CN115807009A

CN115807009A - 一种植物结瘤调控基因及其应用

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Publication number: CN115807009A
Application number: CN202310023959.6A
Authority: CN
Inventors: 王幼宁; 李霞; 王小迪; 陈宽
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2023-01-09
Filing date: 2023-01-09
Publication date: 2023-03-17
Anticipated expiration: 2043-01-09
Also published as: CN115807009B

Abstract

本发明提供了一种植物结瘤调控基因及其应用，属于基因工程技术领域。本发明提供的植物结瘤调控基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明将所述的植物结瘤调控基因转导入植物体内，令其过表达，可显著增加根瘤的结瘤数量和毛状根的生根数量，从而提高植物从土壤中汲取营养物质的能力，促进植物的生长发育。

Description

一种植物结瘤调控基因及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种植物结瘤调控基因及其应用。

背景技术

植物与微生物互作过程中的“断粮”或“供粮”的营养权衡是研究中的一大核心话题，其中，病原菌或共生菌侵染植物时大多需要以植物的光合产物糖类作为生存所需碳源，由此使得植物与微生物界面的糖分运输及再分配调控机制备受关注。糖转运蛋白主要负责将光合产物糖类运至各个“库”器官，其对植物抗病性及与有益菌的共生关系建立都有重要作用。目前对于植物与有益菌共生关系的建立主要集中于有益菌菌种、浓度等研究，对于植物本身的特性研究较少。

随着基因工程技术的发展和相关基因组测序工作的开展，功能性基因的分析是现阶段工作中的重点工作之一，可为植物有益菌，尤其是根瘤菌的侵染、根瘤形态建成提供理论基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种植物结瘤调控基因及其应用。本发明将所述的植物结瘤调控基因转导入植物体内，令其过表达，可显著增加根瘤的结瘤数量和毛状根的生根数量，从而提高植物从土壤中汲取营养物质的能力，促进植物的生长发育。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种植物结瘤调控基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了一种上述植物结瘤调控基因编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种重组载体，所述重组载体包含上述植物结瘤调控基因。

本发明还提供了一种重组菌，所述重组菌包含上述植物结瘤调控基因或上述重组载体。

本发明还提供了一种上述植物结瘤调控基因或上述蛋白质或上述重组载体或上述重组菌在调控植物生长中的应用。

优选的，所述调控植物生长的方法是将所述植物结瘤调控基因过表达增加根瘤的结瘤数量和毛状根的生根数量。

本发明还提供了一种上述植物结瘤调控基因的扩增用引物对，所述引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供了一种上述植物结瘤调控基因表达量的定量检测用引物对，所述引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

本发明提供了一种植物结瘤调控基因及其应用。本发明将所述的植物结瘤调控基因转导入植物体内，令其过表达，显著增加了根瘤的结瘤数量，并增加了毛状根的生根数量，可使植物从土壤中汲取营养物质的能力大大提高，促进植物生长发育，为研究植物增产等问题提供了新的理论基础。

附图说明

图1为对照组和实验组的大豆根部表型图；

图2为对照组和实验组的单条毛状根的结瘤数目；

图3为对照组和实验组的植物结瘤调控基因的相对表达量。

具体实施方式

在本发明中，SEQ ID NO.1的核苷酸序列为：

ATGGCAGAGACCCTTCGTATGGTTGTTGCTGTTATTGGGAATGTTGCCTCAGTGTCTCTTTATGCTGCACCAACGGTTACCTTCAAAAGGGTCATAAGGAAGAAAAGCACAGAGGAGTTTTCATGCATTCCTTACATCATAGCACTGCTGAATTGTCTCCTTTTCACTTGGTATGGATTGCCAGTAGTAAGCAACAAGTGGGAAAATTTCCCCCTTGTCACAGTTAATGGAGTTGGGATTCTTTTTGAGCTATCCTATGTTCTCATTTATTTCTGGTTTTCTACACCAAAAGGAAAGGTGAAGGTGGCCATGACAGCAGTACCAGTTCTTATAGTGTTCTGTGTGATTGCTGTTGTATCAGCTTTTGTCTTCCCGGATCATCGCCACCGGAAGCTTCTGGTGGGTAGCATAGGCTTGGGGGTGTCAATAGCAATGTATGCATCTCCTTTGGTTGTAATGAAGAAAGTGATACAAACCAAGAGTGTGGAATTCATGCCACTACCTTTATCTTTCTGCTCATTCTTGGCCAGTGTACTGTGGCTGACTTACGGACTCCTCATTCGGGACATTTTCGTAGCGGGGCCAAGTGTGATTGGAACACCCTTAGGCATACTTCAACTAGTTCTCCACTGCAAATACTGGAAGAGGAGAGTTACGGAAGAACCTACCAAGGTGGAATTGCAGAAGGGGAACAACGCAGAGAAATTGGACTTGGAAAATGGACATGGAAAAGAATGTGTCACAGTTCCTAGTAACTTCAACTCATGA。

在本发明中，SEQ ID NO.2的氨基酸序列为：

MAETLRMVVAVIGNVASVSLYAAPTVTFKRVIRKKSTEEFSCIPYIIALLNCLLFTWYGLPVVSNKWENFPLVTVNGVGILFELSYVLIYFWFSTPKGKVKVAMTAVPVLIVFCVIAVVSAFVFPDHRHRKLLVGSIGLGVSIAMYASPLVVMKKVIQTKSVEFMPLPLSFCSFLASVLWLTYGLLIRDIFVAGPSVIGTPLGILQLVLHCKYWKRRVTEEPTKVELQKGNNAEKLDLENGHGKECVTVPSNFNS。

在本发明中，所述重组载体的构建用表达载体优选包括pC3F质粒。

在本发明中，所述重组菌的基因工程菌优选包括大肠杆菌、农杆菌。

在本发明中，所述调控植物生长的方法优选是将所述植物结瘤调控基因过表达增加根瘤的结瘤数量和毛状根的生根数量。

在本发明中，SEQ ID NO.3的核苷酸序列为：

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCAATGGCAGAGACC CTTCGTATGG。

在本发明中，SEQ ID NO.4的核苷酸序列为：

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTGAGTTGAAGTTACT AGGAACTGTGACTGT。

在本发明中，SEQ ID NO.7的核苷酸序列为：

CGGATCATCGCCACCGG。

在本发明中，SEQ ID NO.8的核苷酸序列为：

CCCCGCTACGAAAATGTCC。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

1.载体构建

提取Williams 82大豆RNA，利用RNA专用逆转录酶(购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司)将其反转录为cDNA，将此cDNA作为模板，使用下述扩增用引物对进行扩增，得到扩增片段。

上游引物：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCAATGGCA GAGACCCTTCGTATGG(SEQID NO.3)；

下游引物：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTGAGTTGAAGTTACTAGGAACTGTGACTGT(SEQ ID NO.4)。

将扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳，将有目的片段的凝胶用刀子切下装入离心管，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(购自上海生工生物工程技术服务有限公司)回收PCR产物，将回收片段连接到pDonor207(购自武汉擎科生物技术有限公司)后转化大肠杆菌DH5α(购自武汉擎科生物技术有限公司)，PCR鉴定之后进行测序验证序列是否正确。

将测序正确的大肠杆菌中的质粒提取出来，利用同源重组交换的方法将目的片段连接到pC3F质粒载体上，转化大肠杆菌DH5α。将大肠杆菌DH5α中的带有目的片段的pC3F质粒和空载体pC3F质粒分别转化进入农杆菌K599(购自上海唯地生物技术有限公司)，鉴定正确后保存到-80℃超低温冰箱中待用。

2.基因转导

分别将带有目的片段的pC3F质粒和空载体pC3F质粒的农杆菌K599在50mL LB液体培养基(含50mg/mL卡那霉素、50mg/mL链霉素)中扩大培养，于28℃下、200rpm培养过夜。将培养后的菌液在4500rpm下离心10分钟，弃上清，用液体CCM共培养基重悬菌液至OD₆₀₀值为0.8。

用已灭菌的解剖刀从离子叶节0.5cm的下胚轴处切下萌发的大豆种子作为外植体，平均分为两组，分别为实验组和对照组，分别放入上述准备好的菌液中。实验组外植体放入带有目的片段的pC3F质粒的农杆菌菌液中，对照组外植体放入空载体pC3F质粒的农杆菌菌液中。将实验组和对照组外植体于室温下放置在80rpm的摇床上侵染一小时后，将外植体转移到固体CCM培养基上，在室温条件下，于黑暗中与农杆菌共培养三天。

将共培养后的实验组和对照组外植体移到事先用低氮营养液(0.127mM四水硝酸钙，0.51mM氯化钙，0.7348mM磷酸二氢钾，0.4187mM十二水合磷酸氢二钠，0.4869mM七水硫酸镁，0.1mM铁(II)七水硫酸钠，0.0997mM EDTA二钠盐，1mL/L微量元素(0.047mM硼酸，0.011mM一水硫酸锰，0.0007mM七水硫酸锌，0.003mM五水硫酸铜，0.00008mM二水钼酸钠))浸湿的土中并覆膜保湿，移土六天后取掉膜。

用TY液体培养基重悬根瘤菌(由中国农业大学陈文新院士实验团队馈赠)至菌液OD₆₀₀值为0.08，四天后(移土第十天)在外植体上接种根瘤菌，每个外植体根部周围接30mL根瘤菌液后培养。

3.结果统计

接种3天后，实验组和对照组的大豆根部如图1所示。对实验组和对照组的大豆单条毛状根分别取样，统计单条毛状根的结瘤数目，统计结果如图2所示。

将统计后的单条毛状根进行编号，随后将单条根分为两份材料，用于分别提取DNA与RNA，检测植物结瘤调控基因的相对表达量。具体操作如下：使用CTAB法)提取毛状根DNA，利用Bar引物检测DNA，引物对序列如下：

上游引物：CTACATCGAGACAAGCACGGTCAA(SEQ ID NO.5)；

下游引物：AGAAACCCACGTCATGCCAGTTC(SEQ ID NO.6)。

记下DNA阳性的毛状根所标记的序号，将该序号所对应的毛状根利用TRIpureReagent试剂(购自武汉擎科生物技术有限公司)进行RNA提取。将提好的RNA利用RNA专用逆转录酶将其反转录为cDNA；利用下述定量检测用引物进行qPCR检测，引物序列如下：

上游引物：CGGATCATCGCCACCGG(SEQ ID NO.7)；

下游引物：CCCCGCTACGAAAATGTCC(SEQ ID NO.8)。

统计实验组和对照组的基因相对表达量检测结果进行对比，对比结果如图3所示。

从图1～3可以看出，本发明的植物结瘤调控基因在实验组大豆中成功过表达，相对表达量显著高于对照组，过表达后的大豆毛状根根瘤数量明显高于对照组，且毛状根数量也明显高于对照组。表明，本发明的植物结瘤调控基因可通过在植物体内表达来增加植物根瘤数量，同时能够增加植物的毛状根的生根数量。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种植物结瘤调控基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种权利要求1所述的植物结瘤调控基因编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包含权利要求1所述的植物结瘤调控基因。

4.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌包含权利要求1所述的植物结瘤调控基因或权利要求3所述的重组载体。

5.一种权利要求1所述的植物结瘤调控基因或权利要求2所述的蛋白质或权利要求3所述的重组载体或权利要求4所述的重组菌在调控植物生长中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述调控植物生长的方法是将所述植物结瘤调控基因过表达增加根瘤的结瘤数量和毛状根的生根数量。

7.一种权利要求1所述的植物结瘤调控基因的扩增用引物对，其特征在于，所述引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

8.一种权利要求1所述的植物结瘤调控基因表达量的定量检测用引物对，其特征在于，所述引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，下游引物的核苷酸序列如SEQID NO.8所示。