CN101984077A - 用于荷斯坦牛群体的亲子鉴定snp标记组合及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于荷斯坦牛群体的亲子鉴定SNP标记组合，一种含28个SNP标记，其中所述28个SNP标记的上游引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.23～50所示；下游引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.73～100所示；单碱基延伸引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.123～150所示；一种含50个SNP标记，其中所述50个SNP标记的上游引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1～50所示；下游引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.51～100所示；单碱基延伸引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.101～150所示。本发明提供的SNP标记组合用于荷斯坦牛群，结果准确，优选利用飞行质谱方法，可快速、高通量、简便的检测SNP标记多态，从而推断牛群的亲子关系。
Description
技术领域
本发明涉及使用SNP标记进行荷斯坦牛亲子鉴定的检测体系，具体涉及28个或50个标记组合以及引物序列和检测方法。
背景技术
据文献报道，全世界各国牛群平均系谱错误率可达11％(Banos等，2001)，不同国家由于饲养方式和生产管理情况不同，系谱错误率也存在一定差异，但系谱错误在实际生产管理中难以完全避免。
如果按照世界平均11％的系谱错误率发生在实际生产中，美国的奶牛群体产奶性状的遗传进展将降低12％～15％(Banos等，2001)，，同时会导致近交系数、公畜方差和跨国间的遗传相关等的估计值偏低。Israel和Weller等(2000)的模拟研究表明，如果系谱错误率达10％，假设遗传力为0.25，在20年内以色列奶牛的群体遗传进展将会损失4.3％。
因此，完整、准确的系谱对整个奶牛业生产与研究的发展是十分必要的，亲子鉴定已日益成为生产和科研工作的必要内容之一。
目前，应用于奶牛亲子鉴定最多的是微卫星亲子鉴定方法，如国际上ISAG(International Society for Animal Genetics)推荐的。中国农业大学课题组田菲(2006)、张毅(2009)分别对微卫星标记亲子鉴定方法进行了构建和进一步完善。
但是，微卫星标记的判型工作比较复杂，判型周期长，一般需要三天以上，并且一些特点和技术体系不利于其用于亲子鉴定：1)标记本身多态性高，不同等位基因的长度相差不大，区分、判型较困难；2)人为操作与判断不当情况存在。以上都会导致判型错误，一般每个PCR反应的判型错误率可达1％～5％(Bonin等，2004；Weller等，2004)，Hoffman和Amos(2005)的研究表明微卫星标记的错判率为0.001-0.0127。判型错误率直接影响亲子关系推断的准确性，也会导致各个实验室之间甚至是同一实验室不同时期的同一微卫星标记的同一个体判型结果不一致，使得数据可交流、比较性差，试验的可重复性也较差(Bonin等，2004)。
而SNP标记，即单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism)标记，与微卫星标记相比，SNP标记具有以下优点：
(1)数量丰富，分布广泛，代表性强。SNP标记很丰富，90％以上的基因中都有SNP分布。如在牛基因组平均每443bp就存在一个SNP位点(Heaton等，2001)。
(2)遗传稳定，突变率低，受选择影响小。SNP的突变概率非常低，仅为1×10-9～5×10-9(Martinez-Arias等，2001)，远低于微卫星的10-4～10-6(Herraez等，2005)。此外，SNP在单个基因或整个基因组中的分布是不均匀的，在非转录序列中要多于转录序列，而且即使在转录区也是非同义突变的频率较大(Cargill等，1999)。因此无论在自然选择还是人工选择的过程中，SNP标记都能够很稳定的遗传，不受选择压的影响。
(3)准确性高，方便自动化、高通量检测。SNP通常只是二等位基因或二态(biallelic)的遗传变异，即在该位置上存在两种不同的碱基，因此判型非常简单，二进制的形式可以通过计算机实现自动化，大大减少了人为错误的发生(Kruglyak等，1997；Fries等，2001)，提高判型准确性，节约劳动力和成本。据报道在目前大规模SNP检测的研究中，SNP的判型错误率为0.0001～0.005(Anderson等，2006)，并且SNP判型和数据处理技术与软件发展快速，方便了实验室互相交流和重复实验。
(4)DNA样品量要求低。SNP是单碱基突变，在PCR过程中一般只需要扩增100bp左右片段长度，因此对DNA样品量以及样品的质量要求进一步降低(Morin等，2004)，例如，使用时间飞行质谱(MALDI-TOF)的方法对SNP标记进行分型使用的DNA样品量只需达到2.5～5ng即可。
(5)检测技术丰富。随着应用的增加和技术的发展，SNP标记判型的方法越来越丰富，可以根据不同的群体规模、成本预算选择不同的检测方法。如果在小规模样本情况下考虑成本，应用PCR-RFLP等方法检测SNP位点是比较经济适用的。如果检测样本大，传统方法耗时长、工作量大，更适合选择飞行质谱(MALDI-TOF)或芯片等高通量的方法。
因此，虽然单个SNP标记多态性比微卫星标记低，但具备代表性强、稳定性高、测定准确简便、可自动化高通量检测等优势，可望很好地解决在亲子鉴定中微卫星标记判型错误率较高、重复性差的问题，通过使用多个SNP标记能够弥补其多态性差的缺点，因此将其用于亲子鉴定的前景十分广阔。
发明内容
本发明的目的是针对现在微卫星标记判型难以自动化，错误率高的缺点，利用SNP标记高通量、易检测、自动化的优点，针对荷斯坦牛群，建立一套可用于荷斯坦牛群体的亲子鉴定标记组合，并建立简便、准确的飞行质谱来检测此套SNP标记多态性的技术。
为达到上述目的，本发明的技术方案提供一种用于荷斯坦牛群体的亲子鉴定SNP标记组合，其包含如下表1所示的28个SNP标记：
其中，上述28个SNP标记的上游引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.23～50所示；下游引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.73～100所示；单碱基延伸引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.123～150所示。
上述28个SNP标记在荷斯坦牛群的基因频率与基因型频率如下表2所示：
表228个SNP标记在荷斯坦牛群的基因频率与基因型频率
| 标记 | P | H | R | MAF |
| SNPLD101 | 0.21 | 0.24 | 0.55 | 0.49 |
| SNPLD103 | 0.22 | 0.29 | 0.49 | 0.46 |
| SNPLD108 | 0.12 | 0.44 | 0.45 | 0.34 |
| SNPLD11 | 0.26 | 0.17 | 0.56 | 0.45 |
| SNPLD113 | 0.23 | 0.26 | 0.51 | 0.49 |
| SNPLD114 | 0.29 | 0.21 | 0.50 | 0.46 |
| SNPLD120 | 0.30 | 0.18 | 0.52 | 0.44 |
| SNPLD13 | 0.25 | 0.21 | 0.55 | 0.48 |
| SNPLD131 | 0.41 | 0.17 | 0.42 | 0.38 |
| SNPLD139 | 0.23 | 0.15 | 0.62 | 0.46 |
| SNPLD142 | 0.26 | 0.26 | 0.49 | 0.50 |
| SNPLD147 | 0.26 | 0.29 | 0.45 | 0.49 |
| SNPLD20 | 0.36 | 0.10 | 0.54 | 0.37 |
| SNPLD22 | 0.40 | 0.11 | 0.49 | 0.35 |
| SNPLD27 | 0.20 | 0.23 | 0.57 | 0.48 |
| SNPLD33 | 0.38 | 0.14 | 0.48 | 0.38 |
| SNPLD34 | 0.38 | 0.14 | 0.47 | 0.38 |
| SNPLD38 | 0.22 | 0.31 | 0.46 | 0.45 |
| SNPLD4 | 0.18 | 0.23 | 0.59 | 0.47 |
| SNPLD42 | 0.50 | 0.07 | 0.43 | 0.29 |
| SNPLD44 | 0.30 | 0.19 | 0.50 | 0.45 |
| SNPLD55 | 0.14 | 0.36 | 0.50 | 0.39 |
| SNPLD66 | 0.11 | 0.43 | 0.46 | 0.34 |
| SNPLD78 | 0.16 | 0.39 | 0.45 | 0.38 |
| SNPLD80 | 0.32 | 0.13 | 0.55 | 0.40 |
| SNPLD83 | 0.15 | 0.37 | 0.48 | 0.39 |
| SNPLD84 | 0.18 | 0.32 | 0.50 | 0.43 |
| SNPLD9 | 0.39 | 0.13 | 0.48 | 0.37 |
注：1.P、H、R分别代表纯合子AA基因型频率、杂合子AB基因型频率和纯合子BB基因型频率
2.MAF，最小等位基因频率
上述28个SNP标记是通过严谨的试验筛选得到的，具体的筛选过程将在后续具体实施方式中进一步描述。本发明也通过整套SNP标记在实际群体中进行亲子推断验证的试验证明了上述28个SNP标记组合可以比较准确的验证推断出随机牛群之间的母子关系、父子关系以及双亲关系。
在筛选SNP标记的过程中，发现上述28个SNP标记已足以进行亲子关系推断，但SNP标记的数量越大其准确性也会越高，故本发明为了牛亲子鉴定应用过程中有各种不同的要求，例如不同的群体规模的亲子鉴定；较多的半同胞群体的亲子鉴定；资金有限的群体亲子鉴定以及严格要求准确性的种公牛鉴定等多种情况，可以灵活选择不同数量的SNP标记。进一步地，本发明提供了一种更为准确的用于荷斯坦牛群体的亲子鉴定SNP标记组合，其包含如下表3所示的50个SNP标记(其中含上述28个SNP标记)：
其中，上述50个SNP标记的上游引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1～50所示；下游引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.51～100所示；单碱基延伸引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.101～150所示。
上述50个SNP标记在荷斯坦牛群的基因频率与基因型频率如下表4所示：
表450个SNP标记在荷斯坦牛群的基因频率与基因型频率
| 标记 | P | H | R | MAF |
| SNPLD1 | 0.15 | 0.35 | 0.50 | 0.40 |
| SNPLD104 | 0.25 | 0.26 | 0.49 | 0.49 |
| SNPLD112 | 0.22 | 0.23 | 0.55 | 0.49 |
| SNPLD134 | 0.33 | 0.16 | 0.51 | 0.41 |
| SNPLD144 | 0.34 | 0.18 | 0.48 | 0.42 |
| SNPLD16 | 0.42 | 0.08 | 0.49 | 0.33 |
| SNPLD18 | 0.38 | 0.15 | 0.48 | 0.39 |
| SNPLD23 | 0.18 | 0.24 | 0.58 | 0.47 |
| SNPLD39 | 0.12 | 0.44 | 0.44 | 0.34 |
| SNPLD47 | 0.23 | 0.28 | 0.49 | 0.48 |
| SNPLD48 | 0.08 | 0.54 | 0.38 | 0.27 |
| SNPLD5 | 0.24 | 0.21 | 0.55 | 0.49 |
| SNPLD56 | 0.35 | 0.11 | 0.54 | 0.38 |
| SNPLD59 | 0.20 | 0.23 | 0.57 | 0.48 |
| SNPLD62 | 0.41 | 0.09 | 0.50 | 0.34 |
| SNPLD72 | 0.23 | 0.26 | 0.51 | 0.48 |
| SNPLD82 | 0.29 | 0.21 | 0.50 | 0.46 |
| SNPLD85 | 0.22 | 0.27 | 0.51 | 0.48 |
| SNPLD88 | 0.38 | 0.12 | 0.50 | 0.37 |
| SNPLD90 | 0.18 | 0.33 | 0.48 | 0.43 |
| SNPLD92 | 0.12 | 0.41 | 0.47 | 0.35 |
| SNPLD97 | 0.21 | 0.22 | 0.56 | 0.50 |
| SNPLD101 | 0.21 | 0.24 | 0.55 | 0.49 |
| SNPLD103 | 0.22 | 0.29 | 0.49 | 0.46 |
| SNPLD108 | 0.12 | 0.44 | 0.45 | 0.34 |
| SNPLD11 | 0.26 | 0.17 | 0.56 | 0.45 |
| SNPLD113 | 0.23 | 0.26 | 0.51 | 0.49 |
| SNPLD114 | 0.29 | 0.21 | 0.50 | 0.46 |
| SNPLD120 | 0.30 | 0.18 | 0.52 | 0.44 |
| SNPLD13 | 0.25 | 0.21 | 0.55 | 0.48 |
| SNPLD131 | 0.41 | 0.17 | 0.42 | 0.38 |
| SNPLD139 | 0.23 | 0.15 | 0.62 | 0.46 |
| SNPLD142 | 0.26 | 0.26 | 0.49 | 0.50 |
| SNPLD147 | 0.26 | 0.29 | 0.45 | 0.49 |
| SNPLD20 | 0.36 | 0.10 | 0.54 | 0.37 |
| SNPLD22 | 0.40 | 0.11 | 0.49 | 0.35 |
| SNPLD27 | 0.20 | 0.23 | 0.57 | 0.48 |
| SNPLD33 | 0.38 | 0.14 | 0.48 | 0.38 |
| SNPLD34 | 0.38 | 0.14 | 0.47 | 0.38 |
| SNPLD38 | 0.22 | 0.31 | 0.46 | 0.45 |
| SNPLD4 | 0.18 | 0.23 | 0.59 | 0.47 |
| SNPLD42 | 0.50 | 0.07 | 0.43 | 0.29 |
| SNPLD44 | 0.30 | 0.19 | 0.50 | 0.45 |
| SNPLD55 | 0.14 | 0.36 | 0.50 | 0.39 |
| SNPLD66 | 0.11 | 0.43 | 0.46 | 0.34 |
| SNPLD78 | 0.16 | 0.39 | 0.45 | 0.38 |
| SNPLD80 | 0.32 | 0.13 | 0.55 | 0.40 |
| SNPLD83 | 0.15 | 0.37 | 0.48 | 0.39 |
| SNPLD84 | 0.18 | 0.32 | 0.50 | 0.43 |
| SNPLD9 | 0.39 | 0.13 | 0.48 | 0.37 |
| 平均 | 0.42 |
注：1.P、H、R分别代表纯合子AA基因型频率、杂合子AB基因型频率和纯合子BB基因型频率
2.MAF，最小等位基因频率
上述标记组合可以利用PCR-RFLP、AS-PCR等方法检测SNP位点，比较经济适用。如果检测样本大，耗时长、工作量大，优选利用飞行质谱(MALDI-TOF)或芯片等高通量的方法来检测。以飞行质谱的方法为例，利用上述标记组合进行荷斯坦牛亲子鉴定检测的方法可以包括以下步骤：(1)提取基因组：包括提取抗凝血DNA和提取公牛冻精基因组DNA；(2)飞行质谱检测SNP多态；(3)用软件进行亲子推断。
本发明经过飞行质谱检测SNP多态以及亲子推断试验验证，上述50个SNP标记的LOD值都为正，且Delta都大于等于0，无论是父子推断还是双亲推断，亲子关系都是极显著(置信度超过95％)，母子推断仅有一个trios亲子关系为较显著(置信度为85％)。并且推断亲本与实际亲本完全一致(实际亲本已经过牛场的各相关记录验证是正确的)。
本发明提供的SNP标记组合用于荷斯坦牛群，结果准确，优选利用飞行质谱方法，可快速、高通量、简便的检测SNP标记多态，从而推断牛群的亲子关系。
附图说明
图1是本发明实施例1中标记SNPLD4所有个体的判型散点图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1：SNP标记组合的选择
本发明对用于亲子鉴定体系的SNP标记的选择共经过了三个过程，具体如下：
(1)参考文献和牛芯片数据初步筛选
本发明初步选择的SNP标记主要来源包括两个部分，一部分来自于文献(Heaton等，2002；Werner等，2004)报道的应用于牛的部分SNP标记，另外一部分是来自中国农业大学奶牛全基因组选择研究课题组(“948”项目2010C10)SNP标记芯片(BovineSNP50 Genotyping BeadChip)数据，共获取149个SNP标记。
(2)池DNA测序
针对以上149个SNP标记设计引物，以30个不具有亲缘关系的荷斯坦牛混合DNA池作为模板，PCR扩增后ABI 3730XL直接测序。多态位点出现一个双峰套叠的情况，根据双峰比值进行筛选，选择多态性好的标记92个。
(3)飞行质谱检测
飞行质谱法的原理是首先进行多重PCR，扩增得到多态位点及附近序列的片段产物，然后根据碱基组合不同飞行时间不同进行区分。按照染色体分布均匀且检测片段分子量差异显著的原则设计多重PCR引物，多重PCR组合中SNP标记数目越小其互相干扰的可能性越低，以25重为最佳。本研究SNP标记数量较多，因此从92个确定多态性良好的SNP标记中进行筛选组合和优化。按照组合尽可能多的标记和标记尽可能广的覆盖染色体的原则，共确定了61个标记组合组成两套多重PCR，第一套PCR反应体系包括31个SNP标记，第二套包括30个SNP标记。
对多重PCR引物使用Assay Design 3.1软件设计，合成的引物使用质谱仪检测其分子量，保证其准确且无杂质。本研究中61对设计的引物经过检测后，57对符合理论分子量，两对存在杂质，两对分子量错误。也就是说，61对引物有57对完全合格，2对效果略差，2对完全不可用，为了在同一多重PCR体系中得到尽可能多的SNP标记的信息，因此选择了59对引物继续实验。
利用MassARRAY飞行质谱检测系统进行每个个体的SNP标记基因型判型。图1显示的是标记SNPLD4(G/A)的判型散点图，蓝色为AA型，23个，绿色为AG型，88个，橙色为GG型，55个，红色表示未检出，2个，因此该标记的检出率为98.81％，MAF为0.47。
在飞行质谱检测的过程中随机设置了10对重复样品(盲样)用于估计结果的准确性，检出的486个一一对应基因型数据中只有1个出现不一致，由此估计本研究中飞行质谱法判型不一致率为0.002(1/486)，这与Anderson等(2006)报道的SNP判型错误率0.005-0.0001相一致，即可认为飞行质谱检测SNP基因型的实验结果可靠。
所有飞行质谱检测的59个标记，统计检出率并处理数据，对检出率低于85％，哈代温伯格严重不平衡(p＜0.01)的SNP标记做缺失处理。最后，共筛选并确定了结果可靠的50个SNP标记用于建立亲子鉴定标记体系，所述50个标记的上下游引物序列和单碱基延伸引物序列见上述表3，占检测标记的84.75％(50/59)。这50个SNP标记分别有22个来自第一套多重PCR组合，28个来自第二套多重PCR组合，所述28个标记的上下游引物序列和单碱基延伸引物序列见上述表1。
168头个体(122荷斯坦牛+46其他品种)50个SNP标记理论上应得出8400条基因型数据，实际获得了8160条数据，因此平均检出率为97.01％(8160/8400)。
50个SNP标记在荷斯坦牛群的基因频率与基因型频率见上述表4。可以看出，在荷斯坦牛群体(122头)中50个SNP标记平均MAF为0.42，范围是0.27-0.5。
考虑到牛亲子鉴定应用过程中有各种不同的要求，例如不同的群体规模的亲子鉴定；较多的半同胞群体的亲子鉴定；资金有限的群体亲子鉴定以及严格要求准确性的种公牛鉴定等多种情况，可以灵活选择不同数量的SNP标记。由于SNP标记的数量越大其准确性越高，检测成本也会相应增加，为了满足不同亲子鉴定的需要，本研究对第二套多重PCR组合的28个SNP标记也进行了分析，研究了用其做亲子鉴定的效率。
在荷斯坦牛群体中，单亲推断和双亲推断情况下，使用50个SNP标记或者是28个SNP标记的累积排除概率见下表5。
表5荷斯坦牛群体不同数量SNP标记的累积排除概率
| 标记数量 | 平均MAF | 单亲推断 | 双亲推断 |
| 50标记 | 0.42 | 0.997853 | 0.999999 |
| 28标记 | 0.42 | 0.968440 | 0.999879 |
实施例2：采用飞行质谱的方法对牛群进行SNP多态分析及亲子推断：
一、基因组提取
1、抗凝血DNA提取方法
本试验的血样是加入抗凝剂(柠檬酸钠)的牛全血，为尾静脉取血，冷冻保存，血液鲜红，稍粘稠，仅个别有部分凝结。
本试验使用的是离心柱法提取抗凝血DNA，采用天根公司生产的DP318试剂盒，具体步骤如下：
样品上下颠倒摇匀，样品管中部取600ul全血于2mL离心管。
加入20ul蛋白酶K和200ul缓冲液GB，使用涡旋仪15秒，充分晃动摇匀。
样品放入56℃分子杂交炉烘箱，注意盖紧盖子或使用封口膜防止漏液，消化5-10小时，边消化边缓慢颠倒混匀，直至溶液清亮无沉淀。
加入200ul冰的无水乙醇，轻轻上下颠倒混匀10次，转移至吸附柱，吸附柱下面有配套的废液收集管，此时可能观察到絮状沉淀。
12,000rpm离心30s，弃去收集管中的废液。
向吸附柱内加入500ul缓冲液GD，12,000rpm离心30s，弃去收集管中废液，吸附柱放回废液收集管中。
向吸附柱内加入700ul漂洗液PW，12,000rpm离心30s，弃去收集管中废液，吸附柱放回废液收集管中。
向吸附柱内加入500ul漂洗液PW，12,000rpm离心30s，弃去收集管中废液，吸附柱放回废液收集管中。
12,000rpm离心2min，弃去废液收集管。
取已消毒灭菌的1.5mL离心管剪掉盖子作为DNA收集管，将吸附柱转移到其中，开盖常温放置5min，晾干其中的残余的漂洗液。
向吸附柱中加入事先56℃预热的100ul洗脱缓冲液TB，常温静置30min或4℃中过夜。
12,000rpm离心2min，离心管中即获得基因组DNA。
使用1μL DNA样品，1％琼脂糖凝胶，130V电泳10分钟，观察结果合格后转移至PCR管中。
使用分光光度计NanoDrop2000测定溶液中DNA的浓度和A260/A280比值，测量3次取平均值，浓度应在30ng/μl，A260/A280比值应该在1.7-2.0之间，合格DNA 4℃取用或-20℃保存。
2、公牛冻精基因组DNA的提取
公牛冻精均为细管冻精，进口冻精管较粗，容量分为0.5ml和0.25ml两种。本试验采用的是酚仿抽提法提取冻精基因组中的DNA，具体步骤如下：
将冻精室温放置2ml离心管中解冻，用剪刀剪去去两端堵塞物使其中冻精完全流入离心管中。
加入800μl生理盐水，充分混匀，洗去冻精中的稀释液及精清等蛋白成分。
12,000rpm离心1min，小心倒去废液，保留白色沉淀。
重复2和3步操作一次。
加入冻精DNA抽提液600μl及20mg/ml的蛋白酶K5μl，使用用涡旋仪1min，充分混匀呈悬浮状。
置分子杂交炉56℃消化5-10小时，注意盖紧盖子或者使用封口膜防止漏液，直至溶液清亮无沉淀。
加入500μl苯酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)，轻轻转动混匀10min。
12,000rpm离心10min。
小心吸取上清，转移到另一新离心管中，加入400μl氯仿/异戊醇(24/1)，轻轻转动混匀10min。
12,000rpm离心10min。
小心吸取上清，转移到另一新离心管中，加入800ml冰镇无水乙醇，轻轻颠倒转动至DNA聚集成团。
12,000rpm离心2min，小心倒去废液，静置10min，彻底晾干残留液体。
加入100μl TE，常温静置30min或4℃中过夜使其充分溶解。
使用1μl DNA样品，1％琼脂糖凝胶，130V电泳10分钟，观察结果合格后转移至PCR管中。
使用分光光度计NanoDrop2000测定溶液中DNA的浓度和A260/A280比值，测量3次取平均值，浓度应在30ng/μl，A260/A280比值应该在1.7-2.0之间，合格DNA4℃取用或-20℃保存。
二、飞行质谱检测SNP多态
1)引物与DNA稀释以及质检
将普通引物稀释至终浓度为100pmol/ul，根据Sequenom的稀释公式，将单碱基延伸终止引物稀释引物至终浓度为135.3-284.8pmol/ul之间。
13000转离心2.5min，用振荡器轻微震荡，每隔1h震荡一次，在常温下放至3-4小时即可。4℃取用或-20℃保存。
使用1％琼脂糖和分光光度计NanoDrop2000测定样品DNA的有无及浓度，保留合格样品，失败样品重新提取，将DNA浓度稀释至10-20ng/μl，4℃取用或-20℃保存。
2)384孔多重PCR反应
多重PCR过程与普通PCR过程完全相同，在PCR管中依次加入表6中体系，按照表7设置PCR仪程序，混合PCR反应液Mix时额外增加38％，以防止意外损失。
表65μl PCR反应体系
表7多重PCR反应循环参数
3)384孔SAP(虾碱性磷酸酶)消化反应
目的在于消化掉剩余的dNTP。将PCR反应板放入离心机中3000rpm离心3min。SAP消化过程与普通PCR过程相类似，在PCR管中依次加入表8中体系，按照表9设置PCR仪程序，混合SAP酶Mix时额外增加38％，以防止意外损失。
表8SAP消化反应体系
表9SAP消化反应循环参数
4)单碱基延伸终止反应
将SAP反应板放入离心机中3000转离心3min；单碱基延伸终止反应过程与普通PCR过程相类似，在PCR管中依次加入表10中体系，按照表11设置PCR仪程序，单碱基延伸Mix时额外增加38％，以防止意外损失。
表10单碱基延伸终止反应体系
表11单碱基延伸终止循环参数
5)树脂纯化与数据收集
将反应产物(共9μl)稀释3倍，使用树脂进行脱盐；将脱盐处理后的样品点在样品靶点上，自然结晶；上机进行质谱检测，并收集数据。
三、亲子推断
使用的似然法推断亲子关系的软件是Cervus 3.0。其原理是对候选亲本按照LOD值(亲子鉴定似然比的对数转换值：logL)高低做出排队，并且比较最可能亲本与第二可能亲本LOD值之差(Delta)，LOD值越大是真实亲本的可能性越高，Delta越大可靠性越高(Mashall等，1995)。
实施例3：在实际群体中的应用
为了验证整套SNP标记在实际群体中进行推断的可行性和准确性，从试验群体中随机选择了十个家庭组合(trios)做实际的亲子推断验证，采用实施例2获得的数据结果进行了母子推断、父子推断以及双亲推断，结果分别见表12和表13。
表1228个SNP标记组合在实际群体中的应用
注：*代表亲子关系极显著(置信度超过95％)，+代表亲子关系较显著(置信度超过85％)-代表亲子关系没能达到显著要求(置信度低于85％)，这三种情况都表示能够推断出亲子关系，只是显著性水平有差异。
从表12中看出，使用28个SNP标记的情况下，亲子鉴定效率较高，较准确，父亲推断效果非常好，推断父亲与真实父亲是完全一致的，而母子推断时由于标记数目较少，不排除概率降低，因此出现有2头犊牛推断的可能母亲为2头母牛，其中一头母牛是真实母亲。也就是说，使用28个标记，结合生产记录仍然能够准确的推断出犊牛的真实亲本。
表1350个SNP标记组合在实际群体中的应用
注：*代表亲子关系极显著(置信度超过95％)，+代表亲子关系较显著(置信度超过85％)-代表亲子关系没能达到显著要求(置信度低于85％)，这三种情况都表示能够推断出亲子关系，只是显著性水平有差异。
从表13中看出，使用50个SNP标记的情况下，亲子鉴定效率很高，很准确，上述50个SNP标记的LOD值都为正，且Delta都大于等于0，无论是父子推断还是双亲推断，亲子关系都是极显著(置信度超过95％)，母子推断仅有一个trios亲子关系为较显著(置信度为85％)。并且推断亲本与实际亲本完全一致。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种用于荷斯坦牛群体的亲子鉴定SNP标记组合，其特征在于，包含28个SNP标记，其中所述28个SNP标记的上游引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.23～50所示；下游引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.73～100所示；单碱基延伸引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.123～150所示。
2.如权利要求1所述的亲子鉴定SNP标记组合，其特征在于，包含50个SNP标记，其中所述50个SNP标记的上游引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1～50所示；下游引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.51～100所示；单碱基延伸引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.101～150所示。
3.权利要求1或2所述的亲子鉴定SNP标记组合在荷斯坦牛群体亲子鉴定中的应用。
4.一种利用权利要求1或2所述的亲子鉴定标记组合进行荷斯坦牛亲子鉴定检测的方法，包括以下步骤：(1)提取基因组：包括提取抗凝血DNA和提取公牛冻精基因组DNA；(2)飞行质谱检测SNP多态；(3)用软件进行亲子推断。
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