CN107586856B - 一种基于snp位点的川金丝猴亲子鉴定和个体识别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一用于川金丝猴亲子鉴定的SNP标记组合：(1)提取川金丝猴个体的基因组DNA；（2）飞行质谱检测SNP多态性；（3）利用软件进行亲子推断和个体识别。将本发明用于濒危动物的亲子鉴定和个体识别的前景十分广阔。本发明经过检测SNP多态性及亲子推断实验验证，无论是父子关系推断还是双亲推断，亲子关系都是极显著的，并且推断关系与实际亲缘关系完全吻合；本发明提供的SNP标记组合用于川金丝猴亲子鉴定，结果准确，可快速、高通量、简便的进行川金丝猴的亲子鉴定和个体识别。
Description
技术领域
本发明涉及使用SNP位点进行川金丝猴的亲子鉴定和个体识别方法，具体涉及80个川金丝猴的SNP位点引物序列和检测方法。
背景技术
随着全球人口数量的急剧增加，当前地球上的物种正在以有史以来最快的速度灭绝，特别是在那些野生动植物丰富的生态系统中，人类不合理的物种利用不仅影响了生态系统的组成和结构，而且这些活动导致的生态功能的降低反过来进一步影响全球环境变化。随着气候变化、外来物种入侵、生物遗传资源获取与惠益共享等问题的出现，生物多样性保护日益受到国际社会的高度重视。生物多样性保护的关键之一是保护物种，更具体的说就是保护物种的遗传多样性或进化潜力。自20世纪90年代以来，越来越多的证据表明濒危物种种群的遗传变化与种群命运息息相关的，特别是遗传多样性的降低和近交衰退在物种灭绝中起着十分重要的作用。濒危物种的种群一般较小，小种群的遗传后果，如遗传多样性降低、近交衰退等往往无法避免，遗传结构的不利变化将加大濒危物种在变化环境中的灭绝风险。在短时期内，它们可能降低物种的生殖和生存能力；从长远看，它们将削弱种群应对环境变化的进化潜力，毫无疑问，它们是许多物种灭绝的原因，同时，也是目前物种濒危的重要因素。
大多数野生的珍稀濒危动物栖息地往往偏远、生性机警，野外的数量及性比的调查通常不能用传统的调查方法不能实现。近年来，通过在野外收集濒危动物的非损伤性样品(毛发、粪便等)与遗传标记(线粒体DNA、微卫星DNA标记)技术的结合，利用个体识别和遗传多样性分析，极大推动了许多濒危物种的数量调查和相关保护研究。Liu等(2007)利用微卫星分子标记给11个滇金丝猴种群的的粪便样品进行个体识别，并成功的鉴定出个体；Arandjielovic等(2010)通过微卫星分子标记辨别野生西部大猩猩和中部黑猩猩，及调查西部大猩猩的种群数量，结果能准确鉴别粪便样本的归属物种，并发现通过分子标记和传统的标志重捕法的结果的置信区间小于传统样线调查的结果置信区间。同时，动物园内的繁殖种群也存在谱系不清，严重的近亲交配和遗传漂变等遗传问题，通过亲子鉴定的方法，也为这些物种建立明确的亲缘关系，避免或者降低近亲繁殖提供了技术保障。
现代亲缘关系鉴定的方法是DNA分析，利用染色体上的不同遗传标记来识别不同个体之间是否存在血缘关系。目前，用于亲子鉴定和个体识别的遗传标记主要是微卫星DNA标记(SSR)，它具有分布广泛、易于检测、有高度多态性并遵循孟德尔共显性遗传等特点。但是微卫星DNA遗传标记的等位基因长度相近，区分和分型有一定困难。随着科学技术的发展，单核苷酸多态性(SNP)作为新一代遗传标记，SNP比SSR分布的数量更多，更为稳定。SNP在PCR过程中一般只需要扩增100bp左右的长度即可完成检测，对DNA模板的要求更低，能够适应更多的特殊环境样品。SNP标记具有稳定性好，测定准确率高，检测方法简单并且通量高等优点，将其应用于珍稀濒危动物的亲子鉴定和个体识别领域中前景广阔。
随着应用的增加和技术的发展，SNP标记判型的方法越来越丰富，可以根据不同的群体规模、成本预算选择不同的检测方法。
发明内容
本发明的目的是利用SNP标记稳定好、通量高、自动化检测程度高等优点，建立一套用于川金丝猴的亲子鉴定和个体识别的SNP标记组合和检测SNP标记多态性的技术。
为达到上述目的，本发明的技术方案提供一种用于川金丝猴亲子鉴定的SNP标记组合，其保护川金丝猴的80个SNP标记组合并进行检测，本发明检测方法包括以下步骤:
(1)提取川金丝猴个体的基因组DNA，包括抗凝血DNA、毛发和粪便DNA；
(2)飞行质谱检测SNP多态性；
(3)利用软件进行亲子推断和个体识别。
所述的SNP标记组合，其中，第(3)步是通过软件CERVUS3.0.7利用最大似然法进行亲子鉴定，根据待测个体的基因型计算亲子指数的LOD值，当LOD值大于0时，候选亲本有可能是真实亲本，LOD值最高个体为最似亲本；当LOD值小于0，候选亲本不可能是真实亲本。模拟参数设置为模拟10000个子代，候选亲本检出率为100％，位点分型成功率设为0.99，分析错误率为0.01，置信水平的临界值设置为80％和95％。
本发明所述飞行质谱检测SNP多态性所用的是80个SNP标记组合，引物序列如下：
进一步地，其中用到的SNP位点单碱基延伸探针引物序列如下：
所述的的SNP标记组合，其中进行的SNP位点的PCR反应体系按20μl计，具体为：
| 10Xbuffer | 2μl |
| Taq酶 | 1μl |
| dNTP | 0.5μl |
| 上游引物 | 0.5μl |
| 下游引物 | 0.5μl |
| DNA模版 | 1μl |
| 无菌水 | 14.5μl |
本发明选择的SNP位点多态性高、容易扩增、位点的数量适中，虽然单个SNP标记多态性比微卫星标记低，但具备代表性强、稳定性高、测定准确简便、可自动化高通量检测等优势，可望很好地解决在亲子鉴定中微卫星标记判型错误率较高、重复性较差的问题，通过使用多个SNP标记能够弥补其多态性较差的缺点，因此，将其用于濒危动物的亲子鉴定和个体识别的前景十分广阔。本发明经过检测SNP多态性及亲子推断实验验证，无论是父子关系推断还是双亲推断，亲子关系都是极显著的，并且推断关系与实际亲缘关系完全吻合；本发明提供的SNP标记组合用于川金丝猴亲子鉴定，结果准确，可快速、高通量、简便的进行川金丝猴的亲子鉴定和个体识别。
具体实施方式
1.DNA的提取
1)粪便DNA的提取
本研究粪便DNA提取是采用QIAamp DNA Stool Kit(QIAGEN)试剂盒，DNA提取的方法参照试剂盒说明书，但根据实际情况，有所调整，具体操作如下：
(1)取大约200mg粪便表面样品入新2ml的离心管中；
(2)取1.6ml ASL裂解缓冲液入有粪便样品的离心管中，振荡均匀，使样本与裂解液充分接触，静置约2h，在静置的过程中，约10～20min振荡一次；
(3)以12,000rpm速度离心2min，取1.4ml上层无残渣的液体转移到新2ml离心管中；
(4)取一片吸附剂片(InhibitEX)，充分振荡，使吸附剂片溶解完全，使剂片与液体充分接触，室温静置1min；
(5)以12,000rpm速度离心l0min，将上层液体转移到新1.5ml的离心管中；
(6)以12,000rpm速度6min；
(7)取25μl蛋白酶K入新2ml的离心管中，将上一步离心管中的上清液移到含蛋白酶K的离心管中，再加入600μl AL缓冲液，充分振荡；
(8)将混匀的溶液放入70℃的水浴锅，温育10mins；
(9)取600μl无水乙醇加入温育好的溶液中，并充分振荡，混匀；
(10)取600μl步骤混合的溶液到QIAamp DNA吸附柱中，以12,000rpm速度离心1min；更换一个新离心管，弃离心液和旧离心管，继续离心完剩下的混合液；
(11)取500μlBufferAW1溶液到吸附柱中，以12,000rpm速度离心1min，弃离心液和旧离心管；再取300μlBufferAW1溶液到吸附柱中，以12,000rpm速度离心1min，弃离心液和旧离心管；
(12)取500μlBufferAW2溶液到吸附柱中，以12,000rpm速度离心1min，弃离心液和旧离心管；再取300μlBufferAW2溶液到吸附柱中，以12,000rpm速度离心1min，弃离心液和旧离心管；
(13)把吸附柱移到已编号的新1.5ml的离心管中，以12,000rpm速度离心2min，以去无水乙醇的余液；
(14)打开盖子，室温静置5～10mins，充分将无水乙醇挥发；
(15)取100μl温育2～5mins的Buffer AE入离心柱底部，静置2mins，以12,000rpm速度离心1min；
(16)重复步骤15，取100μl温育2～5mins的Buffer AE入离心柱底部，静置2mins，以12,000rpm速度离心2min；并分装DNA，保存于-20℃冰箱备用。
2)毛发DNA的提取
毛发DNA提取是采用QIAamp DNA Investigator Kit(QIAGEN)试剂盒，DNA提取的方法参照试剂盒说明书，根据实际情况，有所调整，具体操作如下：
(1)取10～15根带有毛囊的毛发，用75％酒精冲洗两遍，再用无菌水冲洗2遍；
(2)取新1.5ml的离心管，将毛囊端入离心管底部，截取1cm，加300μl Buffer ATE溶液、20μl蛋白酶K和20μl1MDTT，盖上盖子，振荡混匀；
(3)将离心管放置在56℃水浴锅中温育1～3h，在温育的过程中10mins一次振荡，直至样本完全裂解；
(4)短暂离心，将沾在内盖上的液滴收集入管内，加入300μl Buffer AL，盖上盖子，振荡混匀，以产生均质的溶液；
(5)将离心管放置在70℃水浴锅中温育10min，温育过程中每3min振荡均匀；
(6)加150μl无水乙醇，振荡均匀，充分混合，短暂离心，将站在内盖上的液滴收集入管内；
(7)取600μl至QIAamp MinElute柱，以8,000rpm速度离心1min，弃离心液和旧离心管，更换新离心管；
(8)取400μlBufferAW1溶液到吸附柱中，以8,000rpm速度离心1min，弃离心液和旧离心管；再取300μlBufferAW1溶液到吸附柱中，以8,000rpm速度离心1min，弃离心液和旧离心管；
(9)取400μlBufferAW2溶液到吸附柱中，以8,000rpm速度离心1min，弃离心液和旧离心管；再取300μlBufferAW2溶液到吸附柱中，以8,000rpm速度离心1min，弃离心液和旧离心管；
(10)取700μl无水乙醇入离心柱中，以8,000rpm速度离心2min，弃离心液和旧离心管；换新离心管，再以14,000rpm速度离心3min；
(11)将QIAamp MinElute柱放置在新1.5ml的离心管中，打开盖子，室温静置5～10min；
(12)加80μl温育2～5mins的Buffer AE入离心柱底部，静置2mins，以12,000rpm速度离心1min；
(13)再将离下的液体重新加入离心柱中，静置2min，以12,000rpm速度离心2min；保存于-20℃冰箱备用。
3)血液DNA的提取
血液样本的DNA提取采用QIAamp Blood DNA Mini Kit(QIAGEN)试剂盒，提取的方法参照试剂盒说明书，且根据实际情况，有所调整，具体操作如下：
(1)取200μl溶解后的血液样本入新2ml的离心管中，加20μl蛋白酶K入有样本的离心管中(如果样本量大于200μl时，则其他溶液的量得呈比例增加)；
(2)取200μlAL buffer溶液入有样本的离心管中，充分混匀，在56℃水浴锅中温育30mins，直至裂解液变清亮；
(3)取200μl无水乙醇入温育好的溶液中，充分混匀，低速离下离心管盖上的液体；
(4)取混合液体入
Blood DNA Mini Kit的吸附柱中，以12,000rpm速度离心1min；更换一个新吸离心管，弃离心液和旧离心管；
(5)取400μlBufferAW1溶液到吸附柱中，以12,000rpm速度离心1min，弃离心液和旧离心管；再取300μlBufferAW1溶液到吸附柱中，以12,000rpm速度离心1min，弃离心液和旧离心管；
(6)取400μlBufferAW2溶液到吸附柱中，以12,000rpm速度离心1min，弃离心液和旧离心管；再取300μlBufferAW2溶液到吸附柱中，以12,000rpm速度离心1min，弃离心液和旧离心管；
(7)把吸附柱移到已编号的新1.5ml的离心管中，以12,000rpm速度离心2min；
(8)打开盖子，室温静置5～10mins；
(9)取60μl温育2～5min的Buffer AE入离心柱底部，静置2mins，以12,000rpm速度离心1min；
(10)重复步骤9，取60μl温育2～5min的Buffer AE入离心柱底部，静置2min，以12,000rpm速度离心2min；并分装DNA，保存于-20℃冰箱备用。
2.SNP多态性的检测
(1)根据测序和RAD-seq分析获得的SNP序列，应用Primer3在线进行PCR引物和单碱基延伸探针设计，引物序列见表1和表2。其中SNP-SEQ-1—SNP-SEQ-80分别为80个SNP位点的正向引物，SNP-SEQ-81—SNP-SEQ-160分别为80个SNP位点的反向引物。
(2)将普通引物稀释至终浓度为100pmol/UL，按相关的试剂说明配备反应体系，典型的PCR反应体系如表3。
(3)PCR反应条件：95℃变性3min；94℃变性30s,55℃复性1min，72℃延伸30s,共35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
(4)在PCR反应体系中加入1.5U小牛碱性磷酸化酶(CIP)和1U核酸外切酶I(ExoI),37℃处理45min,然后85℃处理15min，使CIP和ExoI变性。
(5)在上述反应液中加入25pmol单碱基延伸探针引物，0.5U热测序酶,100pmolddNTPs,10X缓冲液。延伸反应：94℃变性20s，52℃退火40s,65℃延伸25s,35个循环。
(6)单碱基延伸反应产物用DNA纯化试剂盒进行纯化。
(7)取0.5μl纯化产物与0.5μl基质混合，取出0.5μl进行飞行质谱检测(MALDI-TOF)分析(杨何义,蔡耘,王杰,等.2003.生物质谱作为SNP分型检测方法的研究.质谱学报,24(4):449-455)。
表1.SNP位点PCR扩增引物
表2.SNP位点延伸探针引物序列
表3.SNP位点的PCR反应体系(20μl)
| 10Xbuffer | 2μl |
| Taq酶 | 1μl |
| dNTP | 0.5μl |
| 上游引物 | 0.5μl |
| 下游引物 | 0.5μl |
| DNA模版 | 1μl |
| 无菌水 | 14.5μl |
3.亲子鉴定和个体识别
通过软件CERVUS3.0.7利用最大似然法进行亲子鉴定(Kalinowski S T,Taper ML,Marshall T C.2007.Revising how the computer program CERVUS accommodatesgenotyping error increases success in paternity assignment.Molecular Ecology,16,1099-1106.)，根据待测个体的基因型计算亲子指数的LOD值，当LOD值大于0时，候选亲本有可能是真实亲本，LOD值最高个体为最似亲本；当LOD值小于0，候选亲本不可能是真实亲本。模拟参数设置为模拟10000个子代，候选亲本检出率为100％，位点分型成功率设为0.99，分析错误率为0.01，置信水平的临界值设置为80％和95％。
Claims (2)
1.一种川金丝猴亲子鉴定的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取川金丝猴个体的基因组DNA；
(2)采用飞行质谱检测SNP多态性；
(3)利用软件进行亲子推断和个体识别，得出结论；
其中，所述飞行质谱检测SNP多态性是采用下述引物序列对80个SNP标记进行检测：
用到的SNP位点延伸探针引物序列如下：
所述第(3)步是通过软件CERVUS3.0.7利用最大似然法进行亲子鉴定，根据待测个体的基因型计算亲子指数的LOD值，当LOD值大于0时，候选亲本有可能是真实亲本，LOD值最高个体为最似亲本；当LOD值小于0，候选亲本不可能是真实亲本，模拟参数设置为模拟10000个子代，候选亲本检出率为100％，位点分型成功率设为0.99，分析错误率为0.01，置信水平的临界值设置为80％和95％。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：提取川金丝猴个体的基因组DNA提取提是抗凝血DNA、毛发DNA，或粪便DNA。
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