CN116377112B - 十二种弱寄生蜜环菌通用多态性微卫星分子标记及其引物与应用 - Google Patents

十二种弱寄生蜜环菌通用多态性微卫星分子标记及其引物与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及十二种弱寄生蜜环菌通用多态性微卫星分子标记及其引物与应用，属于分子生物学技术领域，本发明公开了十二种弱寄生蜜环菌通用多态性微卫星分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～13所示；本发明还公开了十二种弱寄生蜜环菌通用多态性微卫星分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO.14～39所示；本本发明所述的多态性微卫星分子标记和引物可用于弱寄生蜜环菌的遗传图谱的构建、目标基因的标定、指纹图谱的绘制、品种鉴定、谱系分析、群体间遗传距离分析、进化和遗传多样性及品种选育。

Description

十二种弱寄生蜜环菌通用多态性微卫星分子标记及其引物与 应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体的说，涉及十二种弱寄生蜜环菌通用多态性微卫星分子标记及其引物与应用。
背景技术
根据Guo et al., (2016)的研究，我国的蜜环菌在基于ITS/tef1-a/β-tubulin联合矩阵采用最大似然法构建的蜜环菌属分子系统发育树上呈2个主要分支（参照附图1），位于基部的分支为寄生性较强的蜜环菌Armillariamellea复合群，另一个分支则由寄生性稍弱的蜜环菌组成，生物学种上，弱寄生蜜环菌分支主要由CBSA、CBSB、CBSC、CBSD、CBSF、CBSH、CBSJ、CBSL、CBSM、CBSN、CBSO和CBSP十二个生物学种组成。这些弱寄生蜜环菌包括广泛用于天麻栽培的高卢蜜环菌（CBSB），其他物种也具有栽培天麻的潜力且都可以作为食用菌资源。针对十二种弱寄生蜜环菌开发一套通用有效的分子指纹品种鉴别系统，将有助于解决弱寄生分支若干蜜环菌物种的谱系分析、群体间遗传距离分析、品种鉴定、进化和遗传多样性等研究中问题。
SSR(Simple Sequence Repeats)标记是近年来发展起来的一种以特异引物PCR为基础的分子标记技术，也称为微卫星DNA(Microsatellite DNA)，是一类由几个核苷酸（一般为1~6个）为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列。研究发现，微卫星中重复单位的数目存在高度变异，这些变异表现为微卫星数目的整倍性变异或重复单位序列中的序列有可能不完全相同，因而造成多个位点的多态性，将这些变异揭示出来，就能发现不同的SSR在不同的种甚至同种不同个体间的多态性。目前，SSR分子标记以其多态性高、稳定性好、共显性、易于扩增以及标记丰富且分布于全基因组等特点，被广泛应用于遗传图谱的构建、目标基因的标定、指纹图谱的绘制、品种鉴定、谱系分析、群体间遗传距离分析、进化和遗传多样性等研究中。随着测序技术的发展，基因组、转录组以及基因组重测序成本越来越低，越来越多物种完成了基因组、转录组或者群体重测序，基于参考基因组、转录组或群体重测序基因组数据进行SSR标记开发极大缩短了SSR标记的开发时间和成本，同时极大提高了SSR标记开发成功率，使得基于群体基因组数据进行SSR分子标记开发成为未来SSR分子标记开发主流方法。
本发明根据软件CandiSSR (Xia et al.，2016)预测出的十二种弱寄生蜜环菌通用的多态性微卫星位点，挑选出其中40个评分较为理想的微卫星位点，利用来源不同的39个属于十二种弱寄生蜜环菌的样本对这些位点的多态性进行初步验证。本发明为蜜环菌属十二种弱寄生蜜环菌的品种鉴定、谱系分析、群体间遗传距离分析、进化和遗传多样性等提供分子技术的支持。
发明内容
为了克服背景技术中存在的问题，本发明提供了十二种弱寄生蜜环菌通用多态性微卫星分子标记及其引物与应用。
为实现上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：
十二种弱寄生蜜环菌通用多态性微卫星分子标记，所述的微卫星分子标记为RJSSSR7、RJSSSR9、RJSSSR13、RJSSSR107、RJSSSR147、RJSSSR189、RJSSSR213、RJSSSR226、RJSSSR245、RJSSSR275、RJSSSR290、RJSSSR326和RJSSSR376，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1～13所示。
进一步的，所述的微卫星分子标记RJSSSR7的重复序列为ACC；
所述的微卫星分子标记RJSSSR9的重复序列为ACC；
所述的微卫星分子标记RJSSSR13的重复序列为ACC；
所述的微卫星分子标记RJSSSR107的重复序列为CG；
所述的微卫星分子标记RJSSSR147的重复序列为CG；
所述的微卫星分子标记RJSSSR189的重复序列为GAC；
所述的微卫星分子标记RJSSSR213的重复序列为GATG；
所述的微卫星分子标记RJSSSR226的重复序列为GCC；
所述的微卫星分子标记RJSSSR245的重复序列为GGT；
所述的微卫星分子标记RJSSSR275的重复序列为TA；
所述的微卫星分子标记RJSSSR290的重复序列为TC；
所述的微卫星分子标记RJSSSR326的重复序列为TCG；
所述的微卫星分子标记RJSSSR376的重复序列为TTG。
本发明还提供，十二种弱寄生蜜环菌通用多态性微卫星分子标记的引物，
RJSSSR7的引物正向序列和反向序列如SEQ ID NO.14和15所示；
RJSSSR9的引物正向序列和反向序列如SEQ ID NO.16和17所示；
RJSSSR13的引物正向序列和反向序列如SEQ ID NO.18和19所示；
RJSSSR107的引物正向序列和反向序列如SEQ ID NO.20和21所示；
RJSSSR147的引物正向序列和反向序列如SEQ ID NO.22和23所示；
RJSSSR189的引物正向序列和反向序列如SEQ ID NO.24和25所示；
RJSSSR213的引物正向序列和反向序列如SEQ ID NO.26和27所示；
RJSSSR226的引物正向序列和反向序列如SEQ ID NO.28和29所示；
RJSSSR245的引物正向序列和反向序列如SEQ ID NO.30和31所示；
RJSSSR275的引物正向序列和反向序列如SEQ ID NO.32和33所示；
RJSSSR290的引物正向序列和反向序列如SEQ ID NO.34和35所示；
RJSSSR326的引物正向序列和反向序列如SEQ ID NO.36和37所示；
RJSSSR376的引物正向序列和反向序列如SEQ ID NO.38和39所示。
进一步的，所述的引物正向序列5’端设带有荧光标记。
进一步的，所述的微卫星分子标记RJSSSR13和RJSSSR189引物对的荧光标记为TAMRA，所述的微卫星分子标记RJSSSR9、RJSSSR107、RJSSSR213和RJSSSR245引物对的荧光标记HEX，所述的微卫星分子标记RJSSSR147、RJSSSR275和RJSSSR290引物对的荧光标记为FAM，所述的微卫星分子标记RJSSSR7、RJSSSR226、RJSSSR326和RJSSSR376引物对的荧光标记为ROX。
本发明还提供十二种弱寄生蜜环菌通用多态性微卫星分子标记在蜜环菌菌种检测鉴别中的应用。
本发明还提供十二种弱寄生蜜环菌通用多态性微卫星分子标记的引物在蜜环菌菌种检测鉴别中的应用。
本发明的有益效果：
本发明首先对十二种弱寄生蜜环菌（CBSA、CBSB、CBSC、CBSD、CBSF、CBSH、CBSJ、CBSL、CBSM、CBSN、CBSO和CBSP）进行基于三代HIFI测序技术的基因组测序，再运用生物信息学方法检测十二种弱寄生蜜环菌基因组中通用的SSR序列，选取部分SSR序列进行引物开发，运用来自全国不同科研单位、公司、野生环境、市场获得的所有十二种弱寄生蜜环菌菌株进行SSR位点的筛选，最终筛选出13对通用的、多态性较高的SSR分子标记。本发明开发了一套可以将十二种弱寄生蜜环菌不同菌株进行准确鉴定的SSR标记方法，开发出一套十二种弱寄生蜜环菌通用的SSR分子标记，为弱寄生蜜环菌的遗传图谱的构建、目标基因的标定、指纹图谱的绘制、品种鉴定、谱系分析、群体间遗传距离分析、进化和遗传多样性及品种选育等提供有力工具。
附图说明
图1是本发明背景技术中Guo et al., 2016基于ITS/tef1-a/β-tubulin联合矩阵采用最大似然法构建的蜜环菌属分子系统发育树。
图2是本发明中12个用于弱寄生蜜环菌SSR位点及引物开发的基因组组装质量的BUSCO评价结果。
图3是本发明中基于来源不同的15个蜜环菌生物学种菌株的ITS/tef1-a/β-tubulin/LSU/rpb1/rpb2联合矩阵采用最大似然法构建的蜜环菌属分子系统发育树；
图4是本发明中13个SSR位点在12个弱寄生蜜环菌物种的39个菌株中扩增出的等位基因和等位基因频率分布图；
图5是本发明中基于13个SSR位点对39个菌株构建的UPGMA树。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将对本发明的优选实施例进行详细的说明，以方便技术人员理解。
实施例
一、弱寄生蜜环菌基因组提取及检测：
总DNA提取采用TSINGKE植物DNA提取试剂盒（通用型），具体步骤如下：
（1）将Spin Colu2置于Collection Tube中，加入250μl Buffer BL，12000 rpm/min离心1 min活化硅胶膜；
（2）取样本干燥组织（不大于20 mg），加入液氮充分研磨。研磨后置于1.5 ml离心管中，加入400μl Buffer gP1，涡旋振荡1 min，65℃水浴10~30 min，期间可取出颠倒混匀以充分裂解；
（3）加入150μl Buffer gP2，涡旋振荡1 min，冰浴5 min；
（4）12000 rpm/min离心5 min，将上清转移至新的离心管中；
（5）加入上清等体积的无水乙醇，立即充分振荡混匀，液体全部转入Spin Colu2中，12，000rpm/min离心30 s，弃废液；
（6）向Spin Colu2中加入500μlBuffer Pw（使用前已加入无水乙醇），12000 rpm/min离心30 s，弃废液；
（7）向Spin Colu2中加入500μlWash Buffer（使用前已加入无水乙醇），12000rpm/min离心30 s，弃废液；
（8）重复操作步骤 7；
（9）将Spin Colu2放回Collection Tube 中，12，000 rpm/min 离心2 min，开盖晾干1 min；
（10）取出Spin Colu2，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中央处加50~100μlTE Buffer（65℃预热TE Buffer），20 ~ 25℃放置2 min，12，000 rpm/min离心2 min。
（11）用核酸浓度检测仪检测DNA浓度，将浓度调节至l00ng/µ1，置于-20°C冰箱保存。
二、先对从全国科研院所、公司、野生环境、市场收集的所有菌株进行ITS、tef1-α、β-tubulin、LSU、rpb1、rpb2测序，并构建ITS-tef1-a-β-tubulin-LSU-rpb1-rpb2多基因联合系统发育树（如附图3所示），确认属于十二个弱寄生蜜环菌的菌株。分别从十二个弱寄生蜜环菌生物学种中挑选出的1个菌株(CBSA96042、CBSB96032、CBSC96038、CBSD96043、CBSF97033、CBSH0006、CBSJ02044、CBSLW17039、CBSM05021、CBSN02066、CBSO19095、CBSP19062)进行基于三代HIFI测序技术的全基因组测序，以CBSA96042为参考序列，通过CandiSSR软件对十二个弱寄生蜜环菌基因组中通用的SSR位点进行检测并在其上游及下游200bp范围内进行引物开发，引物开发条件设定为软件默认值。设计出的引物先根据缺失率进行升序排列，保留缺失率为0的引物，在根据标准差降序排列，选标准差排名前40对引物在十二个弱寄生蜜环菌菌株上检测。图2为十二个用于弱寄生蜜环菌SSR位点及引物开发的基因组组装质量的BUSCO评价结果图。图3是本发明中基于来源不同的15个蜜环菌生物学种菌株的ITS/tef1-a/β-tubulin/LSU/rpb1/rpb2联合矩阵采用最大似然法构建的蜜环菌属分子系统发育树。图4是本发明中13个SSR位点在12个弱寄生蜜环菌物种的39个菌株中扩增出的等位基因和等位基因频率分布图。图5是本发明中基于13个SSR位点对39个菌株构建的UPGMA树。
三、SSR位点的PCR扩增：设计出的引物先根据缺失率进行升序排列，保留缺失率为0的引物，在根据标准差降序排列，选标准差排名前60对引物对81个不同来源的高卢蜜环菌菌株进行初步筛选，检测扩增条带的有无。PCR反应体系为：100ng/µ1的DNA模板1 µ1，10μl2× TSINGKE Master Mix (blue)，0.15μl 10μM Primer F（加接头），1.2μl 10μM PrimerR，1.2μl 10μM Tag（荧光），1μl Template（gDNA），6.45μl ddH2O。PCR反应条件为：94°C: 5min，(94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s) X 35 cycles，72 ℃ 8min。
四、SSR位点的PCR产物检测：
（1）将扩增好的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳（2μl样品+6μl溴酚蓝），300 V电压下12分钟，获取鉴定胶图，通过胶图确定模板浓度，加水稀释到毛细管电泳所需浓度。
（2）将HiDi与GS500的内标按130：1混合，配成mix。
（3）用国产96孔反应板分装mix，每个孔中加入10μl mix。
（4）对应着在96孔板中加入0.5μl样品模板，离心到4000 rpm即停。
（5）用金属浴加热器将混合板95 ℃加热预变性5分钟，拿出后立即放入-20 ℃。
（6）冷却后拿出，4000 rpm离心，解冻、混匀。
（7）上3730测序仪进行毛线管电泳。
（8）获取下机结果并分析，筛选出多态性较好的位点。
五、 位点分析和筛选：
（1）用软件Gene mapper 4.1进行数据准确位点的分析，分析数据按照引物对应关系的核心碱基重复数（例如(AG)6）片段大小263（应加了Tag的16个碱基，所以大小实际为279）来确定位点准确大小。
（2）根据分析出来的位点信息（峰图.PDF和数据.excel）来判断检测引物是否具有位点多态性，选取特异性高，多态性好的位点作为后续研究的重点。
（3）将每个个体的特异性条带以条带大小（bp）的方式统计，根据Gene mapper 4.1分析的峰图，信号值在400以上，无其他杂峰干扰，并且同一个位点所跑出来的峰形都是相似的，若峰形不相似，即使峰值高于400bp并且无其他杂峰干扰也不采纳数据，以此来筛选数据是否可用。最终建立原始数据矩阵。
微卫星分子标记为RJSSSR7、RJSSSR9、RJSSSR13、RJSSSR107、RJSSSR147、RJSSSR189、RJSSSR213、RJSSSR226、RJSSSR245、RJSSSR275、RJSSSR290、RJSSSR326和RJSSSR376，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～13所示。
所述的微卫星分子标记RJSSSR7的重复序列为ACC；
所述的微卫星分子标记RJSSSR9的重复序列为ACC；
所述的微卫星分子标记RJSSSR13的重复序列为ACC；
所述的微卫星分子标记RJSSSR107的重复序列为CG；
所述的微卫星分子标记RJSSSR147的重复序列为CG；
所述的微卫星分子标记RJSSSR189的重复序列为GAC；
所述的微卫星分子标记RJSSSR213的重复序列为GATG；
所述的微卫星分子标记RJSSSR226的重复序列为GCC；
所述的微卫星分子标记RJSSSR245的重复序列为GGT；
所述的微卫星分子标记RJSSSR275的重复序列为TA；
所述的微卫星分子标记RJSSSR290的重复序列为TC；
所述的微卫星分子标记RJSSSR326的重复序列为TCG；
所述的微卫星分子标记RJSSSR376的重复序列为TTG。
十二种弱寄生蜜环菌通用多态性微卫星分子标记的引物为（正向序列5’端设有荧光标记）：
RJSSSR7的引物正向序列和反向序列如SEQ ID NO.14和15所示；荧光标记为ROX；
RJSSSR9的引物正向序列和反向序列如SEQ ID NO.16和17所示；荧光标记为HEX；
RJSSSR13的引物正向序列和反向序列如SEQ ID NO.18和19所示；荧光标记为TAMRA；
RJSSSR107的引物正向序列和反向序列如SEQ ID NO.20和21所示；荧光标记为HEX；
RJSSSR147的引物正向序列和反向序列如SEQ ID NO.22和23所示；荧光标记为FAM；
RJSSSR189的引物正向序列和反向序列如SEQ ID NO.24和25所示；荧光标记为TAMRA；
RJSSSR213的引物正向序列和反向序列如SEQ ID NO.26和27所示；荧光标记为HEX；
RJSSSR226的引物正向序列和反向序列如SEQ ID NO.28和29所示；荧光标记为ROX；
RJSSSR245的引物正向序列和反向序列如SEQ ID NO.30和31所示；荧光标记为HEX；
RJSSSR275的引物正向序列和反向序列如SEQ ID NO.32和33所示；荧光标记为FAM；
RJSSSR290的引物正向序列和反向序列如SEQ ID NO.34和35所示；荧光标记为FAM；
RJSSSR326的引物正向序列和反向序列如SEQ ID NO.36和37所示；荧光标记为ROX；
RJSSSR376的引物正向序列和反向序列如SEQ ID NO.38和39所示；荧光标记为ROX。
六、SSR位点遗传多样性信息计算：
将获得的SSR数据分别在GenAlEx version 6.501和PowerMarkerV3.25软件中计算SSR位点和群体的各项遗传多样性指标，结果如表1所示，13个SSR位点在39个弱寄生蜜环菌样品中的观测等位基因（Na）为4～9个，平均6.23个，香浓多样性指数I平均值为1.18，观测杂合度Ho平均值为0.17，期望杂合度He平均值为0.62，多态性信息含量PIC平均值为0.58，13个通用SSR位点在所有弱寄生蜜环菌样本中具有较高的多态性，如附图5所示，13个通用SSR位点能将所有39个弱寄生蜜环菌菌株进行区分。本发明所述的多态性微卫星分子标记和引物可用于弱寄生蜜环菌的遗传图谱的构建、目标基因的标定、指纹图谱的绘制、品种鉴定、谱系分析、群体间遗传距离分析、进化和遗传多样性及品种选育。
表1 13个微卫星位点的遗传多样性信息
Locus Na Ne I Ho He PIC
RJSSSR7 8.00 2.16 1.18 0.15 0.54 0.51
RJSSSR9 5.00 3.92 1.48 0.10 0.74 0.71
RJSSSR13 4.00 2.37 1.06 0.12 0.58 0.52
RJSSSR107 6.00 1.84 0.87 0.08 0.46 0.41
RJSSSR147 9.00 4.99 1.77 0.24 0.80 0.77
RJSSSR189 6.00 2.98 1.29 0.02 0.66 0.61
RJSSSR213 6.00 3.16 1.42 0.07 0.68 0.65
RJSSSR226 6.00 1.69 0.88 0.15 0.41 0.39
RJSSSR245 6.00 3.10 1.33 0.17 0.68 0.63
RJSSSR275 7.00 4.35 1.67 0.07 0.77 0.74
RJSSSR290 6.00 3.88 1.53 0.32 0.74 0.71
RJSSSR326 4.00 1.93 0.92 0.07 0.48 0.45
RJSSSR376 8.00 2.25 1.18 0.17 0.56 0.52
Mean 6.23 2.97 1.28 0.13 0.62 0.58
最后说明的是，以上优选实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (7)

1.十二种弱寄生蜜环菌通用多态性微卫星分子标记，其特征在于：所述的微卫星分子标记为RJSSSR7、RJSSSR9、RJSSSR13、RJSSSR107、RJSSSR147、RJSSSR189、RJSSSR213、RJSSSR226、RJSSSR245、RJSSSR275、RJSSSR290、RJSSSR326和RJSSSR376，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～13所示。
2.根据权利要求1所述的十二种弱寄生蜜环菌通用多态性微卫星分子标记，其特征在于：所述的微卫星分子标记RJSSSR7的重复序列为ACC；
所述的微卫星分子标记RJSSSR9的重复序列为ACC；
所述的微卫星分子标记RJSSSR13的重复序列为ACC；
所述的微卫星分子标记RJSSSR107的重复序列为CG；
所述的微卫星分子标记RJSSSR147的重复序列为CTG；
所述的微卫星分子标记RJSSSR189的重复序列为GAC；
所述的微卫星分子标记RJSSSR213的重复序列为GATG；
所述的微卫星分子标记RJSSSR226的重复序列为GCC；
所述的微卫星分子标记RJSSSR245的重复序列为GGT；
所述的微卫星分子标记RJSSSR275的重复序列为TA；
所述的微卫星分子标记RJSSSR290的重复序列为TC；
所述的微卫星分子标记RJSSSR326的重复序列为TCG；
所述的微卫星分子标记RJSSSR376的重复序列为TTG。
3.根据权利要求1或2任一项所述的十二种弱寄生蜜环菌通用多态性微卫星分子标记的引物，其特征在于：
RJSSSR7的引物正向序列和反向序列如SEQ ID NO.14和15所示；
RJSSSR9的引物正向序列和反向序列如SEQ ID NO.16和17所示；
RJSSSR13的引物正向序列和反向序列如SEQ ID NO.18和19所示；
RJSSSR107的引物正向序列和反向序列如SEQ ID NO.20和21所示；
RJSSSR147的引物正向序列和反向序列如SEQ ID NO.22和23所示；
RJSSSR189的引物正向序列和反向序列如SEQ ID NO.24和25所示；
RJSSSR213的引物正向序列和反向序列如SEQ ID NO.26和27所示；
RJSSSR226的引物正向序列和反向序列如SEQ ID NO.28和29所示；
RJSSSR245的引物正向序列和反向序列如SEQ ID NO.30和31所示；
RJSSSR275的引物正向序列和反向序列如SEQ ID NO.32和33所示；
RJSSSR290的引物正向序列和反向序列如SEQ ID NO.34和35所示；
RJSSSR326的引物正向序列和反向序列如SEQ ID NO.36和37所示；
RJSSSR376的引物正向序列和反向序列如SEQ ID NO.38和39所示。
4.根据权利要求3所述的十二种弱寄生蜜环菌通用多态性微卫星分子标记的引物，其特征在于：所述的引物正向序列5’端设带有荧光标记。
5.根据权利要求3所述的十二种弱寄生蜜环菌通用多态性微卫星分子标记的引物，其特征在于所述的微卫星分子标记RJSSSR13和RJSSSR189引物对的荧光标记为TAMRA，所述的微卫星分子标记RJSSSR9、RJSSSR107、RJSSSR213和RJSSSR245引物对的荧光标记为HEX，所述的微卫星分子标记RJSSSR147、RJSSSR275和RJSSSR290引物对的荧光标记为FAM，所述的微卫星分子标记RJSSSR7、RJSSSR226、RJSSSR326和RJSSSR376引物对的荧光标记为ROX。
6.根据权利要求1或2任一项所述的十二种弱寄生蜜环菌通用多态性微卫星分子标记在蜜环菌菌种检测鉴别中的应用。
7.根据权利要求3所述的十二种弱寄生蜜环菌通用多态性微卫星分子标记的引物在蜜环菌菌种检测鉴别中的应用。
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