CN108588234B

CN108588234B - 刺槐叶瘿蚊广腹细蜂的ssr引物及其在种群遗传多样性分析中的应用

Info

Publication number: CN108588234B
Application number: CN201810416755.8A
Authority: CN
Inventors: 姚艳霞; 杨君; 赵文霞; 淮稳霞; 林若竹
Original assignee: Research Institute of Forest Ecology Environment and Protection of Chinese Academy of Forestry
Current assignee: Research Institute of Forest Ecology Environment and Protection of Chinese Academy of Forestry
Priority date: 2018-05-03
Filing date: 2018-05-03
Publication date: 2021-12-07
Anticipated expiration: 2038-05-03
Also published as: CN108588234A

Abstract

本发明公开了刺槐叶瘿蚊广腹细蜂的SSR引物及其在种群遗传多样性分析中的应用。本发明根据刺槐叶瘿蚊广腹细蜂线粒体基因组数据设计获得13多万条SSR序列并从中筛选出差异较为稳定、多态性良好的37对SSR特异性引物。本发明进一步公开了所述的37对SSR特异性引物在刺槐叶瘿蚊广腹细蜂种群的遗传多样性分析、种群进化分析、多态性分析以及构建刺槐叶瘿蚊广腹细蜂指纹图谱等方面的应用。本发明对于开展刺槐叶瘿蚊广腹细蜂这类天敌类群群体遗传多样性研究、掌握其来源及群体分化情况等具有重要的价值。

Description

刺槐叶瘿蚊广腹细蜂的SSR引物及其在种群遗传多样性分析中的应用

技术领域

本发明涉及SSR引物，尤其涉及刺槐叶瘿蚊广腹细蜂(Platygaster robiniaeBuhl and Duso)的特异性SSR引物，本发明进一步涉及所述特异性SSR引物在刺槐叶瘿蚊广腹细蜂种群遗传多样性分析等方面的应用，属于刺槐叶瘿蚊广腹细蜂的特异性SSR引物及其应用领域。

背景技术

刺槐叶瘿蚊广腹细蜂Platygaster robiniae Buhl and Duso(Hymenoptera:Platygastridae)是中国重要外来种刺槐叶瘿蚊Obolodiplosis robiniae(Haldeman)(双翅目：瘿蚊科)卵-幼虫跨期寄生性天敌，对刺槐叶瘿蚊的寄生率较高，尤其在其寄主年发生后期，寄生率往往可达到80％以上，是一类十分优良的天敌资源。在过去的十多年间，刺槐叶瘿蚊广腹细蜂的寄主--刺槐叶瘿蚊因向欧洲和亚洲的很多国家与地区迅速传播扩散而受到了广泛关注，与此同时，刺槐叶瘿蚊广腹细蜂也在这些国家和地区先后被发现，并因其寄生率较高、降低寄主虫口密度的作用十分显著而逐渐被研究者青睐。

目前，关于刺槐叶瘿蚊广腹细蜂的研究仍停留在生物学基础研究阶段，对其起源、传播扩散及遗传分化情况尚处于空白。研究生物不同种群间遗传多样性及遗传结构，是探讨其起源和传播历史最为有效的手段之一。通过对种群遗传学的研究，可以揭示生物进化的历史，有助于我们更加直观的感受到物种在自然条件下与所处环境之间的相互关系及历程。物种的遗传多样性现状是物种长期进化的产物，也是其生存和进化的基础；是解释其进化历程和适应潜力的基础，又是进一步揭示其濒危机理和稀有程度的关键方法，并将为标准的制定保护策略和方法提供重要的论证(解新明等,2000)；通过对种群遗传学的研究，还可以对现存的其他生物的生存状况和将来的发展趋势进行评估和预测。生物的遗传多样性程度与其适应能力具有一定相关性，一般而言，遗传多样性程度越高，其对所处周围环境的适应能力就越大，并且进化的潜力也越大。遗传多样性的研究结果是保护遗传学中制定保护策略措施的重要依据。

种群遗传学属于遗传学下的一门分支学科，研究内容包括种群遗传结构及其变化规律。利用分子标记技术进行种群遗传学研究，加速了种群遗传学的发展进程。从起初的限制性片段长度多态性分子标记(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)技术逐步发展到现今应用比较普遍的微卫星分子标记技术(simple sequence repeats，SSR)和单核苷酸分子多态性标记(Single Nucleotide Polymorphisms，SNP)技术，在昆虫方面为群体遗传学研究提供了有力保障。

微卫星DNA(microsatellites DNA)分子标记，又称SSR(Simple SequenceRepeat)即简单重复序列，是目前研究群体遗传多样性中应用最为广泛的分子标记方法之一。微卫星DNA序列在真核细胞中均匀分布，多由2-6个不同核苷酸以短串联重复的形式组合而成，平均每段短重复序列之间间隔5-10kb，在序列的编码区、调控区、内含子中以及其他区域均可发现。它于1981年由Spritz在珠蛋白中首次被发现，到目前SSR分子标记技术在分子生物学中广泛应用。微卫星DNA分子标记由于具有特异性好、多态性高、有用遗传信息量大、共显性遗传及检测方便快速且稳定性高等特点，目前广泛应用于遗传结构及遗传多样性等方面的研究，是生物群体遗传结构分析与变异研究中极有价值的分子标记，研究不同种群的遗传多样性及遗传结构。

开发刺槐叶瘿蚊广腹细蜂的特异性SSR引物，能够应用于研究刺槐叶瘿蚊广腹细蜂不同群体的遗传多样性，分析该寄生蜂不同群体遗传结构特征和群体遗传多样性，明晰不同群体遗传分化和基因流状况以及群体系统发育与进化关系，从而能够揭示刺槐叶瘿蚊广腹细蜂群体遗传变异规律，阐明刺槐叶瘿蚊广腹细蜂群体的系统进化和地理分化，进而为后续探讨刺槐叶瘿蚊广腹细蜂的起源与传播历史奠定基础，这对于掌握其来源及群体分化情况，对开发与利用天敌、继而开展生物防治等具有十分重要的理论与实践意义。

发明内容

本发明目的之一是提供基于刺槐叶瘿蚊广腹细蜂的多态性较好的SSR引物，这些SSR引物能够在刺槐叶瘿蚊广腹细蜂扩增出特异性、稳定性、多态性的目的条带；

本发明目的之二是将所筛选出的特异性SSR引物应用于刺槐叶瘿蚊广腹细蜂不同种群的遗传多样性分析或遗传结构分析等。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明首先公开了刺槐叶瘿蚊广腹细蜂的特异性SSR引物，选自以下37对引物中的任意一对或多对：

引物对1：由核苷酸序列为SEQ ID No.1所示上游引物和SEQ ID No.2所示下游引物组成；引物对2：由核苷酸序列为SEQ ID No.3所示上游引物和SEQ ID No.4所示下游引物组成；引物对3：由核苷酸序列为SEQ ID No.5所示上游引物和SEQ ID No.6所示下游引物组成；引物对4：由核苷酸序列为SEQ ID No.7所示上游引物和SEQ ID No.8所示下游引物组成；引物对5：由核苷酸序列为SEQ ID No.9所示上游引物和SEQ ID No.10所示下游引物组成；引物对6：由核苷酸序列为SEQ ID No.11所示上游引物和SEQ ID No.12所示下游引物组成；引物对7：由核苷酸序列为SEQ ID No.13所示上游引物和SEQ ID No.14所示下游引物组成；引物对8：由核苷酸序列为SEQ ID No.15所示上游引物和SEQ ID No.16所示下游引物组成；引物对9：由核苷酸序列为SEQ ID No.17所示上游引物和SEQ ID No.18所示下游引物组成；引物对10：由核苷酸序列为SEQ ID No.19所示上游引物和SEQ ID No.20所示下游引物组成；引物对11：由核苷酸序列为SEQ ID No.21所示上游引物和SEQ ID No.22所示下游引物组成；引物对12：由核苷酸序列为SEQ ID No.23所示上游引物和SEQ ID No.24所示下游引物组成；引物对13：由核苷酸序列为SEQ ID No.25所示上游引物和SEQ ID No.26所示下游引物组成；引物对14：由核苷酸序列为SEQ ID No.27所示上游引物和SEQ ID No.28所示下游引物组成；引物对15：由核苷酸序列为SEQ ID No.29所示上游引物和SEQ ID No.30所示下游引物组成；引物对16：由核苷酸序列为SEQ ID No.31所示上游引物和SEQ ID No.32所示下游引物组成；引物对17：由核苷酸序列为SEQ ID No.33所示上游引物和SEQ IDNo.34所示下游引物组成；引物对18：由核苷酸序列为SEQ ID No.35所示上游引物和SEQ IDNo.36所示下游引物组成；引物对19：由核苷酸序列为SEQ ID No.37所示上游引物和SEQ IDNo.38所示下游引物组成；引物对20：由核苷酸序列为SEQ ID No.39所示上游引物和SEQ IDNo.40所示下游引物组成；引物对21：由核苷酸序列为SEQ ID No.41所示上游引物和SEQ IDNo.42所示下游引物组成；引物对22：由核苷酸序列为SEQ ID No.43所示上游引物和SEQ IDNo.44所示下游引物组成；引物对23：由核苷酸序列为SEQ ID No.45所示上游引物和SEQ IDNo.46所示下游引物组成；引物对24：由核苷酸序列为SEQ ID No.47所示上游引物和SEQ IDNo.48所示下游引物组成；引物对25：由核苷酸序列为SEQ ID No.49所示上游引物和SEQ IDNo.50所示下游引物组成；引物对26：由核苷酸序列为SEQ ID No.51所示上游引物和SEQ IDNo.52所示下游引物组成；引物对27：由核苷酸序列为SEQ ID No.53所示上游引物和SEQ IDNo.54所示下游引物组成；引物对28：由核苷酸序列为SEQ ID No.55所示上游引物和SEQ IDNo.56所示下游引物组成；引物对29：由核苷酸序列为SEQ ID No.57所示上游引物和SEQ IDNo.58所示下游引物组成；引物对30：由核苷酸序列为SEQ ID No.59所示上游引物和SEQ IDNo.60所示下游引物组成；引物对31：由核苷酸序列为SEQ ID No.61所示上游引物和SEQ IDNo.62所示下游引物组成；引物对32：由核苷酸序列为SEQ ID No.63所示上游引物和SEQ IDNo.64所示下游引物组成；引物对33：由核苷酸序列为SEQ ID No.65所示上游引物和SEQ IDNo.66所示下游引物组成；引物对34：由核苷酸序列为SEQ ID No.67所示上游引物和SEQ IDNo.68所示下游引物组成；引物对35：由核苷酸序列为SEQ ID No.69所示上游引物和SEQ IDNo.70所示下游引物组成；引物对36：由核苷酸序列为SEQ ID No.71所示上游引物和SEQ IDNo.72所示下游引物组成；引物对37：由核苷酸序列为SEQ ID No.73所示上游引物和SEQ IDNo.74所示下游引物组成。

优选的，本发明所提供的刺槐叶瘿蚊广腹细蜂的特异性SSR引物为上述引物对1-引物对26中的任何一对或多对。

本发明所述刺槐叶瘿蚊广腹细蜂选自成都群体和丹东群体。

本发明根据刺槐叶瘿蚊广腹细蜂线粒体基因组数据进行了SSR引物的设计，其中退火温度Tm值相差不能大于5℃，PCR目的产物150-500bp；GC含量40％-60％，引物长度18-24bp，得到了139874对引物。本发明从中随机挑选了240对所设计的退火温度及扩增效果对刺槐叶瘿蚊广腹细蜂48个样本(成都群体样本1-24；丹东群体样本1-24)进行了初步筛选，结果在240对引物中有92对引物具有差异效果的引物，在总引物中占据了38％的比例，证明本发明所述SSR引物具有一定的多态性。

本发明进一步通过对660个样本(刺槐叶瘿蚊广腹细蜂22个地理群体的660个个体)进行SSR扩增反应，从上述92对引物中抽选了微卫星位点大于等于3的特异SSR标记共37对引物进行筛选，这37对SSR引物在660个样本中具有疑似不一致的扩增效果，表现形式主要以条带长度不一致和部分样本为两条相近带等两种形式体现；其长度范围为147-442bp，平均长度为261bp，等位基因数2-8个，平均观测杂合度和期望杂合度变化范围分别为0.00-0.96和0.04-0.70，等位基因频率在0.13-0.50之间。通过上述37对多态性良好的微卫星位点引物对中国刺槐叶瘿蚊广腹细蜂22个种群进行遗传多样性分析，分析结果表明该22个种群在其中的26个微卫星位点上显示出较高的遗传多样性，等位基因数(Na)为1-9，有效等位基因数(Ne)在1.00-4.10之间，观测杂合度(Ho)变化范围为0.24-0.78，期望杂合度(He)变化范围在0.01-0.62之间，多态信息含量(PIC)为0.23-0.75，表现出高度多态性。实验结果证明，本发明所筛选的37对SSR引物多态性良好，能够应用于刺槐叶瘿蚊广腹细蜂种群遗传多样性研究。

本发明进一步应用这37对SSR引物对刺槐叶瘿蚊广腹细蜂种群进行遗传多样性分析，分析结果发现，这37对SSR引物中有9对(P-LH123303、P-LH126326、P-LH1431、P-LH165921、P-LH375606、P-LH550、P-LH6835和P-LH82949、P-LH87353)微卫星引物不能成功扩增所有22个刺槐叶瘿蚊广腹细蜂种群，经多次尝试均未能成功；引物对1-引物对26(SEQID No.1-SEQ ID No.52)能够成功扩增所有22个刺槐叶瘿蚊广腹细蜂种群；本发明采用引物对1-引物对26(SEQ ID No.1-SEQ ID No.52)对中国22个种群共计660个个体进行遗传多样性分析、各种群间的遗传分化以及种群偏离哈迪温伯格平衡情况分析，分析结果分别如下：

(1)刺槐叶瘿蚊广腹细蜂种群的遗传多样性分析

采用26对SSR引物对中国22个刺槐叶瘿蚊广腹细蜂种群遗传多样性进行分析，结果发现除P-LH150918位点的多态信息含量(PIC)小于0.25之外(PIC＝0.2270)其它25个均大于0.25且有19个位点的多态信息含量(PIC)大于0.5，占总位点数的76％，说明中国刺槐叶瘿蚊广腹细蜂的多态性水平普遍偏高；结合Shannon多性指数I分析得知，刺槐叶瘿蚊广腹细蜂在中国的资源多样性比较丰富，能够为刺槐叶瘿蚊广腹细蜂不同种群遗传多样性以及遗传结构的研究提供充足的数据支持。

分析结果发现，刺槐叶瘿蚊广腹细蜂22个种群在26个微卫星位点上的种内近交系数(F_IS)在-0.5980～0.6154之间，平均值为0.1815；总近交系数(F_IT)在-0.0883～0.9438之间，平均值为0.6048；种群间分化系数(F_ST)在0.2808～0.8910之间，平均值为0.5172；基因流(Nm)在0.0306～0.6403之间，平均值为0.2334。种内近交系数(F_IS)、总近交系数(F_IT)、种群间分化系数(F_ST)和基因流(Nm)均可反映种群内个体间或种群间的遗传分化程度和近交程度，这说明各种群间具有一定程度的遗传分化现象和基因交流现象。

(2)各种群间的遗传分化分析

本发明利用Genemarker2.2.0、GenePop4.3和Ntsys软件分析，获得遗传多样性信息及UPGMA聚类图。通过聚类发现，22个刺槐叶瘿蚊广腹细蜂种群大体聚为三大支。就全国的地理分布而言，并未发现明显的聚类规律。

(3)种群偏离哈迪温伯格平衡情况分析

哈迪温伯格平衡解释了在一个随机交配群体中基因频率与基因型频率的关系，为不同群体的遗传分化情况提供理论依据。在哈迪温伯格检测结果中，共有181个偏离了哈迪温伯格平衡，总占比31.64％。其中武汉(WH)、秦皇岛(QH)和北京(BJ)种群偏离程度最低，分别有2个、2个和3个位点偏离哈迪温伯格平衡检测(P<0.5)，占总位点数的7.7％-11.5％；烟台(YT)、贵阳(GY)和郑州(ZZ)种群偏离程度最高，分别为14个、15个和15个，占总数的53.8％-57.7％。

本发明的SSR引物能够应用于刺槐叶瘿蚊广腹细蜂种群的遗传多样性分析，包括：通过微卫星位点基因多态性分析，研究遗传多样性指标，如杂合度、基因多样度、遗传距离、核苷酸多样性、固定指数、共享带率，利用杂合度、多态信息含量、基因多样性指数、等位基因数等参数评估刺槐叶瘿蚊广腹细蜂种群遗传多样性。

本发明的SSR引物进一步应用于刺槐叶瘿蚊广腹细蜂种群进化分析，包括：根据遗传距离进行聚类分析，分析各种群间的进化关系及演变规律。

作为参考，本发明提供了一种应用所述的26对特异性SSR引物对刺槐叶瘿蚊广腹细蜂种群遗传多样性分析的方法，包括：

(1)提取待检测样品基因组DNA；

(2)采用序列表SEQ ID No.1～52所示SSR引物进行PCR扩增；

(3)将步骤(2)的扩增产物经6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染法染色，照相并统计结果，某位置若有条带记为‘1’，若无则记为‘0’；

(4)利用步骤(3)的统计结果进行遗传多样性分析。

优选的，步骤(4)中所述遗传多样性分析方法可以是：利用Genemarker2.2.0和GenePop4.3软件对构建的等位基因数据库信息进行数据处理，具体包括等位基因数、有效等位基因数、观测杂合度、期望杂合度、Nei氏遗传距离、哈迪-温伯格平衡检测、连锁不平衡检测、种群内近交系数、种群间分化系数、总近交系数、遗传一致度、基因、多样性指数或多态性信息含量中的任何一种或多种；或者使用GenAlEx V6.501软件计算各引物的PIC值；或者利用Ntsys软件计算品种间的遗传距离，用UPGMA法进行聚类分析，绘制树状图；或者根据基因多样性Na、Nei指数、香农指数、He、Ho等遗传多样性估计参数进行分析。

本发明还提供了一种应用所述SSR引物用于刺槐叶瘿蚊广腹细蜂多态性分析的方法，包括：

(1)提取待检测样品基因组DNA；

(2)采用序列表SEQ ID No.1～52所示SSR引物进行PCR扩增；

(3)将扩增产物处理后用多态性分析软件进行分析。

本发明进一步提供了应用所述SSR引物用于刺槐叶瘿蚊广腹细蜂系统发育分析的方法，包括：

(1)提取待检测样品基因组DNA；

(2)采用序列表SEQ ID No.1～52所示SSR引物进行PCR扩增；

(3)将扩增产物进行处理后基于Nei’s无偏差遗传距离通过UPGMA法构建刺槐叶瘿蚊广腹细蜂不同种群的系统发育树；或者基于Nei’s无偏差遗传距离通过UPGMA法构建刺槐叶瘿蚊广腹细蜂不同种群的系统发育树。

作为参考，上述方法中所述PCR扩增的反应条件可以是：扩增反应为10ul体系，其中包括8.5ul Golden Star T6Super PCR Mix(1.1×)，正向引物0.2ul，反向引物0.5ul，外加0.3μL TP-M13(5mol/L)接头，DNA模板0.5ul。扩增程序可以为：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，循环35次，72℃延伸10s，4℃保存。

本发明进一步包括应用所述的SSR引物构建刺槐叶瘿蚊广腹细蜂的指纹图谱。

本发明所涉及到术语及定义

哈迪温伯格平衡又称遗传平衡定律，该定律多用于检测在某一种群内基因频率和基因型频率的变化程度。在理想状态下，各种群等位基因频率和基因型频率在遗传中趋于稳定状态，即保持着基因平衡，多运用在生物学、生态学及遗传学领域，是衡量选取研究群体是否科学合理的重要指标(王雷,2007)。

基因杂合度包括期望杂合度和观测杂合度，期望杂合度是由种群内占据优势等位基因的基因型频率决定的，是用公式计算出来的理想状态，该数值能够间接地反映出种群内遗传结构变化程度的水平。在一个种群内，稀有基因的基因型频率是非常低的，致使它基本对期望杂合度不产生影响。因此，期望杂合度的改变基本不受样本量大小的影响，它也是衡量群体遗传多样性水平的优良指标(Nei,1975)。

固定指数是衡量种群中基因型实际频率是否偏离遗传平衡理论比例的指标。一般用符号“F”表示。固定指数又称F-统计数，其数值在-1和1之间。三者关系如下：1-F_ST＝(1-F_IT)/(1-F_IS)。近五十年来，随着生态学、生物化学和分子生物学等在群体遗传学研究中日臻成熟和普遍使用，固定指数理论已成为研究种群遗传结构的重要理论指标，加速了群体遗传的发展进程(向华和毛盛贤,1995；包文斌等,2007；姚启伦等,2007；吴仲真等,2011；Ballian,2015.米奇等,2015；杨香娣等,2016)。

多态信息含量(PIC)表示一个后代所获得某个等位标记来自于它的父代或母代的同一个等位标记的可能性。该理论是由Bostein于1980年提出用来衡量群体基因片段多态性的指标。随着等位基因频率、等位基因的改变而改变。它可用来衡量微卫星DNA特异性位点变异程度的高低(Bostein et al.,1980)。理想的多态性位点应具有较大的多态信息含量，较低的遗传相似性和较高的特异性。多态信息含量与其对应的可利用程度及使用频率有关：某一群体内多态信息含量越高，则表明杂合子在该位点所占的比率就越高、其所包含的遗传信息就相应越多。

聚类分析是指根据种内或种间的相互作用关系，将各个种群之间的关系用分支图的方式将其表示出来，采用分组的形式，将个体或种群总结归纳为不同的具有相互关系的若干组，分组之后，组内的个体或种群遗传距离最为接近，遗传关系尽量相似，而组间的个体或种群尽量具有差异，以此来达到其客观的分类的目的，也就是所说的系统发育树。系统发育树分为两种，一种为有根树，另一种为无根树。有根树和无根树的本质区别为有无外群。有根树是将外群作为树根，反映分类单元间的进化关系；而无根树没有外群的介入，仅将所分析的个体或种群根据遗传距离等归纳到一起。无根树加进外群即为有根树。

附图说明

图1为部分引物在刺槐叶瘿蚊广腹细蜂24个样品中扩增出的效果；其中，(a)为引物P-LH620、P-LH1099、P-LH8765和P-LH23400对刺槐叶瘿蚊广腹细蜂24个样本的扩增条带，其中P-LH620引物在P-CD1和P-CD3样本中扩增出的条带亮度不明显，在其余样本中扩增出单条带，引物P-LH1099在P-CD9样本中扩增出的条带不明显，在P-DD1样本中扩增出两条相近条带，其余样本扩增出单条带；(b)为引物P-LH28311、P-LH34007、P-LH44376、P-LH45531对刺槐叶瘿蚊广腹细蜂24个样本的扩增结果，其中引物P-LH28311在P-CD3、P-CD6和P-CD9样本中扩增出的条带亮度不明显，在其余样本中扩增出单条带，引物P-LH34007在P-CD2、P-CD8、P-CD10、P-CD11和P-DD5样本中扩增出两条相近条带，其余样本中扩增出单条带，引物P-LH45531在P-CD5样本中扩增出的条带与其余样本有细微差异；(c)为引物P-LH50591、P-LH54936、P-LH61231和P-LH63418对刺槐叶瘿蚊广腹细蜂24个样本的扩增结果，其中引物P-LH50591在P-CD7、P-DD2、P-DD3和P-DD4样本中扩增出的条带亮度不明显，其余样本中扩增出单条带，引物P-LH63418在P-DD10样本中扩增出不明显的两条相近条带，其余样本中扩增出单条带；(d)为引物P-LH74065、P-LH87349、P-LH87353和P-LH126326对刺槐叶瘿蚊广腹细蜂24个样本的扩增结果，其中引物P-LH87349在P-CD4、P-DD1、P-DD2和P-DD3样本中扩增出的条带与其余样本有细微差异，引物P-LH87353在P-CD10和P-DD9样本中扩增出的条带亮度不明显，其余样本中扩增出单条带；(e)为引物P-LH133174、P-LH150918、P-LH158987和P-LH165567对刺槐叶瘿蚊广腹细蜂24个样本的扩增结果，其中引物P-LH158987在P-DD11样本中扩增出的条带亮度不明显，其余样本中扩增出单条带，引物P-LH133174在P-CD11、P-DD7样本中扩增出的条带亮度不明显，在P-DD11和P-DD12样本中扩增出的条带与其余样本有细微差异，其余样本中扩增出单条带，引物P-LH165567在P-DD12样本中扩增出的条带不明显，在P-CD9、P-DD11、P-DD3、P-DD8和P-DD10样本中扩增出的条带与其余样本有细微差异；(f)为引物P-LH206646、P-LH246376、P-LH307411和P-LH375606对刺槐叶瘿蚊广腹细蜂24个样本的扩增结果，其中引物P-LH307411在P-CD10、P-DD9、P-DD10和P-DD12样本中扩增出的条带亮度不明显，引物P-LH246376在P-CD11样本中扩增出的条带亮度不明显，其余样本中扩增出双条带，引物P-LH206646在P-CD9、P-CD11样本中扩增出的条带亮度不明显，在样本P-CD2中扩增出的条带与其余样本有细微差异；

图2为部分毛细管电泳结果图；其中，(a)、(b)、(c)分别为经由软件GeneMarker处理后引物P-LH17682、P-LH61231和P-LH74065的毛细管电泳胶图显示结果，纵坐标为样本序号(1-48依次为样本P-CD1、P-CD2…P-CD24、P-DD1、P-DD2…P-DD24)，横坐标为条带长度，方框中为扩增差异的条带；

图3为部分毛细管电泳结果图；其中，(a)、(b)、(c)分别为经由软件GeneMarker处理后引物P-LH550、P-LH129182和P-LH17682的毛细管电泳峰图显示结果；纵坐标代表了引物在样本中的扩增效果，横坐标代表了扩增条带的长度；Sample 1-7依次为样本P-CD1、P-CD2、P-CD3、P-CD4、P-CD5、P-CD6和P-CD7；

图4为部分毛细管电泳结果图；其中，(a)、(b)、(c)、(d)分别为经由软件GeneMarker处理后引物P-LH18283、P-LH185124、P-LH20524和P-LH269819的毛细管电泳峰图显示结果；纵坐标代表了引物在样本中的扩增效果，横坐标代表了扩增条带的长度；Sample 1-7依次为样本P-CD1、P-CD2、P-CD3、P-CD4、P-CD5、P-CD6和P-CD7；

图5刺槐叶瘿蚊广腹细蜂48个个体聚类图(UPGMA)；

图6长春(CC)个体在P-LH20524位点的基因分型图；

图7 22个刺槐叶瘿蚊广腹细蜂种群系统发育聚类分析。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1特异性SSR引物的设计及筛选

1试验材料

在野外采集被刺槐叶瘿蚊危害的刺槐受害叶片并寄回实验室，放入广口瓶中饲养，瓶口覆三层纱布，并用橡皮筋绑紧，防止细蜂羽化逃逸；恒温(25℃)恒湿(70％)，由专职人员负责管理，每天将羽化的细蜂成虫用小毛刷装入含有无水乙醇的离心管中，﹣20℃保存备用。

2试验方法

2.1DNA提取

将辽宁省营口市的刺槐叶瘿蚊广腹细蜂成虫作为对象，采用方法参照王文和施立明(1993)提取基因组DNA，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测收集基因组DNA。

2.2基因组DNA片段化

用仪器Covaris M220把DNA打断化成300～500bp的片段。

2.3文库构建

(1)在DNA片段两端连接A&B接头；(2)筛选去除接头自连片段；(3)琼脂糖凝胶电泳进行片段筛选，保留一端是A接头、一端是B接头的片段；(4)氢氧化钠变性，产生单链DNA片段。

2.4桥式PCR

(1)DNA片段的一端与引物碱基互补，固定在芯片上；(2)另一端随机与临近的另一个引物互补，也被固定住，形成"桥(bridge)"；(3)PCR扩增，产生DNA簇；(4)DNA扩增子线性化成为单链。

2.5 Illumina Hiseq测序

(1)加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP，每次循环只掺入单种碱基；(2)用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类；(3)将"荧光基团"和"终止基团"化学切割，恢复3'端粘性，继续聚合第二个核苷酸；(4)统计每轮收集到的荧光信号结果，获知模板DNA片段的序列。

3结果与分析

3.1原始测序数据质控

通过生物信息统计学的方法，对所有测序reads的每个circle进行碱基分布和质量波动的统计，可以比较直观地把每一样本的文库构建质量和测序质量情况显示出来。为此，将样本所测得的原始数据进行如下两方面的质量评估：A/T/C/G碱基含量分布统计及碱基错误率分布统计。

(1)A/T/C/G碱基含量分布统计

A/T/C/G碱基含量分布统计主要用来检查是否有A/T、C/G分离情况。正常情况下，每一条双链上的A/T和C/G含量是一一对应的，并且在测序过程中基本不会有变化，呈直线型。模糊碱基N是测序质量优劣的参考值。

(2)碱基错误率分布统计

在测序过程中，由于所测序列长度不断增加，Illumina高通量测序仪测序时错误率也相应升高。这是因为在测序过程中，其中的化学试剂不断消耗，对测序准确度产生影响，这是该仪器在使用中共有的情况。

3.2原始测序数据质量剪切

由于Illumina HiSeq的原始测序数据会存在一些质量比较低的数据，为了使后续的组装更加准确，会对原始数据进行质量剪切，具体步骤如下：

(1)去除reads中的adapter序列；(2)剪切前去除5’端含有非AGCT的碱基；(3)修剪测序质量较低的reads末端(测序质量值小于Q20)；(4)去除含N的比例达到10％的reads；(5)舍弃去adapter及质量修剪后长度小于25bp的小片段。

3.3测序数据统计

对经过质量剪切前后的数据分别进行测序reads数、reads读长、总碱基数、文库平均插入长度、Q20％。

3.4基因组组装

首先，运用SOAPdenovo v2.04拼接软件对前期质量剪切数据进行多个Kmer参数的拼接，得到最佳组装结果。随后，运用GapCloser v1.12软件将组装结果进行碱基校正和局部内洞填充。以最终拼接序列所得总长、scaffold N50和scaffold的数量等技术指标为参照，将所有Kmer最终拼装结果整合到一起，进行综合评估；其次，将Kmer值为41的结果作为拼装的最终结果。组装结果各指标见表1。

表1组装结果各指标统计

3.5 SSR位点查找及引物设计

利用MISA软件对Unigene序列进行SSR位点查找。参数设置为：1-10；2-6；3-5；4-5；5-5；6-5；两个SSR之间的最小距离设置为100bp。参数意义：即1个碱基重复10次即10次以上；2个碱基重复6次及6次以上；3个碱基重复5次及5次以上；4个碱基重复5次及5次以上；5个碱基重复5次及5次以上；6个碱基重复5次及5次以上，同时两个微卫星之间的距离小于100bp的时候，两个微卫星组成一个复合微卫星。利用primer软件对MISA识别获得的SSR序列设计引物。引物设计过程按照以下标准执行：退火温度Tm值55℃-65℃(上下游引物的Tm值相差不能大于5℃)；PCR目的产物150-500bp；GC含量40％-60％；引物长度18-24bp。统计结果见表2和表3。

表2 SSR分析结果统计

表3不同重复单元的SSR类型分布统计

3.6微卫星多态性引物验证

本试验将成都和丹东两地种群作为试验材料，每个种群各选用24头细蜂成虫共计48个个体对随机挑选的240对引物进行多态性验证。

3.6.1 DNA的提取与检测

3.6.2 PCR扩增

以刺槐叶瘿蚊广腹细蜂成虫DNA为模版进行PCR扩增，通过对SSR引物的退火温度(Tm)及DNA模板量进行优化，扩增出具有良好特异性及多态性的目的产物。在每对引物的正向或反向的5’端添加一个M13接头(5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’)，PCR扩增体系(10ul)如下：2×Taq Mix 5ul，10uM正向引物0.05ul，反向引物0.15ul，荧光分子内标0.1ul；DNA模板0.5ul，ddH2O定容至10ul；PCR扩增程序如下：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，循环35次，72℃延伸10s，4℃保存。PCR采用10ul反应体系，退火温度在50℃～60℃之间设置8个温度梯度，DNA模板量设置0.5ul、1.0ul和1.5ul 3个梯度。将这两个条件同步在一个试验中进行筛选，筛选出具有条带的引物并保留；没有条带的引物，通过改变扩增条件及PCR体系对其进行进一步优化，结果好的保留，以此进行逐步筛选，逐步保留扩增结果比较好的引物。将筛选结果不理想的引物放弃使用。从MISA及Primer3软件所获得的所有微卫星引物中按照不同的重复单元类型，共挑选出240对，对该48个个体进行引物筛选，通过Genemarker2.2.0(SoftGenetics)(Goodnight&Queller,1999)、GenePop4.3(Laboratiore de Genetique et Environment)(Rousset,2008)和Ntsys(AppliedBiostatistics)(Rohlf,1993)软件分析，获得遗传多样性信息及UPGMA聚类图。

3.6.3 SSR微卫星引物相关特征

从检测到的上万个SSR位点中挑选240对引物，通过48个个体多态性验证，筛选出37对多态性较好的SSR引物，平均片段大小261bp(表6)。

表4第一批引物多态性筛选结果

表5第二批引物多态性筛选结果

图1为37对多态性较好的SSR引物中的部分引物在刺槐叶瘿蚊广腹细蜂24个样品中扩增出的结果。该37对SSR引物中，包含重复单元类型分别为单核苷酸重复、二核苷酸重复、三核苷酸重复、五核苷酸重复和六核苷酸重复。其中三核苷酸重复类型最多，占59.46％，其他占比例分别为8.11％、27.03％、、2.70％和2.70％。在37对SSR引物中，重复类型分别为：T和G(1个重复单元)；AC、AT和TA(两个重复单元)；AAG,、AAT、ACG、AGC、ATC、ATG、ATT、CGT、CTA、CTT、GAG、GCT、GGA、GGT、TAT、TTA、TTC和TTG(3个重复单元)；GGTTC(5个重复单元)和CCGTTG(6个重复单元)(见表7)。由表7可见，筛选出的SSR位点中3个重复单元的重复序列最多。

表6 37对微卫星引物相关特征信息

表7 37对SSR引物中不同重复单元类型统计

3.6.4遗传多样性分析

将PCR产物在ABI 3730xl DNA analyzer基因分析仪上进行基因扫描，获得的结果利用Genemarker2.2.0软件进行数据的初步处理，得到共显性等位基因大小，然后将读取的数据结果保存在Excel中，建成微卫星基因型数据库；再利用GenePop4.3软件计算每个位点的等位基因数(Na)、等位基因频率(MAF)、基因型个数(N_G)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、多态信息含量(PIC)和哈迪温伯格平衡检测(Hardy-Weinberg equilibrium test)以及连锁不平衡检测(linkage disequilibrium test)，图2-图4为经由软件GeneMarker处理后部分引物的毛细管电泳胶图显示结果。

48个个体在37对SSR位点上的等位基因频率(MAF)在0.13-0.5之间，平均值为0.33；基因型个数(NG)在2-10个之间，平均值为6个；等位基因数(Na)在2-8个之间，平均值为4.05个；观测杂合度(Ho)在0.00-0.96之间，平均值为0.35；期望杂合度(He)在0.04-0.7之间，平均值为0.42；多态信息含量(PIC)在0.04-0.73之间，平均值为0.36。通过GenePop4.3软件得到微卫星等位基因0/1矩阵，做成微卫星基因型0/1数据库，然后利用Ntsys软件进行分析，所得引物遗传多样性信息及UPGMA聚类图见表8和图5。

表8 48个个体对应37个SSR位点遗传多样性指数

试验例1基因微卫星分子标记的刺槐叶瘿蚊广腹细蜂种群的遗传多样性的分析试验

1试验材料

本试验共选用中国22个种群的660个个体作为试验材料，此22个种群的选取依据尚兴朴(2016)对中国刺槐叶瘿蚊广腹细蜂的寄主—刺槐叶瘿蚊调查采集及遗传结构研究情况，有选择性地17个省、市、自治区的29个种群进行挑选，使得本节所选用的样本在保证具有代表性的前提下，有效地节约了成本、提高了效率。该样本的分布区域范围大致在北纬26°35.451′～43°53.482′，东经103°51.816′～125°15.969′，海拔4～1097m，仍代表其在中国的分布情况。

2试验方法

2.1刺槐叶瘿蚊广腹细蜂总基因组DNA的提取

利用TIANamp Genomic DNA Kit血液、细胞、组织基因组DNA提取试剂盒进行提取(操作前先在缓冲液GD和漂洗液PW中按要求加入无水乙醇)。

2.2引物合成与PCR扩增

将表6所示的37对具有多态性的特异微卫星序列信息进行合成，其中有9对(P-LH123303、P-LH126326、P-LH1431、P-LH165921、P-LH375606、P-LH550、P-LH6835和P-LH82949、P-LH87353)微卫星引物不能成功扩增所有22个种群，经多次尝试均未能成功；剩余28对中，引物P-LH64210和P-LH185124是在遗传多样性试验即将结束之后筛选出来，因此在本试验中将剩余26对引物对中国刺槐叶瘿蚊广腹细蜂22个种群的660个个体(每个种群选取30头试验样本)进行PCR扩增，本试验所用26对引物的相关信息见表9，对中国22个种群进行遗传多样性分析。

表9试验所用26对SSR引物相关信息

以上述提取并经凝胶电泳检测成功的刺槐叶瘿蚊基因组DNA为模板，参照已有的扩增体系及程序并有针对性的稍作改进以达到扩增效果的最优化，对目的基因片段进行PCR扩增，扩增反应在Gene Amp PCR system 9600PCR仪(ABI公司)上进行。扩增反应为10ul体系，其中包括8.5ul Golden Star T6Super PCR Mix(1.1×)，正向引物0.2ul，反向引物0.5ul，外加0.3μL TP-M13(5mol/L)接头，DNA模板0.5ul。以100bp DNA ladder为分子量参考对照，用2％琼脂糖凝胶上机电泳检测，通过KODAK Gel Logic 212(KODAK，美国)凝胶成像系统观察电泳结果，对于目的条带且较清晰的扩增产物在3730xl基因分析仪(ABI公司)上检测。

3.2.2.3等位基因检测

首先利用特定测序胶按照不同片段大小将PCR产物分开，在3730xl DNA analyzer基因分析仪(ABI)上进行基因扫描，其次，以GeneScan-500Orange为标准进行分子量检测。由于试验过程中使用了TAMRA、ROX、HEX和FAM四种不同的荧光标记，因此在进行毛细管电泳扫描过程中，可以将四种不同片段大小的产物在同一个泳道中同时检测。

3.2.2.4数据分析软件及使用方法

(1)PCR产物目的基因片段数据的读取

通过不同目的基因等位基因片段大小范围，利用Genemarker2.2.0软件，按照不同峰形的特征进行数据处理，确定不同个体对应的不同微卫星多态性引物的等位基因，导出到Excel表格中，按照不同种群构建等位基因样本数据库。

(2)种群遗传多样性水平的检测

利用Genemarker2.2.0和GenePop4.3软件对构建的等位基因数据库信息进行数据处理。具体包括：具体包括等位基因数(Number of allele,Na)、有效等位基因数(Numberof effective allele,Ne)、观测杂合度(observed heterozygosity,Ho)、期望杂合度(expected heterozygosity,He)、Nei氏遗传距离(Nei’s standard genetic distance,GD)、哈迪-温伯格平衡检测(Hardy-Weinberg equilibrium test)、连锁不平衡检测(linkage disequilibrium test)、种群内近交系数(inbreeding coefficient inpopulation,Fis)、种群间分化系数(inbreeding coefficient among populations,Fst)、总近交系数(total inbreeding coefficient,Fit)、遗传一致度(genetic identity,I)、基因流(gene flow,Nm)、Shannon多样性指数(shannon’s information index,I)和多态性信息含量(polymorphic information content,PIC)。

就等位基因而言，在种群遗传学研究中，随着样本量的增加，一些稀有等位基因会随着其增加而被检测出来，因此导致等位基因数(Number of alleles,Na)也会随之相应增加(尚兴朴等,2016)；有效等位基因数(Effective number of alleles,Ne)方面，其数值离实际观测到的等位基因数越接近，表明在群体中分布越均匀(牛东红等,2010)。

(3)种群遗传结构的分析

单纯通过对种群间遗传多样性相近程度无法判别其种群间遗传关系的远近。因此，需通过对种群间遗传距离和近交程度等多方面综合分析。本次试验通过Ntsys软件对中国22个种群进行了聚类分析。

3.2.3结果与分析

3.2.3.1 PCR扩增产物电泳检测结果

对本试验选用的26对多态性微卫星引物所对应的22个种群共计660个个体进行PCR扩增，扩增产物以100bp DNA ladder为分子量参考对照，用2％琼脂糖凝胶上机电泳检测，通过KODAK Gel Logic 212(KODAK，美国)凝胶成像系统观察，电泳结果显示，绝大多数PCR产物都能够看到目的条带且较清晰，表明可以继续进行下一步试验。PCR扩增产物电泳条带是否清晰且稳定，主要取决于扩增时的扩增条件(扩增体系、退火温度、循环次数、DNA模板浓度等)以及凝胶的质量(浓度、厚度等)、电泳仪电压等各项指标的影响。由于电泳试验所用凝胶为2％琼脂糖所配制，大多数多态性位点不能很明显地在胶图中呈现，因此很难通过电泳图肉眼观察样本个体的纯合子或杂合子情况，对微卫星扩增产物等位基因数据的精确分析，需通过Genemarker2.2.0等软件进一步处理。

3.2.3.2基因分型检测

PCR扩增产物在3730xl DNA analyzer基因分析仪上进行毛细管电泳(96道，50cm，4331246型号)检测，再利用Genemarker2.2.0软件对检测结果进行进一步基因分型检测，读取等位基因片段的长度，将等位基因型频率导入Excel表格中并保存，构建种群微卫星等位基因型数据库。图6是长春种群(CC)其中两个个体在引物P-LH20524中的等位基因分型情况，分别为纯合子和杂合子，其中纯合子在该位点的等位基因片段长度为440bp，杂合子在该位点的等位基因片段长度为440bp和461bp，两者相差19bp碱基长度，其中440bp为两个个体共有的等位基因，又称为共享等位基因，该图用的是FAM荧光检测。

3.2.3.3种群遗传多样性检测

通过26对微卫星引物对22个种群进行遗传多样性检测，共得到141个等位基因，其中P-LH87349、P-LH158987和P-LH246376等位基因数较高，分别为9个、9个和8个，表现出较高的多态性；而P-LH28311、P-LH45531和P-LH150918的等位基因数较低，仅为2个、3个和3个，多态性较低；在26个微卫星位点中，其26个微卫星位点的期望杂合度(He)、观测杂合度(Ho)多态信息含量(PIC)分别在0.2427-0.7841、0.0136-0.6242和0.2270-0.7496之间。在此26个微卫星位点中，共有19个位点的多态信息含量(PIC)大于0.5、8个位点在0.25和0.5之间、仅1个位点(P-LH150918)小于0.25，并且该位点的等位基因数和Shannon多性指数(I)也偏低。

表10刺槐叶瘿蚊广腹细蜂22个种群在26个微卫星位点的遗传多样性

总的来讲，该26个微卫星位点上的等位基因大多为杂合子，表现出一定的遗传变异程度及遗传多样性(表10)。

26个微卫星位点在22个种群中的哈迪温伯格平衡检测结果发现，其中每一个种群或多或少都有偏离哈迪温伯格平衡的情况，其中武汉(WH)、秦皇岛(QH)和北京(BJ)种群偏离程度最低，分别有2个、2个和3个位点偏离哈迪温伯格平衡检测(P<0.5)，占总位点数的7.7％-11.5％；烟台(YT)、贵阳(GY)和郑州(ZZ)种群偏离程度最高，分别为14个、15个和15个，占总数的53.8％-57.7％。

刺槐叶瘿蚊广腹细蜂22个种群在26个微卫星位点上的种内近交系数(F_IS)、总近交系数(F_IT)、种群间分化系数(F_ST)和基因流(Nm)分别在-0.5980～0.6154、-0.0883～0.9438、0.2808～0.8910和0.0306～0.6403(表11)，其平均值分别为0.1815、0.6048、0.5172和0.2334。种内近交系数(F_IS)、总近交系数(F_IT)、种群间分化系数(F_ST)和基因流(Nm)均可反映种群内个体间或种群间的遗传分化程度和近交程度。由此可见，各种群间具有一定程度的遗传分化和基因交流现象。

表11各位点固定指数及基因流

通过遗传距离和遗传相似度的大小可以反映各种群间亲缘关系的远近分析结果可以看出，刺槐叶瘿蚊广腹细蜂22个种群的遗传距离在0.167-0.994之间，其中天水(TS)种群和银川(YC)种群之间遗传距离最近，为0.167，且在22个试验种群中，该两种群之间的地理位置相距也比较近，说明具有一定的基因相似性；秦皇岛(QH)种群和天水(TS)种群之间遗传距离最远，为0.994。经UPGAM非加权平均法聚类分析，22个刺槐叶瘿蚊广腹细蜂种群大体聚为三大支。就全国的地理分布而言，并未发现明显的聚类规律，可能因为刺槐叶瘿蚊广腹细蜂会随寄主刺槐叶瘿蚊传播扩散，再加上刺槐叶瘿蚊广腹细蜂本身也具有一定的飞行扩散能力，加之现今交通运输等人为干扰，导致不同种群间会发生一定程度的种群扩散和基因交流。其中丹东(DD)、营口(YK)、大连(DL)和秦皇岛(QH)种群聚为一支，亲缘关系接近，说明在环渤海湾地区的种群具有一定的基因流和基因相似性，与尚兴朴研究其寄主刺槐叶瘿蚊的种群结果一致(尚兴朴,2016)，进一步证明了刺槐叶瘿蚊广腹细蜂随着寄主刺槐叶瘿蚊传播扩散的推理。其中成都(CD)、天水(TS)、银川(YC)西南部内陆种群聚在一支，长春(CC)和沈阳(SY)东北地区种群也聚为一支，就全国的种群地理分布而言，也具有一定的代表性。

同一种群在不同位点或同一位点在不同种群之间的遗传多样性水平具有一定的差异。该22个种群中，等位基因数在1-9个之间，其中北京(BJ)和大连(DL)种群等位基因数最多，平均每个位点上等位基因个数为4.31和3.66个。贵阳(GY)种群等位基因数最少，平均2个。可以看出北京和大连地区刺槐叶瘿蚊广腹细蜂的遗传分化程度高于贵阳(GY)地区；期望杂合度在1.35-2.31之间，基本趋于稳定。近交系数在-0.98～1.0之间，表明在种群之间存在不同程度的近交情况。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所

<120> 刺槐叶瘿蚊广腹细蜂的SSR引物及其在种群遗传多样性分析中的应用

<130> BJ-2003-180108A

<160> 74

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 1

tcgagacgat tctggaggac 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 2

gcacagcgtt tcagtgtcat 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 3

cttccggcgt actcgtttc 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 4

ggctagagcc aagctgtctg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 5

ggaatttcgg gcttttcttc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 6

ttgcttcagc cacaacagtc 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 7

tctttcatcc acccgatctc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 8

tgtcacagca gtacgccttc 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 9

gaagacgtcg aagaagccac 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 10

aaaatcacgc agaaaaacgg 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 11

cgaggaaaca gcaggtaagg 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 12

acgtcatgca atgctgaaag 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 13

accgtatcag aatggcttgc 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 14

gacgtttgat ctacctgggg 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 15

ttaaacgctg ccgaaagact 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 16

gaaccgaaac gaactgaacc 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 17

ttttgcacga aaatgctcag 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 18

acaagcccaa caacctatgc 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 19

atttggccat tttcgtgtgt 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 20

ggatgctaaa atcgagcctg 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 21

caaccctggc aaacattctt 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 22

atacaccgcc cctctttctt 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 23

ttttgcagcg tgcttgtaac 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 24

catgacgcag ggtatttgtg 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 25

ttgaagcaca caaggtggag 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 26

gcgagttggt cagctctttc 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 27

tgcttcttcc aaattccagg 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 28

gccatgggca aatatacgat 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 29

tacccgcagt caacacagag 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 30

gccttgggaa attggaaaat 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 31

cgaggagttg aacgaggaag 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 32

ccgcggaata ttgtaccact 20

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 33

aacgccgcac cacactatac 20

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 34

cccaaagcga caacgtttat 20

<210> 35

<211> 21

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 35

tcgatccaac attctccact c 21

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 36

actctagtca ggcccttgcc 20

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 37

atagcggcat cattttcacc 20

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 38

aaagggcgct tcttcttttc 20

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 39

cgacgagtcg gagagttttc 20

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 40

tacttttgtc cttggtcggg 20

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 41

atcgtcgaaa tggattcagc 20

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 42

tgcaacaatc attcagccat 20

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 43

cgggtacaac tgctggattt 20

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 44

aggggtaact tttcgacgct 20

<210> 45

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 45

cgagaaatac gtttcacgcc 20

<210> 46

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 46

ctatggccca ttgaaaaacg 20

<210> 47

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 47

acgacgataa tgggcatgtt 20

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 48

aacgtctatg acacgagggg 20

<210> 49

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 49

ccacaatcat gctgaaaacg 20

<210> 50

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 50

gaaagcgcag gtcgatactc 20

<210> 51

<211> 19

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 51

ccaccgttct tgctcaatg 19

<210> 52

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 52

acgtaatttc agccacgtcc 20

<210> 53

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 53

tggtcatttt ccctcgtttc 20

<210> 54

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 54

cgaagcattc cattgttgtg 20

<210> 55

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 55

agtcgcgagc acttgattct 20

<210> 56

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 56

acgctttttc atcgttcagg 20

<210> 57

<211> 21

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 57

gaacttcatg ctcttggatc g 21

<210> 58

<211> 21

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 58

cgaacgaaac tctgtaggac g 21

<210> 59

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 59

tcaccatgtt cctgggaagt 20

<210> 60

<211> 22

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 60

tgaccttttg tgatttcgtg tc 22

<210> 61

<211> 22

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 61

gccatgattg ttgttatttt cg 22

<210> 62

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 62

gaggtggagg tagagagggg 20

<210> 63

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 63

aatccctatg tcacgcgaag 20

<210> 64

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 64

tcgcctaaat aactgccacc 20

<210> 65

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 65

cattttccct agtcgttgcc 20

<210> 66

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 66

tcccgcgctt ttctataatg 20

<210> 67

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 67

tctcggtcac ctgcttctct 20

<210> 68

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 68

caacggaggt caagatggtt 20

<210> 69

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 69

tcggcagaat ttcgtgattt 20

<210> 70

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 70

cgaatttggt gtgtcaatgc 20

<210> 71

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 71

gaaattgatc actcggagcc 20

<210> 72

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 72

aagttgggcc attgtaggtg 20

<210> 73

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 73

acatgtaggg tgaggggttg 20

<210> 74

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 74

tgcttgcata gatttcgtcg 20

Claims

1.刺槐叶瘿蚊广腹细蜂（Platygaster robiniae Buhl and Duso）的特异性SSR引物，其特征在于，包括：引物对1：由核苷酸序列为SEQ ID No.1所示上游引物和SEQ ID No.2所示下游引物组成；引物对2：由核苷酸序列为SEQ ID No.3所示上游引物和SEQ ID No.4所示下游引物组成；引物对3：由核苷酸序列为SEQ ID No.5所示上游引物和SEQ ID No.6所示下游引物组成；引物对4：由核苷酸序列为SEQ ID No.7所示上游引物和SEQ ID No.8所示下游引物组成；引物对5：由核苷酸序列为SEQ ID No.9所示上游引物和SEQ ID No.10所示下游引物组成；引物对6：由核苷酸序列为SEQ ID No.11所示上游引物和SEQ ID No.12所示下游引物组成；引物对7：由核苷酸序列为SEQ ID No.13所示上游引物和SEQ ID No.14所示下游引物组成；引物对8：由核苷酸序列为SEQ ID No.15所示上游引物和SEQ ID No.16所示下游引物组成；引物对9：由核苷酸序列为SEQ ID No.17所示上游引物和SEQ ID No.18所示下游引物组成；引物对10：由核苷酸序列为SEQ ID No.19所示上游引物和SEQ ID No.20所示下游引物组成；引物对11：由核苷酸序列为SEQ ID No.21所示上游引物和SEQ ID No.22所示下游引物组成；引物对12：由核苷酸序列为SEQ ID No.23所示上游引物和SEQ ID No.24所示下游引物组成；引物对13：由核苷酸序列为SEQ ID No.25所示上游引物和SEQ ID No.26所示下游引物组成；引物对14：由核苷酸序列为SEQ ID No.27所示上游引物和SEQ IDNo.28所示下游引物组成；引物对15：由核苷酸序列为SEQ ID No.29所示上游引物和SEQ IDNo.30所示下游引物组成；引物对16：由核苷酸序列为SEQ ID No.31所示上游引物和SEQ IDNo.32所示下游引物组成；引物对17：由核苷酸序列为SEQ ID No.33所示上游引物和SEQ IDNo.34所示下游引物组成；引物对18：由核苷酸序列为SEQ ID No.35所示上游引物和SEQ IDNo.36所示下游引物组成；引物对19：由核苷酸序列为SEQ ID No.37所示上游引物和SEQ IDNo.38所示下游引物组成；引物对20：由核苷酸序列为SEQ ID No.39所示上游引物和SEQ IDNo.40所示下游引物组成；引物对21：由核苷酸序列为SEQ ID No.41所示上游引物和SEQ IDNo.42所示下游引物组成；引物对22：由核苷酸序列为SEQ ID No.43所示上游引物和SEQ IDNo.44所示下游引物组成；引物对23：由核苷酸序列为SEQ ID No.45所示上游引物和SEQ IDNo.46所示下游引物组成；引物对24：由核苷酸序列为SEQ ID No.47所示上游引物和SEQ IDNo.48所示下游引物组成；引物对25：由核苷酸序列为SEQ ID No.49所示上游引物和SEQ IDNo.50所示下游引物组成；引物对26：由核苷酸序列为SEQ ID No.51所示上游引物和SEQ IDNo.52所示下游引物组成。

2.权利要求1所述的特异性SSR引物在刺槐叶瘿蚊广腹细蜂种群的遗传多样性分析中的应用。

3.按照权利要求2所述的应用，其特征在于，包括：

(1) 提取待检测样品基因组DNA；

(2) 采用所示SSR引物进行PCR扩增；

(3) 将步骤(2) 的扩增产物经6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染法染色，照相并统计结果，某位置若有条带记为‘1’，若无则记为‘0’；

(4) 利用步骤(3) 的统计结果进行遗传多样性分析。

4.按照权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤（4）中所述遗传多样性分析方法包括：利用Genemarker2.2.0和GenePop4.3软件对构建的等位基因数据库信息进行数据处理；或者使用GenAlEx V6.501软件计算各引物的PIC值；或者根据基因多样性Na、Nei指数、香农指数、He或Ho遗传多样性估计参数进行分析。

5.权利要求1所述的特异性SSR引物在刺槐叶瘿蚊广腹细蜂种群进化分析中的应用。

6.按照权利要求5所述的应用，其特征在于，包括：利用Ntsys软件计算品种间的遗传距离，用UPGMA法进行聚类分析，绘制树状图。

7.权利要求1所述的特异性SSR引物在刺槐叶瘿蚊广腹细蜂多态性分析中的应用。

8.按照权利要求7所述的应用，其特征在于，包括：

(1) 提取待检测样品基因组DNA；

(2) 采用所示SSR引物进行PCR扩增；

(3) 将扩增产物处理后用多态性分析软件进行分析。

9.权利要求1所述的特异性SSR引物在构建刺槐叶瘿蚊广腹细蜂指纹图谱中的应用。