CN105039325A

CN105039325A - 用于中国西门塔尔牛亲子关系鉴定的微卫星标记及其应用

Info

Publication number: CN105039325A
Application number: CN201510405616.1A
Authority: CN
Inventors: 高雪; 李俊雅; 孙东晓; 贺建宁; 宋玲; 郭立平
Original assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Current assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Priority date: 2015-07-10
Filing date: 2015-07-10
Publication date: 2015-11-11

Abstract

本发明提供一组用于中国西门塔尔牛亲子关系鉴定的微卫星标记，共包括10个微卫星标记，这些标记多态性高、标记间不连锁且片段大小间隔适当，易于同时检测。在三种不同情况下，利用此标记组合鉴定中国西门塔尔牛亲子关系，累积排除概率CPE(1)、CPE(2)、CPE(3)分别达0.9960969、0.999854、0.9999997，检测效率极高。本发明的微卫星标记组合可用于中国西门塔尔牛完整、准确的系谱鉴定，可提高中国西门塔尔牛育种准确性，加快其育种进程，具有良好的应用前景和经济效益。

Description

用于中国西门塔尔牛亲子关系鉴定的微卫星标记及其应用

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，具体地说，涉及用于中国西门塔尔牛亲子关系鉴定的微卫星标记及其应用。

背景技术

系谱信息在牛育种中起着重要的作用。错误的系谱会大大降低遗传评定准确性，影响选种选配的效果，降低群体的遗传进展，给养牛业带来巨大经济影响。然而，在实际养殖生产中，系谱记录错误是难免的，它受多种因素影响，如配种记录、产犊记录、系谱录入及整理中的人为错误等，尤其在饲养粗放的散养式牧场，犊牛出生后很难确定父亲甚至双亲，往往会造成系谱错误。

目前，在我国牛亲缘关系鉴定研究和应用最多的是微卫星标记法。田菲(2006年)从30个微卫星标记中选择9个标记和3个候选标记作为中国荷斯坦牛亲子鉴定的微卫星标记组合。贺建宁、宋玲(2010年)利用12个微卫星标记对西门塔尔牛亲子鉴定进行初步探讨。周磊(2011年)对利用微卫星和SNP标记信息进行奶牛亲子鉴定的模拟进行了研究。郭立平(2013年)利用微卫星和SNP标记对西门塔尔牛进行亲子推断的研究。另外，CN101024857A公开了中国荷斯坦奶牛的亲子鉴定方法及其专用引物与试剂盒；CN101705299A公开了牛微卫星标记组合及其应用。由于不同物种微卫星标记的分布比例存在差异；且高度近亲的不同品种间，微卫星标记也存在一定保守性和差异性，同时微卫星标记具有高度的个体特异性，两个无关个体具有相同微卫星的概率低于10^-4。

发明内容

本发明针对中国西门塔尔牛牛群特点，旨在提供用于中国西门塔尔牛亲子关系鉴定的微卫星标记组合。另外，针对已有基因分型技术上存在着操作复杂、耗时、重复性低等缺点，以及现有商业化试剂盒价格昂贵，检测成本高等不足之处，通过检测技术的改进，实现在筛选基因型的同时达到检测的目的。

为了实现本发明目的，本发明提供用于中国西门塔尔牛亲子关系鉴定的微卫星标记，由下述10个标记组成：TGLA53、BM2113、INRA023、TGLA122、CSSM66、ETH225、SPS115、HAUT27、INRA037和ETH10。

上述10个标记位于染色体的位置、引物等基本特征如下：

本发明还提供用于中国西门塔尔牛亲子关系鉴定的PCR检测试剂盒，所述试剂盒含有用于扩增所述微卫星标记的PCR引物。

本发明还提供所述微卫星标记在中国西门塔尔牛亲子关系鉴定中的应用。

前述的应用是以待测牛的基因组DNA为模板，利用多重荧光PCR和毛细管电泳技术结合进行基因型检测。

具体步骤包括：(1)DNA提取：牛血液或精液DNA提取；(2)荧光标记PCR扩增：扩增所述10个微卫星标记特异性目的片段；(3)基因分型：荧光标记毛细管电泳技术分析所述标记的基因型。

具体操作过程如下：

1、按照常规方法进行牛血液DNA提取或公牛冻精DNA的提取。

2、根据扩增产物大小选择引物所标记的荧光素，特别对于片段长度有重叠的标记，用不同的荧光染料修饰，这样可使不同颜色的微卫星标记同时检测，提高检测效率。(表1)

表1根据扩增产物大小选择不同荧光素标记

通过优化扩增条件和调整引物浓度，筛选最佳PCR体系组成、扩增条件，建立了10个标记的最优扩增体系。

以20μL总体积为例，PCR扩增的反应体系见表2。

表2PCR反应体系

PCR反应条件见表3。

表3PCR反应条件

3、基因分型

由于步骤2中PCR产物根据片段长度和不同荧光颜色进行了标记，因而通过3次毛细管电泳即可获得不同微卫星标记座位的基因型。

将步骤2中每组PCR产物样品板装入ABIPRISM3730XL遗传分析仪进行电泳。利用GeneMaPPerTM4.0软件，设定分子量标准条带后，根据遗传分析仪所收集电泳荧光信号的颜色和位置，自动计算各标记座位的基因型。

进一步地，本发明是根据待测牛个体的基因型以及累积排除概率(Combinedexclusionprobabilities)确定待测中国西门塔尔牛亲子关系，即根据待测牛个体和候选亲本的基因型是否一致以及计算待测个体与候选亲本的累积排除概率来确定待测个体和候选亲本是否有亲缘关系。其原理及计算过程如下：

亲子鉴定是基于孟德尔遗传的两个基本定律：分离和自由组合规律。子代的两个同对等位基因一个来自父亲，一个来自母亲。通过结果分析，如果符合孟德尔遗传定律，则不能排除具有亲子关系，否则可排除其亲子关系。根据孟德尔遗传定律，后代染色体上的全部基因，一半遗传于其亲生父亲，一半遗传于其亲生母亲。因此在应用微卫星基因座进行亲子鉴定时，(i)肯定子代的某个标记基因型来自亲生父亲，而候选父亲并不携带此标记基因型，这就违背了孟德尔遗传定律，可以排除子代与候选父亲之间的亲缘关系；(ii)肯定子代的某个标记基因型来自亲生父亲，而候选父亲也携带此标记基因型，其符合孟德尔遗传定律，据此不能排除子代与候选父亲之间的亲缘关系，但是可以利用似然函数计算它们之间亲缘关系的相似程度。

根据孟德尔遗传定律，(1)如果累积排除概率＞0.99，子代所检测的标记基因型与候选父亲完全一致，可确定其为子代的生物学父亲；(2)如果累积排除概率＞0.99，子代所检测的标记基因型与候选父亲存在2个或以上基因型不遵循遗传规律，可排除其为子代的生物学父亲。

首先，计算所检测标记的非父排除概率及累积排除概率。非父排除概率(probabilityofpaternityexclusion，PE)是评价遗传标记在亲子鉴定中实用价值大小的一个重要指标；是利用各位点的等位基因频率来计算候选父亲某标记的等位基因不是来自亲生父亲的排除概率。非父排除概率的计算一般分以下三种情况计算：

(1)当另一亲本信息未知时，排除子代与假设亲本是亲子关系的排除概率为：

P_{1} = 1 - 4 Σ_{i = 1}^{n} p_{i}^{2} + 2 {(Σ_{i = 1}^{n} p_{i}^{2})}^{2} + 4 Σ_{i = 1}^{n} p_{i}^{3} - 3 Σ_{i = 1}^{n} p_{i}^{4}

(2)当另一亲本信息已知时，排除子代与假设亲本是亲子关系的排除概率为：

P_{2} = 1 - 2 Σ_{i = 1}^{n} p_{i}^{2} + Σ_{i = 1}^{n} p_{i}^{3} + 2 Σ_{i = 1}^{n} p_{i}^{4} - 3 Σ_{i = 1}^{n} p_{i}^{5} - 2 {(Σ_{i = 1}^{n} p_{i}^{2})}^{2} + 3 Σ_{i = 1}^{n} p_{i}^{2} Σ_{i = 1}^{n} p_{i}^{3}

(3)排除子代与无关的假设父母对是亲子关系的排除概率为：

P_{3} = 1 + 4 Σ_{i = 1}^{n} p_{i}^{4} - 4 Σ_{i = 1}^{n} p_{i}^{5} - 3 Σ_{i = 1}^{n} p_{i}^{6} - 8 {(Σ_{i = 1}^{n} p_{i}^{2})}^{2} + 8 (Σ_{i = 1}^{n} p_{i}^{2}) {(Σ_{i = 1}^{n} p_{i}^{3}) + 2 (Σ_{i = 1}^{n} p_{i}^{3})}^{2}

其中，n代表每个标记的等位基因数，p_i代表第i个等位基因的频率。

k个标记的累积排除概率计算公式为：

CPE＝1-(1-P₁)(1-P₂)(1-P₃)…(1-P_k)

在上述三种不同情况下，根据以上计算公式分别得出CPE(1)、CPE(2)、CPE(3)。CPE(1)为第一种情况下的累积排除概率，即(1)当另一亲本信息未知时，排除子代与假设亲本是亲子关系的排除概率：CPE(2)为第二种情况下的累积排除概率，即当另一亲本信息已知时，排除子代与假设亲本是亲子关系的排除概率；CPE(3)为第三种情况下的累积排除概率，即排除子代与无关的假设父母对是亲子关系的排除概率，通过计算每个候选亲本在所有检测位点排除概率，即可知道候选亲本为子代真实亲本的可能性大小，从而可对亲子对之间的亲缘关系做出判断。

本发明进一步提供所述微卫星标记在中国西门塔尔牛遗传改良育种中的应用。

本发明针对中国西门塔尔牛牛群的特点，筛选出一组适用于检测西门塔尔牛亲子关系的微卫星标记，共包括10个微卫星标记，这些标记多态性高、标记间不连锁且片段大小间隔适当，易于同时检测。在三种不同情况下，利用此标记组合鉴定西门塔尔牛亲子关系，累积排除概率CPE(1)、CPE(2)、CPE(3)分别达0.9960969、0.999854、0.9999997，检测效率极高。本发明利用多重荧光PCR和毛细管电泳技术，通过优化实验体系，建立了基于上述10个微卫星标记准确高效的基因分型方法。本发明的微卫星标记组合可用于中国西门塔尔牛完整、准确的系谱鉴定，可提高中国西门塔尔牛育种准确性，加快其育种进程，具有良好的应用前景和经济效益。

附图说明

图1为本发明实施例1中以标记ETH225和CSSM66为例的微卫星基因型分型结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW,Molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

以下实施例中述及的实验牛群中国西门塔尔牛来自内蒙古乌拉盖地区445头中国西门塔尔牛。

实施例1中国西门塔尔牛亲子关系鉴定微卫星标记的筛选与确定

1、微卫星标记位点的选择与分组

根据文献研究相关报道，选择牛的14条不同染色体、多态信息含量较高的14个微卫星基因座。选择的原则是：具有丰富的等位基因、高度多态性，位于不同染色体上，彼此之间没有连锁关系，重复性好，无“哑等位基因(NullAllele)”等。详细信息见表4。

表414个微卫星基因座基本信息

为降低微卫星基因分型的检测成本，根据微卫星标记的片段长度和所携带的荧光基团将PCR产物混合分组。为避免同一组中出现非特异性条带干扰，每组中荧光颜色不同、每个荧光标记的片段大小不重叠。在本实施例中，将14个微卫星标记分为3组，标记组合及其所带荧光基团见表5。

表514个微卫星标记分组情况

2、微卫星标记基因型分型

采用多重荧光PCR结合ABI3730自动测序仪荧光电泳技术对17头公牛及445头后代牛的14个(shorttandemrepeat)微卫星标记进行了基因分型。将14个微卫星标记分成3组，利用各位点引物和退火温度进行PCR扩增，PCR扩增的反应体系及反应条件分别见表2和表3。分组混合的PCR产物经ABI3730自动测序后，采用GeneMapperV4.0软件对微卫星基因型进行判定(A.L.VANEENENNAAM，2007)。图1以B组ETH225和CSSM66微卫星标记为例，该组中ETH225(TET，荧光蓝)标记为杂合子，片段大小为(136bp，145bp)；CSSM66(HEX，荧光绿)标记为纯合子，片段大小为(184bp，184bp)。

3、微卫星标记的群体遗传学分析

应用CERVUS3.0.3软件统计14个微卫星标记遗传多态性参数，包括等位基因数、期望杂合度、多态信息含量、位点组合的累积排除概率等统计结果见表6，其中TGLA227位点只有两个等位基因，未能在中国西门塔尔牛中表现丰富的多态性，将其剔除；剩余13个微卫星位点等位基因数为9～24个，均表现高度多态性；各位点的观察杂合度在0.543～0.8475之间，期望杂合度在0.541～0.8845之间，且每个微卫星标记的观察杂合度和期望杂合度差值不大，在0.003～0.180之间，说明各微卫星标记的等位基因分布合理，能够准确的反映群体的遗传结构。各位点的多态信息含量(PIC)在0.499～0.878之间，说明这13个微卫星标记在西门塔尔牛中具有较高的使用价值。

表613个微卫星基因座的遗传多态性

4、微卫星标记组合的筛选与优化

根据各微卫星基因座的等位基因频率，计算各位点的非父排除概率(表7)。由表7可知，TGLA53位点的排除概率最高为0.632，ETH10、BM1824、TGLA126、INRA032位点的排除概率相对较低。通过计算它们的排除概率和累积排除概率(表8)，由表8可知，这13个微卫星标记在三种不同情况下，累积排除概率CPE(1)、CPE(2)、CPE(3)分别高达0.9986276、0.999979、1.0000000，说明这13个微卫星标记亲子鉴定效力极高。

表713个微卫星基因座的排除概率

注：PE(1)：当另一亲本信息未知时，排除子代与假设亲本是亲子关系的排除概率；PE(2)：当另一亲本信息已知时，排除子代与假设亲本是亲子关系的排除概率；PE(3)：排除子代与无关的假设父母对是亲子关系的排除概率。

将13个微卫星标记按照单个标记排除概率的高低进行排序(顺序见表7)，然后将微卫星标记划分为不同标记数目的标记组合，分别含1-13个标记。含N(1≤N≤13)个标记的STR组合中的微卫星标记是按照排除概率排序名次靠前的N个标记，以保证标记数目一定的情况下，获得最大的排除概率。

由表8可知，当微卫星标记数目为8时累积排除概率均大于0.99，但微卫星标记数目继续增加时对亲子鉴定效力的提高不大；当微卫星标记数目降到7时累积排除概率降到0.99以下。依据亲子鉴定排除概率不低于0.9950的标准，确定TGLA53、BM2113、INRA023、TGLA122、CSSM66、ETH225、SPS115、HAUT27、INRA037和ETH10，10个多态性较高的微卫星标记为中国西门塔尔牛微卫星亲子鉴定体系，其标记组合在三种情况下，累积排除概率CPE(1)、CPE(2)、CPE(3)分别高达0.9960969、0.999854、0.9999997。

表8微卫星标记组合累积排除概率

注：CPE(1)：当另一亲本信息未知时，排除子代与假设亲本是亲子关系的累积排除概率；CPE(2)：当另一亲本信息已知时，排除子代与假设亲本是亲子关系的累积排除概率；CPE(3)：排除子代与无关的假设父母对是亲子关系的累积排除概率。

实施例210个微卫星标记在中国西门塔尔牛亲子关系鉴定中的应用

本实施例从中国西门塔尔牛亲子群体中选择了1对父子关系明确的父子和1个无关个体进行验证。

1、样本：

(1)子代小牛19105102血样，编号1；

(2)候选父本公牛cow1171冻精，编号2；

(3)候选父本公牛14_2620冻精，编号3。

2、鉴定要求：DNA检验，亲子鉴定

3、检验及结果

提取上述待测样本DNA，对10个微卫星遗传标记进行PCR扩增后，在ABI3730自动测序仪上检测，结果见表9。

表9检测结果

位点

编号1

编号2

编号3

TGLA53	162，166	166，170	168，170
				BM2113	129，129	129，129	125，129
INRA023	206，207	207，207	212，214
				TGLA122	150，154	150，157	146，157
CSSM66	188，199	184，199	188，188
				ETH225	147，147	137，147	145，147
SPS115	333，337	333，337	333，333
				HAUT27	145，154	145，147	143，143
INRA037	121，126	121，130	126，130
				ETH10	220，220	220，220	220，222

4、鉴定结论

在被检测的10个微卫星标记中，编号1和编号2完全符亲子遗传方式，编号1和编号3有5个位点不符合亲子遗传方式，故排除公牛14_2620为子代小牛19105102的生物学父亲，而公牛cow1171为子代小牛19105102的生物学父亲。

实施例310个微卫星标记在中国西门塔尔牛遗传改良育种中的应用

1、样本：

公牛冻精，管号10008，样品编号1；

公牛冻精，管号20017，样品编号2。

2、鉴定要求：DNA检验，样品1和样品2一致性鉴定

3、检验及结果

提取上述待测样本DNA，对10个微卫星遗传标记进行PCR扩增后，在ABI3730自动测序仪上检测，结果见表10。

表10检测结果

位点	编号1	编号2
			TGLA53	162，166	162，166
BM2113	129，129	129，129

INRA023	206，207	206，207
			TGLA122	150，154	150，154
CSSM66	188，199	188，199
			ETH225	147，147	147，147
SPS115	333，337	333，337
			HAUT27	145，154	145，154
INRA037	121，126	121，126
			ETH10	220，220	220，220

4、鉴定结论

在被检测的10个微卫星标记中，编号1和编号2两份待测样本均具有相同的基因型，它们遗传一致性的几率大于99.99％。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

参考文献

田菲.中国荷斯坦牛微卫星亲子鉴定体系的建立.中国农业大学，2006

宋玲.贺建宁.孙东晓.内蒙古地区西门塔尔牛亲子鉴定微卫星标记筛选[J].中国畜牧杂志.2011.47(13).

周磊,初芹,张沅等.利用微卫星和SNP标记信息进行奶牛亲子鉴定的模拟研究[J].畜牧兽医学报,2011,42(2):169-176.

郭立平，徐丽，朱淼，张路培，高会江，李俊雅，许尚忠，高雪*.西门塔尔牛微卫星亲子鉴定体系的优化.畜牧兽医学报，2013，44(6):871-879.

Claims

1.用于中国西门塔尔牛亲子关系鉴定的微卫星标记，其特征在于，由下述10个标记组成：TGLA53、BM2113、INRA023、TGLA122、CSSM66、ETH225、SPS115、HAUT27、INRA037和ETH10；

上述10个标记的基本特征如下：

2.用于中国西门塔尔牛亲子关系鉴定的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有用于扩增权利要求1所述微卫星标记的PCR引物。

3.权利要求1所述微卫星标记在中国西门塔尔牛亲子关系鉴定中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，以待测牛的基因组DNA为模板，利用多重荧光PCR和毛细管电泳技术结合进行基因型检测。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，根据待测牛个体的基因型以及累积排除概率确定待测中国西门塔尔牛亲子关系。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，根据孟德尔遗传定律，(1)如果累积排除概率＞0.99，子代所检测的标记基因型与候选父亲完全一致，可确定其为子代的生物学父亲；(2)如果累积排除概率＞0.99，子代所检测的标记基因型与候选父亲存在2个或以上基因型不遵循遗传规律，可排除其为子代的生物学父亲。

7.权利要求1所述微卫星标记在中国西门塔尔牛遗传改良育种中的应用。