CN101024857A

CN101024857A - 中国荷斯坦奶牛的亲子鉴定方法及其专用引物与试剂盒

Info

Publication number: CN101024857A
Application number: CNA2007100652611A
Authority: CN
Inventors: 张沅; 孙东晓; 田菲
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2007-04-09
Filing date: 2007-04-09
Publication date: 2007-08-29
Anticipated expiration: 2027-04-09
Also published as: CN100587079C

Abstract

本发明公开了一种中国荷斯坦奶牛的亲子鉴定方法及其专用引物与试剂盒。所述引物包括下述引物对：1)由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列组成的引物对；2)由序列表中序列3和序列4的核苷酸序列组成的引物对；3)由序列表中序列5和序列6的核苷酸序列组成的引物对；4)由序列表中序列7和序列8的核苷酸序列组成的引物对；5)由序列表中序列9和序列10的核苷酸序列组成的引物对；6)由序列表中序列11和序列12的核苷酸序列组成的引物对；7)由序列表中序列13和序列14的核苷酸序列组成的引物对；8)由序列表中序列15和序列16的核苷酸序列组成的引物对；9)由序列表中序列17和序列18的核苷酸序列组成的引物对。

Description

中国荷斯坦奶牛的亲子鉴定方法及其专用引物与试剂盒

技术领域

本发明涉及利用微卫星标记技术对中国荷斯坦奶牛进行亲子鉴定的方法及其专用引物与试剂盒。

背景技术

人工授精技术和种牛遗传评定是在奶牛育种中最为关键的内容，对奶牛的遗传进展都有巨大的影响，其中，公牛遗传评定是奶牛育种的关键和核心内容，准确的遗传评定需要公牛个体的各种亲属信息。如果采用了错误的系谱，就难以准确地采用动物模型BLUP进行奶牛的遗传评定，将对种公牛的选择、群体遗传进展以及整体生产水平造成严重损失，而经验证的公牛通过人工授精技术能够在群体中扩大其影响，进而提高遗传进展。人工授精技术的使用则使遗传评定的准确性提高，能够获得更多的遗传进展。但是，在人工授精中，由于重复输精而造成系谱记录错误，将导致遗传进展的减少。研究表明，10％的系谱错误将导致3-4％的年遗传进展的减少，而英国的研究表明，80年代以后系谱的错误率已经上升到22％。因此，需要通过亲子鉴定来纠正系谱记录的错误，保证获得尽可能多的遗传进展。目前，应用传统的血清蛋白标记和血型因子进行奶牛亲子鉴定的有效性差、鉴定结果的准确率低，迫切需要采用新的遗传标记有效地解决这一问题。随着分子生物技术的发展，亲子鉴定中应用的遗传标记也由原来的生化标记发展为分子标记，在众多分子标记中，微卫星标记由于其自身的优点成为在亲子鉴定中应用最为广泛的分子标记。

微卫星是于1980年被发现，随后成为一种应用广泛的分子遗传标记，在人类以及动植物遗传变异、起源进化、遗传疾病的分子诊断和遗传图谱的绘制等研究中都使用了大量的微卫星标记。微卫星标记具有以下优点：①个体识别机率和非父排除概率高：由于它在人类和动物基因组中分布极为广泛，且片段小，与传统的蛋白质遗传标记相比，等位基因多，杂合度高，因此，不同个体基因型不同的可能性更大。据报道，两个无关个体在14个微卫星标记基因型完全相同的可能性仅为1×10^-14。理论上，在目前地球上60亿人口中没有任何两个无关个体这14个基因座基因型完全相同。②比较容易解释其遗传模式以及突变模式(Usha A.P，S P Simpson，J L Willianms.Probability of random sire exclusion using microsatellite marks for parentageverification.Animal Genetics，1995，26：155-161.)。③检材量少，灵敏度和成功率高，且适用于各种来源的生物性检材：少量检材即可满足DNA的提取，将提取的DNA通过PCR扩增，灵敏度比传统的DNA指纹高得多。由于PCR扩增片长度较短，所以即使仅含降解的DNA陈旧性斑痕，其扩增效率仍很高，因而可适用于各种来源的检材。基于上述优点，微卫星标记分型被认为是第二代法医DNA指纹技术的核心，是目前个体识别和亲子鉴定的主要发展方向。

目前，奶业发达国家都建立了适合于本国牛群的微卫星亲子鉴定体系，联合国粮农组织(FAO)也推荐了9个微卫星标记进行荷斯坦牛的亲子鉴定。中国荷斯坦牛的育成包含了欧洲荷斯坦牛、北美荷斯坦牛以及中国黄牛的血统，由于遗传标记的品种特异性，其它国家的微卫星亲子鉴定体系不适宜中国荷斯坦奶牛，因此，需要通过筛选微卫星标记建立适合的亲子鉴定体系。

发明内容

本发明的目的是提供利用微卫星标记技术对中国荷斯坦奶牛进行亲子鉴定的方法及其专用引物。

本发明所提供的用于对中国荷斯坦奶牛进行亲子鉴定的微卫星引物，包括下述引物对：

1)由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列组成的引物对；

2)由序列表中序列3和序列4的核苷酸序列组成的引物对；

3)由序列表中序列5和序列6的核苷酸序列组成的引物对；

4)由序列表中序列7和序列8的核苷酸序列组成的引物对；

5)由序列表中序列9和序列10的核苷酸序列组成的引物对；

6)由序列表中序列11和序列12的核苷酸序列组成的引物对；

7)由序列表中序列13和序列14的核苷酸序列组成的引物对；

8)由序列表中序列15和序列16的核苷酸序列组成的引物对；

9)由序列表中序列17和序列18的核苷酸序列组成的引物对。

将由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列组成的引物对命名为ETH225，序列表中的序列1由22个碱基组成，序列表中的序列2由21个碱基组成；将由序列表中序列3和序列4的核苷酸序列组成的引物对命名为ETH10，序列表中的序列3由23个碱基组成，序列表中的序列4由23个碱基组成；将由序列5和序列6的核苷酸序列组成的引物对命名为INRA032，序列表中的序列5由22个碱基组成，序列表中的序列6由23个碱基组成；将由序列7和序列8的核苷酸序列组成的引物对命名为BM2113，序列表中的序列7由21个碱基组成，序列表中的序列8由20个碱基组成；将由序列9和序列10的核苷酸序列组成的引物对命名为BM1824，序列表中的序列9由21个碱基组成，序列表中的序列10由21个碱基组成；将由序列11和序列12的核苷酸序列组成的引物对命名为SPS115，序列表中的序列11由24个碱基组成，序列表中的序列12由24个碱基组成；将由序列13和序列14的核苷酸序列组成的引物对命名为TGLA227，序列表中的序列13由25个碱基组成，序列表中的序列14由24个碱基组成；将由序列15和序列16的核苷酸序列组成的引物对命名为TGLA126，序列表中的序列15由25个碱基组成，序列表中的序列16由25个碱基组成；将由序列17和序列18的核苷酸序列组成的引物对命名为TGLA122，序列表中的序列17由21个碱基组成，序列表中的序列18由25个碱基组成。

当已知亲本基因型信息缺失或无已知亲本时，所述用于对中国荷斯坦奶牛进行亲子鉴定的微卫星引物还包括下述引物对，以提高结果的可信度：

1)由序列表中序列19和序列20的核苷酸序列组成的引物对；

2)由序列表中序列21和序列22的核苷酸序列组成的引物对；

3)由序列表中序列23和序列24的核苷酸序列组成的引物对。

将由序列19和序列20的核苷酸序列组成的引物对命名为INRA035，序列表中的序列19由22个碱基组成，序列表中的序列20由22个碱基组成；将由序列21和序列22的核苷酸序列组成的引物对命名为INRA023，序列表中的序列21由24个碱基组成，序列表中的序列22由26个碱基组成；将由序列23和序列24的核苷酸序列组成的引物对命名为INRA037，序列表中的序列23由22个碱基组成，序列表中的序列24由22个碱基组成。

本发明的第二个目的是提供一种对中国荷斯坦奶牛进行亲子鉴定的方法。

本发明所提供的对中国荷斯坦奶牛进行亲子鉴定的方法，是以待测牛的基因组DNA为模板，在由上述用于对中国荷斯坦奶牛进行亲子鉴定的微卫星引物对的引导下进行PCR扩增，扩增结束后，对PCR扩增片段进行8-10％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，分析基因型，根据基因型计算亲子指数(paternity index)的LOD值(对数值)，当LOD值大于0时，候选亲本(Candidate Parent)有可能是真实的亲代，LOD值最高的个体是最似亲本(Most likely parent)的个体；当LOD值小于0时，候选亲本不可能是真实的亲本。

其中，以20μl总体积为例，PCR扩增的反应体系包括：模板DNA(50-100ng/μl)10ng，上游引物0.25-1μmol/L(10μmol/μl)，下游引物0.25-0.5μmol/L(10μmol/μl)，10×dNTPs0.05μmol/L，20×PCR缓冲液(Tris·HCl(pH8.0)200mM，KCl1000mM，MgCl₂40mM，0.2％明胶)2μl，MgCl₂2.0μmol/L，Taq E1U，用ddH₂O补足反应体系至20μl。

所述PCR反应条件可为：先94℃预变性3-5分钟；然后94℃变性30秒，55-65℃30秒，72℃延伸30秒，循环30-35次；72℃延伸7-10分钟。当引物的合成、基因组DNA的提取、dNTPs和TaqDNA聚合酶试剂来自不同批次时，反应条件，包括退火温度等都会发生一定的变化。所以每次进行大批量PCR前，都要选择少量个体进行温度梯度、引物浓度梯度PCR，进行2％琼脂糖凝胶电泳，检测扩增效果，以确定最佳的PCR反应条件。此外，确定好单标记引物PCR的退火温度(Tm)之后，可以根据PCR产物的大小，适当对部分引物进行组合，再摸索多重PCR反应的条件。进行多重PCR时，为了保证所有引物扩增的特异性和产物量，尽量选择退火温度相同或相近的引物。进行多重PCR时合并的引物对数最好不超过2对。此外，由于所用到的引物对应的目标产物片段不超过350bp，所以循环中的延伸时间均控制在30秒左右，总延伸时间不超过10分钟。

本发明的第三个目的是提供一种对中国荷斯坦奶牛进行亲子鉴定的试剂盒。

本发明所提供的试剂盒，可包括上述用于对中国荷斯坦奶牛进行亲子鉴定的专用引物。

根据实际情况，所述试剂盒还可包括Taq DNA聚合酶、10×PCR扩增缓冲液(含Mg²⁺)、dNTPs、重蒸水、硝酸银、无水碳酸钠、甲醛、硼酸、尿素、乙酸、无水乙醇、苯酚、氯仿、异戊醇、十二烷基硫酸钠(SDS)、NaCl、HCl、NaOH、10×TBE、溴化乙啶贮存液和6×凝胶加样缓冲液等中的一种或几种试剂；所述各种溶液的溶剂均为水。

本发明提供了一种对中国荷斯坦奶牛进行亲子鉴定的方法及其专用引物。本发明就是利用30个微卫星标记，从中筛选出适合于中国荷斯坦牛亲子鉴定的微卫星标记而建立的中国荷斯坦牛亲子鉴定方法。本发明的鉴定方法操作简单，快捷，费用低廉，准确度高(可达99.95％)，并可实现自动化的直接检测。此外，可根据本方明的方法开发出相应的检测试剂盒，用于中国荷斯坦牛的亲子鉴定，该试剂盒具有使用方法简便、快速、灵敏的优点，不需要特殊的仪器，适合常规实验室检测的需要，且检测结果可靠、稳定、准确，为种牛的育种工作提供了便利。本发明将在中国荷斯坦奶牛的微卫星亲子鉴定及优良种牛的分子选育中发挥重要作用，应用前景广阔。

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。

附图说明

图1A为INRA032PCR扩增产物的8％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果

图1B为SPS115PCR扩增产物的8％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果

图1C为BM1824PCR扩增产物的8％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果

图1D为INRA023PCR扩增产物的8％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果

图1E为ETH10PCR扩增产物的8％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果

图1F为TGLA126PCR扩增产物的10％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。所用引物合成工作由上海生工生物技术服务有限公司完成。

实施例1、用于对中国荷斯坦奶牛进行亲子鉴定的微卫星引物的筛选

一、微卫星标记的选择

根据已有文献和它人的相关研究结果，共选用FAO推荐的30个微卫星标记，它们的核苷酸全序列、引物序列、PCR反应条件、群体多态信息及染色体遗传图谱位置等均可以从以下网站获得：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/，http://www.marc.usda.gov，http://www.ri.bbsrc.ac.uk。标记选择的原则是等位基因数多，具有高度多态性，相互之间不存在连锁关系，分布在多条不同的染色体。所选的30个微卫星标记的具体信息如表1所示：

表1 微卫星标记信息

编号	标记	染色体位置	引物序列(5’-3’)	检测范围(bp)
编号	标记	染色体位置	引物序列(5’-3’)	检测范围(bp)	12345678	ETH225D9S1ETH152D5S1HEL1D15S10ILSTS005D10S25HEL5D21S15INRA005D12S4INRA035D16S11INRA063D18S5	95151021121618	GATCACCTTGCCACTATTTCCT(序列表中序列1)ACATGACAGCCAGCTGCTACT(序列表中序列2)TACTCGTAGGGCAGGCTGCCTGGAGACCTCAGGGTTGGTGATCAGCAACAGCTATTTAACAAGGAAGGCTACAGTCCATGGGATTGGAAGCAATGAAATCTATAGCCTGTTCTGTGAGTTTGTAAGCGCAGGATCACTTGTTAGGGAAGACGTTAGTGTACATTAACCAATCTGCATGAAGTATAAATATCTTCAGGCATACCCTACACCATCCTTTGCAGCCTCCACATTG(序列表中序列19)TTGTGCTTTATGACACTATCCG(序列表中序列20)ATTTGCACAAGCTAAATCTAACCAAACCACAGAAATGCTTGGAAG	131-155181-211103-117184-196147-171139-147102-114171-187

9101112131415

MM12D9S20HEL9D8S4CSRM60D10S5CSSM66D14S31ETH185D17S1HAUT24D22S26HAUT27D26S21

981014172226

CAAGACAGGTGTTTCAATCTATCGACTCTGGGGATGATGTCCCATTCAGTCTTCAGAGGTCACATCCATGTTCTCACCACAAGATGTGATCCAAGAGAGAGGCAAGGACCAGATCGTGAAAGGCATAGACACAAATCCTTTCTGCCAGCTGAAATTTAATGCACTGAGGAGCTTGGTGCATGGACAGAGCAGCCTGGCGCACCCCAACGAAAGCTCCCAGCTCTCTGCCTTTGTCCCTGTAATACACTTTAGGAGAAAAATATTTTATGTTCATTTTTTGACTGGAACTGCTGAAATCTCCATCTTA

105-135169-14396-116177-209221-245109-129127-155

161718192021222324

ETH3D19S2ETH10D5S3INRA032D11S9INRA023D3S10BM2113D2S26BM1818D23S21BM1824D1S34HEL13D11S15ILSTS006D7S8

1951132231117

GAACCTGCCTCTCCTGCATTGGACTCTGCCTGTGGCCAAGTAGGGTTCAGGACTGGCCCTGCTAACA(序列表中序列3)CCTCCAGCCCACTTTCTCTTCTC(序列表中序列4)AAACTGTATTCTCTAATAGCAC(序列表中序列5)GCAAGACATATCTCCATTCCTTT(序列表中序列6)GAGTAGAGCTACAAGATAAACTTC(序列表中序列21)TAACTACAGGGTGTTAGATGAACTCA(序列表中序列22)GCTGCCTTCTACCAAATACCC(序列表中序列7)CTTAGACAACAGGGGTTTGG(序列表中序列8)AGCTGGGAATATAACCAAAGGAGTGCTTTCAAGGTCCATGCGAGCAAGGTGTTTTTCCAATC(序列表中序列9)CATTCTCCAACTGCTTCCTTG(序列表中序列10)TAAGGACTTGAGATAAGGAGCCATCTACCTCCATCTTAACTGTCTGTATTTCTGCTGTGGACACGGAAGCGATCTAAACG

133-109207-225166-190197-221125-143258-272178-192177-197281-299

252627282930

INRA037D10S12SPS115D15TGLA227D18S1TGLA126D20S1TGLA53D16S3TGLA122D21S6

101518201621

GATCCTGCTTATATTTAACCAC(序列表中序列23)AAAATTCCATGGAGAGAGAAAC(序列表中序列24)AAAGTGACACAACAGCTTCTCCAG(序列表中序列11)AACGCGTGTCCTAGTTTGGCTGTG(序列表中序列12)CGAATTCCAAATCTGTTAATTTGCT(序列表中序列13)ACAGACAGAAACTCAATGAAAGCA(序列表中序列14)CTAATTTAGAATGAGAGAGGCTTCT(序列表中序列15)TTGGTCTCTATTCTCTGAATATTCC(序列表中序列16)GCTTTCAGAAATAGTTTGCATTCAATCTTCACATGATATTACAGCAGACCCTCCTCCAGGTAAATCAGC(序列表中序列17)AATCACATGGCAAATAAGTACATAC(序列表中序列18)

112-148185-20576-104116-122152-186137-181

二、微卫星标记的基因型检测

用步骤一获得的30个微卫星标记对北京市种公牛站的206头母牛和124头公牛，共计330头中国荷斯坦牛进行微卫星基因型检测，具体方法包括以下步骤：

1、PCR扩增

按照文献(陈慧勇.利用中国荷斯坦定位BTA6上影响产奶性状的QTLs[D].北京：中国农业大学，2005)中第27页描述的DNA提取方法提取上述公牛精液(新鲜或冷冻)和母牛血液(新鲜或冷冻)的基因组DNA(基因组DNA还可以从组织样品(如耳组织等)或含有毛囊的牛毛样品中提取)，然后以此为模板，分别在步骤一的30对引物的引导下利用梯度PCR仪进行PCR扩增，20μl PCR反应体系为：模板DNA(50-100ng/μl)10ng，上游引物0.25-1μmol/L(10μmol/μl)，下游引物0.25-0.5μmol/L(10μmol/μl)，10×dNTPs 0.05μmol/L，20×PCR缓冲液(Tris·HCl(pH8.0)200mM，KCl1000mM，MgCl₂40nM，0.2％明胶)1μl，MgCl₂2.0μmol/L，Taq E 1U，用ddH₂0补足反应体系至20μl。个微卫星标记的PCR反应条件可如表2所示，

表2 PCR反应条件

步骤		温度(℃)	时间	循环数
步骤		温度(℃)	时间	循环数	1)预变性2)循环3)总延伸	变性退火延伸	949455-65℃7272	3-5分钟30秒种30秒种30秒种7-10分钟	130-351

4)保存

4

∞

当引物的合成、基因组DNA的提取、dNTPs和TaqDNA聚合酶试剂来自不同批次时，反应条件，包括退火温度等都会发生一定的变化。所以每次进行大批量PCR前，都要选择少量个体进行温度梯度、引物浓度梯度PCR，进行2％琼脂糖凝胶电泳，检测扩增效果，以确定最佳的PCR反应条件。此外，确定好单标记引物PCR的退火温度(Tm)之后，可以根据PCR产物的大小，适当对部分引物进行组合，再摸索多重PCR反应的条件。进行多重PCR时，为了保证所有引物扩增的特异性和产物量，尽量选择退火温度相同或相近的引物。本实施例进行的多重PCR时合并的引物对数不超过2对。此外，由于所用到的引物对应的目标产物片段不超过350bp，所以循环中的延伸时间均控制在30秒左右，总延伸时间不超过10分钟。纵上所述，本实施例采用的PCR反应条件为：先94℃预变性5分钟；然后94℃变性30秒，55-65℃30秒，72℃延伸30秒，循环30-35次；72℃延伸7分钟。

2、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染

步骤1的PCR反应结束后，先对各引物对的PCR扩增产物进行8-10％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，具体过程包括以下步骤：

①用夹子将已经用垫片密封好的玻璃板夹紧；

②取30mL8-10％聚丙烯酰胺凝胶工作液，加入150μl APS，25μl TEMED，迅速混匀，缓慢倒入密封好玻璃板中，插入点样梳子，检查是否有气泡产生；

③在室温下聚合2小时，拔出点样梳子和底边垫条，然后将其固定于电泳槽上，用1×TBE冲洗胶孔，低电压预电泳10分钟；

④取扩增好的PCR产物各3ul，将其以1∶4的比例与变性胶上样缓冲液混合，98℃变性10分钟，迅速取出置于冰上冷却。点样，300V电压10分钟，后根据片断大小选择100-200V电压，电泳5-7小时。

然后进行硝酸银染色，具体过程包括以下步骤：

①取出电泳后的凝胶，放入脱色盘中，用蒸馏水洗涤凝胶1次，2分钟；

②将蒸馏水倒出，加入1％硝酸银溶液染色30分钟；

③将硝酸银倒出，用蒸馏水洗涤凝胶2次，每次2分钟；

④将蒸馏水倒出，倒入适量的显色液，显色10-20分钟；

⑤当凝胶上显示出清晰的DNA条带时，将显色液倒出，倒入蒸馏水洗涤，拍照。

部分微卫星标记(INRA032、SPS115、BM1824、INRA023、ETH10、TGLA126)的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果如图1A-图1F所示(泳道M为标准分子量PBR322/MspI，泳道1-10为PCR扩增产物)，微卫星PCR扩增产物在100-300bp之间，大部分微卫星标记的纯合子为2条带，杂合子为3或4条带；也有部分微卫星标记的纯合子为1条带，而杂合子为2条带。

三、微卫星标记的遗传多态性分析

1、等位基因、等位基因数和有效等位基因数统计

通过凝胶成像系统分析软件Alpha Immager对步骤二的扩增结果进行分析，得到了各微卫星标记的等位基因大小及等位基因频率，其中，30个微卫星标记的等位基因数和等位基因频率结果如表3所示，30个微卫星标记点的等位基因数和有效等位基因数的统计结果如表4所示，各位点均表现了多态性。其中，BM2113、ETH225、CSSM66和CSRM060四个位点的等位基因数最多，达到10个；而位点ETH10和INRA005等位基因数最少，仅有5个；这30个位点的平均等位基因数则为7.63。尽管各个位点的等位基因数有较大的变化(5-10)，但是各位点的有效等位基因数之间差异并不大。有效等位基因数也是反映群体遗传变异大小的一个指标，用纯合度的倒数表示。如果等位基因在群体中的分布越均匀，有效等位基因数就越接近所检测到的实际等位基因的绝对数。有效等位基因数最小的是INRA005，仅为3.84，而有效等位基因数最大的BM21136则有8.74。在某些位点上，尽管观察到的等位基因数较多，但是有效等位基因数却较小，如位点ETH185，检测到等位基因有7个，而计算的有效等位基因数仅为4.59；HEL5检测到的等位基因为7个，而有效等位基因数则为4.99，说明这些位点上等位基因分布不均匀。在有些位点上，有效等位基因数与等位基因数的绝对值非常接近，如TGLA126，观察到的等位基因为9个，有效等位基因数为8.52，说明在该位点上等位基因分布比较均匀。

表3 30个微卫星标记的等位基因和等位基因频率统计结果

位点	等位基因	等位基因频率	位点	等位基因	等位基因频率
位点	等位基因	等位基因频率	位点	等位基因	等位基因频率	ILSTS005ILSTS006INRA005INRA023BM1818INRA035	1861881901921941962322902922942963023061481521541561582032112132152212252312232292312332352372472539094100104120128	13.5521.1815.5220.6919.219.850.2414.3211.419.9524.2727.6712.1414.3929.0224.3925.856.349.4719.4224.2717.728.016.8014.327.047.5210.195.8333.9817.2313.115.1024.5117.9623.5422.098.743.16	INRA037HEL5ETH10ETH152HAUT27SPS115	128136148156160164155161163171173175183219221227231237183189193197203207215157159161163165167169171252258262268272278	6.8037.1420.8715.0515.784.3718.6925.241.2123.3019.908.013.6410.4410.6830.5835.9212.385.8318.6934.2220.8712.624.613.168.7816.105.3712.6816.3412.6814.6313.416.5515.7832.5225.2412.147.77

位点	等位基因	等位基因频率.	位点	等位基因	等位基因频
位点	等位基因	等位基因频率.	位点	等位基因	等位基因频	INRA032HAUT24MM12TGLA53INRA063	19319719920521121522523196100102104106110114120116120126130136138140140144152160164172176178151155161163171	8.9817.729.7130.108.9813.116.315.109.9516.5024.2711.655.588.9810.4412.625.8313.5921.124.8523.0619.9011.6511.4124.7617.236.319.9510.6810.688.985.6413.4821.084.9023.28	TGLA122HEL9BM1824HEL1ETH3	1481501521541561601701721591611651671691711731811831871891911931959610010210410611011412089939597103	5.834.6112.3825.7318.2019.665.837.7716.5023.0622.338.2511.175.5813.1116.5023.0622.098.2510.926.0713.119.7116.5023.5412.145.838.9810.1913.119.2718.2924.1512.6813.17

173

20.10

107

9.02

BM2113TGLA126HEL13CSSM66

123127129131133135137139141145123125127131133135137139145207209211213215217219221223199203209211213215217219

13.1113.117.287.779.9515.5314.813.406.318.7413.357.7711.898.9810.1914.5614.8111.177.2813.667.3221.226.1012.4410.009.279.7610.2410.920.978.2520.396.3113.118.7410.19

ETH225TGLA227EYH185CSRM060

11311912112512913113513714715188909498100104106116120179187191195199207209215219909698102106108112114

6.075.5825.0017.487.049.476.074.3710.448.5010.4423.7918.696.559.715.835.1011.178.749.7116.7523.7912.145.588.9812.867.522.675.346.0723.3018.456.559.716.316.55

221223

10.9210.19

124128

9.228.50

表4 30个微卫星位点的等位基因数和有效等位基因数统计结果

位点	等位基因数	有效等位基因数	位点	等位基因数	有效等位基因数	位点	等位基因数	有效等位基因数
位点	等位基因数	有效等位基因数	位点	等位基因数	有效等位基因数	位点	等位基因数	有效等位基因数	ILSTS005ILSTS006HEL5INRA005INRA023SPS115BM1824BM2113BM1818TGLA122	67757671068	5.665.164.993.485.944.565.928.745.285.94	INRA032INRA037INRA035ETH10ETH225TGLA126TGLA227HEL9HEL13HAUT27	86651099798	5.844.244.874.257.278.527.035.897.887.42	ETH152CSSM66CSRM060MM12TGLA53HAUT24ETH185INRA063ETH3HEL1	710107889778	4.598.207.545.716.726.776.995.686.256.86

2、杂合度和多态信息含量

统计上述30个微卫星位点的多态信息含量(polymorphism information content，PIC)和杂合度(Heterozygosity，He)。PIC的计算公式如下(Botstein D.，White R.L.，Skolnik M.，Dayis R.W.Construction of a genetic linkage map in man usinglength polymorphism.Am.J.Hum.Genet.，1980，32(3)：314-331.)：

PIC = 1 - (Σ_{i = 1}^{n} p_{i}^{2}) - Σ_{i = 1}^{n - 1} Σ_{j = i + 1}^{n} 2 p_{i}^{2} p_{j}^{2}

杂合度的计算公式如下(Ott J.Analysis of human linkage，2d ed.John HopkinsUniversity Press，Baltimore，1992)：

He = 1 - Σ p_{i}^{2}

选择用于进行亲子鉴定的微卫星标记应满足以下条件：①具有较高的多态信息含量(PIC＞0.7)和杂合度(He＞0.9)，等位基因数丰富，有10-12个等位基因最佳；②扩增片断长度在400bp以下；③微卫星标记位于不同的染色体上，或各标记之间没有连锁，标记之间的距离大于40cM；④没有“哑等位基因”，标记具有种数特异性；⑤重复性好，PCR扩增结果稳定。

多态信息含量和杂合度统计结果如表5所示，多态信息含量是表示微卫星位点变异程度高低的一个指标，当PIC＞0.5时，该位点为高度多态性位点，具有高度的可提供信息性，当0.25＜PIC＜0.5时，为中度多态性位点，标记能够提供较合理的信息；当PIC＜0.25时，为低度多态性位点，标记可提供的信息较差。由表5可知，各位点的PIC范围在0.350-0.874之间变动，平均值为0.671。所有位点的PIC均在0.2以上，而0.2＜PIC＜0.5的位点共有6个，分别为ILSTS006、ILSTS005、HAUT27、HEL1、BM1818和INRA005，占全部微卫星标记的20％；PIC＞0.5的位点有24个，占全部微卫星标记的80％，说明所选择的微卫星标记均具有较丰富的多态性，能够满足个体识别的要求。

另外，所有位点的观察杂合度的变化范围比较大，标记位点INRA005的观察杂合度仅为0.05，而标记位点TGLA122的观察杂合度则高达0.847，平均观察杂合度为0.506。所有位点的期望杂合度基本在0.3-0.9之间，平均值为0.7586。期望杂合度与观察杂合度的最大差值为0.598(ILSTS005)，最小差值为0.064(INRA035)；差值小于0.2的标记有10个，占所有标记数目的33.3％，用各标记观察值与期望值的差除以观察值后得一比值，该比值最大出现在杂合度最低的位点INRA005，高达52.4，而比值最低的位点则是TGLA122，仅为0.083，比值小于0.5的标记有个15个，包括：TGLA122、INRA035、SPS115、CSSM66、MM12、HEL5、BM1824、INRA063、TGLA126、INRA037、ETH10、TGLA53、ETH225、TGLA227、BM211，占所有微卫星标记的40％。观察值与期望值差异较小，进一步反映了微卫星标记的合理性，微卫星标记等位基因分布比较合理，能够准确的反映群体的遗传结构。

表5 30个微卫星标记的等位基因频率、观察杂合度、期望杂合度、多态信息含量和排除概率

位点	观测杂合度	期望杂合度	多态信息含量(PIC)	排除概率1Exc(1 )	排除概率2Exc(2)
位点	观测杂合度	期望杂合度	多态信息含量(PIC)	排除概率1Exc(1 )	排除概率2Exc(2)	ILSTS005ILSTS006HEL5INRA005INRA023INRA032INRA037INRA035ETH10ETH225ETH152CSSM66CSMR060	0.2270.3590.6800.0050.3830.4560.6120.7330.6500.6460.3400.4660.471	0.8250.8080.8020.2670.8340.8310.7660.7970.8530.8650.7840.5120.833	0.4980.4790.7690.3500.6100.6090.7310.7630.7340.7490.7510.7800.709	0.4670.4400.4240.2650.4910.4960.3750.4130.5380.5710.4040.6020.398	0.6430.6180.6020.3250.6630.6670.5550.5920.7030.7290.5830.7540.577

MM12TGLA53SPS115BM1824BM2113BM1818TGLA122TGLA126TGLA227HEL9HEL13HAUT27HAUT24ETH185INRA063ETH3HEL1

0.4090.6500.7490.6890.6260.1990.8470.7280.6260.4710.4390.3170.4270.4370.6860.4290.437

0.4710.8530.8210.8270.8700.3130.8540.8850.8600.8320.8750.7670.8540.8590.8260.8420.856

0.6330.6340.8060.7010.8740.4890.7110.8710.8420.7080.7600.4250.7360.6410.5000.8200.437

0.490.3340.5810.4760.6200.2650.4960.6100.5560.4880.5900.4610.5400.5530.2740.5090.443

0.5010.5110.7370.6500.7670.3410.6670.7600.7170.6600.6440.5390.6050.6150.3480.6790.507

3、排除概率和累积排除概率

评价微卫星标记在亲子鉴定中的实用价值大小主要通过排除概率来反应，所谓排除概率指的是非父排除概率(probability of paternity exclusion，PE)是指通过检测某一遗传标记系统，能将不是生父的争议父亲排除的机会，用它来衡量各个遗传标记系统在亲子鉴定中的实用价值大小。PE的大小取决于各个系统的遗传方式、等位基因数和等位基因频率，与被检测对象无关。计算公式如下：

PE = Σ_{i = 1}^{n} p_{i} {(1 - p_{i})}^{2} + Σ_{i = 1}^{n = 1} Σ_{j = i + 1}^{n} {(p_{i} p_{j})}^{2} (3 p_{i} + 3 p_{j} - 4)

(p_i，p_j为第i，j个等位基因频率，n为等位基因数目)

在亲子鉴定中，由于单个遗传标记检测系统的排除概率一般较小，不能达到有效排除无亲缘关系个体的要求，因此要求使用多个遗传标记检测，以提高排除概率。其累积排除概率为：

CPE＝1-(1-PE₁)(1-PE₂)......(1-PE_i)

根据统计计算得出的PE和CPE可以优化遗传标记的组合，可以筛选出累积排除概率高的遗传标记组合。

大多数情况的亲子鉴定，在排除假设父亲时，母亲和子代的基因型是已知的，只需要比较母亲、子代和假设父亲的基因型即可。最广义的使用n个等位基因的排除概率计算公式为(Jamieson A.The genetics of transferrin in cattle[J].Heredity，1965，(20)：419～441.)：

PE = Σ_{i}^{n} p_{i} {(1 - p)}^{2} - Σ_{i > j}^{n} {(p_{i} p_{j})}^{2} [4 - 3 (p_{i} + p_{j})]

为简化并便于计算机处理，后将该公式改写为(Jamieson A.The effectiveness ofusing codominant polymorphic allelic series for(1)checking pedigrees and(2)distinguishing full-sib pair members[J].Animal Genetics.1994，(25，Suppl.1)：37-44.)：

PE = 1 - 2 Σ_{i = 1}^{n} {p_{i}}^{2} + Σ_{i = 1}^{n} p_{i}^{3} + 2 Σ_{i = 1}^{n} p_{i}^{4} + - 3 Σ_{i = 1}^{n} p_{i}^{5} - 2 {(Σ_{i = 1}^{n} p_{i}^{2})}^{2} + 3 Σ_{i = 1}^{n} p_{i}^{2} Σ_{i = 1}^{n} p_{i}^{3}

根据等位基因频率计算出各微卫星标记的排除概率，结果如表5所示，其中排除概率1(Exc(1))指的是当子代和假设亲代的基因型已知，而已知亲本的基因型未知时的排除概率。排除概率2(Exc(2))是子代、已知亲代和假设亲代的基因型均已知时的排除概率。根据表3-3可知，排除概率1的最大值出现在位点BM2113上，其值为0.620，而排除概率1最小为0.265，在位点BM1818和INRA005，平均值为0.492，其中排除概率1大于0.5的标记有11个，占所有标记的36.67％。排除概率2的范围为0.325(位点INRA005)-0.767(位点BM2113)之间，平均值为0.647，仅有2个标记位点小于的排除概率2小于0.5。

4、微卫星亲子鉴定体系的确立

通过计算机程序visual basic计算3个不同标记的累积排除概率以及3组不同组合的累积排除概率，排除概率1的3个标记的累积排除概率在0.75-0.95之间，排除概率2的3个标记的累积排除概率在0.94-0.98之间，而对于3组不同组合的多组累计排除概率1和2均到达0.99以上。

表6 30个微卫星标记的组合排除概率的部分结果

微卫星标记	累积排除概率1CPE1	累积排除概率2CPE2	多组累积排除概率1Multiplex sets ofCPE1	多组累积排除概率2Multiplex sets ofCPE2
微卫星标记	累积排除概率1CPE1	累积排除概率2CPE2	多组累积排除概率1Multiplex sets ofCPE1	多组累积排除概率2Multiplex sets ofCPE2	BM2113TGLA126CSSM66HEL13SPS115ETH225BM1818	0.94101640.926302090.9159841	0.9457230.9482660.946077	0.999634786	0.999848586

HAUT27TGLA227ETH185HAUT24ETH10ETH3INRA032TGLA122INRA023MM12HEL9BM1824ILSTS005INRA005HEL1ILSTS006HEL5INRA035ETH152CSMR060

0.905003560.8752781440.867089920.8494616120.820334080.789389096

0.97220.9300860.9785520.9713090.9753680.976879

0.9984252640.994303687

0.9999583130.99998366

由于计算结果较多，表6列举了几种不同微卫星位点组合的累积排除概率。通过表5和6可以看出单个位点排除概率难以满足亲子鉴定的要求，但当3个以上这样的位点组合起来其排除概率则可以达到0.75以上，而9个这样的位点(INRA032，ETH10，ETH225，SPS115，BM1824，BM2113，TGLA122，TGLA227和TGLA126)组合起来，排除概率则可以达到99％以上。也就是说利用9个微卫星标记，对于任意一个后代可以在100个随机可能父亲中排除99个非生物学意义上的父亲。通过表6可以看出在缺失一个亲本基因型信息时，其排除概率(CPE1)要低于双亲排除概率(CPE2)，因此在某些微卫星标记组合中，仅3-6个标记就可以使排除概率达到98％以上。但是在已知亲本基因型信息缺失或无已知亲本时，只有9个以上的微卫星标记才可以满足排除概率大于99％，而且在某些标记不能提供信息时，其排除概率只能达到95％，不能达到CPE＞0.99的要求。因此在这9个微卫星标记以外，又增加了三个标记INRA037，INRA023和INRA035，通过12个微卫星标记进行亲子鉴定，其结果在绝大多数的情况下能达到CPE＞0.99。

根据累积排除概率的大小、PCR反应条件和PCR扩增产物长度，选择其中PCR扩增稳定、电泳效果好、基因型易判定、累积排除概率最高的组合。最终筛选出了9个微卫星标记的组合作为中国荷斯坦亲子鉴定的微卫星标记检测体系，其总排除概率高达99.9％以上；并且其PCR反应条件相近，基本可以通过5次PCR反应完成扩增和电泳，分别为ETH225和ETH10一组，SPS115、BM1824一组，TGLA122和INRA032一组，以及TGLA227和TGLA126一组，BM2113单独扩增。这9个微卫星标记为INRA032，ETH10，ETH225，SPS115，BM1824，BM2113，TGLA122，TGLA227和TGLA126，它们的排除概率以及累积排除概率见表7。

表7 9个微卫星标记组合的累积排除概率

微卫星标记(microsatellite markers)	排除概率1(PE1)	排除概率2(PE2)
微卫星标记(microsatellite markers)	排除概率1(PE1)	排除概率2(PE2)	INRA032ETH10ETH225SPS115BM1824BM2113TGLA122TGLA126TGLA227	0.4960.5380.5710.5810.4760.6200.4960.6100.556	0.6670.7030.7290.7370.6500.7670.6670.7600.717
Multiplex	0.9992	0.9999	INRA032ETH10ETH225SPS115BM1824BM2113TGLA122TGLA126TGLA227	0.4960.5380.5710.5810.4760.6200.4960.6100.556	0.6670.7030.7290.7370.6500.7670.6670.7600.717

实施例2、微卫星检测体系的验证

从理论上讲，只要有一个遗传标记的基因型不符合孟德尔遗传定律就可以作出排除父权关系的结论。但是通过检测DNA多态性鉴定亲权关系，存在着错误排除的可能，为了防止错误结论，本发明在父权排除中遵循以下原则：有3个或3个以上的微卫星标记不符合孟德尔遗传定律，则作出排除亲子关系的结论。

应用实施例1筛选出的9个微卫星标记基因型结果进行模拟亲子鉴定，抽样10000次，PCR反应体系及反应条件与实施例1相同，结果显示，当一个亲本已知时，鉴定的成功率达到99.98％，并且结果可信度达到95％以上；当没有亲本信息时，结果可信度在95％以上时，鉴定的成功率达到90.30％，结果可信度在80％以上时，鉴定的成功率在99.93％。当使用12个微卫星标记时，结果可信度在95％以上时，鉴定的成功率达到了99.95％。而使用13个微卫星标记对模拟结果的提高影响不大，而使用11个微卫星标记则导致一个亲本基因型未知时鉴定成功率降低了1％。因此，决定增加3个微卫星标记作为亲子鉴定微卫星标记的补充，分别为INRA023，INRA037和INRA035。应用筛选出的12个微卫星标记的累积排除概率如表8所示。

表8 12个微卫星标记的累积排除概率

微卫星标记(microsatellite markers)	排除概率1(PE1)	排除概率2(PE2)
微卫星标记(microsatellite markers)	排除概率1(PE1)	排除概率2(PE2)	INRA032ETH10ETH225SPS115BM1824BM2113TGLA122TGLA126TGLA227INRA023INRA035INRA037	0.4960.5380.5710.5810.4760.6200.4960.6100.5560.4910.6630.375	0.6670.7030.7290.7370.6500.7670.6670.7600.7170.4910.6630.375
Multiplex	0.99992	0.999998

从试验中国荷斯坦牛亲子群体中选择5个父女亲子对及1个无关父亲。假设这6头公牛(编号S1-S6)均为这10头母牛(编号C1-C10)的假设父亲，根据所选择的9个微卫星标记的基因型在亲代和子代中的分布，进行了亲子鉴定。应用Ceruvs2.0软件计算检测个体的亲子关系，父权概率的计算方法如下：

根据所检测的表型，分别列出母亲、孩子及假设父亲的各种可能基因型。根据母子组合来确定母亲的基因型(生母基因)和必定来自生父的基因型(生父基因)。计算嫌疑父亲为孩子生父的概率：

X＝f×c

公式中f为亲生母亲基因的概率(当只有一种生母基因时，该基因100％遗传给子代，故此时生母基因概率为1)，c为嫌疑父亲提供生父基因的概率。

计算种群中随机个体成为孩子生父的概率：

Y＝f×g

公式中g为种群中生父的基因频率。

根据PI＝X/Y计算出PI(父权指数)，在据此求出父权相对机会RCP(RelativeChance Paternity)值。

RCP＝PI/(PI+1)

多个标记的累计RCP为：

累计RCP＝1-∏(1-RCP_i)

RCP_i为第i个标记的RCP。

上述10个女儿的单亲鉴定结果结果见表9，其中LOD值为亲子指数(paternityindex)的对数值，LOD大于0的意义是，与任意个体相比，候选亲本(Candidate Parent)最有可能是真实的亲代；LOD值小于0代表，与任意个体相比，候选亲本不可能是真实的亲本。最似亲本(Most likely parent)就是LOD值最高的个体。Delta是用于评价鉴定结果可信度的统计量。当只用一个个体LOD值大于0时，Delta就被定义为LOD值本身，根据模拟的结果显示当Delta大于2.3时，可信度达到99％；当Delta大于2.3时可信度达到85％。父权相对机会(RCP)是亲子指数的一个函数，表示疑似父亲是真实父亲的机会。检测结果表明C1，C2为S1的后代；C3，C4为S2后代；C5，C6为S3的后代；C7，C8为S4的后代；C9，C10为S5的后代；S6为无关个体，试验检测结果与系谱记录相符。除C6对其亲本的肯定概率为98％外，每一个子代对亲本的随机排除概率均大于0.9999，结果的可信度在95％；除C6外，其余个体的候选亲本的RCP值均大于99％。上述分析结果证实用实施例1筛选的9个微卫星标记对中国荷斯坦牛进行亲子鉴定是可行的。

表9 10个女儿的单亲鉴定结果

	检测标记数Num of locitested	随机排除概率Prob.exclusion	候选公牛号Candidateparent ID	LOD	RCP	Delta
	检测标记数Num of locitested	随机排除概率Prob.exclusion	候选公牛号Candidateparent ID	LOD	RCP	Delta	C1C2C3C4C5C6C7C8C9C10	9999989999	9.92E-053.79E-044.36E-038.39E-046.42E-032.16E-023.73E-041.65E-032.49E-034.02E-03	S1S1S2S2S3S3S4S4S5S5	6.794.252.445.202.350.4284.333.583.162.61	0.99980.99940.99560.99980.99310.72840.99940.99820.99730.9964	5.35^3.25^3.44^4.37^2.35^0.345⁺4.33^7.20^7.16^4.84^*

*代表可信度达到99％以上，+代表可信度达到85％以上。

另外，在对C6进行PCR扩增时，有一个标记位点没有检测到扩增产物，对该位点信息进行缺失处理，并且该个体与几个公牛(S1，S2，S3，S4，S5，S6)的基因型对比，差异标记在3-6个，但导致该个体进行计算时，鉴定结果的可信度为80％。因此，对该个体及6个假设父亲在INRA037，INRA023和INRA035三个标记进行检测后，重新计算排除概率，肯定了前一次的结果，并且随机父亲排除概率降到2.28E-04，结果的可信度为95％。用这12个微卫星标记重新对以上个体进行亲子鉴定，结果见表10，与前一次结果相同，但是对真实亲本和疑似亲本的鉴定结果的可信度增加，并且排除概率和相对父权机会增加。

表10 应用12个微卫星标记10个女儿的单亲鉴定结果

	检测标记数	排除概率	候选公牛号	LOD	RCP	Delta
	检测标记数	排除概率	候选公牛号	LOD	RCP	Delta	C1C2C3C4C5C6C7C8C9C10	12121212121112121212	7.67E-067.03E-058.30E-046.90E-053.78E-052.28E-043.86E-041.62E-047.67E-044.45E-04	S1S1S2S2S3S3S4S4S5S5	7.166.033.446.236.313.784.374.753.814.23	0.99990.99990.99960.99990.99990.99980.99990.99990.99980.9999	5.53^3.26^3.70^3.85^4.97^3.57^5.34^3.80^3.30^3.62^

^*代表Delta大于3.2时可信度达到99％以上。

上述试验结果表明，应用9个微卫星标记INRA032，ETH10，ETH225，SPS115，BM1824，BM2113，TGLA122，TGLA227和TGLA126可以进行中国荷斯坦牛的亲子鉴定，对真实亲本和疑似亲本的排除概率能够大于99％，相对父权机会大于0.99，鉴定结果较为可信；当这9个微卫星标记的鉴定结果不能满足要求时，增加3个微卫星标记INRA037，INRA023和INRA035，可以增加鉴定排除概率和肯定概率，使结果的可信度提高。

实施例3、制备中国荷斯坦奶牛亲子鉴定试剂盒

本发明用于对中国荷斯坦奶牛进行亲子鉴定的试剂盒包括以下试剂：

(1)2.5U/ul Taq DNA聚合酶；

(2)20×PCR扩增缓冲液；

(3)25mmol/L10×dNTPs；

(4)25mmol/LMgCl₂；

(5)实施例1筛选的12对用于对中国荷斯坦奶牛进行亲子鉴定的专用引物，25umol/L；

(6)ddH₂O。

试剂盒的规格为25次/盒，每盒中各组分的量为：2.5U/ul Taq DNA聚合酶1瓶(500ul/瓶)，20×PCR扩增缓冲液1瓶(500ul/瓶)，25mmol/L10×dNTPs 1瓶(200ul/瓶)，25mmol/L MgCl₂1瓶(500ul/瓶)，每对引物的上、下游引物各1瓶(50ul/瓶)和ddH₂O1瓶(1000ul/瓶)。按上述剂量对试剂盒中的各组分进行分装，包装后得到中国荷斯坦奶牛亲子鉴定试剂盒。

序列表

<160>24

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>1

gatcaccttg ccactatttc ct 22

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>2

acatgacagc cagctgctac t 21

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>3

gttcaggact ggccctgcta aca 23

<210>4

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>4

cctccagccc actttctctt ctc 23

<210>5

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>5

aaactgtatt ctctaatagc ac 22

<210>6

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>6

gcaagacata tctccattcc ttt 23

<210>7

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>7

gctgccttct accaaatacc c 21

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>8

cttagacaac aggggtttgg 20

<210>9

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>9

gagcaaggtg tttttccaat c 21

<210>10

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>10

cattctccaa ctgcttcctt g 21

<210>11

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>11

aaagtgacac aacagcttct ccag 24

<210>12

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>12

aacgcgtgtc ctagtttggc tgtg 24

<210>13

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>13

cgaattccaa atctgttaat ttgct 25

<210>14

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>14

acagacagaa actcaatgaa agca 24

<210>15

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>15

ctaatttaga atgagagagg cttct 25

<210>16

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>16

ttggtctcta ttctctgaat attcc 25

<210>17

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>17

ccctcctcca ggtaaatcag c 21

<210>18

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>18

aatcacatgg caaataagta catac 25

<210>19

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>19

atcctttgca gcctccacat tg 22

<210>20

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>20

ttgtgcttta tgacactatc cg 22

<210>21

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>21

gagtagagct acaagataaa cttc 24

<210>22

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>22

taactacagg gtgttagatg aactca 26

<210>23

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>23

gatcctgctt atatttaacc ac 22

<210>24

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>24

aaaattccat ggagagagaa ac 22

Claims

1、用于对中国荷斯坦奶牛进行亲子鉴定的微卫星引物，包括下述引物对：

1)由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列组成的引物对；

2)由序列表中序列3和序列4的核苷酸序列组成的引物对；

3)由序列表中序列5和序列6的核苷酸序列组成的引物对；

4)由序列表中序列7和序列8的核苷酸序列组成的引物对；

5)由序列表中序列9和序列10的核苷酸序列组成的引物对；

6)由序列表中序列11和序列12的核苷酸序列组成的引物对；

7)由序列表中序列13和序列14的核苷酸序列组成的引物对；

8)由序列表中序列15和序列16的核苷酸序列组成的引物对；

9)由序列表中序列17和序列18的核苷酸序列组成的引物对。

2、根据权利要求1所述的微卫星引物，其特征在于：所述引物还包括下述引物对：

1)由序列表中序列19和序列20的核苷酸序列组成的引物对；

2)由序列表中序列21和序列22的核苷酸序列组成的引物对；

3)由序列表中序列23和序列24的核苷酸序列组成的引物对。

3、一种对中国荷斯坦奶牛进行亲子鉴定的方法，是以待测牛的基因组DNA为模板，在由权利要求1或2所述的用于对中国荷斯坦奶牛进行亲子鉴定的微卫星引物对的引导下进行PCR扩增，扩增结束后，对PCR扩增片段进行8-10％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，根据基因型计算亲子指数的LOD值，当LOD值大于0时，候选亲本有可能是真实的亲代，LOD值最高的个体是最似亲本的个体；当LOD值小于0时，候选亲本不可能是真实的亲本。

4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述20μl PCR扩增的反应体系为：模板DNA 10ng，上游引物0.25-1μmol/L，下游引物0.25-0.5μmol/L，10×dNTPs0.05μmol/L，20×PCR缓冲液2μl，MgCl₂2.0μmol/L，Taq E 1U，用ddH₂O补足反应体系至20μl。

5、根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述PCR反应条件为：先94℃预变性3-5分钟；然后94℃变性30秒，55-65℃30秒，72℃延伸30秒，循环30-35次；72℃延伸7-10分钟。

6、一种对中国荷斯坦奶牛进行亲子鉴定的试剂盒，包括权利要求1或2所述的用于对中国荷斯坦奶牛进行亲子鉴定的引物。

7、根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括Taq DNA聚合酶、10×PCR扩增缓冲液、dNTPs、重蒸水、硝酸银、无水碳酸钠、甲醛、硼酸、尿素、乙酸、无水乙醇、苯酚、氯仿、异戊醇、十二烷基硫酸钠、NaCl、HCl、NaOH、10×TBE、溴化乙啶贮存液和6×凝胶加样缓冲液中的一种或几种试剂；所述各种溶液的溶剂均为水。