CN109810978A

CN109810978A - 一种培育高结瘤/固氮转基因植物的方法

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Publication number: CN109810978A
Application number: CN201910231973.9A
Authority: CN
Inventors: 王志娟; 任仔银; 李霞
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2019-03-26
Filing date: 2019-03-26
Publication date: 2019-05-28
Anticipated expiration: 2039-03-26
Also published as: CN109810978B

Abstract

本发明公开了一种培育高结瘤/固氮转基因植物的方法，利用人工miRNAi载体特异性下调表达大豆的GmBTSa基因（基因号：Glyma.05G237500），培育出具有高结瘤/固氮能力的转基因植物。利用本发明构建的下调表达载体转化受体大豆植株获得转基因植物，能够显著提高大豆的结瘤/固氮能力，对提高大豆产量具有重大的意义。

Description

一种培育高结瘤/固氮转基因植物的方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种下调特异基因表达的生物工程技术及应用。

背景技术

大豆是重要的粮油经济作物，其通过根瘤可将空气中的氮气转化为可被植物吸收利用的氨态氮，从而为大豆生长发育提供了必需的氮素营养。由根瘤介导的共生固氮过程不仅影响着大豆的正常生长和产量，还有利于节约能源，减少环境污染。目前，提高共生固氮效率已成为提高大豆产量及保证农业可持续发展的重要途径之一。

在分子水平解析调控大豆根系结瘤及共生固氮发挥的机制为在生产上更合理高效地利用并发挥共生固氮过程的效能奠定了重要基础。尽管此前在大豆中克隆并证明了miR172c-NNC1、miR167c-GmARF8、miR393-GmTIR1/AFB2等模块参与调控大豆的根系结瘤及共生固氮（Wang et al., 2014, 2015; Cai et al., 2017），但仍然需要大力挖掘与大豆共生固氮有关的更多的元件或功能基因，从而可为在生产上更为充分地利用该“绿色”氮素营养供给方式提供数据支持。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种基于人工miRNAi 技术下调特异基因表达从而培育高结瘤/固氮转基因植物的方法。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。

一种培育高结瘤/固氮转基因植物的方法，利用人工miRNAi 载体特异性下调表达植物的 Glyma.05G237500基因或其同源基因，培育具有高结瘤/固氮能力的转基因植物。

作为本发明的一种优选技术方案，该方法包含如下步骤：

A、根据目的基因的序列并考虑miRNA的特异性及其载体，设计如下4条引物用作人工miRNA茎环前体的离体PCR合成：

BTSa I miR-s gaTTTGTCGGACATATGCGTCATtctctcttttgtattcc SEQ ID NO：1；

BTSa II miR-a gaATGACGCATATGTCCGACAAAtcaaagagaatcaatga SEQ ID NO：2；

BTSa III miR*s gaATAACGCATATGTGCGACAATtcacaggtcgtgatatg SEQ ID NO：3；

BTSa IV miR*a gaATTGTCGCACATATGCGTTATtctacatatatattcct SEQ ID NO：4；

进一步设计PEGAD-PA和PEGAD-PB用来扩增最终序列：

PEGAD-PA: GCAGCGGCCGAATTCCCCGGGctgcaaggcgattaagttgggtaac SEQ ID NO：5

PEGAD-PB:GTTATCTAGATCCGGTGGATCCgcggataacaatttcacacaggaaacag SEQ ID NO：6

PEGAD-PA和PEGAD-PB带有载体PEGAD的重组接头，分别含有SmaI和BamHI酶切位点；

B、通过搭桥PCR的方法，将骨架上pre-miRNA的miRNA和miRNA*置换为设计好的序列；以pRS300质粒为模板，分别用引物A和IV，III和II，I和B进行PCR反应，再以三次PCR的产物混合液为模板，用引物PEGAD-PA和PEGAD-PB进行扩增得到修改后的miRNA序列；

反应	上游引物	下游引物	模板
				a	A	IV	pRS300
b	III	II	pRS300
				c	I	B	pRS300
d	A	B	a+b+c

其中，反应a，b，c扩增程序为：98 ℃ 5 min；98 ℃ 30 sec，56 ℃ 30 sec，68 ℃ 15sec，25个循环；72 ℃ 10 min；反应d扩增程序为：98 ℃ 5 min；98 ℃ 30 sec，56 ℃ 30sec，68 ℃ 30 sec，25个循环；72 ℃ 10 min；

C、通过同源重组的方法将反应d的回收产物连接到PEGAD载体上；用SmaI和BamHI限制性内切酶酶切PEGAD载体获得线性化的载体，用同源重组酶将人工miRNA序列重组到PEGAD载体上；然后将重组产物热激转化到大肠杆菌DH5α感受态中，37℃过夜培养，挑取阳性克隆进行测序，得到重组质粒人工miRNA-PEGAD；

D、通过农杆菌K599介导的毛状根转化法转化目的植物，筛选得到与正常植物相比具有高结瘤/固氮能力的转基因植物。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤D包含如下步骤：D-1、采用液氮冻溶法转化农杆菌，具体操作为：a. 取出冻存的200 μl感受态细胞，融化后加入5-10 μl质粒DNA，轻弹管壁混匀，冰上放20-30 min；b. 放入液氮中5 min后取出，将管转入37 ℃ 5 min 融化后，加入800 μl LB 无抗性液体培养基，28 ℃低速振荡 150 r/min 4-5 h；c. 4000 r/min，30sec, 去上清，加100 μl LB 液体培养基，悬浮菌体后涂板，含50 mg/ml 卡那霉素；d. 置28℃培养至白色转化子长出，用于毛状根的转化。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤D包含如下步骤：D-2、农杆菌K599介导的毛状根转化：取目的植物种子材料用氯气消毒10 h后，在B₅培养基上萌发5天，待子叶刚要张开时切下子叶，在子叶下端十字交叉切割，浸在活化的农杆菌K599中侵染30 min后，将外植体转至1/2 MS培养基，0.5×MURA SHIGE & SKOOG BASAL MEDIOM w/VITAMINS 上共培生长3天后，移栽入蛭石中，暗培3天后光照培养，移栽10天后接种根瘤菌USDA11030 mL/株，培养14天后统计根瘤数量，筛选转基因植物。

作为本发明的一种优选技术方案，所述目的植物为蝶形花科植物，尤其是大豆。

本发明还包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列在培育高结瘤/固氮转基因植物上的用途。

本发明还包含SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列在培育高结瘤/固氮转基因植物上的用途。

本发明还包含SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列在培育高结瘤/固氮转基因植物上的用途。

本发明还包含SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列在培育高结瘤/固氮转基因植物上的用途。

采用上述技术方案所产生的有益效果在于：本发明的理论研究和试验结果显示，利用本发明构建的下调表达载体转化受体大豆植株获得转基因植物，能够显著提高大豆的结瘤/固氮能力，对提高大豆产量具有重大的意义。

附图说明

图1为GmBTSa基因组织表达模式分析，检测接根瘤菌处理后28天的大豆实生苗中GmBTSa在不同组织中的表达情况，表明GmBTSa特异地在大豆根瘤中表达，说明GmBTSa基因可能参与调控大豆根瘤的发生和发育过程。

图2为下调表达GmBTSa后对大豆结瘤的表型分析，在完全相同的实验环境下，下调表达GmBTSa的转基因根同空载体转化的转基因根系（EV）相比，根瘤数量显著增多（图2A和2C），图2B为对转基因根系中GmBTSa的表达水平分析，结果显示在转基因根系中GmBTSa的表达显著下调，而转基因根系的根瘤数被显著上调。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置两次重复实验，结果取平均值。

本发明构建的下调表达载体能够下调表达大豆中的GmBTSa基因（基因号：Glyma.05G237500）。此基因定位在大豆5号染色体上，实时荧光定量PCR检测结果表明，GmBTSa基因特异地在大豆根瘤中表达；通过毛状根转化大豆苗的结瘤分析显示，下调表达GmBTSa可以显著促进大豆根系结瘤数目的增加，表明GmBTSa基因在大豆根瘤发生发育中具有重要的作用。

实施例1、GmBTSa基因组织表达模式分析。

1）材料获取：实验所用材料为威廉姆斯82（简称W82）；材料按照以下流程进行：大豆种子用70%的洒精灭菌30 sec，播种于低氮营养液浸泡的蛭石基质中，于培养室中培养，16 h光/8 h 暗，光强7000 LUX，温度26 ℃，相对湿度为70%。播种后10天，接种根瘤菌处理，每株接种慢生型根瘤菌USDA110菌液（OD₆₀₀=0.08）30 mL，接菌处理后用低氮营养液和蒸馏水交替浇灌大豆苗，培养期间没有生物和非生物胁迫，在接菌28天后分别取大豆的根、茎、叶、瘤组织用于RNA表达水平的检测.

2）mRNA的分离：采用Trizol法提取大豆总RNA。

①先将组织放入研磨中用液氮研磨3次，将研磨好的组织0.1-0.2 g加入1 mL离心管中然后加入1 mL TRI pure试剂，充分震荡，裂解产物应呈澄清的透明粘稠液体，室温放置5 min；

②加200 μL氯仿，振荡混匀，室温静置5 min，4 ℃，12000 r/min，离心15 min；③将上清移入另外一个离心管中，加入等体积异丙醇，振荡混匀，-20 ℃沉淀30 min，4 ℃，12000r/min，离心10 min；

④弃上清，用75%的乙醇（DEPC处理过的无菌水配制）洗，4 ℃，12000 r/min，离心10min，重复两次，室温风干10 min左右，加20 μl左右 DEPC处理过的RNase Free水（DEPC水）溶解沉淀；

3）反转录为cDNA：将提取的mRNA用TaKaRa反转录试剂盒，反转录为cDNA。

4）实时荧光定量PCR分析：采用TIANGEN公司的 SuperReal PreMix Plus（SYBRGreen）试剂盒，具体实验方法如下：在10 μl体系中加入上步所得cDNA模板0.3 μl、正反向引物各0.2 μl、2 x SuperReal PreMix Plus 5 μl、ddH₂O 4.3 μl；扩增程序为：95 ℃，15min；95 ℃，10 sec；60 ℃，34 sec，40 cycles；65 ℃，5 sec，95 ℃，5 sec；其中：

正向引物为：AAGTGCATCAGGTTGCT（SEQ ID NO：7）；

反向引物为：GCTAATACCGAGCAATGTC（SEQ ID NO：8）。

5）结果：如图1所示，接种根瘤菌28天后，GmBTSa基因特异地在根瘤中表达，在根、茎、叶中表达很低，该结果说明GmBTSa基因可能在大豆根瘤发生和发育中发挥功能。

实施例2、培育具有高结瘤固氮能力的转基因大豆。

1）构建人工miRNAi载体。

（1）依据GmBTSa基因选择特异性最佳的人工miRNA，选择miRNA载体为pRS300（MIR319a Arabidopsis thaliana），得到4条引物：

BTSa I miR-s gaTTTGTCGGACATATGCGTCATtctctcttttgtattcc （SEQ ID NO：1）；

BTSa II miR-a gaATGACGCATATGTCCGACAAAtcaaagagaatcaatga （SEQ ID NO：2）；

BTSa III miR*s gaATAACGCATATGTGCGACAATtcacaggtcgtgatatg （SEQ ID NO：3）；

BTSa IV miR*a gaATTGTCGCACATATGCGTTATtctacatatatattcct （SEQ ID NO：4）；

用作人工miRNA茎环前体的离体PCR合成；

PEGAD-PA: GCAGCGGCCGAATTCCCCGGGctgcaaggcgattaagttgggtaac （SEQ ID NO：5）

PEGAD-PB:GTTATCTAGATCCGGTGGATCCgcggataacaatttcacacaggaaacag（SEQ ID NO：6）

PEGAD-PA和PEGAD-PB用来扩增最终序列，带有载体PEGAD的重组接头，分别含有SmaI和BamHI酶切位点。

（2）通过搭桥PCR的方法，将骨架上pre-miRNA的miRNA和miRNA*置换为设计好的序列。以pRS300质粒为模板，分别用引物A和IV，III和II，I和B进行PCR反应，再以三次PCR的产物混合液为模板，用引物PEGAD-PA和PEGAD-PB进行扩增得到修改后的miRNA序列；

反应a，b，c扩增程序为：98 ℃ 5 min；98 ℃ 30 sec，56 ℃ 30 sec，68 ℃ 15 sec，25个循环；72 ℃ 10 min；反应d扩增程序为：98 ℃ 5 min；98 ℃ 30 sec，56 ℃ 30 sec，68℃ 30 sec，25个循环；72 ℃ 10 min。

（3）通过同源重组的方法将反应d的回收产物连接到PEGAD载体上；用SmaI和BamHI限制性内切酶酶切PEGAD载体获得线性化的载体，用同源重组酶将人工miRNA序列重组到PEGAD载体上。

（4）将步骤（3）的重组产物热激转化到大肠杆菌DH5α感受态中，37℃过夜培养，挑取阳性克隆进行测序，得到重组质粒人工miRNA-PEGAD。

2）农杆菌K599介导的毛状根转化。

（1）农杆菌的转化，采用液氮冻溶法转化农杆菌，具体操作为：

a. 取出冻存的200 μl感受态细胞，融化后加入5-10 μl质粒DNA，轻弹管壁混匀，冰上放20-30 min；

b. 放入液氮中5 min后取出，将管转入37 ℃（5 min）融化后，加入800 μl LB（无抗性）液体培养基，28 ℃低速振荡 (150 r/min) 4-5 h；

c. 4000 r/min，30 sec, 去上清，加100 μl LB 液体培养基，悬浮菌体后涂板（含50mg/ml 卡那霉素）；

d. 置28 ℃培养至白色转化子长出，用于毛状根的转化。

（2）农杆菌K599介导的毛状根转化。

以大豆品种W82为材料，取种子材料用氯气消毒10 h后，在B₅培养基（培养基配方：2％蔗糖，0.8 g琼脂粉（sigma），1×GAMBORG B-5 BASAL（Phyto TechnologyLaboratories，货号：G398），pH调至5.7）上萌发5天，待子叶刚要张开时切下子叶，在子叶下端十字交叉切割，浸在活化的农杆菌K599中侵染30 min（OD₆₀₀=0.6）后，将外植体转至1/2MS培养基（培养基配方：2％蔗糖，0.8 琼脂粉（sigma），0.5×MURA SHIGE & SKOOG BASALMEDIOM w/VITAMINS （Phyto Technology Laboratories，货号：G519），pH调至5.7）上共培生长3天后，移栽入蛭石中，暗培3天后光照培养，移栽10天后接种根瘤菌USDA110（OD₆₀₀=0.08）30 mL/株，培养14天后统计根瘤数量。

3）结果观察：结果如图2所示，表明在完全相同的实验环境下，下调表达GmBTSa的转基因根同空载体转化的转基因根系（EV）相比，根瘤数量显著增多（图2A和2 C），图2B为对转基因根系中GmBTSa的表达水平分析，结果显示在转基因根系中GmBTSa的表达显著下调，而根瘤数目显著增加。

上述描述仅作为本发明可实施的技术方案提出，不作为对其技术方案本身的单一限制条件。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种培育高结瘤/固氮转基因植物的方法

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> 大豆属大豆(Glycine max)

<400> 1

gatttgtcgg acatatgcgt cattctctct tttgtattcc 40

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213> 大豆属大豆(Glycine max)

<400> 2

gaatgacgca tatgtccgac aaatcaaaga gaatcaatga 40

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

gaataacgca tatgtgcgac aattcacagg tcgtgatatg 40

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

gaattgtcgc acatatgcgt tattctacat atatattcct 40

<210> 5

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

gcagcggccg aattccccgg gctgcaaggc gattaagttg ggtaac 46

<210> 6

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

gttatctaga tccggtggat ccgcggataa caatttcaca caggaaacag 50

<210> 7

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

aagtgcatca ggttgct 17

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

gctaataccg agcaatgtc 19

Claims

1.一种培育高结瘤/固氮转基因植物的方法，其特征在于：利用人工miRNAi 载体特异性下调表达植物的 Glyma.05G237500基因或其同源基因，培育具有高结瘤/固氮能力的转基因植物。

2.根据权利要求1所述的一种培育高结瘤/固氮转基因植物的方法，其特征在于：该方法包含如下步骤：

BTSa I miR-s gaTTTGTCGGACATATGCGTCATtctctcttttgtattcc SEQ ID NO：1；

BTSa II miR-a gaATGACGCATATGTCCGACAAAtcaaagagaatcaatga SEQ ID NO：2；

BTSa III miR*s gaATAACGCATATGTGCGACAATtcacaggtcgtgatatg SEQ ID NO：3；

BTSa IV miR*a gaATTGTCGCACATATGCGTTATtctacatatatattcct SEQ ID NO：4；

进一步设计PEGAD-PA和PEGAD-PB用来扩增最终序列：

PEGAD-PA: GCAGCGGCCGAATTCCCCGGGctgcaaggcgattaagttgggtaac SEQ ID NO：5

PEGAD-PB:GTTATCTAGATCCGGTGGATCCgcggataacaatttcacacaggaaacag SEQ ID NO：6

3.根据权利要求1所述的一种培育高结瘤/固氮转基因植物的方法，其特征在于：步骤D包含如下步骤：

D-1、采用液氮冻溶法转化农杆菌，具体操作为：a. 取出冻存的200 μl感受态细胞，融化后加入5-10 μl质粒DNA，轻弹管壁混匀，冰上放20-30 min；b. 放入液氮中5 min后取出，将管转入37 ℃ 5 min 融化后，加入800 μl LB 无抗性液体培养基，28 ℃低速振荡 150r/min 4-5 h；c. 4000 r/min，30 sec, 去上清，加100 μl LB 液体培养基，悬浮菌体后涂板，含50 mg/ml 卡那霉素；d. 置28 ℃培养至白色转化子长出，用于毛状根的转化；

D-2、农杆菌K599介导的毛状根转化：取目的植物种子材料用氯气消毒10 h后，在B₅培养基上萌发5天，待子叶刚要张开时切下子叶，在子叶下端十字交叉切割，浸在活化的农杆菌K599中侵染30 min后，将外植体转至1/2 MS培养基，0.5×MURA SHIGE & SKOOG BASALMEDIOM w/VITAMINS 上共培生长3天后，移栽入蛭石中，暗培3天后光照培养，移栽10天后接种根瘤菌USDA11030 mL/株，培养14天后统计根瘤数量，筛选转基因植物。

4.根据权利要求1所述的一种培育高结瘤/固氮转基因植物的方法，其特征在于：所述目的植物为蝶形花科植物。

5.根据权利要求1所述的一种培育高结瘤/固氮转基因植物的方法，其特征在于：所述目的植物为大豆。

6.权利要求1中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列在培育高结瘤/固氮转基因植物上的用途。

7.权利要求1中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列在培育高结瘤/固氮转基因植物上的用途。

8.权利要求1中SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列在培育高结瘤/固氮转基因植物上的用途。

9.权利要求1中SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列在培育高结瘤/固氮转基因植物上的用途。