CN105296608A - 一种基于snp组合的亲子鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于人类亲子鉴定的SNP标记组合，包括60个SNP标记。这些SNP标记的上游引物的核苷酸序列依次如SEQ？ID？NO.？1~60所示；下游引物的核苷酸序列依次如SEQ？ID？NO.61~120所示；单碱基延伸引物的核苷酸序列依次如SEQ？ID？NO.121~180所示。本发明利用飞行质谱方法，将上述SNP标记组合用于人类的亲子鉴定，结果准确，方法快速简便并且有很高通量。
Description
技术领域
本发明涉及使用SNP标记进行人类亲子鉴定的检测体系，具体涉及60个标记组合以及引物序列和检测方法。
背景技术
现代亲缘关系鉴定的方法是DNA分析，利用人类染色体上的遗传标记来识别两个个体之间是否有血缘关系。有亲缘关系的个体之间，共享相同标记的概率，比没有亲缘关系的个体要大。目前，用于亲子鉴定的遗传标记是第二代遗传标记短串联重复序列（STR），它具有分布广泛，易于检测，信息量大，有高度多态性并遵循孟德尔共显性遗传等特点。STR进行亲子鉴定时，一般检测十几个STR位点，如果有3个以上的位点不同，则可排除亲子关系。但是STR不同等位基因的序列长度相似，区分和判型有一定困难，一般每个PCR反应的判型错误率可达1%~5%（boninetal.2004;Welleretal.2004），判型错误影响亲子鉴定的准确性和可重复性。
随着科学技术的发展，单核苷酸多态性（SNP）作为第三代遗传标记，越来越多的进入人们的视野。在遗传制图、连锁性分析、疾病基因定位和物种多态性研究等诸多领域中，SNP已经逐渐取代STR，成为首选的遗传标记。相对于STR，SNP在染色体中的分布更为广泛，数量更多，检测方法也更方便可靠。在亲缘关系鉴定领域，SNP分型也可以充分发挥其优势：
1）作为遗传标记，SNP比STR更为稳定，STR序列的突变率高于人类基因的平均突变率，而且STR中存在着多个核心序列重复、核心序列的非整倍重复等现象，SNP则不存在这类问题；
2）SNP检测比STR检测对DNA样本的要求更低，适应更多的特殊环境，SNP是单碱基图片，在PCR过程中一般只需扩增100bp左右的长度即可完成检测，9.11灾难的遇难人员身份识别，因为很多样本在极端温度与湿度的影响下，其DNA已经降解，很难收集到足够的STR数据，因此有一部分就是利用SNP完成的；
3）相对于STR，SNP的检测更加廉价，且通量更高，美国等发达国家在9.11等事件中的经验表明，利用STR鉴定技术成功识别一个遗体的平均成本可以达到上千美元，SNP鉴定技术有望将识别成本减半甚至更低；
4）在鉴定父母与子女这样之间的亲缘关系方面，目前所广泛使用的，十几个位点的STR鉴定系统能够提供充分的信息，但是当鉴定的需求扩充到更远的亲缘关系，比如当一个灾难事故遇难者，只有一个表亲能够提供身份鉴别所需的样本时，这样的STR鉴定就有些力不从心，而SNP位点由于具有远超过STR位点的数量，可以提供更多的信息，理论上能够对很远的亲属关系也提供可信的判定；
综上所述，SNP标记具有稳定性高，测定准确，检测方法简便并且高通量等优点，将其应用于亲子鉴定的前景十分广阔，代表了未来的发展方向。
发明内容
本发明的目的是利用SNP标记高通量、易检测、方便自动化的有点，建立了一套用于人类亲子鉴定的标记组合，并建立简便准确的飞行质谱方法检测此套SNP标记多态性的技术。
为达到上述目的，本发明的技术方案提供一种用于人类亲子鉴定的SNP标记组合，其保护如附表所示的60个SNP标记：上述标记组合优选利用飞行质谱（MALDI-TOF）方法进行检测，检测方法包括以下步骤（1）提取基因组DNA，包括提取抗凝血DNA和口腔上皮细胞DNA；（2）飞行质谱检测SNP多态；（3）利用软件进行亲子推断。
本发明经过飞行质谱检测SNP多态及亲子推断实验验证，无论是父子关系推断还是双亲推断，亲子关系都是极显著的，并且推断关系与实际亲缘关系完全吻合；本发明提供的SNP标记组合用于人类亲子鉴定，结果准确。利用飞行质谱方法，可快速、高通量、简便的进行人类亲子鉴定。
应用本发明公开的方法，对500组样品（每组样品包括父本、母本和子本样品）进行的亲子鉴定测试，准确率为100%，达到理论计算值。
实施例
以下结合实施例，对本发明的具体实施方式进行详细描述，实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1：采用飞行质谱方法对人群进行SNP分型及亲子推断：
一）提取基因组DNA
1）本试验的样本是使用刮棒采集的口腔粘膜细胞，室温保存。刮棒采样DNA提取的具体步骤如下：
2）将口腔刮棒上的脱落细胞溶于400uL1X裂解液中，加入1uL蛋白酶K，56度水浴30分钟；
3）取出样品置冰水浴1分钟，加入6mol/LNaCl150uL，剧烈振荡15-20秒，13000转离心10分钟；
4）吸取取上清液至新的离心管中，加入1.1mL无水乙醇，上下颠倒10次至絮状DNA沉淀出现，室温放置10分钟，13000转离心2分钟沉淀DNA；
6）弃去上清液，再加入0.25mL70%乙醇洗涤DNA沉淀，室温放置1分钟后，13000转离心5分钟；
7）用移液器小心吸取乙醇，然后放入通风橱中通风10分钟，然后用35uLTE溶解DNA；8）DNA可在4度保存1-2个月，或者存放在-20度长期保存；
9）使用2uLDNA样品，1.5%琼脂糖凝胶，120V电泳15分钟，观察结果合格后转移至PCR管中；
10）紫外分光光度计SMA3000测定溶液中DNA的浓度和A260/A280比值，测量3次取平均值，浓度应在30ng/uL，A260/A280比值应该在1.7-2.0之间，合格的DNA4℃取用或-20℃保存；
二）飞行质谱检测SNP多态：
1.引物与DNA稀释以及质检：
1）将普通引物稀释至终浓度为100pmol/uL，根据Sequenom的稀释公式，将单碱基延伸终止引物稀释至终浓度为135.3-284.8pmol/uL之间；
2）13000转离心2.5min，用振荡器轻微震荡，每隔1h震荡一次，在常温下放至3-4小时即可，4℃取用或-20℃保存；
3）使用1.5%琼脂糖和紫外分光光度计SMA3000测定样品DNA的有无及浓度，保留合格样品，失败样品重新提取，将DNA浓度稀释至10-20ng/uL，4℃取用或-20℃保存；
2.384孔多重PCR反应
1）多重PCR过程与普通PCR过程完全相同，在384孔PCR板中依次加入表2中体系，按照表3设置PCR仪程序，混合PCR反应液Mix时额外增加38%，以防止意外损失；
3.384孔SAP（虾碱性磷酸酶）消化反应
目的在于消化掉剩余的dNTP，将PCR反应板放入离心机中1000rpm离心数秒钟，SAP消化过程与普通PCR过程相类似，在384孔PCR板中依次加入表4中体系，按照表5设置PCR仪程序，混合SAP酶Mix是额外增加38%，以防止意外损失；
4.单碱基延伸终止反应
将SAP反应板放入离心机中1000转离心数秒钟；单碱基延伸终止反应过程与普通PCR过程相类似，在384孔PCR板中依次加入表6中体系，按照表7设置PCR仪程序，单碱基延伸Mix时额外增加38%，以防止意外损失；
5.树脂纯化与数据收集
将反应产物（共9uL）加入25uL水进行稀释，使用树脂进行脱盐；将脱盐处理后的样品点在芯片靶点上，自然结晶，上机进行质谱检测，并收集数据；
三）进行亲子推断
对飞行质谱产生的SNP分型数据进行分析，推算出每个SNP位点的paternityindex(PI)，PI值的计算依据表2中的公式进行（Kaiser,L.andSever,G,1983）
两个样本之间最终的PI值（compositePI，CPI），由所有SNP位点的PI值相乘得到，CPI值>1000的两个样本，可以确定真实的父子关系，CPI值=0且PI=0的SNP位点个数大于或等于3的，可以排除父子关系，CPI值=0且PI=0的SNP位点个数为1或者2的，为父子关系不能确定也不能排除的。
参考文献
Kaiser,L.andSever,G.(1983).Paternitytesting:I.Calculationofpaternityindexes.AmericanJournalofMedicalGenetics.15(2):323-329.
SEQUENCELISTING
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acgttggatgtgggtggaagaggaagttga30
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<213>Homosapiens
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<212>DNA
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<212>DNA
<213>Homosapiens
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acgttggatgggaaggaataaatgtctac29
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<211>30
<212>DNA
<213>Homosapiens
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acgttggatgctgatgtgcagtatcaagtg30
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<212>DNA
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acgttggatgaggaagtccctatcttcttg30
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<213>Homosapiens
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acgttggatgcaagactacccaagatggga30
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<212>DNA
<213>Homosapiens
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acgttggatgcttgaggctattgctggaga30
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<212>DNA
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<213>Homosapiens
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<212>DNA
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acgttggatgtccccaagacatatttcccc30
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acgttggatgcatatcattaatcttgtctc30
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acgttggatggggaactactgtgaagtgtc30
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acgttggatgttaggcctgtgcttcagcg29
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<213>Homosapiens
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acgttggatgggacaaactgaaggttgagg30
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<212>DNA
<213>Homosapiens
<400>157
acgttggatgcagaaaagaatagggagcag30
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<211>30
<212>DNA
<213>Homosapiens
<400>158
acgttggatgtcaagccagtgcaagaaaac30
<210>159
<211>30
<212>DNA
<213>Homosapiens
<400>159
acgttggatgaggtctgtagtcaaatgcac30
<210>160
<211>30
<212>DNA
<213>Homosapiens
<400>160
acgttggatggctaactttttttctctcgc30
<210>161
<211>15
<212>DNA
<213>Homosapiens
<400>161
aaccccgccagaaaa15
<210>162
<211>15
<212>DNA
<213>Homosapiens
<400>162
atgcactgggctgtt15
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<213>Homosapiens
<400>163
ggcccagagaagaaag16
<210>164
<211>17
<212>DNA
<213>Homosapiens
<400>164
ccctccaccactgaaca17
<210>165
<211>17
<212>DNA
<213>Homosapiens
<400>165
tctatgtggcttgtctt17
<210>166
<211>18
<212>DNA
<213>Homosapiens
<400>166
tccctaatccttgctaac18
<210>167
<211>18
<212>DNA
<213>Homosapiens
<400>167
gtggccatgtgattccta18
<210>168
<211>19
<212>DNA
<213>Homosapiens
<400>168
agctgccattcccttttac19
<210>169
<211>19
<212>DNA
<213>Homosapiens
<400>169
acaggtagcactgaggtga19
<210>170
<211>20
<212>DNA
<213>Homosapiens
<400>170
ctctccctatgcacaataga20
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<211>20
<212>DNA
<213>Homosapiens
<400>171
aggccatctccatgggattc20
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<211>20
<212>DNA
<213>Homosapiens
<400>172
gggaagaggtccttgctaga20
<210>173
<211>21
<212>DNA
<213>Homosapiens
<400>173
gtgcttaggtgatactttcct21
<210>174
<211>21
<212>DNA
<213>Homosapiens
<400>174
aagggtgacagtggaaatcat21
<210>175
<211>22
<212>DNA
<213>Homosapiens
<400>175
cctgcttatactttatctgctt22
<210>176
<211>22
<212>DNA
<213>Homosapiens
<400>176
taaagaaacaactcaagaaaac22
<210>177
<211>23
<212>DNA
<213>Homosapiens
<400>177
cttttttgactgccttttgatac23
<210>178
<211>23
<212>DNA
<213>Homosapiens
<400>178
cataaaacaagatggatgcttta23
<210>179
<211>24
<212>DNA
<213>Homosapiens
<400>179
atagcaatgccacaatctttgact24
<210>180
<211>24
<212>DNA
<213>Homosapiens
<400>180
ttaatcagtattttgagtatggta24
Claims (2)
1.一种用于人类亲子鉴定的SNP标记组合，其特征在于，包含60个SNP标记，这些SNP标记的上游引物的核苷酸序列依次如SEQIDNO.1~60所示；下游引物的核苷酸序列依次如SEQIDNO.61~120所示；单碱基延伸引物的核苷酸序列依次如SEQIDNO.121~180所示，权利要求1所述的亲子鉴定SNP标记组合在人类亲子鉴定中的应用。
2.一种利用权利要求1所述的亲子鉴定标记组合进行人类亲子鉴定检测的方法，包括以下步骤：（1）提取基因组DNA，包括提取抗凝血DNA和口腔上皮细胞DNA；（2）飞行质谱检测SNP多态；（3）利用软件进行亲子推断。
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