CN106367498A - 美洲大蠊微卫星位点及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一类微卫星标记及其在美洲大蠊群体遗传学中的应用。本发明公开了36个美洲大蠊微卫星位点及其引物，所述微卫星位点提供了可有效地应用于美洲大蠊种群遗传学研究的遗传标记，所述引物的扩增结果具有高效的多态性和稳定性，可用于分析美洲大蠊种群的遗传多样性、种质资源的鉴定以及亲缘关系的鉴定。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和遗传学领域，尤其涉及美洲大蠊微卫星DNA，及其在美洲大蠊群体遗传学中的应用。
背景技术
微卫星DNA(Microsatellite DNA)又称短串联重复序列(Short tandem repeat，STR)，或简单序列重复(Simple sequence repeat，SSR)，一般是指基因组中由1-6个核苷酸为基本重复单元组成的DNA串联重复序列，例如(AG)n、(CT)n、(AGC)n、(AATT)n、(AAAAC)n等。广泛分布于真核生物和原核生物的基因组中，甚至在最小的细菌基因组中也存在，微卫星具有较高的突变率，且突变大都属于可积累的中性突变，因此微卫星具有丰富的多态性，可提供较多的遗传信息；微卫星各等位基因具有共显性特点，符合孟德尔遗传规律，而且微卫星片段小(一般在200bp以下)，其侧翼序列相对保守，通过在侧翼序列上设计引物很容易从基因组中扩增出来，技术要求不高，检测方便、迅速，灵敏度高、重复性好。
美洲大蠊是我国传统的药用动物，近年来基于美洲大蠊已开发出了康复新液、心脉隆、肝龙胶囊等药品，由于康复新液等药品临床效果好，很受市场欢迎，美洲大蠊市场需求越来越大，人工养殖越来越多，而且已有规模养殖的需求。人工选育、优质种源的培育将成为规模化养殖的基础，需要了解有关该物种的遗传背景和群体遗传结构，从而建立美洲大蠊的遗传背景档案。近年来，人们通过各种DNA分子标记技术，从不同角度和不同层次，更加全面的揭示物种的遗传信息。目前，国内外对美洲大蠊的遗传背景知之甚少，还未见有微卫星等分子marker的报道以及亲缘鉴定等工作开展，美洲大蠊人工养殖种源质量、我国主要分布区美洲大蠊之间遗传差异等重要的种群遗传信息缺乏，这也是一个急需解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供美洲大蠊微卫星位点，检测该标记的引物及方法等。
在第一个方面，本发明提供美洲大蠊微卫星位点，所述微卫星标记的序列如SEQID NO：1-36任意一条所示；所述微卫星标记由引物扩增而得。
在第二个方面，本发明提供扩增美洲大蠊微卫星标记序列的引物对，所述引物对选自SEQ ID NO:37+SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:39+SEQ ID NO:40，SEQ ID NO:41+SEQ IDNO:42，SEQ ID NO:43+SEQ ID NO:44，SEQ ID NO:45+SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:47+SEQ IDNO:48，SEQ ID NO:49+SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:51+SEQ ID NO:52，SEQ ID NO:53+SEQ IDNO:54，SEQ ID NO:55+SEQ ID NO:56，SEQ ID NO:57+SEQ ID NO:58，SEQ ID NO:59+SEQ IDNO:60，SEQ ID NO:61+SEQ ID NO:62，SEQ ID NO:63+SEQ ID NO:64，SEQ ID NO:65+SEQ IDNO:66，SEQ ID NO:67+SEQ ID NO:68，SEQ ID NO:69+SEQ ID NO:70，SEQ ID NO:71+SEQ IDNO:72，SEQ ID NO:73+SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:75+SEQ ID NO:76，SEQ ID NO:77+SEQ IDNO:78，SEQ ID NO:79+SEQ ID NO:80，SEQ ID NO:81+SEQ ID NO:82，SEQ ID NO:83+SEQ IDNO:84，SEQ ID NO:85+SEQ ID NO:86，SEQ ID NO:87+SEQ ID NO:88，SEQ ID NO:89+SEQ IDNO:90，SEQ ID NO:91+SEQ ID NO:92，SEQ ID NO:93+SEQ ID NO:94，SEQ ID NO:95+SEQ IDNO:96，SEQ ID NO:97+SEQ ID NO:98，SEQ ID NO:99+SEQ ID NO:100，SEQ ID NO:101+SEQID NO:102，SEQ ID NO:103+SEQ ID NO:104，SEQ ID NO:105+SEQ ID NO:106，SEQ ID NO:107+SEQ ID NO:108。
第三个方面，本发明提供美洲大蠊微卫星位点群，所述微卫星标记群包括2到36个美洲大蠊微卫星位点，所述微卫星标记的序号如SEQ ID NO1-36所示。
第四个方面，本发明提供美洲大蠊微卫星位点或其微卫星标记群在美洲大蠊的种群遗传多样性检测、种质资源鉴定方面的应用。
第五个方面，本发明提供一种筛选美洲大蠊微卫星位点的方法，包括：
(a)利用MSDBv2.4软件中的SWR找出四碱基微卫星序列后，再从中选取两侧保守序列完整的完美型四碱基微卫星序列；
(b)利用步骤(a)中选取四碱基原始序列，根据引物设计原则，利用软件Primer 3设计引物，并以PCR进行引物筛选，确定36对引物，其序列分别为SEQ ID NO:37+SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:39+SEQ ID NO:40，SEQ ID NO:41+SEQ ID NO:42，SEQ ID NO:43+SEQ IDNO:44，SEQ ID NO:45+SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:47+SEQ ID NO:48，SEQ ID NO:49+SEQ IDNO:50，SEQ ID NO:51+SEQ ID NO:52，SEQ ID NO:53+SEQ ID NO:54，SEQ ID NO:55+SEQ IDNO:56，SEQ ID NO:57+SEQ ID NO:58，SEQ ID NO:59+SEQ ID NO:60，SEQ ID NO:61+SEQ IDNO:62，SEQ ID NO:63+SEQ ID NO:64，SEQ ID NO:65+SEQ ID NO:66，SEQ ID NO:67+SEQ IDNO:68，SEQ ID NO:69+SEQ ID NO:70，SEQ ID NO:71+SEQ ID NO:72，SEQ ID NO:73+SEQ IDNO:74，SEQ ID NO:75+SEQ ID NO:76，SEQ ID NO:77+SEQ ID NO:78，SEQ ID NO:79+SEQ IDNO:80，SEQ ID NO:81+SEQ ID NO:82，SEQ ID NO:83+SEQ ID NO:84，SEQ ID NO:85+SEQ IDNO:86，SEQ ID NO:87+SEQ ID NO:88，SEQ ID NO:89+SEQ ID NO:90，SEQ ID NO:91+SEQ IDNO:92，SEQ ID NO:93+SEQ ID NO:94，SEQ ID NO:95+SEQ ID NO:96，SEQ ID NO:97+SEQ IDNO:98，SEQ ID NO:99+SEQ ID NO:100，SEQ ID NO:101+SEQ ID NO:102，SEQ ID NO:103+SEQ ID NO:104，SEQ ID NO:105+SEQ ID NO:106，SEQ ID NO:107+SEQ ID NO:108；
(c)提取32个美洲大蠊基因组DNA，并将步骤(b)筛选得到的引物进行FAM和HEX荧光标记，标记在每对引物的上游引物5’端，根据优化好的PCR扩增条件，用荧光标记的上游引物与原引物的下游引物扩增32个美洲大蠊DNA样品，得到美洲大蠊微卫星位点。
在一种优选实施方式中，步骤(b)中采用的PCR体系为25μL反应体系：
PCR扩增反应程序步骤是：95℃预变性4分钟，然后94℃变性30秒，52℃-62℃退火40秒，72℃延伸30秒，以上进行35个循环，72℃延伸10分钟，最后4℃保存；
为了提高微卫星引物的筛选效率和可靠性，通过三次PCR扩增程序来筛选引物，第一次PCR，通过52℃-62℃的温度梯度，72℃延伸35秒进行扩增，PCR扩增产物经浓度为1.5％的琼脂糖电泳、凝胶成像系统分析，根据凝胶成像的检测的三种结果：(a)没有带的引物；(b)有目的扩增产物但有非特异性扩增的引物；(c)无杂带产物的引物，对于(a)条件的引物，丢弃，对于(b)和(c)，继续优化，进行第二次PCR；
第二次PCR，(b)的PCR条件调整为Tm＝55℃；(c)的PCR条件调整为Tm＝58℃，然后再根据凝胶成像的检测的结果，确定扩增出的有目的扩增产物且无非特异性扩增的引物的PCR条件，对于继续没有扩增结果的引物，选择放弃；有目的扩增产物但有非特异性扩增的引物，继续优化，进行第三次PCR；
第三次PCR，将有目的扩增产物但有非特异性扩增的引物的PCR调整为Tm＝60℃，同第一次和第二次一样，根据检测结果，确定有目的扩增产物且无非特异性扩增的引物的PCR条件；考虑到微卫星引物的稳定性，其他扩增结果情况的引物放弃优化，最终筛选出有目的扩增产物且无非特异性扩增的引物。
本发明的优点
1.本发明从美洲大蠊基因组中筛选出36个美洲大蠊微卫星位点，并根据这些微卫星位点两端的侧翼序列设计出了相应的36对多态性微卫星引物。
2.所获得的36对微卫星引物的扩增结果具有高度的多态性和稳定性，可用于美洲大蠊的种群遗传多样性检测、种质资源鉴定的应用。
具体实施方式
一、美洲大蠊微卫星位点的筛选及引物的获得
1.基因组序列的测定
美洲大蠊样品由四川好医生药业有限公司提供，选取活的成虫，去除肠道，利用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取美洲大蠊基因组DNA，并用1.5％琼脂糖电泳检测DNA的完整性，核酸测定仪检测DNA的纯度。将合格的样品送至千年基因公司，基于Illumina公司的Hiseq 2000测序平台，通过构建插入片段大小为300bp的文库，对美洲大蠊基因组进行浅测序。测序的基本方法是：首先在DNA片段两端加上序列已知的通用接头，再构建文库，文库加载到测序芯片Flowcell上，文库两端的已知序列与Flowcell基底上的Oligo序列互补，每条文库片段都经过桥式PCR扩增形成一个簇，测序时采用边合成边测序，即在碱基延伸过程中，每个循环反应只能延伸一个正确互补的碱基，根据四种不同的荧光信号确认碱基种类，保证最终的核酸序列质量，经过多个循环后，完整读取核酸序列。最终获得442,694,715对PE 100的reads，对低质量的reads进行过滤，并去除接头序列，采用idba(主要参数：--mink 20--maxk 70--step 10)进行组装，最终得到的基因组总大小为2.67Gb，序列以FASTA格式保存。
2.四碱基微卫星序列
利用四川大学生命科学院开发的微卫星序列搜索和统计软件MSDBv2.4，在美洲大蠊2.67Gb大小的基因组序列中，搜索完美型的微卫星序列。MSDBv2.4是采用Perl程序语言编程得到的能够识别和建立物种全基因组微卫星序列数据库的软件，能搜索到任意重复长度的微卫星序列，并将其定位在染色体上(假如物种的基因组图谱已经定位到了染色体)，不但能搜索到完美型微卫星，还能搜索到复合型及间断性微卫星。与现有常用的微卫星序列搜索软件SciRoKo、MISA、SSR Finder、SSRIT等相比，MSDBv2.4软件具有运算速度快，界面易操作，输出文件格式易于分析等优点。
研究表明，四碱基微卫星重复在DNA扩增过程中不容易形成滑带或阴影带，从而减少错误的基因分型，与单碱基、二碱基、三碱基等微卫星重复类型相比较，四碱基微卫星是更精确和更可靠的微卫星遗传标记。开发美洲大蠊四碱基多态性微卫星标记对开展美洲大蠊种群遗传多样性和结构分析、亲子鉴定、连锁图谱构建等研究具有极其重要的意义。因此，利用MSDBv2.4软件对美洲大蠊基因组四碱基微卫星序列进行搜索和统计，设置的统计标准如下：
(1)重复拷贝数。四碱基重复的拷贝数为4个及以上。
(2)重复序列两边的侧翼序列长度都是200bp。
(3)考虑到记数拷贝数起始碱基顺序的排列差异和碱基互补配对原则，将同类重复兼并为一种微卫星重复拷贝类别，四碱基重复的重复拷贝类别兼并情况见表1。四碱基重复类型中各重复拷贝类别的数量及其在所属类型中的比例见表2。
表1四碱基的重复拷贝类别兼并
注：重复类型中的Mono-，Di-，Tri-，Tetra-，Pentra-，Hexa-的后缀都是nucleotide。
表2四碱基重复类型中各重复拷贝类别的数量及其在所属类型中的比例
从表2可以看出，在四碱基微卫星重复类型中，AAAT重复拷贝类别最多，为100,932个，占四碱基类型(共434,659个)的23.22％；其次是ATTT和ACAT，分别为59,799(13.76％)和34,805(8.01％)。由于四碱基微卫星的重复拷贝类别较多，以下只列出数量较多的(大于4,500个)15种拷贝类别，这些拷贝依次是：ATGT，27,883个(6.41％)；AATG，27,763个(6.39％)；AAGT，21,500个(4.95％)；ATTC，21,185个(4.87％)；ACTT，19,759个(4.55％)；AAAG，18,963个(4.36％)；AGAT，12,663个(2.91％)；ATCT，8,579个(1.97％)；AATT，8,464个(1.95％)；CTTT，7,162个(1.65％)；ATCC，7,028个(1.62％)；ATGG，6,833个(1.57％)；ACAG，6,088个(1.40％)；CTGT，4,554个(1.05％)；AAAC，4,564个(1.05％)。其余数量较少的类别总和到一起列出，它们的数量是21,426个，只占四碱基重复类型的4.93％，其中包括数量最少的重复拷贝类别CGCT，只有36个。
本章利用软件MSDBv2.4对美洲大蠊基因组中的所有完美型微卫星序列进行搜索，并统计分析了微卫星序列中的四碱基重复类别的数量、密度、丰度及所占的比例等分布特征。为了验证研究结果的准确性和有效性，我们还通过设置相同的搜索参数利用另外的常用的微卫星搜索软件SciRoKo对美洲大蠊基因组中的完美型微卫星序列进行搜索和统计，搜索到的结果和本章的搜索结果相一致，证明了本研究统计和分析结果的准确性。
3.微卫星引物的设计
利用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取美洲大蠊样本中的DNA，-20℃保存备用。
选取32个美洲大蠊样本(8个种群，每个种群4个个体)，这8个种群分别来自：美洲大蠊样本来源于不同的地理位置，分别为：ZGRX(四川省自贡荣县农户散养)、XCSL(西昌石榴基地野生)、XCYZ(西昌基地养殖)、LSCZ(凉山蚕种厂野生)、AHXC(安徽宣城养殖)、JSHA(江苏淮安养殖)、YNDL(云南大理养殖)和XCYS(西昌基地野生)。去除肠道，翅膀，用剪刀从腿部取一小块，放入1.5mL离心管中，剪碎，按照试剂盒操作提取DNA，并用琼脂糖电泳检测DNA质量和完整性，用于下一步微卫星标记的筛选。
四碱基重复次数分布范围广泛，从4-17次都有分布，其中适合多态性标记开发的重复次数分布于10-17次的四碱基微卫星共有106,065个，为开发适合设计引物的美洲大蠊四碱基微卫星序列数据库，以及为筛选大量高质量的美洲大蠊四碱基微卫星遗传标记提供了重要的资源。可以根据需要，按照微卫星重复类型、重复次数以及侧翼序列等特征，选择适于设计引物的微卫星序列，尽可能的选择不同重复拷贝类别的四碱基微卫星序列，设计合适的引物。比传统的微卫星富集文库筛选法准确，有效，省时省力，是一种可行的办法。
在用MSDBv2.4软件中的SWR找出四碱基微卫星序列，再进一步选取适合设计引物的四碱基原始序列，选取原则如下：
(1)选取完美型的四碱基微卫星序列；
(2)选取两侧保守序列完整的微卫星序列，利用软件Primer3设计引物。设计的引物分送到成都擎科梓熙生物技术有限公司合成，合成的引物在使用时稀释成25μmol。
引物设计统计如下(例如DLG-3)，以方便查看。
DLG-3
TCGCGTGAAAAGGTAACAAACATCTAGACAGGCAGGCAAGCAGGCAGGCAGGCAGGCAGGCAGACAGACAGACAGACAGACAGACAGACAGACAGACAGACAGACAGTACATAGAAACAAAAATTTGAAAAGAGCGATTTTCGGTTTCAGGGTGATTAATTATATATGTTAGGACCAATGATTTTTGGAAAATCGAAAATTACCAGAAAAATTTCGGCTACAGATTTATTATTAGTATAAATAAAGAACGTTATTTAATACATCCTCTTAACGCGACTGCAGAATGGCTAAGTAGACGTGAGATAACA
优化微卫星引物时采用的PCR体系为25μL反应体系：
PCR扩增反应程序步骤是：95℃预变性4分钟；然后94℃变性30秒，52℃-62℃退火40秒，72℃延伸30秒，以上进行35个循环，72℃延伸10分钟，最后4℃保存。
为了提高微卫星引物的筛选效率和可靠性，本实验通过三次PCR扩增程序来筛选引物。第一次PCR，通过52℃-62℃的温度梯度72℃延伸35秒进行扩增，因为所有引物设计和合成时的参考Tm退火温度基本都是58℃。PCR扩增产物经浓度为1.5％的琼脂糖电泳、凝胶成像系统分析，根据凝胶成像的检测的三种结果：(a)没有带的引物；(b)有目的扩增产物但有非特异性扩增(有杂带)的引物；(c)无杂带产物的引物。对于(a)条件的引物，丢弃，对于(b)和(c)，继续优化，进行第二次PCR。
第二次PCR，(b)的PCR条件调整为Tm＝55℃；(c)的PCR条件调整为Tm＝58℃。然后再根据凝胶成像的检测的结果，确定扩增出的有目的扩增产物且无非特异性扩增(无杂带)的引物的PCR条件。对于继续没有扩增结果的引物，选择放弃；有目的扩增产物但有非特异性扩增(有杂带)的引物，继续优化，进行第三次PCR。
第三次PCR，将有目的扩增产物但有非特异性扩增(有杂带)的引物的PCR调整为Tm＝60℃。同第一次和第二次一样，根据检测结果，确定有目的扩增产物且无非特异性扩增(无杂带)的引物的PCR条件；考虑到微卫星引物的稳定性，其他扩增结果情况的引物放弃优化。最终筛选出有目的扩增产物且无非特异性扩增(无杂带)的引物，以备后用。
将筛选得到的引物进行荧光标记(FAM、HEX)，标记在每对引物的上游引物5’端。根据以上优化好的PCR扩增条件，用荧光标记的上游引物与原引物的下游引物扩增32个美洲大蠊DNA样品，在143对引物序列中，筛选出的有目的扩增产物(无杂带)的微卫星标记共36个，命名为SEQ ID NO1-36。对这36对引物进行双色荧光标记，利用荧光标记引物PCR扩增所有32个美洲大蠊DNA样品，然后对扩增产物进行基因分型。根据基因分型结果，在32个美洲大蠊样品中，36对引物的基因分型结果表现出高度多态性，具有多态性的微卫星标记的筛选信息见表3，这36对引物的序列分别为SEQ ID NO 37-108。
表3具有多态性的微卫星标记筛选信息
二、美洲大蠊种群遗传多样性检测
1.美洲大蠊种群PCR扩增及基因分型
美洲大蠊样本来源于不同的地理位置，分别为：ZGRX(四川省自贡荣县农户散养)、XCSL(西昌石榴基地野生)、XCYZ(西昌基地养殖)、LSCZ(凉山蚕种厂野生)、AHXC(安徽宣城养殖)、JSHA(江苏淮安养殖)、YNDL(云南大理养殖)和XCYS(西昌基地野生)。利用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取美洲大蠊样本中的DNA，每个样本提取20个个体的DNA进行PCR扩增，优化优化微卫星引物时采用的PCR体系为25μL反应体系：
PCR扩增反应程序步骤是：95℃预变性4分钟；然后94℃变性30s,52℃-62℃退火40s,72℃延伸30s，以上进行35个循环，72℃延伸10分钟，最后4℃保存。
并对PCR产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，对于条带大小符合的，将产物FAM标记和HEX标记的样品混合，用锡箔纸包住不透光，送成都擎科梓熙生物技术有限公司进行基因分型，扫描结果利用Genescan分析仪和Genotyper软件进行分析。本研究对8个地理种群的美洲大蠊DNA提取，每个种群提取20个个体，琼脂糖电泳检测DNA质量和完整性，用于下一步种群的扩增。
2.种群的HW平衡检验
Hardy-Weinberg平衡检验(Hardy-Weinberg exact test，HWE)等参数利用Genepop 3.4软件进行分析，结果如表4所示，位点DLG5在所有种群中都偏离平衡，DLG16在所有种群中都符合平衡，其余位点都在某几个种群中偏离平衡。
表4 8个种群在16个微卫星位点中的HW平衡
3.种群的多样性分析
通过Popgene 32软件检验，种群多态性信息如表7所示。8个地理种群的观测等位基因数在7.6875-10.0000个之间，平均观测等位基因数是8.8438个，最高的是西昌基地野生种群，为10.0000个，最低的是云南大理养殖种群，为7.6875个；有效等位基因数在4.3607-5.9994个之间，有效等位基因数的平均值是5.0533个，安徽宣城养殖群体最低，是4.3607个，西昌基地野生群体最高，是5.9994个，可以看出，西昌基地野生种群观测等位基因数和有效等位基因数都是最高的，如表5，表7所示。但是最低的观测等位基因数种群和有效等位基因数种群却不是相同的，说明两者之间没有必然关系。表观杂合度的变化范围从0.6500到0.7500,云南大理养殖群体最低，为0.6500，江苏淮安最高，为0.7500，平均表观杂合度为0.7141；预期杂合度的变化范围从0.7214到0.8154，最低的是安徽宣城养殖群体，为0.7214，最高的是西昌基地野生群体，为0.8154，平均预期杂合度为0.7830，如表6，表7所示，可以看出表观杂合度和预期杂合度之间也无必然联系。
香农指数可进行种群内遗传分化的估算，香农指数越大，遗传多样性越大，种群分化的程度越高。Shannon信息指数在1.6064-1.9067之间,平均为1.7581，最低的是安徽宣城养殖群体，为1.6064；最高的是西昌基地野生群体，为1.9067。多态位点率可反映种群遗传多样性的大小，多态位点频率就是多态位点占总位点的比率。种群水平上的多态位点百分率都是100％，都有很高的多态性。各种群香农指数与种群多态位点率相比有一定的差异，说明香农指数和多态位点率在说明种群遗传变异上有不同的结果。Nei’s基因多样性指数在0.7034-0.7950之间，最高的是西昌基地野生种群，最低的是安徽宣城养殖种群，平均为0.7635，可以看出基地野生种群的遗传多样性比较丰富。
表5 16个微卫星位点的有效等位基因数
表6 16个微卫星位点的预期杂合度
表7 16个微卫星位点在8个种群中的遗传变异参数
注：Na：观测等位基因数Observed number of alleles；Ne：有效等位基因数Effective number of alleles；I：香浓信息指数Shannon's information index；Nei's：基因多样性Nei's gene diversity；Ho：表观杂合度Observed heterozygosity；He：预期杂合度Expected heterozygosity；P：多态位点百分率Percentage of polymorphic loci。
Claims (6)
1.美洲大蠊微卫星位点，其特征在于所述微卫星位点的序列如SEQ ID NO：1-36任意一条所示。
2.根据权利要求1所述的美洲大蠊微卫星位点的引物对，所述引物对选自SEQ ID NO:37+SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:39+SEQ ID NO:40，SEQ ID NO:41+SEQ ID NO:42，SEQ IDNO:43+SEQ ID NO:44，SEQ ID NO:45+SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:47+SEQ ID NO:48，SEQ IDNO:49+SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:51+SEQ ID NO:52，SEQ ID NO:53+SEQ ID NO:54，SEQ IDNO:55+SEQ ID NO:56，SEQ ID NO:57+SEQ ID NO:58，SEQ ID NO:59+SEQ ID NO:60，SEQ IDNO:61+SEQ ID NO:62，SEQ ID NO:63+SEQ ID NO:64，SEQ ID NO:65+SEQ ID NO:66，SEQ IDNO:67+SEQ ID NO:68，SEQ ID NO:69+SEQ ID NO:70，SEQ ID NO:71+SEQ ID NO:72，SEQ IDNO:73+SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:75+SEQ ID NO:76，SEQ ID NO:77+SEQ ID NO:78，SEQ IDNO:79+SEQ ID NO:80，SEQ ID NO:81+SEQ ID NO:82，SEQ ID NO:83+SEQ ID NO:84，SEQ IDNO:85+SEQ ID NO:86，SEQ ID NO:87+SEQ ID NO:88，SEQ ID NO:89+SEQ ID NO:90，SEQ IDNO:91+SEQ ID NO:92，SEQ ID NO:93+SEQ ID NO:94，SEQ ID NO:95+SEQ ID NO:96，SEQ IDNO:97+SEQ ID NO:98，SEQ ID NO:99+SEQ ID NO:100，SEQ IDNO:101+SEQ ID NO:102，SEQID NO:103+SEQ ID NO:104，SEQ ID NO:105+SEQ ID NO:106，SEQ ID NO:107+SEQ ID NO:108。
3.一种美洲大蠊微卫星位点群，包括2到36个如权利要求1所述的美洲大蠊的微卫星位点。
4.权利要求1或3所述美洲大蠊微卫星位点或其微卫星位点群在美洲大蠊的种群遗传多样性检测、种质资源鉴定方面的应用。
5.一种筛选如权利要求1所述的美洲大蠊微卫星位点的方法，包括：
(a)利用MSDBv2.4软件中的SWR找出四碱基微卫星序列后，再从中选取两侧保守序列完整的完美型四碱基微卫星序列；
(b)利用步骤(a)中选取四碱基原始序列，根据引物设计原则，利用软件Primer 3设计引物，并以PCR进行引物筛选，确定36对引物，其序列分别为SEQ ID NO:37+SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:39+SEQ ID NO:40，SEQ ID NO:41+SEQ ID NO:42，SEQ ID NO:43+SEQ ID NO:44，SEQ ID NO:45+SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:47+SEQ ID NO:48，SEQ ID NO:49+SEQ IDNO:50，SEQ ID NO:51+SEQ ID NO:52，SEQ ID NO:53+SEQ ID NO:54，SEQ ID NO:55+SEQ IDNO:56，SEQ ID NO:57+SEQ ID NO:58，SEQ ID NO:59+SEQ ID NO:60，SEQ ID NO:61+SEQ IDNO:62，SEQ ID NO:63+SEQ ID NO:64，SEQ ID NO:65+SEQ ID NO:66，SEQ ID NO:67+SEQ IDNO:68，SEQ ID NO:69+SEQ ID NO:70，SEQ ID NO:71+SEQ ID NO:72，SEQ ID NO:73+SEQ IDNO:74，SEQ ID NO:75+SEQ ID NO:76，SEQ ID NO:77+SEQ ID NO:78，SEQ ID NO:79+SEQ IDNO:80，SEQ ID NO:81+SEQ ID NO:82，SEQ ID NO:83+SEQ ID NO:84，SEQ ID NO:85+SEQ IDNO:86，SEQ ID NO:87+SEQ ID NO:88，SEQ ID NO:89+SEQ ID NO:90，SEQ ID NO:91+SEQ IDNO:92，SEQ ID NO:93+SEQ ID NO:94，SEQ ID NO:95+SEQ ID NO:96，SEQ ID NO:97+SEQ IDNO:98，SEQ ID NO:99+SEQ ID NO:100，SEQ ID NO:101+SEQ ID NO:102，SEQ ID NO:103+SEQ ID NO:104，SEQ ID NO:105+SEQ ID NO:106，SEQ ID NO:107+SEQ ID NO:108；
(c)提取32个美洲大蠊基因组DNA，并将步骤(b)筛选得到的引物进行FAM和HEX荧光标记，标记在每对引物的上游引物5’端，根据优化好的PCR扩增条件，用荧光标记的上游引物与原引物的下游引物扩增32个美洲大蠊DNA样品，得到美洲大蠊微卫星位点。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，
步骤(b)中采用的PCR体系为25μL反应体系：
PCR扩增反应程序步骤是：95℃预变性4分钟，然后94℃变性30秒，52℃-62℃退火40秒，72℃延伸30秒，以上进行35个循环，72℃延伸10分钟，最后4℃保存；
为了提高微卫星引物的筛选效率和可靠性，通过三次PCR扩增程序来筛选引物，第一次PCR，通过52℃-62℃的温度梯度，72℃延伸35秒进行扩增，PCR扩增产物经浓度为1.5％的琼脂糖电泳、凝胶成像系统分析，根据凝胶成像的检测的三种结果：(a)没有带的引物，(b)有目的扩增产物但有非特异性扩增的引物，(c)无杂带产物的引物，对于(a)条件的引物，丢弃，对于(b)和(c)，继续优化，进行第二次PCR；
第二次PCR，(b)的PCR条件调整为Tm＝55℃；(c)的PCR条件调整为Tm＝58℃，然后再根据凝胶成像的检测的结果，确定扩增出的有目的扩增产物且无非特异性扩增的引物的PCR条件，对于继续没有扩增结果的引物，选择放弃；有目的扩增产物但有非特异性扩增的引物，继续优化，进行第三次PCR；
第三次PCR，将有目的扩增产物但有非特异性扩增的引物的PCR调整为Tm＝60℃，同第一次和第二次一样，根据检测结果，确定有目的扩增产物且无非特异性扩增的引物的PCR条件；考虑到微卫星引物的稳定性，其他扩增结果情况的引物放弃优化，最终筛选出有目的扩增产物且无非特异性扩增的引物。
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