方法引入。

[0031] 图3:接头Blocks杂交封闭示意图。Blocks只封闭单链DNA 5’末端的接头。

[0032] 图 4:单个样品杂交(Pooling-1, Pooling-3, Pooling-4, Pooling-5, Pooling-11,Pooling-12)和两个样品混合后杂交(Pooling-31, Pooling-32, Pooling-33, Pooling-34,Pooling-35, Pooling-36),在Nimblegen液相杂交系统杂交的捕获效率。其中,横坐标depth表示测序深度,纵坐标coverage (% )表示捕获效率。

[0033] 图 5:单个样品杂交(Pooling-1, Pooling-3, Pooling-4, Pooling-5, Pooling-11,Pooling-12)和两个样品混合后杂交(Pooling-31, Pooling-32, Pooling-33, Pooling-34,Pooling-35, Pooling-36),在Nimblegen液相杂交系统杂交后测序,数据比对至目标区域的比例统计结果。其中横坐标pooling表示样品编号,纵坐标Percent(%)表示数据比对至目标区域的比例。

具体实施方式

[0034] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将会理解,下列实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。

[0035] 本发明一方面提供了一组标签,所述一组标签包括如下或由如下组成:表3所示159个标签或与之相差一个碱基的标签中的至少10个,或至少20个,或至少30个,或至少40个,至少50个,或至少60个,或至少70个,或至少80个,或90个,或至少100个,或至少110个,或至少120个,或至少130个,或至少140个,或至少150个,或全部159个,

[0036] 所述一组标签优选地至少包括表3所示的159个标签中的Index_Newl_10,或 Index_Newll_20, Index_New21_30,或 Index_New31_40, Index_New41_50,或 Index_New51-60, Index_New61-70,或 Index_New71_80, Index_New81_90,或 Index_New91_100,Index_Newl01-110,或 Index_Newlll_120, Index_Newl21_130,或 Index_Newl31_140,Index_Newl41-150,或Index_Newl51_159,或者他们任何两个或多个的组合。

[0037] 在本发明的一个具体实施方式中,所述“相差一个碱基的标签”的表述中,相差一个碱基包括标签序列中I个碱基的取代、添加或缺失。[0038] 本发明另一方提供了所述标签用于构建的基因组文库,以及进行序列捕获和/或测序的用途,其中所述标签包含在用于扩增目的序列的PCR引物中,从而构成各自相对应的PCR标签弓丨物,其中使用所述PCR标签引物和如表2所示的引物PE Primer 1.0通过PCR方法为基因组文库引入标签序列。优选地,所述PCR标签弓丨物是3’引物,引物PEPrimer 1.0是5 ’引物。

[0039] 本发明进一步提供了使用所述标签构建的基因组文库。

[0040] 本发明一方面提供了含有上述标签的一组PCR标签引物,其中所述PCR标签引物包含所述标签,并且优选地用作PCR的3’引物,所述一组PCR标签引物包括如下或由如下组成:表1所示159个PCR标签引物或与其中包含的标签相差一个碱基的PCR标签引物中的至少10个,或至少20个,或至少30个,或至少40个,至少50个,或至少60个,或至少70个,或至少80个,或90个,或至少100个,或至少110个,或至少120个,或至少130个,或至少140个,或至少150个,或全部159个,

[0041] 所述一组标签优选地至少包括表1所示的159个PCR标签引物中的Index_Newl-1OPrimer, 或 Index_Newll_20Primer, Index_New21_30Primer, 或 Index_New31-40Primer, Index_New41_50Primer, 或 Index_New5l_60Primer, Index_New61-70Primer, 或 Index_New71_80Primer, Index_New81_90Primer, 或 Index_New91-1OPrimerOPrimer, Index_NewlOPrimer1-1IOPrimer,或 Index_NewlIl-120Primer,Index_Newl21-130Primer,或 Index_Newl31-140Primer, Index_Newl41-150Primer,或Index_Newl51-159Primer,或者他们任何两个或多个的组合。

[0042] 在本发明的一个具体实施方式中,“与其中包含的标签相差一个碱基的PCR标签引物”的表述中,所述相差一个碱基包括对表3所示的159个标签定序列中I个碱基的取代、添加或缺失。

[0043] 本发明另一方面提供了所述PCR标签引物用于构建的基因组文库,以及进行序列捕获和/或测序的用途,其中使用所述PCR标签引物和如表2所示的引物PE Primer 1.0通过PCR方法为基因组文库引入标签序列。优选地,所述PCR标签引物是3’引物,引物PEPrimer 1.0 是 5,引物。

[0044] 本发明进一步提供了使用所述PCR标签引物构建的基因组文库,其中使用所述PCR标签引物和如表2所示的引物PE Primer 1.0通过PCR方法进行构建。优选地,所述PCR标签引物是3’引物,引物PEPrimer 1.0是5’引物。

[0045] 本发明另一方面提供了接头封闭序列,其如表2中blockl和block2所示的序列或与其相差一个碱基的序列,其中block2中的NNNNNNNN如表4中所示的block序列或与其相差一个碱基。

[0046] 在本发明的一个具体实施方式中,“关于接头封闭序列的上下文中,所述相差一个碱基包括序列中I个碱基的取代、添加或缺失。

[0047] 本发明另一方面提供了所述接头封闭序列用于封闭接头序列的用途,在进行杂交时要为含不同标签序列的每个样品加入相应的block。

[0048] 在本发明的一个具体实施方式中,所述杂交在包括但不限于如下杂交系统的中进行=NimbleGen芯片杂交系统、Agilent液相杂交系统和NimbleGen EZ液相杂交系统。

[0049] 本发明进一步提供了使用所述接头封闭序列构建的基因组文库。

[0050] 本发明另一方面提供了一种构建基因组文库的方法,所述方法的特征在于使用上文所述PCR标签引物,和/或使用上文所述接头封闭序列。

[0051] 本发明另一方面提供了一种构建基因组文库的方法,其包括:

[0052] 文库构建:将样品基因组DNA通过包括但不限于超声波打断法打断成优选为200~250bp大小的片段,通过末端修复、加“A”碱基、接头连接等过程为DNA片段加上特定接头,然后通过PCR方法使用上文所述PCR标签引物和如表2所示的引物PE Primer 1.0对不同来源的基因组文库样品DNA进行扩增,优选地所述PCR标签引物是3’引物,引物PEPrimer 1.0是5’引物,使每个基因组DNA文库均带上含特定序列的标签,其中所引入的标签序列可以位于接头序列末端;然后对PCR产物进行纯化;其中所述特定接头包括但不限于以下步骤所使用测序平台所提供的接头。

[0053] 杂交:经纯化的PCR产物作为杂交文库按一定比例(根据各样品所需要的数据量确定)混合,在95°C变性10分钟后在NimbleGen芯片杂交平台或Agilent液相杂交平台进行杂交,同时在杂交体系中加入接头的blockl和block2以及重复序列block(Cot-1DNA);待杂交完毕后,通过变性等方法收集捕获的序列并纯化,得到来自不同样品捕获后的序列混合物。所述重复序列block(Cot-1DNA)是基因组上重复比例较高的一些序列,用于提交杂交效率。

[0054] 本发明进一步提供了通过上文所述的方法构建的文库或文库混合物。

[0055] 本发明另一方面提供了一种测序的方法,所述方法的特征在于使用上文所述的PCR标签引物,和/或使用上文所述的接头封闭序列。

[0056] 在本发明的另一方面中,使用通过上文所述的方法构建的文库或文库混合物进行测序。文库测序可采用任何方法,例如双脱氧链终止法。然而,优选高通量测序方法:如第二代测序技术(Metzker ML.Sequencing technologies-the next generation.NatRev Genet.2010Jan ;11(1 ):31-46),包括 SOLEXA、SOLID 和 454 (焦磷酸测序)测序技术(平台)。或者是单分子测序技术(单分子测序平台),包括Helic0s公司的True SingleMolecule DNA sequencing 技术,Pacific Biosciences 公司的 the single molecule,real-time (SMRT.TM.)技术,以及 Oxford Nanopore Technologies 公司的纳米孔测序技术等(Rusk, Nicole (2009-04-01).CheapThird-Generation Sequencing.Nature Methods6(4):244-245) 0

[0057] 本发明另一方面提供了一种测序的方法,其包括:

[0058] 测序与数据分析:将捕获的序列在Solexa或其他测序平台(需要在构建文库时加入相应的接头)采用边合成边测序的方法进行序列测定。具体而言,先用测序引物I(SPl)对样品DNA的一端测序,再用测序引物3 (SP3)对标签序列测序,最后用测序引物2 (SP2)对样品DNA的另一端进行测序(Illumina测序试剂盒中商业测序引物)。对用SP3测序引物测序得到的数据进行分析可知其上的标签序列,根据此标签序列确定其对应的样品DNA的来源。

[0059] 在本发明的一个具体实施方式中,所述的方法中,标签序列与样品DNA序列的测序采用不同的测序引物,分次完成两端测序以及中间标签序列测序。

[0060] 在本发明的一个具体实施方式中,所述的方法适用于Roche 454和AB Solid等其他的第二代测序平台。

[0061] 表1, PCR标签引物列表(Index_NewN Primer),其中N为1-159的整数。

[0062]

Figure CN102409047BD00101
Figure CN102409047BD00111
Figure CN102409047BD00121
Figure CN102409047BD00131
Figure CN102409047BD00141

[0067] 表2引物列表

[0068]

Figure CN102409047BD00142

[0069] 其中Index—NewN Primer中的NNNNNNNN代表8bp的标签序列(具体序列见表3标 签序列),Block 2中NNNNNNNN代表8bp标签序列的block (具体序列见表4block序列), 所有序列在IDT/Invitrogen/Takra合成,使用HLPC纯化.[0070] 表3X8列表信息

[0071]

Figure CN102409047BD00143
Figure CN102409047BD00151
Figure CN102409047BD00161
Figure CN102409047BD00171
Figure CN102409047BD00181

[0072] 表4标签序列的block序列

Figure CN102409047BD00182
Figure CN102409047BD00191
Figure CN102409047BD00201

[0076] 所用试剂和仪器的列表:

[0077] 主要实验仪器列表

[0078]

Figure CN102409047BD00202

[0079]

Figure CN102409047BD00211

[0082] 实施例1.NimbleGen芯片杂交体系(Roche NimbleGen公司)的对照实施例:单个样品在Nimblegen 855K芯片上杂交

[0083]( 一 )实验方法:

[0084] 1、杂交文库构建

[0085]杂交文库构建流程参考 Illumina Multiplexing Sample Preparation Guide,取3ug基因组DNA(从人外周血中提取)打断后,末端补平,加“A”碱基,加接头(来自IlluminaMultiplexing Sample PreparationOligonucleotide Kit)并进行 PCR 扩增,PCR 反应体系及反应条件如下:

[0086] 反应体系:

Figure CN102409047BD00221

[0088] 反应条件:

[0089] (a).98°C 30s

[0090] (b).98°C 15s

[0091] (c).65°C 30s

[0092] (d).72°C 30s

[0093] (e).重复(b) - (d)步骤 3-9 次(共 4-10 循环)

[0094] (f).72°C 5min

[0095] (g).4°C 静置

[0096]使用 Ampure beads 按照 Agencourt AMPure protocol (美国 Beckman 公司)纯化PCR产物,溶解至25ul纯水中,使用NanoDrop 1000检测PCR产物浓度。

[0097] 2、杂交:

[0098] a.样品准备:

Figure CN102409047BD00222

[0100] b.将准备好的样品置于SpeedVac中60°C蒸干,然后加入11.2 μ L的超纯水溶解样品。

[0101] C.全速离心样品30秒,分别加入以下两种试剂:18.5μ L的2XSCHybridiationBuffer(Roche NimbleGen 公司)和 7.3 μ L 的 SC HybridiationComponent A (RocheNimbleGen公司)。震荡混匀后置于离心机上全速离心30秒,然后于95°C使DNA变性10分钟。

[0102] d.将带有相应探针的芯片按要求固定在杂交仪(Roche NimbleGen公司)上,将变性后的样品加入芯片中并封闭芯片,然后设定杂交程序,于42°C杂交64-72小时。

[0103] e.芯片洗涤与样品洗脱:

[0104]

Figure CN102409047BD00231

[0105] f.将NaOH洗脱液回收,并用32μ L的20%冰醋酸中和。

[0106] g.将上述中和液用Qiagen MinElute PCR Purification Kit纯化,捕获后的样品最后溶解于138 μ L纯水中。

[0107] h.PCR扩增捕获的DNA文库,分为6管50 μ L反应进行PCR:

[0108]

Figure CN102409047BD00232

[0109] 反应条件:

[0110] (a).980C 30s

[0111] (b).98°C 15s

[0112] (c).62°C 30s

[0113] (d).72°C 30s

[0114] (e).重复(b)-(d)步骤 11-19 次(共 12-20 次)

[0115] (f).72°C 5min

[0116] (g).4°C 静置

[0117] 1.PCR 产物用 Qiagen QIAquick PCR Purification Kit 纯化,最后溶于 30 μ L 纯水中。

[0118] 3、测序与数据分析:

[0119] 将样品于Solexa测序平台中进行双末端测序,同时对样品上的标签序列也进行测序。通过数据分析测序数据的样品来源,并对样品的捕获效果进行分析统计。

[0120] (二)结果:[0121] 单个样品855K区域序列捕获效果见表一。

[0122] 表一:单个样品在Nimblegen 855K芯片上杂交结果

[0123]

Figure CN102409047BD00241

[0124] 实施例2.在NimbleGen芯片杂交体系中应用的实施例:12个DNA文库(按照杂交文库构建流程构建)混合后用855K芯片进行序列捕获

[0125](一)实验方法:

[0126] 1、杂交文库的制备:方法与实施例1所述相同。

[0127] 2、杂交:

[0128] a.样品准备:

Figure CN102409047BD00242

[0129]

[0130] 将12个文库(按照杂交文库构建方法构建)混合到一块在同一张芯片上杂交,杂交方法与实施例1相同。

[0131] 3、测序与数据分析:方法与实施例1所述相同。

[0132] (二)结果:

[0133] 12个样品混合后用855K芯片进行序列捕获效果见表二。

[0134] 表二:12个样品混合后用855K芯片进行序列捕获效果:

[0135]

Figure CN102409047BD00251

[0136] 实施例3.在NimbleGen芯片杂交体系中应用的实施例:24个文库(按照杂交文库构建方法构建)混合后用855K芯片进行序列捕获

[0137](一)实验方法:

[0138] 1、杂交文库的制备:方法与实施例1相同。

[0139] 2、杂交:

[0140] a.样品准备:

Figure CN102409047BD00252

[0142] 将24个样品混合到一块在同一张芯片上杂交,杂交方法与实施例1相同。

[0143] 3、测序与数据分析:方法与实施例1相同。

[0144] (二)结果:

[0145] 24个样品混合后用855K芯片进行序列捕获的效果见表三。

[0146] 表三:24个样品混合后用855K芯片进行序列捕获效果:

[0147]

Figure CN102409047BD00261

[0148] NimbleGen芯片杂父体系实施结果总结:在实施例2和3中,用本发明提供的标签序列分别对12个、24个样品进行标记,在NimbleGen芯片杂交系统中对约850kb大小的基因组区域进行序列捕获,结果显示,所有12或24个样品均取得了很好的序列捕获效果。所有样品靶区域的捕获效率都在98%以上,而且有效深度均在30X以上。而单个样品测序深度超过1000X时捕获效率达到99%,这一结果与12个样品或者24个样品进行混合杂交的结果接近。

[0149] 实施例4.NimnleGen芯片杂交体系的对照实施例:单个样品用34M全外显子芯片(Roche NimbleGen公司)进行序列捕获

[0150](一)实验方法:

[0151] 1、杂交文库的制备:方法与实施例1相同。

[0152] 2、杂交:

[0153] 单个样品分别在Nimlegen 34M全外显子芯片上杂交,6个重复(图4、图5中pooling K pooling 3Λ pooling 4Λ pooling 5Λ pooling IK pooling 12)。

[0154] a.样品准备:

Figure CN102409047BD00271

[0156] 杂交方法与实施例1相同。

[0157] 3、测序与数据分析:方法与实施例1相同。

[0158] 实施例5.在NimbleGen芯片杂交体系中应用的实施例:两个样品(按照杂交文库构建方法构建)混合后用34M全外显子芯片进行序列捕获

[0159](一)实验方法:

[0160] 1、杂交文库的制备:方法与实施例1相同。

[0161] 2、杂交:两个样品混合后在Nimlegen 34M全外显子芯片上杂交,3个重复(图1、图 2 中 pooling 31 和 pooIing3l>pooIing 33 和 pooling 34、pooling35 和 pooling 36)。

[0162] a.样品准备:

Figure CN102409047BD00272

[0164] 杂交方法与实施例1相同。

[0165] 3、测序与数据分析:方法与实施例1相同。

[0166] (二)结果:

[0167] 图4和图5分别显示了使用Nimblegen芯片单个样品和两个样品杂交构建文库数据结果,在目标区域覆盖度以及在测序序列比对至目标区域百分比上两种杂交方法结果没

有显著差异。

[0168] 实施例6.Agilent液相杂交体系(Agilent公司)对照实施例:单个样品用38M全外显子序列捕获

[0169](一)实验方法:

[0170] 1、杂交文库的制备:方法与实施例1相同。

[0171] 2、杂交

[0172] a.用浓缩等方法准备≥3.4μ L 147ng/y L的DNA文库。

[0173] b.配制 Hybridization Buffer (所有试剂都来自 Agilent 公司):

[0174]

Figure CN102409047BD00281

[0175] c.准备 SureSelect Oligo Capture Library Mix(所有试剂都来自 Agilent 公

司),并于冰上放置:

[0176]

Figure CN102409047BD00282

[0177] d.于PCR管中加入样品SureSelect-SC的DNA文库,同时加入Blockl、Block2各0.3ul,混匀后保持在65°C中。

[0178] e.按要求将 Hybridization Buffer 和 SureSelect Oligo Capture Library Mix加入到PCR管中,混匀,于65°C (热盖设为105°C )杂交24小时

[0179] f.杂交后的样品用Dynal磁珠(Invitrogen)吸附样品,并用50 μ LSureSelectElution Buffer洗脱捕获后的序列。

[0180] g.加入 50μL SureSelect Neutralization Buffer 中和捕获样品。

[0181] h.将上述中和液用Qiagen MinElute PCR purification Kit纯化,捕获后的样品最后溶解于15 μ LEB中。

[0182] 1.捕获序列的PCR扩增:

Figure CN102409047BD00283

[0184] 反应条件:

[0185] (a).98 °C 2min

[0186] (b).98°C 20s

[0187] (c).60°C 30s

[0188] (d).72°C 30s[0189] (e).重复(b)-(d)步骤 9-14 次(共 10-15 次)

[0190] (f).72°C 5min

[0191] (g).4°C 静置

[0192] j.PCR 产物用 AMPure DNA Purification kit(SPRI beads)纯化,溶于 95 μ LEB中。

[0193] 3、测序与数据分析:方法与实施例1相同。

[0194] 实施例7.Agilent液相杂交体系的实施例:两个样品混合后进行38Μ全外显子序列捕获

[0195] 1、杂交文库的制备:方法与实施例1相同。

[0196] 2、杂交:将SureSelect-DCl和SureSelect_DC2两个样品混合后杂交,方法与实施例6相同。

[0197] 3、测序与数据分析:方法与实施例1相同。

[0198] (二)结果:

[0199] 单个样品38M全外显子序列捕获和两个样品混合后进行38M全外显子序列捕获的效果见表四:

[0200] 表四:单个样品及两个样品混合在一块在Agilent液相杂交系统杂交的结果

[0201]

Figure CN102409047BD00291

[0202]其中样品 SureSelect-SC 是单独杂交捕获的,SureSelect-DCl 和 SureSelect_DC2是两个样品混在一起杂交捕获的。

[0203] 本实施例用本发明提供的标签序列对两个样品进行标记,用AgilentSureSelect全外显子探针对两个混合的样品(Agilent-SureSelect-DCl 和 Agilent-SureSelect_DC2)进行杂交捕获,在Illumina Solexa平台上测序后通过区分标签序列将不同来源的样品区分开。表四中的结果显示,在测序深度达到20X以上时,单个样品杂交(Agilent-SureSelect-SC)和两个样品混合杂交(Agilent-SureSelect-DCl 和Agilent-SureSelect-DC2)覆盖度都达到96%以上,捕获效率也均接近60%.实验数据表明使用该实验流程在Agilent SureSelect平台中单个样品杂交和两个样品无显著差异.[0204] 实施例8.在Nimblegen液相杂交体系中的对照实施例,单个样品34M全外显子序列捕获

[0205]( 一 )实验方法:

[0206] 1、杂交文库的制备:方法与实施例1相同。

[0207] 2、杂交

[0208] a.样品准备:

[0209] a.样品准备:在一个1.5mL EP管中加入以下成分[0210]

Figure CN102409047BD00301

[0211] b.将上述准备好的样品置于SpeedVac中60°C蒸干。

[0212] c.在上述蒸干的EP管中分别加入以下两种试剂

[0213] 2X SC Hybridiation Buffer 7.5 μ L

[0214] SC Hybridiation Component 3uL

[0215] d.震荡混匀后置于离心机上全速离心10秒,将离心后样品转移至95°C使DNA变性10分钟。

[0216] e将上述杂交混合物转入分装好的4.5 μ L Exome Library中(来自RocheNimbleGen 公司)

[0217] f.放在PCR仪上47 V杂交64h_72h,PCR仪热盖应设置保持在57 °C。

[0218] g.捕获序列的洗漆:(洗漆试剂都来自Roche NimbleGen公司)

[0219] 先用Dynal磁珠(Invitrogen)选择性的回收捕获到DNA,然后对捕获到的DNA进行洗漆。先用预热到47Ό的IX Wash Buffer I洗一次,然后用预热到47Ό的IX StringentWash Buffer洗两次,最后用室温放置的IX Wash Buffer 1、I1、III分别洗一次。

[0220] h.加入50 μ L纯水悬浮磁珠。

[0221] 1.PCR扩增捕获的DNA文库,分两管进行PCR(每管100 μ L)

[0222] 在1.5ml的离心管中配制PCR反应体系

[0223]

Figure CN102409047BD00302

[0224] 反应条件:

[0225] (a).98°C 30s

[0226] (b).98°C 15s

[0227] (c).62°C 30s

[0228] (d).72°C 30s

[0229] (e).重复(b) - (d)步骤 14-19 次(共 15-20 次)[0230] (f).72°C 5min

[0231] (g).4°C 静置

[0232] j.PCR产物用 Qiagen QIAquick PCR Purification Ki 纯化,最后溶于 30 μ L 纯水中。

[0233] 3、测序与数据分析:方法与实施例1相同。

[0234] 实施例9.在Nimblegen液相杂交体系中的实施例,两个样品混合后在在Nimblegen液相杂交系统进行34Μ全外显子序列捕获

[0235]( 一 )实验方法:

[0236] 1、杂交文库的制备:方法与实施例1相同。

[0237] 2、杂交:将Nimlegen-EZ-DCI和Niml egen-EZ_DC2两个样品混合后杂交,方法与实施例8相同。

[0238] 3、测序与数据分析:方法与实施例1相同。

[0239] ( 二)结果

[0240] 单个样品34M全外显子序列捕犾和两个样品混合后在在Nimblegen液相杂父系统进行34M全外显子序列捕获的的效果见表五:

[0241] 表五单个样品及两个样品混合在一起在Nimblegen液相杂交系统中杂交的结果

Figure CN102409047BD00311

[0243] 其中样品Nimlegen-EN-SC是单独杂交捕获的,Nimlegen-EN-DC I和Nimlegen-EN-DC 2是两个样品混合在一起杂交捕获的。

[0244]混合的样品(Nimlegen-EZ-DC I 和Nimlegen-EZ_DC2)进行杂交捕获,在 IlluminaSolexa平台上测序后通过区分标签序列将不同来源的样品区分开。表五中的结果显示在测序深度超过20X以上时,单个样品杂交(Nimlegen-EZ-SC)和两个样品混合杂交(Nimlegen-EZ-DCl和Nimlegen-EZ_DC2)杂交覆盖度都超过了 98%,且能比对到目标区域的测序序列(reads)的比例也非常接近,两种建库方法之间不存在显著差异。

[0245] 尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述,本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导,可以对那些细节进行各种修改和替换,这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

[0246] 参考文献

[0247] 1.Metzker M.L.,2010.Sequencing techno1gies~the nextgeneration.NatureGenetics,11:31-46.[0248] 2.Mamanova L., e t al.,2010.Tar ge t-enr i chment strategiesfornextgeneration sequencing.Nature methods,7(2):111-118.[0249] 3.Ng S.B., et al.,2009.Targeted capture and massivelyparallelsequencing of 12human exomes.Nature,461:272-276.[0250] 4.Michael E..System and method for improved processing ofnucleicacids for production of sequencable libraries.1nternationalpatent,20090903, W02009106308.

Claims (44)

1.一组标签,所述一组标签至少包括表3所示的159个标签中的Index_Newl-10。
2.权利要求1所述的一组标签,其还包括Index_Newll-20。
3.权利要求1所述的一组标签,其还包括Index_New21-30。
4.权利要求1所述的一组标签,其还包括Index_New31-40。
5.权利要求1所述的一组标签,其还包括Index_New41-50。
6.权利要求1所述的一组标签,其还包括Index_New51-60。
7.权利要求1所述的一组标签,其还包括Index_New61-70。
8.权利要求1所述的一组标签,其还包括Index_New71-80。
9.权利要求1所述的一组标签,其还包括Index_New81_90。
10.权利要求1所述的一组标签,其还包括Index_New91_100。
11.权利要求1所述的一组标签,其还包括Index_Newl01_110。
12.权利要求1所述的一组标签,其还包括Index_Newlll-120。
13.权利要求1所述的一组标签,其还包括Index_Newl21-130。
14.权利要求1所述的一组标签,其还包括Index_Newl31_140。
15.权利要求1所述的一组标签,其还包括Index_Newl41_150。
16.权利要求1所述的一组标签,其还包括Index_Newl51-159。
17.权利要求1-16中任一项所述的一组标签用于构建基因组文库的用途,其中所述标签包含在用于扩增目的序列的PCR引物中,从而构成各自相对应的PCR标签引物,其中使用所述PCR标签引物和如表2所示的引物PE Primerl.0通过PCR方法为基因组文库引入标签序列。
18.权利要求17所述的用途,其中所述PCR标签引物是3’引物,引物PE Primerl.0是5’引物。
19.使用权利要求1-16中任一项所述的一组标签构建的基因组文库。
20.含有权利要求1-16中任一项所述的一组标签的一组PCR标签引物,其中所述PCR标签引物包含权利要求1-16中任一项所述的标签,所述一组标签至少包括表1所示的159个 PCR 标签引物中的 Index_Newl-10Primer。
21.权利要求20所述的一组PCR标签引物,其还包括Index_Newll-20Primer。
22.权利要求20所述的一组PCR标签引物,其还包括Index_New21-30Primer。
23.权利要求20所述的一组PCR标签引物,其还包括Index_New31-40Primer。
24.权利要求20所述的一组PCR标签引物,其还包括Index_New41-50Primer。
25.权利要求20所述的一组PCR标签引物,其还包括Index_New51-60Primer。
26.权利要求20所述的一组PCR标签引物,其还包括Index_New61-70Primer。
27.权利要求20所述的一组PCR标签引物,其还包括Index_New71-80Primer。
28.权利要求20所述的一组PCR标签引物,其还包括Index_New81-90Primer。
29.权利要求20所述的一组PCR标签引物,其还包括Index_New91-1OPrimerOPrimer。
30.权利要求20所述的一组PCR标签引物,其还包括Index_NewlOPrimer 1-1 IOPrimer。
31.权利要求20所述的一组PCR标签引物,其还包括Index_Newlll-120Primer。
32.权利要求20所述的一组PCR标签引物,其还包括Index_Newl21-130Primer。
33.权利要求20所述的一组PCR标签引物,其还包括Index_Newl31-140Primer。
34.权利要求20所述的一组PCR标签引物,其还包括Index_Newl41-150Primer。
35.权利要求20所述的一组PCR标签引物,其还包括Index_Newl51-159Primer。
36.权利要求20所述的一组PCR标签引物,其中所述PCR标签引物用作PCR的3’引物。
37.权利要求20所述 的PCR标签引物用于进行构建基因组文库的用途,其中使用所述PCR标签引物和如表2所示的引物PE Primerl.0通过PCR方法为基因组文库引入标签序列。
38.权利要求37所述的用途,其中所述PCR标签引物是3’引物,引物PE Primerl.0是5’引物。
39.使用权利要求20所述的PCR标签引物构建的基因组文库,其中使用所述PCR标签引物和如表2所示的引物PE Primerl.0通过PCR方法进行构建。
40.权利要求39所述的基因组文库,其中所述PCR标签引物是3’引物,引物PEPrimerl.0 是 5,引物。
41.一种构建基因组文库的方法,所述方法的特征在于使用权利要求20所述的PCR标签引物,和/或使用接头封闭序列,所述接头封闭序列如表2中blockl和block2所示的序列或与其相差一个碱基的序列,其中block2中的NNNNNNNN代表8bp的标签序列,选自如表4中所示的block序列或与其相差一个碱基。
42.权利要求41所述的方法,其包括: 文库构建:将样品基因组DNA通过包括但不限于超声波打断法打断成优选为200~250bp大小的片段,通过末端修复、加“A”碱基、接头连接过程为DNA片段加上接头,然后通过PCR方法使用权利要求20所述PCR标签引物和如表2所示的引物PE Primerl.0对不同来源的基因组文库样品DNA进行扩增,使每个基因组DNA文库均带上含特定序列的标签,其中所引入的标签序列可以位于接头序列末端;然后对PCR产物进行纯化; 杂交:经纯化的PCR产物作为杂交文库,根据各样品所需要的数据量确定的一定比例混合,在95°C变性10分钟后在NimbleGen芯片杂交平台或Agilent液相杂交平台进行杂交,同时在杂交体系中加入接头的blockl和block2以及重复序列block即Cot-1DNA ;待杂交完毕后,通过变性等方法收集捕获的序列并纯化,得到来自不同样品捕获后的序列混合物。
43.权利要求42所述的方法,其中所述PCR标签引物是3’引物,引物PE Primerl.0是5’引物。
44.通过权利要求41或42所述的方法构建的文库或文库混合物。
CN201010299269.6A 2010-09-21 2010-09-21 一种构建杂交测序文库的方法 CN102409047B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201010299269.6A CN102409047B (zh) 2010-09-21 2010-09-21 一种构建杂交测序文库的方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201010299269.6A CN102409047B (zh) 2010-09-21 2010-09-21 一种构建杂交测序文库的方法
PCT/CN2011/079906 WO2012037883A1 (zh) 2010-09-21 2011-09-20 核酸标签及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102409047A CN102409047A (zh) 2012-04-11
CN102409047B true CN102409047B (zh) 2014-07-23

Family

ID=45873447

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201010299269.6A CN102409047B (zh) 2010-09-21 2010-09-21 一种构建杂交测序文库的方法

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN102409047B (zh)
WO (1) WO2012037883A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103571822B (zh) * 2012-07-20 2016-03-30 中国科学院植物研究所 一种用于新一代测序分析的多重目的dna片段富集方法
WO2014086037A1 (zh) * 2012-12-07 2014-06-12 深圳华大基因科技服务有限公司 构建核酸测序文库的方法及其应用
CN106086162A (zh) * 2015-11-09 2016-11-09 厦门艾德生物医药科技股份有限公司 一种用于检测肿瘤突变的双标签接头序列及检测方法
CN106676169A (zh) * 2016-11-15 2017-05-17 上海派森诺医学检验所有限公司 一种用于乳腺癌易感基因brca1和brca2突变检测的杂交捕获试剂盒及其方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1364916A (zh) * 2001-10-31 2002-08-21 浙江大学 水稻叶片表达序列标签及其构成的生物芯片
WO2005068656A1 (en) * 2004-01-12 2005-07-28 Solexa Limited Nucleic acid characterisation
CN101100764A (zh) * 2007-06-13 2008-01-09 北京万达因生物医学技术有限责任公司 分子置换标签测序并行检测法即寡聚核酸编码标签分子库微球阵列分析
WO2008093098A2 (en) * 2007-02-02 2008-08-07 Illumina Cambridge Limited Methods for indexing samples and sequencing multiple nucleotide templates

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5237099B2 (ja) * 2005-09-29 2013-07-17 キージーン ナムローゼ フェンノートシャップ 変異させた集団のハイスループットスクリーニング
EP1960541B1 (en) * 2005-11-14 2013-04-24 Keygene N.V. Method for high throughput screening of transposon tagging populations and massive parallel sequence identification of insertion sites

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1364916A (zh) * 2001-10-31 2002-08-21 浙江大学 水稻叶片表达序列标签及其构成的生物芯片
WO2005068656A1 (en) * 2004-01-12 2005-07-28 Solexa Limited Nucleic acid characterisation
WO2008093098A2 (en) * 2007-02-02 2008-08-07 Illumina Cambridge Limited Methods for indexing samples and sequencing multiple nucleotide templates
CN101100764A (zh) * 2007-06-13 2008-01-09 北京万达因生物医学技术有限责任公司 分子置换标签测序并行检测法即寡聚核酸编码标签分子库微球阵列分析

Also Published As

Publication number Publication date
CN102409047A (zh) 2012-04-11
WO2012037883A1 (zh) 2012-03-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Serre et al. Differential allelic expression in the human genome: a robust approach to identify genetic and epigenetic cis-acting mechanisms regulating gene expression
Goodwin et al. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies
Voet et al. Single-cell paired-end genome sequencing reveals structural variation per cell cycle
US10457936B2 (en) Massively parallel contiguity mapping
EP1910562B1 (en) Strategies for high throughput identification and detection of polymorphisms
Schoenfelder et al. The pluripotent regulatory circuitry connecting promoters to their long-range interacting elements
EP2963127B1 (en) High throughput detection of molecular markers based on restriction fragments
EP0327429B1 (en) Labeling by simultaneous ligation and restriction
KR20170020704A (ko) 개별 세포 또는 세포 개체군으로부터 핵산을 분석하는 방법
JP2015091262A (ja) 非侵襲的出生前診断に有用な母体試料由来の胎児核酸のメチル化に基づく富化のためのプロセスおよび組成物
US20100069263A1 (en) Sequence tag directed subassembly of short sequencing reads into long sequencing reads
Van Tassell et al. SNP discovery and allele frequency estimation by deep sequencing of reduced representation libraries
CA2814047C (en) High-throughput immune sequencing
JP2009529876A (ja) 核酸を配列決定するための方法および手段
EP2513341B1 (en) Identification of polymorphic sequences in mixtures of genomic dna by whole genome sequencing
US9249460B2 (en) Methods for obtaining a sequence
JP2018514207A (ja) 特異的分子インデックス(umi)を有する冗長リードを用いたシーケンシングdna断片におけるエラーの抑制
DK2697392T3 (en) SOLUTION OF GENOME FRACTIONS USING Polymorphism COUNTS
EP2877594B1 (en) Detecting and classifying copy number variation in a fetal genome
DK2591125T3 (en) V3-d sequence strategies for genom region of interest
US10482993B2 (en) Analyzing copy number variation in the detection of cancer
US20130029852A1 (en) Detecting and classifying copy number variation
US20160210405A1 (en) Detecting and classifying copy number variation
US20160122753A1 (en) High-throughput rna-seq
US9411937B2 (en) Detecting and classifying copy number variation

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
C06 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C10 Entry into substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1168631

Country of ref document: HK

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20130715

Address after: 518083 science and Technology Pioneer Park, comprehensive building, Beishan Industrial Zone, Yantian District, Guangdong, Shenzhen 201

Applicant after: BGI Technology Solutions Co., Ltd.

Address before: Beishan Industrial Zone Building in Yantian District of Shenzhen city of Guangdong Province in 518083

Applicant before: BGI-Shenzhen Co., Ltd.

Applicant before: BGI-Shenzhen

ASS Succession or assignment of patent right

Free format text: FORMER OWNER: BGI-SHENZHEN

Effective date: 20130715

Owner name: BGI TECHNOLOGY SOLUTIONS CO., LTD.

Free format text: FORMER OWNER: BGI-SHENZHEN CO., LTD.

Effective date: 20130715

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant