CN106222292A - 用于构建和鉴定奶牛分子系谱的遗传标记及其应用 - Google Patents

用于构建和鉴定奶牛分子系谱的遗传标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子遗传学，提供了用于构建和鉴定奶牛分子系谱的遗传标记及其应用，该组遗传标记由8个位点组成，分别为TGLA227、TGLA122、BMC1207、BM103、INRA037、INRA134、BP7和MB026，发明人提供了上述8个微卫星位点的引物。并利用该引物获得荧光标记引物进行荧光标记毛细管电泳，并，用Gene Mapper V3.0软件结合Gene Marker软件V1.75进行基因型判定，用Cervus3.0软件进行亲缘关系鉴定，并建立了应用试剂盒；可用于奶牛系谱鉴定和构建，为提高奶牛选种育种的准确性奠定重要的基石，可促进奶牛的育种进程，具有良好的应用前景和经济效益。

Description

用于构建和鉴定奶牛分子系谱的遗传标记及其应用
技术领域
本发明涉及分子遗传学，提供了一组用于构建和鉴定奶牛分子系谱的遗传标记及其应用。
背景技术
对奶牛进行遗传改良工作需要进行种公牛后裔测定和奶牛分子标记辅助选择等几个方面的工作，而系谱记录的准确性对于奶牛的遗传改良至关重要。部分中小型奶牛场管理不严格导致奶牛系谱缺乏，或是由于人工授精技术的普及及生产环节(系谱记录)中不可避免的错误，导致牛群系谱记录不全或错误，所以奶牛分子系谱构建及系谱准确率评估成了遗传改良中的重要一环。
微卫星标记技术是比较成熟的亲缘关系鉴定工具，且具有成本低，可靠性高，方便使用等优点。贾名威等(2004)利用6个微卫星位点对2头确定母女关系的荷斯坦母牛和5头可疑父种公牛进行了亲权鉴定。钟美明等(2010)利用15个微卫星标记进行多重PCR扩增，对350头荷斯坦奶牛和35头种公牛进行了亲缘关系鉴定。
微卫星位点与其它的遗传标记相比，更适宜用于人的亲权鉴定、家畜的系谱构建或鉴定提供了独到的优势。因为其具有以下优点：(1)微卫星标记广泛分布于真核生物基因组中，且多态性高，具有较高的多态信息含量(polymorphism information content,PIC)，由于大部分微卫星位点位于非编码区，基本不受自然选择和人工选择的影响，是一种中性标记。另一方面微卫星标记的遗传遵循孟德尔遗传定律，是一种共显性标记，易于区分纯合子和杂合子。等位基因数目多，SSR位点的杂合度较高；(2)STR标记遗传稳定性好，突变率低，仅为10-4；(3)STR标记具有种间保守性，使得部分微卫星位点具有种间通用性，且SSR位点具有个体间高度特异性，两个个体具有同一位点的概率为10-4；(4)微卫星位点检测试验操作简便，可通过PCR扩增及电泳分析完成检测。并且微卫星位点检测对DNA模板需求量低，部分降解DNA也可用于微卫星位点的检测。
目前已有针对荷斯坦奶牛的微卫星亲权鉴定方法与对应的分子标记，虽然有部分技术公开了一些相关内容，但是由于品种或群体之间的不同，基本没有参考价值且其公开的分子标记较多，依然存在一定弊端，如微卫星位点的使用数量较多，操作方法比较繁琐，使用成本比较高，且不适用于生产实践中奶牛场中常见的少量或个别系谱记录错误或缺失个体间的亲子鉴定。因此，亟需要一种分子标记使用数目少、试验操作简便、系谱鉴定准确度高且成本较低的亲子鉴定方法。
发明内容
本发明的发明人在上述技术背景下，植根于奶牛牛群，旨在优化用于奶牛分子系谱构建的微卫星标记组合，所选择的微卫星遗传标记由8个位点组成，分别为TGLA227、TGLA122、BMC1207、BM103、INRA037、INRA134、BP7和MB026，发明人提供了上述8个微卫星位点的引物。并利用该引物获得荧光标记引物进行荧光标记毛细管电泳，并用Gene MapperV3.0软件结合Gene Marker软件进行基因型判定和亲缘关系鉴定；可用于奶牛系谱鉴定，可提高奶牛育种准确性，加快奶牛的育种进程，具有良好的应用前景和经济效益，同时优化微卫星组合使得检测成本降低。
本发明所提供的微卫星标记，由8个位点组成，分别为TGLA227、TGLA122、BMC1207、BM103、INRA037、INRA134、BP7和MB026；8个位点的基本信息如下表所示：
上述引物序列的核苷酸序列如SEQ NO.1-16所示；
在选取上述8个位点之后，发明人进一步提供了用于奶牛亲缘关系鉴定及分子系谱构建的PCR检测试剂盒，所述试剂盒含有用于PCR扩增上述微卫星位点的荧光PCR引物。
更进一步的，发明人提供了上述微卫星标记在奶牛亲缘关系鉴定、分子系谱构建及系谱准确率评估中的应用。其具体是以待测奶牛的基因组DNA为模板，利用单重荧光PCR扩增和毛细管电泳技术结合进行基因型检测，具体步骤为：
(1)DNA提取：奶牛血液、精液或毛囊样品基因组DNA提取；
(2)荧光标记PCR扩增：根据8个微卫星位点设计荧光标记引物(上表中对应上游引物F5’端FAM标签标记的荧光引物)，以基因组DNA为模板进行PCR扩增；除采用荧光标记除FAM外还可以采用HEX、TAMRA等，
表1 荧光标记引物
8个位点的最优PCR扩增体系和PCR反应程序：
以15μl扩增体系为例，PCR扩增的反应体系见表2。
表2 PCR扩增体系
PCR反应条件见表3。
表3 PCR反应条件
(3)基因分型：进行荧光标记毛细管电泳，并用Gene Mapper V3.0软件结合GeneMarker软件进行基因型判定。
基于上述技术，本发明所提供的技术还可以在奶牛亲缘关系准确率评估中的有所应用，具体可参考上述方法。
综上所述，本发明针对奶牛牛群的特点，筛选出一组适用于奶牛亲权鉴定的微卫星标记，共包括8个微卫星位点，这8个位点多态性高、标记间不连锁，易于进行检测。利用8个微卫星位点组合进行奶牛亲权鉴定，在三种情况下的结合排除概率CPE-1、CPE-2和CPE-3分别为0.990、0.999和0.999，均达到99％的排除概率，检测效率极高。本发明利用单重荧光PCR和毛细管电泳技术，建立了基于上述8个微卫星位点准确高效的基因分型方法，可用于奶牛系谱鉴定，可提高奶牛育种准确性，加快奶牛的育种进程，具有良好的应用前景和经济效益，同时优化微卫星组合使得检测成本降低。
具体实施方式
实施例1.微卫星位点的选择及确定
1、本发明所提供的微卫星标记，由8个位点组成，分别为TGLA227、TGLA122、BMC1207、BM103、INRA037、INRA134、BP7和MB026；8个位点的基本信息如下表4所示：
表4 位点的基本信息
上述引物序列的核苷酸序列如SEQ NO.1-16所示；
2、微卫星位点基因型检测
采用单重荧光PCR结合ABI3730自动测序仪荧光电泳技术对300头奶牛和9头种公牛8个位点的PCR产物进行基因型检测。将荧光标记的PCR扩增产物进行毛细管电泳，并用ABI3730测序仪检测基因型峰值并用Gene Mapper V3.0软件结合Gene Marker V1.75软件进行微卫星基因型判定。
3、微卫星位点的遗传多态性分析
应用CERVUS3.0软件对基因型数据进行处理，计算微卫星位点的各个遗传参数，包括等位基因数、等位基因频率、多态信息含量、期望杂合度、观察杂合度、排除概率等。等位基因及等位基因频率如表5。同时运用Excel表格和公式计算了每个微卫星位点的有效等位基因数，统计结果如表6所示。8个微卫星位点均表现出较多的等位基因数目，其中TGLA227、TGLA122、BMC1207和INRA134等位基因数目分别为19、19、18、19，表现出很高的多态性；INRA037、BM103和MB026三个位点的等位基因数目为13、11和11，均大于10，表现出较高的多态性，微卫星位点BP7等位基因数目最少，为7个，多态性较低。这8个微卫星位点的平均等位基因数为14.63，平均等位基因数较高。有效等位基因数目同样是反映群体遗传变异大小的一个测定指标，有效等位基因是各位点等位基因频率平方和的倒数，由表6可看出，8个微卫星位点的有效等位基因个数与等位基因个数相对比，数目较少，这表明该微卫星位点等位基因在群体中分布不均匀，比如微卫星位点INRA134等位基因数目为19个，但有效等位基因数却为4.25个，位点MB026等位基因个数为11个，而有效等位基因个数为2.28个。平均有效等位基因数为4.99。8个微卫星位点有效等位基因数与等位基因数差别较大，表明8个位点等位基因在群体中分布均匀性优劣不等，这与采样群体随机性有较大关联性。
表5 8个微卫星位点的等位基因和等位基因频率
表6 8个微卫星位点的等位基因数和有效等位基因数
4、微卫星位点的杂合度和多态信息含量
使用Cervus3.0软件的Al lele Frequency Analys is程序，计算各个标记的多态信息含量、期望杂合度、观察杂合度和哈温平衡，结果见表7。多态信息含量(polymorphisminformation content,PIC)是某个位点的多态性信息，是表示微卫星位点突变程度高低的一个指标，是指在某一家系中可以利用的多态性遗传标记作为遗传标志进行基因连锁分析的概率。PIC＞0.5表示该位点为高度多态位点，该遗传标记具备高度的可提供遗传信息性；0.5＞PIC＞0.25表示该位点为中度多态，该遗传标记能比较合理地提供遗传信息；PIC＜0.25表示该位点为低度多态，该遗传标记可提供遗传信息性较差。计算公式如下：(bostein et al.,1980；胡晓明等，2001)。
其中Pi、Pj分别为第i、j个等位基因频率，n为等位基因数。
杂合度(Heterozygos ity，He)指微卫星位点中杂合子占总数的比值。在Cervus中将杂合度分为观察杂合度和期望杂合度，观察杂合度即为杂合子占所有分型个体的比例，期望杂合度即被研究的微卫星位点处于Hardy-Weinberg平衡时，杂合子占总分型个体的比值。计算公式如下：
杂合度平均杂合度(张沅等，1995)
其中Pi为第i个等位基因频率，n为等位基因数。
由表3-4可知，8个微卫星位点的PIC值均大于0.5，平均PIC值为0.747，8个标记均为高度多态性位点。其中位点TGLA227、TGLA122和BMC207PIC值均大于0.8，为高多态性位点，微卫星位点BM103、INRA037和INRA134PIC值大于0.7，为高多态位点。位点BP7和MB026的PIC值最低，分别为0.671和0.528，相较于其他6个位点多态性较低。
8个微卫星位点的观察杂合度与期望杂合度分布较均匀，数值差异不大。8个位点观察杂合度从0.558(MB026)到0.831(BM103)不等，变化范围较小，平均观察杂合度为0.718；8个位点间期望杂合度从0.563(MB026)到0.878(TGLA227)不等，变化范围较小，平均期望杂合度为0.773。各位点间观察杂合度与期望杂合度差值较小，位点TGLA227的观察杂合度与期望杂合度差值最大，为0.186；位点MB026的观察杂合度与期望杂合度差值最小，为0.005。各位点观察杂合度与期望杂合度差值的绝对值与观察杂合度的比值最小的为0.009(MB026)，最大为0.269(TGLA227)，均小于0.5，进一步说明8个微卫星位点选择合理性较强，等位基因分布比较合理，比较准确的展现了畜群的遗传结构。
表7 8个微卫星位点的杂合度和多态信息含量
5、排除概率和结合排除概率
运行Cervus3.0软件的Al lele Frequency Analys is程序，计算每个位点的排除概率，见表8。由表8可知，在给定一个候选亲本与子代信息的情况下(PE-1)，8个位点的排除概率从0.181(MB026)到0.601(TGLA227)，其中大于0.5的位点有TGLA227、TGLA122和BMC1207，8个位点的结合排除概率达到0.990。在给定一个亲本基因型、候选亲本基因型和子代基因型的情况下(PE-2)，8个位点的排除概率从0.352(MB026)到0.752(TGLA227)，8个位点的结合排除概率达到0.999。在给定候选父母双方基因型的情况下(PE-P)，8个位点的排除概率从0.544(MB026)到0.907(TGLA227)，8个位点的结合排除概率大于0.999。由于结合排除概率均达到0.99，所以可以运用这8个微卫星位点进行亲权鉴定和系谱准确率验证。
表8 8个微卫星位点的排除概率和结合排除概率
6、微卫星亲权鉴定体系的确立
为鉴定8个微卫星位点的亲权鉴定效率，探索选择最佳微卫星组合的方法，并优化微卫星组合，依照表8中各位点排除概率由大到小的顺序，将8个微卫星位点按组合数目进行分组，以期取得合理的结合排除概率，结果见表9。由表9可得，微卫星位点个数为8时，三种结合排除概率均达到或超过0.99，8个高多态性的微卫星位点(TGLA227、TGLA122、BMC1207、BM103、INRA037、INRA134、BP7、MB026)可作为奶牛的亲权鉴定及系谱构建体系。随着位点个数的减少，结合排除概率逐渐减少，当位点个数低于8时，CPE-1小于0.99，微卫星位点在3-8个时CPE-1大于90％，仍可为奶牛亲权鉴定提供一定的参考价值。
微卫星位点个数为4时，CEP-2为0.991，大于99％，CPE-2达到0.95，所以当微卫星位点个数大于等于4个时，完全可用于子代一亲本基因型已知情况下的亲权鉴定，同时95％的排除概率基本满足奶牛场亲子代亲缘关系鉴定。由此可见当子代一亲本基因型已知时，可用较少数量的微卫星位点完成亲权鉴定的任务，可减少亲权鉴定的成本并使亲权鉴定工作更为简便。所以奶牛场母牛与犊牛系谱记录的准确性对公牛后裔测定中的亲权鉴定工作有着很大的影响。
表9 微卫星标记组合的结合排除概率
注：CPE-1已知候选亲本和子代基因型，排除候选亲本和子代亲子关系的结合排除概率；CPE-2已知子代一亲本基因型，给定候选亲本和子代基因型，排除候选亲本和子代亲子关系的结合排除概率；CPE-3已知候选亲本对和子代基因型，排除候选亲本对和子代亲子关系的结合排除概率。
实施例2 系谱准确率验证
为验证8个微卫星位点在奶牛群体中进行亲权鉴定的准确性和可靠性，本实施例对有纸质系谱记录存在父子关系的8对父子牛进行了亲权鉴定。提取8个亲子对牛和1个无关父亲牛的基因组DNA，对8个微卫星位点的基因型及其基因频率进行分析，得到如下结果见表10。运用Cervus3.0软件中Analys is程序的Parentage analys is模块进行数据分析，表中LOD值是亲子指数(paternity index)的对数值，LOD值大于0的则表示与任意个体相比，候选亲本(Candidate Parent)最有可能是真实的亲代；LOD值小于0表示与任意个体相比，候选亲本不可能是真实的亲本。Delta是用于评价鉴定结果可信度的统计值。当只用一个个体比较且LOD值大于0时，Delta就被定义为LOD值本身，根据亲子关系模拟的结果显示当Delta值大于2.48时，可信度超过95％；当Delta值小于2.48时可信度达到80％。
由表10可知，无关父亲与8个子代均无亲子关系，5个亲子对亲子关系置信度大于95％，1个亲子对亲子关系置信度达到85％，2个亲子对间无亲缘关系，说明系谱记录存在一定的错误率。
表10 利用8个微卫星位点对8对父子进行亲权鉴定结果
注：*表示亲子关系极显著，置信度超过95％；+表示亲子关系较显著，置信度达到80％；-表示无亲缘关系。
该结果进一步验证8个微卫星位点组合基本满足奶牛亲权鉴定的要求。但仍有个体亲权鉴定置信度低于95％，故仍需要筛选高多态位点予以补充，以获得更高的验证效率。使结果的可信度提高。
实施例3 8个微卫星位点在奶牛亲缘关系鉴定中的应用
本实施例从奶牛群体中选择了一对父子关系明确的亲子代和一个无关亲本进行验证，模拟在正常生产情况下进行亲权鉴定。
样本
(1)子代母牛13325血样，编号1；
(2)候选父本公牛37310001冻精，编号2；
(3)无关父本公牛37310026冻精，编号3。
鉴定要求：DNA检验，亲权鉴定
检验及结果
提取上述待测样本DNA，对8个微卫星位点进行PCR扩增；
以15μl扩增体系为例，PCR扩增的反应体系见表2。
表2 PCR扩增体系
PCR反应条件见表3。
表3 PCR反应条件
扩增产物进行荧光标记毛细管电泳，在ABI3730自动测序仪上检测基因型峰值并用Gene Mapper V3.0软件结合Gene Marker软件进行基因型判定，结果如下表11。
表11 检测结果
检测结论
在被检测的8个微卫星标记中，编号2和编号3完全符合亲权鉴定遗传方式，编号1和编号3有3个位点不符合孟德尔遗传定律，故排除公牛37310026位子代母牛13325的生物学父亲，公牛37310001位子代母牛13325的生物学父亲。
实施例4 制备进行奶牛系谱构建及系谱准确率评估试剂盒
用于对奶牛进行系谱构建(亲权鉴定)及系谱准确率评估的试剂盒包括以下试剂：
(1)5U/μL Taq DNA聚合酶；
(2)2.5mM dNTP mixture；
(3)10×(mg2+plus)PCR buffer；
(4)实施例1中筛选的8对用于对奶牛进行亲权鉴定的荧光标记引物，10μmol/L；
(5)ddH2O。
试剂盒规格暂定50次/盒，每盒中各组分的量为：5U/μL Taq DNA聚合酶1管(200μl/管)，2.5mM dNTP mixture 2管(500μl/管)，10×(mg2+plus)PCR buffer 2管(500μl/管)，每对引物的带荧光标记的上游引物、下游引物各1管(40-60μl/管)，ddH2O 1瓶(50ml/瓶)。按上述剂量对试剂盒中的各组分进行分装，包装后得到奶牛系谱构建(亲权鉴定)及系谱准确率评估试剂盒。

Claims (2)

1.用于构建和鉴定奶牛分子系谱的遗传标记，其特征在于：该遗传标记为微卫星标记，由8个位点组成，分别为TGLA227、TGLA122、BMC1207、BM103、INRA037、INRA134、BP7和MB026；8个位点的基本信息如下表所示：
上述引物序列的核苷酸序列如SEQ NO.1-16所示。
2.权利要求1所述遗传标记在奶牛亲缘关系鉴定、分子系谱构建及系谱准确率评估中的应用，其特征在于：以待测奶牛的基因组DNA为模板，利用单重荧光PCR扩增和毛细管电泳技术结合进行基因型检测，具体步骤为：
(1)DNA提取：奶牛血液、精液或毛囊样品基因组DNA提取；
(2)荧光标记PCR扩增：根据8个微卫星位点设计荧光标记引物，以基因组DNA为模板进行PCR扩增；8个位点的最优PCR扩增体系和PCR反应程序：
以15μl扩增体系为例，PCR扩增的反应体系见下表；
(3)基因分型：进行荧光标记毛细管电泳，并用Gene Mapper V3.0软件结合GeneMarker软件进行基因型判定；
(4)亲缘关系鉴定：应用Cervus3.0软件进行亲缘关系鉴定。
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