CN114438224A - 一种鸭蛋壳性状相关基因型的分子标记、引物及其检测方法和应用 - Google Patents

一种鸭蛋壳性状相关基因型的分子标记、引物及其检测方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鸭蛋壳性状相关基因型的分子标记、引物及其快速检测方法和应用，本申请技术通过设计目的序列和引物，对包含鸭蛋壳性状相关基因型的目的序列的扩增、酶切，通过琼脂糖凝胶电泳
Figure DDA0003491758770000011
直接判定基因型，直接通过电泳条带清晰地判断鸭个体基因组4号染色体上第47418074位点的基因型，从而仅通过一代选育，就可以对产相同色鸭蛋壳的群体实现纯化，实现低成本、快速、准确的选育目标。

Description

一种鸭蛋壳性状相关基因型的分子标记、引物及其检测方法 和应用
技术领域
本发明涉及生物育种和基因型检测，具体为一种鸭蛋壳性状相关基因型的分子标记、引物及其快速检测方法和应用。
背景技术
鸭蛋的青白壳性状属于符合孟德尔遗传的性状，已经发现该性状与ABCG2基因中的一处突变紧密关联，即AA基因型和AG基因型鸭个体产的鸭蛋表现为青壳性状，GG基因型的鸭个体产的鸭蛋表现为白壳性状。市场上比较青睐于青壳蛋，因此快速、准确地剔除蛋鸭种群中表现为白壳性状的种用个体具有重要的经济价值。由于鸭蛋的青壳性状为显性性状，纯粹根据蛋壳颜色来选留青壳性状的鸭个体，后代中仍然会有少量产白壳蛋个体，因此需要根据多个世代不断选育，费时费力。运用分子标记检测法可以在一个世代中迅速筛选出AA基因型个体，后代全部表现为产青壳蛋。
中国专利CN110699465A使用PCR方法扩增出包含该SNP位点的产物，然后运用桑格测序法测序，根据序列结果判定个体基因型进行选留。但该方法需要将扩增产物送交生物公司测序，并根据测序的峰形图具体查看个体基因型，费时费力，且成本较高。
发明内容
为了解决现有的鸭蛋青白壳性状分子检测方法不足的问题，本发明提供了一种更加便捷高效的方法。鸭基因组4号染色体上第47418074位存在G＞A突变，申请人在具体分析鸭基因组4号染色体上第47418074位突变位点周边序列后发现，该突变位点为G时恰好形成了AACGTT的回文结构，该回文结构是AclI限制性内切酶的酶切位点。因此当待测鸭个体在该位点上为AA基因型(当鸭基因组该位点为AA基因型时，该鸭个体产青壳蛋)时，不能被AclI内切酶酶切，为GG基因型(当鸭基因组该位点为GG基因型时，该鸭个体产白壳蛋)时能够完全被AclI内切酶酶切；为AG基因型(当鸭基因组该位点为AA基因型时，该鸭个体产青壳蛋)时，由于等位基因上既有AACGTT序列，也有AACATT序列，即该位点只有部分被酶切。如果将酶切后的序列同时在一个普通的电泳凝胶上清晰呈现，则可以在产业中非常便捷地区分三种基因型。具体来说，本发明为解决上述问题提供了如下的技术方案：
本发明的第一方面，提供了一种鸭蛋壳性状相关基因型的分子标记，所述分子标记为一段DNA，其长度在500bp以内，其序列与鸭基因组4号染色体上的一段序列相同，且包含鸭基因组4号染色体上第47418071-47418076位核苷酸序列。
鸭基因组4号染色体上第47418071-47418076位核苷酸序列为AACRTT，其中R为一个G＞A突变，位于鸭基因组4号染色体上第47418074位，在本申请中将该位点命名为R。所述分子标记包含了AACRTT，因此包含了该突变。
进一步的，当R为G时，AclI内切酶可以将所述分子标记在所述位点断开成两条100bp以上的DNA分子，记为片段a和片段b，所述片段a、片段b以及所述分子标记相互之间的长度差异均在100bp以上和300bp以下。由于片段a、片段b以及所述分子标记这三种DNA分子的分子量均在100bp以上和500bp以下，而且三者彼此长度差异在100bp以上和300bp以下，因此可以同时在同一个普通的琼脂糖凝胶电泳中全部清晰地呈现并且彼此清晰地分离，从而不仅便于肉眼进行准确判断，也便于机器识别，从而可以用图形分析软件进行批量统计。
更进一步的，所述鸭蛋壳性状相关基因型的分子标记的序列如SEQ ID NO：1所示：
TGCCAACTTCACACCCTTCAACTATCTTAAACAGGCTGAAATGCAGGTTGTCAAGCTAGGAAGGTTTTGTTTGTTTGTTTGGTTTGTTTTGTTTTGTTTTTCCATATTCTCAAATGTTGGCTTGGATAAGAAATGACCAGATGTGTTCTTGCCAGCAATTTTATGTAACRTTGTTTTCTTTTTCTAGTCCACCGTTCTCCGGGGCTGATCAAATGGTGACATATAATTTGATTCTCAAAGGGATTGAAAAACTGGACTTTCCTAAAATAATAACAAGGCGGCCTGAGGATTTGATCCGCAGACTTTGCAGGTAGGAGGGGCAGTTTGTGACGGAGACTGGGTGTAGATAGTTTGAGCTATTTAAGATCCAGACTAAAGTCATAAATTCCTTACAACTCCATTTAACATTGTTATGCCTAACATGGTCCATTCTGATTATGTTCAGTACACATGCATGCCTCT(SEQ ID NO：1)，或者与该序列在AACRTT以外具有至少98％的相似度，其中R为第170位脱氧核糖核苷酸，R为G或者A。
本发明的第二方面，提供了本发明第一方面所述的鸭蛋壳性状相关基因型的分子标记在如下方面的应用：
(1)在制备检测鸭个体在其基因组4号染色体上第47418074位为AA基因型、AG基因型或GG基因型的产品中的应用；
(2)在制备检测鸭生殖细胞在其基因组4号染色体上第47418074位为A或者G的产品中的应用；
(3)选育只产青壳蛋的鸭个体；
(4)提高鸭群体青壳蛋产率。
本发明的第三方面，提供了一种引物，所述引物能够扩增如本发明第一方面所述的鸭蛋壳性状相关基因型的分子标记。
进一步的，所述引物可以扩增如SEQID NO：1所示或者与之在AACRTT序列以外具有至少98％相似度的序列。
更进一步的，所述引物包含如下分子：
(1)序列为TGCCAACTTCACACCCTTCA(SEQ ID NO：2)的DNA分子或者与该序列存在至少98％以上相似度的DNA分子；和，
(2)序列为AGAGGCATGCATGTGTACTGA(SEQ ID NO：3)的DNA分子或者与该序列存在至少98％以上相似度的DNA分子。
本发明的第四方面，提供了一种鸭蛋壳性状相关基因型的检测方法，所述基因型包括AA基因型、AG基因型或GG基因型，所述方法包含：
(1)使用引物对目的序列进行扩增；
(2)使用AclI内切酶酶切步骤(1)得到的扩增产物；
(3)对步骤(2)产物进行凝胶电泳，分析单个泳道的条带数量和/或分子量。
所述目的序列为包含鸭基因组4号染色体上第47418071-47418076位核苷酸序列的DNA序列，其中第47418074位是一个突变位点R，R是G或者A。更进一步的，所述的目的序列与本发明第一方面所述鸭蛋壳性状相关基因型的分子标记的序列相同。当所述基因型为AA基因型时，AclI内切酶不能作用于所述目的序列及其扩增产物，因此所述扩增产物保持原先的长度。当所述基因型为GG基因型时，AclI内切酶可以将扩增产物断开成两条100bp以上的DNA分子：片段a和片段b，因此扩增产物经过AclI酶切后包括片段a和片段b。当所述基因型为AG时，扩增产物经酶切后形成包含未被切割的扩增产物、片段a和片段b的混合物。片段a和片段b以及未被切割时的扩增产物彼此之间的长度差异均在100bp以上和300bp以下。由于被AclI内切酶断开后形成的两个DNA分子以及未被断开的DNA分子的长度均在100bp以上和500bp以下，而且三者彼此之间长度差异均在100bp以上和300bp以下，因此可以同时在同一个普通的琼脂糖凝胶电泳中全部清晰地呈现并且彼此清晰地分离，从而不仅便于肉眼进行准确判断，也便于机器识别，从而可以用图形分析软件进行批量统计。在凝胶电泳上100bp至500bp区间内、一定检测阈值以上只呈现单一条带的为AA基因型的鸭个体，呈现两个条带的为GG基因型的鸭个体，呈现三条条带的为AG基因型的鸭个体。
进一步的，所述目的序列与本发明第一方面所述鸭蛋壳性状相关基因型的分子标记的序列相同。
更进一步的，所述的引物为本发明的第二方面所述的引物。
进一步的，所述的用机器读取凝胶电泳结果，用图像智能识别技术自动统计凝胶电泳条带。
本发明的第五方面，提供了本发明第四方面所述鸭蛋壳性状相关基因型的检测方法在如下任一方面的应用：
(1)在制备检测鸭个体在其基因组4号染色体上第47418074位基因型为AA基因型、AG基因型或GG基因型的产品中的应用；
(2)在制备检测鸭生殖细胞在其基因组4号染色体上第47418074位脱氧核糖核苷酸为A或者G的产品中的应用；
(3)选育只产青壳蛋的鸭个体；
(4)提高鸭群体青壳蛋产率。
本发明的有益效果为：
通过合理地设计待扩增的目的序列，针对该目的序列设计引物，对目的序列进行扩增、酶切，通过琼脂糖凝胶电泳，而非送至生物公司测序来直接判定基因型，直接通过电泳条带清晰、准确地判断不同鸭品系的4号染色体上第47418074位点的基因型。
不论是所述扩增产物本身还是经过酶切断开后形成的DNA片段，均能在同一个普通的凝胶电泳上全部清晰呈现，因此便于通过计算机读取和识别，便于用智能图像识别软件统计图像结果，根据图像中每个泳道条带情况，自动识别条带数量，在个体数量较多的情况下，降低人力成本和由于疲劳容易产生的误差率。通过本发明所提供的检测方法鉴定鸭蛋青白壳形状相关基因型具有直观、快捷、准确、低成本的特点。
通过一代选育，使产相同颜色鸭蛋的鸭群体实现纯化，实现低成本、快速、准确的选育目标。
本发明所述的本发明涉及到的鸭品种为金定鸭、绍兴鸭、山麻鸭等家鸭，更进一步的，为绍兴鸭(Anas platyrhyncha var.domestica)。
本申请所述的鸭基因组4号染色体上的序列为GenBank数据库中编号为GenBank：LS423614.1的序列；所述的鸭基因组4号染色体上第47418071-47418076位为编号为GenBank：LS423614.1所述序列的第47418071-47418076位，或者为SEQ ID NO：1所示的序列的第167-172位；其序列为AACGTT或AACATT；所述的鸭基因组4号染色体上第47418074位点GenBank：LS423614.1所述序列的第47418074位，或者为SEQ ID NO：1所示的序列的第170位。
本申请所述的凝胶电泳为琼脂糖凝胶电泳。
附图说明
图1为实施例二的实验流程图；
图2显示了目的片段第170位为AA基因型时的测序结果；
图3显示了目的片段第170位为AG基因型时的测序结果；
图4显示了目的片段第170位为GG基因型时的测序结果。
图5为酶切后的凝胶电泳图，最边上两侧为DL2000 Marker，中间10个泳道从左到右对应的基因型分别为AA、AG、AA、GG、GG、AG、AG、GG、AA、AG。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作出进一步的说明，本发明没有特别注明的操作步骤均是现有技术，所用的原料也都是市售可得，并符合相关国家标准。
实施例一：确定待扩增的目的序列和设计引物
1)具体分析GenBank：LS423614.1所述序列的第47418074位突变位点周边序列，发现该鸭基因组第4号染色体上第47418074位突变位点为G时恰好形成了AACGTT的回文结构，该回文结构是AclI限制性内切酶的酶切位点。
2)确定待扩增的目的序列
根据希望达到的电泳结果确定待扩增的为如SEQ ID NO:1所示的序列：
TGCCAACTTCACACCCTTCAACTATCTTAAACAGGCTGAAATGCAGGTTGTCAAGCTAGGAAGGTTTTGTTTGTTTGTTTGGTTTGTTTTGTTTTGTTTTTCCATATTCTCAAATGTTGGCTTGGATAAGAAATGACCAGATGTGTTCTTGCCAGCAATTTTATGTAACRTTGTTTTCTTTTTCTAGTCCACCGTTCTCCGGGGCTGATCAAATGGTGACATATAATTTGATTCTCAAAGGGATTGAAAAACTGGACTTTCCTAAAATAATAACAAGGCGGCCTGAGGATTTGATCCGCAGACTTTGCAGGTAGGAGGGGCAGTTTGTGACGGAGACTGGGTGTAGATAGTTTGAGCTATTTAAGATCCAGACTAAAGTCATAAATTCCTTACAACTCCATTTAACATTGTTATGCCTAACATGGTCCATTCTGATTATGTTCAGTACACATGCATGCCTCT(SEQ ID NO：1)，其中R为突变位点，位于该序列的170位，R为G或者A。
3)设计引物
设计针对该序列的引物，上游引物：TGCCAACTTCACACCCTTCA(SEQ ID NO:2)，下游引物：AGAGGCATGCATGTGTACTGA(SEQ ID NO:3)。
实施例二：目的片段扩增、酶切和电泳
以绍兴鸭(Anas platyrhyncha var.domestica)为分析样本，按照图1的流程进行目的片段的扩增、酶切和电泳，具体操作流程为：
1)PCR扩增
PCR扩增体系(20μL)：天根PCR试剂盒中的2×Mix 10μL，ddH2O 5.5μL，基因组模板1.5μL，上下游引物各1.5μL。
PCR扩增流程：94℃预变性5min；94℃30s(变性)，56℃30s(退火)，72℃30s(延伸)，共35个循环；最后72℃后延伸10min。
对扩增产物用桑格测序法进行鉴定，得到其序列为如SEQ ID NO：1所示的序列，其中，第170位为SNP位点R，R为G或者A。图2显示了当该位点为AA基因型时的测序结果，图3显示了当该位点为AG基因型时的测序结果，图4显示了该位点为GG基因型时的测序结果。
2)酶切
利用BioLabs的AclI内切酶试剂盒，在10μL扩增产物中加入0.2μL AclI酶，1μL 10×NEBuffer，PCR仪上37℃孵育30min。
3)琼脂糖凝胶电泳
制备2％琼脂糖凝胶。取酶切产物10μL，加入2μL 6×Loding Buffer，混匀后点样。琼脂糖凝胶电泳40min左右，将凝胶条带置于凝胶成像仪中拍照，结果如图5所示,从上图中可以通过每个泳道的条带数量直接判定对应个体的基因型，最边上两侧为DL2000 Marker，中间10个泳道从左到右代表的基因型分别为AA、AG、AA、GG、GG、AG、AG、GG、AA、AG。
4)图像智能识别
将步骤3)的凝胶拍照，打开图像智能识别软件，导入图像，通过参数设置识别图像中每个泳道中的条带数量，1条带自动判定为AA基因型，2条带自动判定为GG基因型，3条带自动判定为AG基因型。每个泳道对应一个个体，将每个泳道的基因型判定结果输出至Excel表中。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 江苏省家禽科学研究所
<120> 一种鸭蛋壳性状相关基因型的分子标记、引物及其检测方法和应用
<130> 1
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 462
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgccaacttc acacccttca actatcttaa acaggctgaa atgcaggttg tcaagctagg 60
aaggttttgt ttgtttgttt ggtttgtttt gttttgtttt tccatattct caaatgttgg 120
cttggataag aaatgaccag atgtgttctt gccagcaatt ttatgtaacr ttgttttctt 180
tttctagtcc accgttctcc ggggctgatc aaatggtgac atataatttg attctcaaag 240
ggattgaaaa actggacttt cctaaaataa taacaaggcg gcctgaggat ttgatccgca 300
gactttgcag gtaggagggg cagtttgtga cggagactgg gtgtagatag tttgagctat 360
ttaagatcca gactaaagtc ataaattcct tacaactcca tttaacattg ttatgcctaa 420
catggtccat tctgattatg ttcagtacac atgcatgcct ct 462
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgccaacttc acacccttca 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agaggcatgc atgtgtactg a 21

Claims (10)

1.一种鸭蛋壳性状相关基因型的分子标记，其特征在于，所述分子标记为一段DNA，其长度在500bp以内，其序列与鸭基因组4号染色体上的一段序列相同，且包含鸭基因组4号染色体上第47418071-47418076位核苷酸序列。
2.根据权利要求1的鸭蛋壳性状相关基因型的分子标记，其特征在于，所述分子标记包含序列AACRTT，其中R为一个突变位点，R是G或者A，当R为G时，AclI内切酶可以将所述分子标记切割成长度均在100bp以上的片段a和片段b，所述片段a、片段b以及所述分子标记相互之间的长度差异均在100bp以上和300bp以下。
3.根据权利要求1的鸭蛋壳性状相关基因型的分子标记，其特征在于，该分子标记的序列如SEQ ID NO：1所示或者与该序列在AACRTT以外具有至少98％的相似度，其中R为G或者A，其位于所述序列的其中第170位。
4.权利要求1-3任一所述的鸭蛋壳性状相关基因型的分子标记的应用，其特征在于，所述应用选自如下任一方面：
(1)在制备检测鸭个体在其基因组4号染色体上第47418074位为AA基因型、AG基因型或GG基因型的产品中的应用；
(2)在制备检测鸭生殖细胞在其基因组4号染色体上第47418074位为A或者G的产品中的应用；
(3)选育只产青壳蛋的鸭个体；
(4)提高鸭群体青壳蛋产率。
5.一种引物，其特征在于，该引物可以扩增权利要求1-3任一所述鸭蛋壳性状相关基因型的分子标记。
6.根据权利要求5所述的引物，其特征在于，该引物包含如下分子：
(1)序列如SEQ ID NO：2所示的DNA分子或者与该序列存在至少98％以上相似度的DNA分子；和，
(2)序列如SEQ ID NO：3所示的DNA分子或者与该序列存在至少98％以上相似度的DNA分子。
7.一种鸭蛋壳性状相关基因型的检测方法，其特征在于，该方法包含：
(1)使用引物对目的序列进行扩增；
(2)使用AclI内切酶酶切步骤(1)得到的扩增产物；
(3)对步骤(2)的产物进行凝胶电泳，统计单个泳道的条带数量和/或分子量。
其中，所述目的序列与权利要求1-3任一项所述鸭蛋壳性状相关基因型的分子标记的序列相同。
8.根据权利要求7所述鸭蛋壳性状相关基因型的检测方法，其特征在于，所述引物为权利要求5-6任一所述的引物。
9.根据权利要求7所述鸭蛋壳性状相关基因型的检测方法，其特征在于，所述方法还包括用机器识别和统计凝胶电泳条带。
10.一种权利要求7-9任一所述鸭蛋壳性状相关基因型的检测方法的应用，其特征在于，所述应用选自如下任一方面：
(1)在制备检测鸭个体在其基因组4号染色体上第47418074位为AA基因型、AG基因型或GG基因型的产品中的应用；
(2)在制备检测鸭生殖细胞在其基因组4号染色体上第47418074位为A或者G的产品中的应用；
(3)选育只产青壳蛋的鸭个体；
(4)提高鸭群体青壳蛋产率。
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