CN107988247A - 蜜环菌筛选标记及构建转基因菌株的方法 - Google Patents
蜜环菌筛选标记及构建转基因菌株的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107988247A CN107988247A CN201711018674.4A CN201711018674A CN107988247A CN 107988247 A CN107988247 A CN 107988247A CN 201711018674 A CN201711018674 A CN 201711018674A CN 107988247 A CN107988247 A CN 107988247A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- halimasch
- egfp
- selection markers
- hygromycin
- agrobacterium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 title abstract description 7
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 claims abstract description 19
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 8
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 7
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 7
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 abstract description 6
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 4
- 239000011149 active material Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 abstract description 2
- 230000000050 nutritive effect Effects 0.000 abstract description 2
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 abstract 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 abstract 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 15
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 7
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 244000221226 Armillaria mellea Species 0.000 description 3
- 235000011569 Armillaria mellea Nutrition 0.000 description 3
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 3
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical class O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 241000216654 Armillaria Species 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 2
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 230000031068 symbiosis, encompassing mutualism through parasitism Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 2
- 238000012256 transgenic experiment Methods 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000305491 Gastrodia elata Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Natural products N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000012407 engineering method Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 description 1
- 230000028023 exocytosis Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000000147 hypnotic effect Effects 0.000 description 1
- -1 i.e. Natural products 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 1
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012772 sequence design Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种蜜环菌筛选标记,即将潮霉素作为蜜环菌筛选标记;本发明通过实验筛选出能抑制蜜环菌生长的抗生素;本发明选用真核表达载体pH2GW7‑35S‑EGFP,转化农杆菌,以潮霉素为筛选标记,通过农杆菌介导法将EGFT基因转入到蜜环菌中,在荧光显微镜下观察到GFP蛋白荧光,表明pH2GW7‑35s‑EGFP在蜜环菌中表达,蜜环菌可用作宿主细胞进行转基因操作;蜜环菌转基因方法的建立为进一步研究蜜环菌基因表达奠定了基础,同时为在蜜环菌体内进行活性物质的生物合成与调控以及蜜环菌与天麻营养物质交流等分子机理的深入研究提供了基因工程研究方法。
Description
技术领域
本发明涉及蜜环菌的筛选标记和农杆菌介导的蜜环菌转基因方法,本发明属于真菌分子基因工程领域。
背景技术
蜜环菌属(Armillaria (Fr.: Fr.)Staude.),又名榛蘑、蜜环蕈、青冈蕈,是一类重要的药食兼用真菌,与天麻共生,是天麻赖以生存的支柱。蜜环菌生长的好坏直接影响到天麻接菌状况以及产量和品质。除了为天麻的生长提供营养外,蜜环菌及其发酵产物还具有与天麻相似的药理作用,包括催眠镇静、调节血液循环、增强免疫能力、清除自由基、延缓衰老,抑制肿瘤等生物活性,而且蜜环菌含有多种类型次生代谢产物,具有良好的经济价值。因此,蜜环菌成为科学工作者最为关注。
到目前为此,随着基因工程的迅速发展和转基因技术体系的日益完善,基因工程为培育出高产、优质、抗病虫、抗逆境的优良品种开辟了新途径,其中研究最为清楚和应用最成功的是农杆菌介导的遗传转化,在已获得近200种转基因植物中约80%是农杆菌介导完成的。农杆菌转化法是利用农杆菌在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物和裸子植物的受伤部位,把目的基因转入到宿主细胞中而获得转基因植物。针对植物细胞特性,在农杆菌转化时切出受伤的切口进行转化。
目前,有关天麻蜜环菌的研究主要集中在蜜环菌筛选、天麻蜜环菌的培养条件优化、蜜环菌对天麻产量的影响以及蜜环菌天麻共生关系等生理生化方面,而对蜜环菌的基因表达、活性物质的生物合成及与天麻营养物质交流等的分子机理研究较少。
发明内容
本发明的目的在于提供一种潮霉素的新用途,即潮霉素在作为蜜环菌筛选标记中的应用。
本发明另一目的是提供一种构建转基因蜜环菌菌株的方法,菌丝的生长是通过在菌丝尖端凝集新的质膜、通过分泌囊包胞吐作用合成新细胞壁。菌丝生长极性仅发生在菌丝顶端,新形成的细胞壁仅在菌丝顶端1µm以内的区域合成,这与植物的受伤部位生长过程相似,而且如果将真菌菌丝打断,菌丝又可以继续生长,农杆菌将可对蜜环菌菌丝进行转化。将带有EGFP基因的真核表达载体pH2GW7-35S-EGFP通过农杆菌介导法转入到蜜环菌体内,将转染后的菌丝体在含有筛选标记潮霉素的PDA固体培养中培养,得到抗潮霉素的转基因蜜环菌。
为了实现本发明的目的,本发明提供如下的技术方法:
1、不同浓度不同种类的抗生素处理蜜环菌
培养基为PDA:马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、加水定容到1000mL。
在PDA平板中分别加入氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Km)、状观霉素(Spe)和潮霉素(Hyg),每种抗生素浓度梯度为:0 µg/mL(CK)、50 µg/mL、100 µg/mL 150 µg/mL、200 µg/mL、250 µg/mL;培养5天后观察蜜环菌的生长情况;蜜环菌能够在所有梯度浓度Amp,Km和Spe抗生素上生长,但不能在含有潮霉素的培养基上生长;潮霉素完全能够抑制蜜环菌的生长。
2、蜜环菌培养
将蜜环菌株接种于斜面培养基PDA中,待菌丝体布满斜面后,转接于液体培养基中,摇床中培养出菌丝体。
3、表达载体转化农杆菌及转基因蜜环菌筛选
构建真核表达载体pH2GW7-35S-EGFP,通过电转化法将表达载体转入农杆菌pMP105菌中,经壮观酶素(Spe)筛选得到阳性克隆,经菌液PCR检测阳性克隆中是否含有外源基因EGFP表达载体pH2GW7-35S-EGFP质粒;然后通过农杆菌介导的遗传转化法转染蜜环菌菌丝体,将转染后的菌丝体在含有筛选标记潮霉素(Hyg)的PDA固体培养中培养,得到的能够抗Hyg的转基因蜜环菌菌丝。
4、转基因蜜环菌的检测
经Hyg筛选能够抗Hyg在平板中长成的菌丝在显微镜下观察报告基因GFP表达情况;提取转化子的基因组DNA,PCR鉴定转化子;发现野生对照组发绿色的荧光,而转基因实验组在绿色荧光的中间出现了青白色的荧光,而且提取其菌丝体的基因组进行PCR扩增,能够扩增出目的大小相同的条带,拿到公司去测序与原目的基因100%相似。
本发明相对于现有技术的优点和技术效果如下:
本发明蜜环菌筛选标记为进一步研究蜜环菌转基因方法提供了更好的研究手段,为通过基因工程方法对蜜环菌和天麻深入分子机理的研究奠定了理论和实验基础。与此同时,本发明中所获得的结果能够为我们通过基因工程手段来改造蜜环菌奠定理论基础以及提供了实验方法。
附图说明
图1为本发明Amp、km、Spe、Hyg抗生素筛选及浓度梯度变化示意图;
图2为本发明蜜环菌培养;其中;图A-固体基上培养的蜜环菌;图B-液体培养基培养出蜜环菌;
图3真核表达载体pH2GW7-35S-EGFP双酶切检测图;M为DL10000 DNA Marker;1-2为pENTR*-T-EGFP重组质粒;3为pH2GW7质粒;4-6,8-9为 pH2GW7-35S-EGFP重组质粒BamHI和XhoI双酶切;7为未加质粒的阴性对照;
图4为本发明转基因蜜环菌显微镜检测图;A:40倍显微镜观察的蜜环菌菌丝图; B:40倍显微镜下转基因蜜环菌菌丝图;
图5为本发明转化子PCR鉴定电泳示意图;M:DL2000 DNA Marker;1:野生型对照;2-3:转化子基因组PCR。
具体实施方式
本实施中采用的试剂主要为分子生物学实验试剂。各种限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、dNTP等为日本宝生物工程有限公司(大连)产品,质粒的提取试剂盒购自博大泰克生物技术有限工程。其余试剂均为国产分析纯。
仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器。所有引物序列均由擎科生工公司合成。本发明实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1:蜜环菌抗生素筛选
培养基为PDA:马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、加水定容到1000mL。在PDA平板中分别加入氨苄霉素Amp、卡那霉素Km、状观霉素Spe、潮霉素Hyg,浓度分别为:0 µg/mL(Ck)、50 µg/mL、100 µg/mL 150 µg/mL、200 µg/mL、250 µg/mL培养5天后拍照观察蜜环菌的生长情况如图1,结果显示蜜环菌能够在所有梯度浓度Amp,Km和Spe抗生素上生长,但不能在含有潮霉素的培养基上生长。
实施例2:蜜环菌的固体培养基和液体培养基上的培养
将蜜环菌株接种于斜面培养基PDA中,在26-27℃下培养10天左右,待菌丝体布满斜面后(图2A),转接于液体培养基中,静置2天,在摇床振荡培养5天,菌球长好后(图2B)4℃保存备用。从固体培养基中看到单菌落菌丝,挑取菌丝到液体培养基后出现了菌球布满液体培养基。
实施例3:表达载体pH2GW7-35S-EGFP转化农杆菌
目的基因序列EGFP(如SEQ ID NO:1);分别用XhoI和BamHI酶将纯化的pENTR*-2B和pMD18-T-EGFP质粒切开,通过琼脂糖凝胶电泳分离已切开的载体和插入片段,回收pENTR*-2B被切割后产生的载体片断pENTR*(3.8kb)及pMD18-T-EGFP被切割产生的DNA片断EGFP(0.717kb),然后用宝生物(TaKaRa)的连接酶试剂盒连接pENTR*和EGFP产生中间载体pENTR*-T-EGFP;用连接反应混合物转化高效率(108)的大肠杆菌感受态细胞(DH5α天根生化科技),把转化好的大肠杆菌涂于加有卡那霉素(Km,50μg/ml)的平板上,于37℃过夜培养,筛选Km抗性重组子菌落,从Km抗性重组子菌落中提取质粒,用XhoI和BamHI双酶切检测。为了检测选出的重组质粒是否连接有正确的目的条带EGFP,以EGFP序列为模板,根据EGFP基因序列设计一对(EGFP-F 5'-GGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3'和EGFP-R 5'-CTCGAGTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3')特异性引物(由擎科生工公司合成)。用EGFP上下游的特异性引物进行PCR(扩增条件:反应条件为:94℃预变性3min,94℃变性30s,57℃解链30s,72℃延伸45s;20个循环;72℃再延伸10min);再电泳检测,同时拿到擎科生工公司测序。筛选出带有目的条带的载体质粒通过Gateway技术的LR反应把pENTR*-T-GFP亚克隆到植物表达载体pH2GW7,0(Gateway的目的载体,比利时VIB/Gent公司)上。把转化好的大肠杆菌涂于加有状观霉素(Spe,100μg/mL)的平板上,于37℃过夜培养,筛选Spe抗性重组子菌落,从抗性重组子菌落中提取质粒,用XhoI和BamHI双酶切检测;然后拿到擎科生工去测序。
取少量(0.2-0.3μl) 已经构建成功的载体质粒加入农杆菌感受态细胞ClC58(pPMP90)中,轻轻混匀;将混合物加入到冰上预冷的电转杯中,轻轻敲击杯身使混和液至杯底;将电转化杯置于电转化仪滑槽中,按“Pulse”电击后,立即取出电转化杯,迅速加入0.5mLSOC培养基,混匀,转移到1.5mL的离心管中;28℃、200rpm摇床培养3-5h;室温下,7500rpm离心1min,弃其上清至100μl将细胞悬浮;将细菌涂布带有抗生素(Spe)的LB固体培养基上,28℃培养1.5-2天即可见菌落。挑取单菌落到液体LB培养中培养过夜提取质粒(酶切检测如图3)并保存菌种。图3可以说明4-6,8-9质粒酶切后与1和2同时出现了750bp左右的条带,而与阴性对照则不同,可能成功连接了GFP基因。拿到公司去测序发现连接的目的条带与EGFP序列完全相同。因此说明带有目的基因的表达载体已经成功的转入了农杆菌中。
实施例4:用含有pH2GW7-T-EGFP表达载体的农杆菌介导蜜环菌遗传转化及检测
将菌丝培养物用均质仪打碎,分装,静置避光培养4d;将培养好的菌丝再次用均质仪打碎,4000rmp、离心10min,去上清。沉淀悬浮后4℃放置一夜。将农杆菌接种于LB固体培养基中(含Hyg,100μg/mL),28℃培养2d;挑取携带pH2GW7-35S-EGFP质粒的农杆菌单菌落接种于50mL的LB培养基中,180rpm,28℃培养24h,待菌液OD600至1.0左右,离心10min(3000rpm),沉淀菌体,重悬于5 mL诱导培养基 (添加As200 μmol/L)中,28℃,200r/min培养至OD600=1.0~1.2;活化的农杆菌要立即用于转化;将打碎的菌丝悬浮液与农杆菌菌液(1:1)混匀,低速离心去上清,剩余的部分涂布在含有PDA(含潮霉素100μg/mL)培养基上;28℃,避光培养13d;取平板中长成的菌丝在显微镜紫外观察(如图4);提取转化子的基因组DNA,PCR鉴定转化子(如图5)。提取野生对照组与转基因蜜环菌的基因组DNA,用EGFP的上下游特异性引物进行PCR扩增,对照组没有条带出现,而转基因实验组只有一条750bp大小的条带出现。而且显微镜观察抗潮霉素的蜜环菌菌丝发现有一条青白色的荧光出现,因此可以认为转化子已经成功转入到蜜环菌细胞中。
序列表
<110> 昆明理工大学
<120> 蜜环菌筛选标记及构建转基因菌株的方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 1
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaag 717
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 2
ggatccatgg tgagcaaggg cgagg 25
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 3
ctcgagttac ttgtacagct cgtccatgcc 30
Claims (2)
1.潮霉素在作为蜜环菌筛选标记中的应用。
2.一种构建转基因蜜环菌菌株的方法,其特征在于:将带有EGFP基因的真核表达载体pH2GW7-35S-EGFP通过农杆菌介导法转入到蜜环菌体内,将转染后的菌丝体在含有筛选标记潮霉素的PDA固体培养中培养,得到抗潮霉素的转基因蜜环菌。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201711018674.4A CN107988247A (zh) | 2017-10-27 | 2017-10-27 | 蜜环菌筛选标记及构建转基因菌株的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201711018674.4A CN107988247A (zh) | 2017-10-27 | 2017-10-27 | 蜜环菌筛选标记及构建转基因菌株的方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN107988247A true CN107988247A (zh) | 2018-05-04 |
Family
ID=62030044
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201711018674.4A Pending CN107988247A (zh) | 2017-10-27 | 2017-10-27 | 蜜环菌筛选标记及构建转基因菌株的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN107988247A (zh) |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110305855A (zh) * | 2019-06-26 | 2019-10-08 | 昆明理工大学 | 天麻GeCPR基因及其应用 |
CN111763663A (zh) * | 2020-07-09 | 2020-10-13 | 昆明理工大学 | 一种天麻葡糖基转移酶基因及应用 |
CN113403202A (zh) * | 2021-05-28 | 2021-09-17 | 重庆市中药研究院 | 一种快速选育天麻蜜环菌的方法 |
CN113416652A (zh) * | 2021-06-25 | 2021-09-21 | 昆明理工大学 | 一株天麻种子萌发菌及其应用 |
CN113528551A (zh) * | 2021-08-03 | 2021-10-22 | 昆明理工大学 | 一种天麻超氧化物歧化酶基因及其应用 |
CN116377112A (zh) * | 2023-03-24 | 2023-07-04 | 中国科学院昆明植物研究所 | 十二种弱寄生蜜环菌通用多态性微卫星分子标记及其引物与应用 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0177243B1 (en) * | 1984-09-27 | 1992-11-11 | Eli Lilly And Company | Method for transforming a cephalosporium cell |
-
2017
- 2017-10-27 CN CN201711018674.4A patent/CN107988247A/zh active Pending
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0177243B1 (en) * | 1984-09-27 | 1992-11-11 | Eli Lilly And Company | Method for transforming a cephalosporium cell |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
KENDRA BAUMGARTNER 等: "Agrobacterium tumefaciens-Mediated Transformation for Investigation of Somatic Recombination in the Fungal Pathogen Armillaria mellea", 《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》 * |
Cited By (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110305855A (zh) * | 2019-06-26 | 2019-10-08 | 昆明理工大学 | 天麻GeCPR基因及其应用 |
CN111763663A (zh) * | 2020-07-09 | 2020-10-13 | 昆明理工大学 | 一种天麻葡糖基转移酶基因及应用 |
CN111763663B (zh) * | 2020-07-09 | 2022-04-15 | 昆明理工大学 | 一种天麻葡糖基转移酶基因及应用 |
CN113403202A (zh) * | 2021-05-28 | 2021-09-17 | 重庆市中药研究院 | 一种快速选育天麻蜜环菌的方法 |
CN113403202B (zh) * | 2021-05-28 | 2023-04-07 | 重庆市中药研究院 | 一种快速选育天麻蜜环菌的方法 |
CN113416652A (zh) * | 2021-06-25 | 2021-09-21 | 昆明理工大学 | 一株天麻种子萌发菌及其应用 |
CN113416652B (zh) * | 2021-06-25 | 2023-05-02 | 昆明理工大学 | 一株天麻种子萌发菌及其应用 |
CN113528551A (zh) * | 2021-08-03 | 2021-10-22 | 昆明理工大学 | 一种天麻超氧化物歧化酶基因及其应用 |
CN113528551B (zh) * | 2021-08-03 | 2023-03-24 | 昆明理工大学 | 一种天麻超氧化物歧化酶基因及其应用 |
CN116377112A (zh) * | 2023-03-24 | 2023-07-04 | 中国科学院昆明植物研究所 | 十二种弱寄生蜜环菌通用多态性微卫星分子标记及其引物与应用 |
CN116377112B (zh) * | 2023-03-24 | 2024-03-15 | 中国科学院昆明植物研究所 | 十二种弱寄生蜜环菌通用多态性微卫星分子标记及其引物与应用 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN107988247A (zh) | 蜜环菌筛选标记及构建转基因菌株的方法 | |
CN113621631A (zh) | 一种甲羟戊酸激酶基因rkmk及其应用 | |
CN105039183B (zh) | 一种埃德菌fs110原生质体及其制备方法和转化方法 | |
CN110607247B (zh) | 一种提高酿酒酵母合成角鲨烯能力的方法 | |
CN112280698B (zh) | 高产雅槛蓝醇型倍半萜的酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用 | |
CN114106130B (zh) | 一种紫心甘薯花色素苷合成调控因子IbJOX4及其应用 | |
CN114133438A (zh) | 一种紫心甘薯花色素苷合成调控因子IbEIN3-2及其应用 | |
CN114058525A (zh) | 一种高产角鲨烯基因工程菌及其构建方法与应用 | |
CN114574518B (zh) | 一种促进豆科作物结瘤尤其是耐盐结瘤的方法 | |
CN112899210B (zh) | 增强正调控蛋白基因表达以提高井冈霉素发酵水平的方法 | |
CN114014918A (zh) | 上游调控因子IbEBF2及其在调控紫心甘薯IbbHLH2表达中的应用 | |
CN107164382A (zh) | 一种受光或生长素诱导的启动子hlp3 | |
CN108456703A (zh) | 一种异源表达埃博霉素的方法 | |
CN110541000B (zh) | 一种磁性纳米颗粒介导的转抗菌肽小球藻的获得方法 | |
CN109810978A (zh) | 一种培育高结瘤/固氮转基因植物的方法 | |
CN113881688A (zh) | 上游调控因子IbERF1及其在调控紫心甘薯IbMYB1表达中的应用 | |
CN112481264B (zh) | 启动子GmLCLa1在调控基因响应脱落酸处理和水分胁迫中的应用 | |
CN114134158A (zh) | 一种紫心甘薯IbDRM基因及其应用 | |
CN102884187A (zh) | 包含啶南平生物合成基因簇和标记基因的核酸构建体 | |
CN109735561A (zh) | 一种高结瘤固氮植物的培育方法 | |
CN113025621B (zh) | Cipk14基因在提高木豆抗旱中的应用 | |
CN114561405B (zh) | 木霉菌Harzianolide的合成基因簇在制备提高植物灰霉病抗性制剂中的应用 | |
CN114316005B (zh) | 上游调控因子IbWRKY1及其在调控紫心甘薯IbMYB1表达中的应用 | |
CN107267513A (zh) | 一种受病原菌诱导的启动子hlp2 | |
CN109536395A (zh) | 一种高表达β-甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌株及应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20180504 |
|
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |