CN111944030B

CN111944030B - 小麦抗逆性调控蛋白TaCOR58及其编码基因与应用

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Publication number: CN111944030B
Application number: CN202010865449.XA
Authority: CN
Inventors: 胡海燕; 于永昂; 茹振钢; 李成伟; 李红民
Original assignee: Henan Institute of Science and Technology
Current assignee: Henan Institute of Science and Technology
Priority date: 2020-08-25
Filing date: 2020-08-25
Publication date: 2022-03-15
Anticipated expiration: 2040-08-25
Also published as: CN111944030A

Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了小麦抗逆性调控蛋白TaCOR58及其编码基因与应用。本发明从小麦品种百农矮抗58中克隆得到一个新的COR基因，将其命名为TaCOR58，TaCOR58基因在干旱、低温、酸、碱等逆境胁迫下表达上调；本发明还构建了用于沉默小麦中TaCOR58基因的病毒诱导载体，降低TaCOR58基因的表达，得到沉默TaCOR58表达的小麦植株。通过实验证明：沉默TaCOR58的小麦抗旱性和抗冻性均明显提高。而且，本发明还构建了转TaCOR58基因拟南芥，对TaCOR58参与盐胁迫应答中的作用进行了分析，结果显示盐胁迫下转TaCOR58基因拟南芥比野生型更敏感。因此，TaCOR58基因及其编码蛋白在提高小麦抗逆性（抗旱性、抗寒、耐盐性等）的育种和研究中具有重要意义，可用于培育抗逆性植物品种。

Description

小麦抗逆性调控蛋白TaCOR58及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及小麦抗逆性调控蛋白TaCOR58及其编码基因与应用。

背景技术

我国1亿hm²耕地中大概有四分之三面积的耕地受到不同程度干旱、盐碱以及低温胁迫的影响，干旱、盐碱等胁迫已成为限制小麦产量的最重要因素之一(Mueller B,Seneviratne S.Hot days induced by precipitation deficits at the globalscale.Proceedings of the National Academy of Sciences,2012,109(31):12398-12403)。随着气候的变化、粮食需求量的增加和灌溉用水的日益减少，干旱和低温等环境问题变得越来越严重。怎样在水供应不足、气候剧变的情况下提高农业生产，将是未来育种工作的指导方向(乐章燕,廖荣伟,刘晶淼,等.水分胁迫对华北平原冬小麦地上部分及产量的影响.气象与环境学报,2014(6):120-124)。小麦是重要的世界性粮食作物，我国是世界小麦生产和消费大国，在世界小麦粮食产量中占有举足轻重位置。但是，干旱、盐碱、低温等非生物胁迫对我国小麦产量造成了巨大威胁。为有效应对这一挑战，创制抗逆新材料，培育抗逆新品种是基础。因此，发掘抗逆关键基因资源，利用基因工程、分子育种等手段，结合传统育种技术创制抗逆优异种质资源，培育高产、优质、多抗新品种，提高其广适性和耐逆水平将是未来小麦育种工作的一个基本方向。

植物对干旱胁迫的反应和适应是通过一系列的形态和生理生化上的变化而实现的。随着分子生物学的不断发展，从分子水平上研究植物抗旱逆也已取得较大发展。干旱、低温诱导基因编码的产物可分为两组：第一组包括在、低温胁迫耐性中发挥作用的功能性蛋白质，该类蛋白主要包括热激蛋白(heat shock proteins,HSPs)、渗透调节物质合成相关酶、胚胎发育晚期丰富(late embryogenesis abundant,LEA)蛋白、抗氧化酶(antioxidant enzymes)、糖类和脯氨酸转运蛋白等。第二组是调控蛋白，即参与信号转导和启动功能性蛋白表达的蛋白，主要包括转录因子、蛋白激酶、蛋白磷酸酶、参与磷脂和其他信号分子代谢的酶，如钙调素结合蛋白等。这些产物协同作用构成了植物应对非生物逆境胁迫时的基因调控网络。也有一些蛋白以多种方式发挥了负调控的作用，这些蛋白在小麦非生物逆境胁迫应答过程中可能是通过调控体内的生长平衡，进而调控小麦对逆境的耐受性。

本申请发明人所属课题组在研究小麦非生物胁迫抗性过程中，从pH诱导的小麦幼苗基因芯片中筛选到一个pH应答基因，在干旱、低温、酸、碱等逆境下表达诱导上调，该基因编码的蛋白与山羊草低温诱导的65kD类蛋白LTI65序列相似性达82.22％，与RD29(Modarresi M,Eyvazi A.Bioinformatical evaluation of desiccation-responsiverd29A gene in Arabidopsis thaliana.Pakistan Journal of Biological ences Pjbs，2014，7(1):80-5)COR蛋白同源，由于该基因是从具多逆境抗性的小麦品种百农矮抗58(李淦,董娜,胡海燕,李小利,张立琳,茹振钢.小麦苗期根系抗低温能力研究.河南农业科学,2012,3:21-25.)中分离的，因此，将其命名为TaCOR58，目前，对该基因的研究尚未见报道，是一个小麦的新基因。TaCOR58蛋白是由TaCOR58基因编码的一个478个氨基酸残基组成的亲水性蛋白，属于PLN03020蛋白家族，该家族蛋白最先在菠菜中发现又被命名为CAP160蛋白家族，该类蛋白在干旱胁迫或低温诱导下表达，在大麦(Hordeum vulgare)、玉米(Zeamays)、水稻(Oryza sativa)、节节麦(Aegilops tauschii)、高粱(Sorghum bicolor)等作物上均存在同源蛋白，但他们确切的功能尚不清楚。

发明内容

本发明的目的旨在提供一种植物抗逆性调控蛋白及其编码基因与应用。

本发明采用的技术方案如下：

本发明的第一目的是提供了一种植物抗逆性调控蛋白。

本发明提供的植物抗逆性调控蛋白来源于麦类小麦属(Triticum aestivum L.)，将其命名为TaCOR58，为如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：

a)氨基酸序列是SEQ ID NO.2所示的蛋白质；

b)在SEQ ID NO.2所示的蛋白质的N端和/或C段连接标签得到的融合蛋白质；

c)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

d)与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有85％或85％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。

其中，SEQ ID NO.2由478个氨基酸残基组成。

为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中SEQ ID NO.2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述c)中的蛋白质TaCOR58，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述c)中的蛋白质TaCOR58可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述c)中的蛋白质TaCOR58的编码基因可通过将序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

本发明的第二目的是提供了编码TaCOR58蛋白质的核酸分子。

所述核酸分子的编码序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第三目的是提供含有编码TaCOR58蛋白质的核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。

本发明的第四个目的是提供TaCOR58蛋白质或上述核酸分子或重组载体或表达盒或转基因细胞系或重组菌或重组病毒在调控植物抗逆性中的应用。

上述应用中，所述抗逆性包括抗旱性、耐盐性、耐酸性、耐碱性、抗寒性等非生物逆境。

上述应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物可以为拟南芥(Arabidopsis thaliana)、番茄(Solanum lycopersicum)等，所述单子叶植物可以为小麦(Triticum aestivum L.)、大麦(Hordeum vulgare L.)等。

本发明的第五个目的是提供TaCOR58蛋白质或上述核酸分子或重组载体或表达盒或转基因细胞系或重组菌或重组病毒在培育抗逆性改变的转基因植物中的应用。

上述应用中，所述抗逆性改变可为抗逆性提高，也可为抗逆性降低。

本发明的第六个目的是提供一种培育抗逆性提高的转基因植物的方法，包括抑制受体植物中上述蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的抗逆性高于所述受体植物。

根据上述的方法，所述抑制受体植物中上述蛋白质的表达量和/或活性的方法为：将抑制上述蛋白质表达的物质导入受体植物中，得到转基因植物，所述转基因植物的抗逆性高于所述受体植物。

根据上述的方法，所述抗逆性包括抗旱性、耐盐性、耐酸性、耐碱性、抗寒性等非生物逆境。

根据上述的方法，所述受体植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为拟南芥(Arabidopsisthaliana)番茄(Solanum lycopersicum)等，所述单子叶植物具体可为小麦(Triticum aestivum L.)、大麦(Hordeum vulgare L.)等。

本发明取得的积极有益效果为：

本发明从具多逆境抗性的小麦品种百农矮抗58中克隆得到COR类基因，将其命名为TaCOR58，TaCOR58基因在干旱、低温、酸、碱等逆境胁迫下表达上调；本发明还构建了用于沉默小麦中TaCOR58基因的病毒诱导载体，降低TaCOR58基因的表达，得到沉默TaCOR58小麦。本发明进一步通过实验证明：沉默TaCOR58小麦的抗旱性和抗冻性均明显提高；表明TaCOR58基因在小麦应对干旱和低温胁迫过程中具有负调控作用，通过沉默手段抑制小麦中的TaCOR58基因的表达，能够提高小麦的抗逆能力。而且，本发明构建TaCOR58基因表达载体并稳定转化col野生型拟南芥，对TaCOR58参与盐胁迫应答中的作用进行了分析，结果显示：盐胁迫下转TaCOR58基因拟南芥比野生型更敏感，表明该基因对耐盐性也具有负向调控作用。因此，TaCOR58基因及其编码蛋白在提高植物抗逆性(抗旱性、抗冻性、耐盐性等)的育种和研究中具有重要意义，可用于培育抗逆性植物品种。

附图说明

图1为干旱胁迫处理下TaCOR58的相对表达量结果图；

图2为低温胁迫处理下TaCOR58的相对表达量结果图；

图3为酸性胁迫处理下TaCOR58的相对表达量结果图；

图4为碱性胁迫处理下TaCOR58的相对表达量结果图；

图5为荧光定量检测TaCOR58基因在植株中的沉默效率(相对表达量)结果图；

图6为干旱胁迫下BSMV 0对照植株与BSMV-TaCOR58植株的表型结果图：A为干旱处理23天BSMV 0对照植株(复水前)的表型；B为干旱处理23天BSMV-TaCOR58植株(复水前)的表型；C为复水后36小时BSMV 0对照植株的表型；D为复水后36小时BSMV-TaCOR58植株的表型；

图7为低温胁迫下BSMV 0对照植株与BSMV-TaCOR58植株的表型结果图：每盆中左侧植株为对照株，右侧植株为沉默株；

图8为转TaCOR58基因拟南芥在盐胁迫下的表现：a为无NaCl对照组，即不采用盐胁迫处理；b为NaCl处理组。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例一：TaCOR58蛋白编码基因的克隆

1、cDNA的获得

取一叶一心期小麦品种百农矮抗58幼苗根系，按植物RNA提取试剂盒(TaKaRa)的说明书所示步骤提取小麦总RNA。将得到的RNA，以带polyT的引物进行反转录获得cDNA。

2、PCR扩增

以步骤1获得的cDNA为模板，采用正向引物TaCOR58-F和反向引物TaCOR58-R进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，引物序列如下：

TaCOR58-F：5’-ATGGACGCGCCGGCCCCCGACAG-3；

TaCOR58-R：5’-TCACATCACATTCGTGTTGGTC-3’。

上述PCR扩增反应条件：95℃1min；然后95℃15s，60℃15s，72℃2min，30个循环；最后72℃5min。

3、电泳和测序

将上述步骤2获得的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果表明，PCR扩增获得了约1.4kb的片段，并将PCR扩增产物连接到pMD-19T载体(TaKaRa)上用于测序，通过DNAman软件对测序结果进行拼接，结果显示，cDNA的核酸序列如SEQ ID NO.1所示，自5’端第1-1437为ORF，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，将其基因命名为TaCOR58。

实施例二：TaCOR58基因在不同逆境胁迫条件下的表达分析

1、TaCOR58基因在干旱胁迫条件下的表达分析：

(1)实验方法：

取小麦品种百农矮抗58的种子，在25℃下催芽三天后，将出芽的种子转移到Hogland营养液中，正常生长温度25/15℃，光照周期16/8h(白天/晚上)水培两周后，从营养液中取出小麦幼苗，用滤纸包裹小麦根系垂直放置在支架上，进行直接缺水干旱胁迫处理，分别取处理0、2、6、12、24h的小麦幼苗的根部材料于液氮中速冻，每个时间点三个生物学重复。

将上述的根部材料样品分别进行研磨，提取总RNA，进行反转录，获得cDNA，以该cDNA为模板，以正向引物qTaCOR58-1和反向引物qTaCOR58-2扩增TaCOR58基因片段，以actin-F和actin-R内参引物扩增内参actin基因片段进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)，分析TaCOR58基因的表达情况。

其中，扩增TaCOR58基因片段的正向引物qTaCOR58-1和反向引物qTaCOR58R-2的核苷酸序列如下：

qTaCOR58-1:5’-CGGTTCTACAGGTGTTCG-3’；

qTaCOR58-2:5'-CAGACGAAGAAACATCGAGT-3'。

扩增actin内参基因的引物对的核苷酸序列如下：

actin-F:5’-TCCAATCTATGAGGGATACACGC-3’；

actin-R:5’-TCTTCATTAGATTATCCGTGAGGTC-3’。

(2)实验结果：

小麦在干旱胁迫下TaCOR58基因的表达结果如图1所示。由图1可知，干旱胁迫处理下TaCOR58被诱导表达，且随着处理时间的延长，表达量不断升高，表明TaCOR58参与了小麦应答干旱胁迫的过程中。

2、TaCOR58基因在低温胁迫条件下的表达分析：

(1)实验方法：

取小麦品种百农矮抗58的种子，播种在含有营养土的营养钵中，正常生长温度25/15℃，光照周期16/8h(白天/晚上)培养至2叶一心期，采用0℃低温胁迫处理小麦幼苗，分别取处理0、6、12、24、48h的小麦幼苗的根系材料于液氮中速冻，每个时间点三个生物学重复。

将上述的根部材料样品分别进行研磨，提取总RNA，进行反转录，获得cDNA，以该cDNA为模板，以正向引物qTaCOR58-1和反向引物qTaCOR58-2扩增TaCOR58基因片段，以actin-F和actin-R内参引物扩增内参actin基因片段进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)，分析TaCOR58基因的表达情况。其中，引物qTaCOR58-1、qTaCOR58R-2、actin-F和actin-R的核苷酸序列与步骤1相同，在次不再赘述。

(2)实验结果：

小麦在低温胁迫下TaCOR58基因的表达结果如图2所示。由图2可知，低温胁迫6h开始TaCOR58基因被诱导表达，24h达到最大表达量，48h仍被诱导表达，表明TaCOR58基因参与了小麦低温胁迫应答过程中。

3、TaCOR58基因在酸胁迫条件下的表达分析：

(1)实验方法：

取小麦品种百农矮抗58的种子，在25℃下催芽三天后，将出芽的种子转移到Hogland营养液(pH6.5)中，正常生长温度25/15℃，光照周期16/8h(白天/晚上)水培两周，然后换用的pH4.0的营养液进行酸胁迫处理，分别取处理0、2、6、12、24h的小麦幼苗的根部材料于液氮中速冻，每个时间点三个生物学重复。

(2)实验结果：

小麦在酸胁迫下TaCOR58基因的表达结果如图3所示。由图3可知，酸胁迫2h，TaCOR58基因被诱导表达，12h表达量达最高，之后有所下降，表明TaCOR58参与了酸胁迫早期快速应答过程。

4、TaCOR58基因在碱胁迫条件下的表达分析：

(1)实验方法：

取小麦品种百农矮抗58的种子，在25℃下催芽三天后，将出芽的种子转移到Hogland营养液(pH6.5)中，正常生长温度25/15℃，光照周期16/8h(白天/晚上)水培两周，然后换用的pH10.0的营养液进行碱胁迫处理，分别取处理0、2、6、12、24h的小麦幼苗的根部材料于液氮中速冻，每个时间点三个生物学重复。

(2)实验结果：

小麦在碱胁迫下TaCOR58基因的表达结果如图4所示。由图4可知，碱胁迫2h，TaCOR58基因被诱导表达，6h表达量达最高，之后有所下降，表明TaCOR58参与了碱胁迫早期快速应答过程。

以上实验结果表明，在干旱、低温、酸、碱等非生物胁迫下，TaCOR58基因在小麦根中明显被诱导表达，其表达量明显上调，说明TaCOR58基因可快速响应干旱、低温、酸、碱等非生物胁迫。

实施例三：沉默TaCOR58小麦的获得

1、基因沉默片段的获得：

以TaCOR58基因的cDNA(SEQ ID NO.1)作为模板，采用引物对BSMV-TaCOR58F和BSMV-TaCOR58R进行PCR扩增，得到大小为379bp的片段，该片段对应TaCOR58基因序列SEQID NO.1自5’端第1到第379位核苷酸，将其记作TaCOR58(VIGS)，用于构建VIGS沉默载体。

其中，上述引物对BSMV-TaCOR58F和BSMV-TaCOR58R的核苷酸序列如下：

BSMV-TaCOR58F:5’-GCTAGCTGAGCGGCCGCCAAGGTCACCAAGCCGCAC-3’；

BSMV-TaCOR58R:5’-AGCTAGCTGATTAATTAAATGGACGCGCCGGCCCCCGA-3’。

2、基因沉默载体的构建

按照常规分子生物学方法，采用Not I和Pac I对BSMV-VIGS病毒载体γ进行酶切，然后通过无缝克隆技术将上述步骤1获得的沉默片段TaCOR58(VIGS)反向插入BSMV-VIGS病毒载体γ的Not I和Pac I酶切位点间，且保持BSMV-VIGS病毒载体γ的其他序列不变，得到重组载体γ-TaCOR58。

3、BSMV-VIGS载体系统

BSMV-VIGS病毒载体α、β和γ载体共同构成病毒载体系统BSMV:00。

BSMV-VIGS病毒载体α、β和重组载体γ-TaCOR58共同构成可沉默TaCOR58基因的病毒沉默载体系统BSMV:TaCOR58。

4、BSMV体外转录

(1)载体的线性化：

用MluⅠ酶切BSMV病毒载体α链、γ链、重组载体γ-TaCOR58，用SpeⅠ酶切BSMV病毒载体β链，分别得到线性化质粒。

(2)以上述步骤(1)获得的线性化质粒为模板进行体外转录，分别得到体外转录的BSMV病毒载体α、β、γ、γ-TaCOR58。体外转录反应按照试剂盒mMESSAGE mMACHINE^TM T7Transcription Kit(品牌：invitrogen；货号：AM1344)说明书进行操作。转录反应体系和条件分别是：反应总体系20.0μL，包括线性化质粒6μL，10X Reaction Buffer 2μL，2X NTP/CAP 10μL，Enzyme Mix 2μL，37℃反应2h，转录产物放至-80℃保存备用。

5、BSMV接种

挑选生长旺盛的一叶一心期百农矮抗58小麦植株，取8-10μl BSMV:TaCOR58重组病毒载体溶液，通过机械摩擦法将BSMV:TaCOR58重组病毒载体溶液接种到一叶一心期小麦的第二片叶；接种完毕后用喷壶在塑料袋内壁喷上少量DEPC水，将整个塑料袋套在接种植株的培养盆外，然后放置在23℃左右的黑暗生长室内，24小时后揭去塑料袋，植株转为正常培养条件生长，生长温度控制在20℃-28℃，得到转BSMV:TaCOR58植株(即为沉默TaCOR58基因的小麦植株，记作BSMV-TaCOR58植株)。同时，部分植株接种BSMV:00病毒载体溶液，得到转BSMV:00空载对照植株，记作BSMV0对照植株。

上述BSMV:TaCOR58重组病毒载体溶液是将体外转录产物按照1μLα、1μLβ、1μLγ-TaCOR58和22μL FES Buffer的比例混合得到的溶液。所述FES Buffer是按照文献(PogueGP,Lindbo J A,Dawson W O,Turpen T H.Tobamovirus transient expression vectors:tools for plant biology and high-level expression of foreign proteins inplants.Plant Molecular Biology Manual，1998,L4:1-27)记载的方法制备而成。

上述BSMV:00重组病毒载体溶液是将体外转录产物按照1μLα、1μLβ、1μLγ和22μLFES Buffer的比例混合得到的溶液。

4、沉默TaCOR58小麦株系的鉴定

通过RT-PCR检测转BSMV:TaCOR58植株(BSMV-TaCOR58植株)和BSMV0对照植株中TaCOR58基因沉默的情况。具体方法如下：

分别提取上述BSMV-TaCOR58植株和BSMV0对照植株中病毒接种后的株系叶片总RNA，反转录获得cDNA。以获得cDNA为模板，通过定量PCR检测TaCOR58基因的相对表达量。设置actin为内参基因，相对表达量通过^－ΔΔCT法计算得到。

检测TaCOR58基因的相对表达量的定量PCR引物对的核苷酸序列如下：

qTaCOR58-F:5’-CCACGGAGTACGGCAAGAAG-3’

qTaCOR58-R:5’-CACATTCGTGTTGGTCCTTGG-3’。

检测actin内参基因的引物对的核苷酸序列如下：

actin-F:5’-TCCAATCTATGAGGGATACACGC-3’

actin-R:5’-TCTTCATTAGATTATCCGTGAGGTC-3’。

TaCOR58基因的相对表达量结果如图5所示。由图5可以看出，与BSMV0对照植株相比，BSMV-TaCOR58植株中TaCOR58基因的表达量显著降低，说明BSMV-TaCOR58植株中TaCOR58基因的表达被明显抑制，达到了基因沉默的效果。

实施例四：沉默TaCOR58小麦的抗逆性分析：

1、沉默TaCOR58小麦的抗旱性分析：

将有效沉默了TaCOR58基因的BSMV-TaCOR58植株、BSMV0对照植株放在同一个托盘中培养，正常生长温度25/15℃，光照周期16/8h(白天/晚上)，通过不浇水进行干旱缺水处理，在处理23d后，植株出现枯干枯萎蔫情况，然后进行复水处理，复水36h后进行记录和统计。

植株复水36h后的表型照片如图6所示。由图6可知，沉默了TaCOR58基因的BSMV-TaCOR58植株复水36h后返绿，而BSMV0对照植株并无返绿现象。进一步对复水36h后的BSMV-TaCOR58植株、BSMV0对照植株复活率进行统计，发现BSMV-TaCOR58植株的复活率为100％，BSMV0对照植株复活率仅为16.7％，三次重复试验的结果一致。由此说明，沉默TaCOR58基因的小麦植株的抗旱性能明显提高。

2、沉默TaCOR58小麦的抗冻性分析：

将有效沉默了TaCOR58基因的BSMV-TaCOR58植株、BSMV0对照植株盆栽一个培养钵中，放在同一个托盘中培养，正常生长温度25/15℃，光照周期16/8h(白天/晚上)，在共培养15d，-18℃低温胁迫处理4h，然后恢复到正常生长条件，5d后记录BSMV-TaCOR58植株、BSMV0对照植株的表型照片，并统计BSMV-TaCOR58植株、BSMV0对照植株的成苗率。

恢复到正常生长条件5d后的小苗植株的表型照片如图7所示。由图7可知，沉默了TaCOR58基因的BSMV-TaCOR58植株恢复正常生长条件后大部分可成活，而大部分的BSMV0对照植株已枯死。进一步对恢复到正常生长条件5d的小苗植株成活率进行统计，发现BSMV-TaCOR58植株的成活率为81.25％，BSMV0对照植株复活率仅为16.7％，三次重复试验的结果一致。由此说明，沉默TaCOR58基因后小麦幼苗的抗冻性增强。

3、转基因拟南芥的耐盐性分析：

以TaCOR58的cDNA(SEQ ID NO.1)为模板，以TaCOR58-OEF和TaCOR58-OER为引物，扩增转基因ORF序列。用BamH I和Xba I双酶切pCAMBIA-1301质粒，将酶切液和扩增到的目的片段经琼脂糖凝胶电泳后回收，后用无缝连接试剂盒连接，再将连接液转化大肠杆菌感受态细胞，涂布于含kan的LB平板上。挑取菌斑做菌落PCR验证，将验证正确的菌落摇菌提质粒并进一步做双酶切验证，将验证正确的质粒送测序做更进一步验证。重组质粒记为pOE-TaCOR58。其中，引物TaCOR58-OEF和TaCOR58-OER的核苷酸序列如下：

TaCOR58-OEF：5’-GAGAACACGGGGGACTCTAGAATGGACGCGCCGGCCCCCGAC-3’；

TaCOR58-OER:5’-GAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCACATCACATTCGTGTTGG-3’。

采用花序侵染法转化拟南芥。将构建好的载体pOE-TaCOR58转化农杆菌感受态GV3101，挑取菌斑做菌落PCR验证。将验证正确的菌落摇菌(卡那、利福平抗性液体LB)，待摇至OD600至1.2时，4500rmp，28℃离心5min收集菌液沉淀，后用拟南芥侵染液重悬沉淀，调OD600至1.5。将拟南芥未开放的花序浸入重悬的农杆菌中2min，后将拟南芥水平放置于暗处24h，将植株放在正常光照温度下生长至果荚成熟，收取种子，利用潮霉素MS平板筛选阳性株，阳性株即为TaCOR58转基因拟南芥株系。

分别对转TaCOR58基因拟南芥植株和野生型拟南芥植株进行盐胁迫，盐胁迫的具体操作为：将获得转基因拟南芥和野生型拟南芥种子点播于同一含100mM NaCl的MS平板中，同时点播于对照(无NaCl)平板中，竖直放在培养架上培养，生长温度为25℃，光照周期14/10h(白天/晚上)，培养10d左右观察生长情况并拍照。

盐胁迫的实验结果如图8所示。由图8可知，与野生型拟南芥植株相比，在100mM的NaCl胁迫下转TaCOR58基因拟南芥植株的长势较对照差，存活植株较少，说明转TaCOR58基因拟南芥植株对盐胁迫更加敏感。由此表明TaCOR58基因在抗盐过程中起负向调控作用。

以上所述仅为本发明专利的实例而已，但不仅限于上述实例，凡在本发明专利的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明专利的保护范围之内。

序列表

<110> 河南科技学院

<120> 小麦抗逆性调控蛋白TaCOR58及其编码基因与应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1437

<212> DNA

<213> 小麦(Triticum aestivum)

<400> 1

atggacgcgc cggcccccga cagcatcgcc gctgaggagg gcgggcagca gcaacagatg 60

caccaggacg agaaggagca caggccgatg ttcaggagag tcaaggacag gatgaggaag 120

atgaagaaca ccatcgccgg ccacggccac gatcacgatc acgatcacga gcaggacacc 180

ggtggcggtg atagcaacag caccggcgag gacgaggagg atgcggcgac gagggaagcc 240

gaggtggaca agggcggata ccagcagcaa gacgtcgagg acaagcccat cttcgcggac 300

tccagtcccg agcagcacgg cggcgcaccc agtaaggtaa agcacaacga cgctccgggg 360

gtgcggcttg gtgaccttgg cgccccggca gcggcgcagg aggtgaaccg cgacgacgcc 420

gcggggatgc ggctcggcga ccttggcggc ccgccgtcgg ccaaggaggt gaagctggac 480

gacacccagg gggtgccgct cggcgacttg ggcggcccgc cgtcggcgaa ggaggtgaag 540

ctggacgaca cccagggggt gccgctcggc gacttgggcg gcccgccgtc ggcggaggag 600

gtgaagctgg acgacaccca cggggtgcgg ctcggcgatc tcggcagccc tgtcgtggag 660

gacccggctg tgccgaactc gagtacgccc atgccaagag gaggcgaaga catcagcacg 720

acggatgccg tccgtaactt ggaggcgatg actgtgtcag acgaccccaa gcaagtcggc 780

gcacggaaga tggacgtgga cgtgagcaaa gagtatgagg caatgccggt gtcggacggc 840

accggggagg aaccgaacga cgcacccacg gacgccgagt acaccgggag cgacacggac 900

aggctcaaga acacggcagc tgacacggta tatgagaagg tcgccggcgt cggcacggtc 960

atggcgagca aggcgcagga ggtcaccccc agcttcggcg ctggcgggaa cgcgcaggac 1020

gactccagcg caactgccgc ccctgaatcg gtgaccgccg gtgccgggaa gagggacctc 1080

gacttgccgc aagagggaac gcgggcgtcg tacaccggca cggaggggct gaagagcgcg 1140

gcaacggacg cgacgggcac ggagggcgcg cctggcgcga cgtacaccga catgatcaag 1200

tcggcggcgg cgggcacgac ggggtacggc aagaagctgg cgagcacggt gtacgacatg 1260

atcaagtccg cggtggcggg cgccacggag tacggcaaga agctagcgag cacggtgtac 1320

gagaaggtcg ccggcgtcgg cacggccgtt gcgagcaagg cccagcaggt gacgacatcg 1380

gccggcaccg cggtgcttca cggcgcggct ccaaggacca acacgaatgt gatgtga 1437

<210> 2

<211> 478

<212> PRT

<213> 小麦(Triticum aestivum)

<400> 2

Met Asp Ala Pro Ala Pro Asp Ser Ile Ala Ala Glu Glu Gly Gly Gln

1 5 10 15

Gln Gln Gln Met His Gln Asp Glu Lys Glu His Arg Pro Met Phe Arg

20 25 30

Arg Val Lys Asp Arg Met Arg Lys Met Lys Asn Thr Ile Ala Gly His

35 40 45

Gly His Asp His Asp His Asp His Glu Gln Asp Thr Gly Gly Gly Asp

50 55 60

Ser Asn Ser Thr Gly Glu Asp Glu Glu Asp Ala Ala Thr Arg Glu Ala

65 70 75 80

Glu Val Asp Lys Gly Gly Tyr Gln Gln Gln Asp Val Glu Asp Lys Pro

85 90 95

Ile Phe Ala Asp Ser Ser Pro Glu Gln His Gly Gly Ala Pro Ser Lys

100 105 110

Val Lys His Asn Asp Ala Pro Gly Val Arg Leu Gly Asp Leu Gly Ala

115 120 125

Pro Ala Ala Ala Gln Glu Val Asn Arg Asp Asp Ala Ala Gly Met Arg

130 135 140

Leu Gly Asp Leu Gly Gly Pro Pro Ser Ala Lys Glu Val Lys Leu Asp

145 150 155 160

Asp Thr Gln Gly Val Pro Leu Gly Asp Leu Gly Gly Pro Pro Ser Ala

165 170 175

Lys Glu Val Lys Leu Asp Asp Thr Gln Gly Val Pro Leu Gly Asp Leu

180 185 190

Gly Gly Pro Pro Ser Ala Glu Glu Val Lys Leu Asp Asp Thr His Gly

195 200 205

Val Arg Leu Gly Asp Leu Gly Ser Pro Val Val Glu Asp Pro Ala Val

210 215 220

Pro Asn Ser Ser Thr Pro Met Pro Arg Gly Gly Glu Asp Ile Ser Thr

225 230 235 240

Thr Asp Ala Val Arg Asn Leu Glu Ala Met Thr Val Ser Asp Asp Pro

245 250 255

Lys Gln Val Gly Ala Arg Lys Met Asp Val Asp Val Ser Lys Glu Tyr

260 265 270

Glu Ala Met Pro Val Ser Asp Gly Thr Gly Glu Glu Pro Asn Asp Ala

275 280 285

Pro Thr Asp Ala Glu Tyr Thr Gly Ser Asp Thr Asp Arg Leu Lys Asn

290 295 300

Thr Ala Ala Asp Thr Val Tyr Glu Lys Val Ala Gly Val Gly Thr Val

305 310 315 320

Met Ala Ser Lys Ala Gln Glu Val Thr Pro Ser Phe Gly Ala Gly Gly

325 330 335

Asn Ala Gln Asp Asp Ser Ser Ala Thr Ala Ala Pro Glu Ser Val Thr

340 345 350

Ala Gly Ala Gly Lys Arg Asp Leu Asp Leu Pro Gln Glu Gly Thr Arg

355 360 365

Ala Ser Tyr Thr Gly Thr Glu Gly Leu Lys Ser Ala Ala Thr Asp Ala

370 375 380

Thr Gly Thr Glu Gly Ala Pro Gly Ala Thr Tyr Thr Asp Met Ile Lys

385 390 395 400

Ser Ala Ala Ala Gly Thr Thr Gly Tyr Gly Lys Lys Leu Ala Ser Thr

405 410 415

Val Tyr Asp Met Ile Lys Ser Ala Val Ala Gly Ala Thr Glu Tyr Gly

420 425 430

Lys Lys Leu Ala Ser Thr Val Tyr Glu Lys Val Ala Gly Val Gly Thr

435 440 445

Ala Val Ala Ser Lys Ala Gln Gln Val Thr Thr Ser Ala Gly Thr Ala

450 455 460

Val Leu His Gly Ala Ala Pro Arg Thr Asn Thr Asn Val Met

465 470 475

Claims

1.一种蛋白质，为如下a）或b）的蛋白质：

a）氨基酸序列是SEQ ID NO.2所示的蛋白质；

b）在SEQ ID NO.2所示的蛋白质的N端和/或C段连接标签得到的融合蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。

3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子的编码序列如SEQ IDNO.1所示。

4.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体、表达盒、重组菌或重组病毒。

5.权利要求1所述蛋白或权利要求2或3所述核酸分子或权利要求4所述的重组载体、表达盒、重组菌或重组病毒在调控植物抗逆性中的应用；

或，权利要求1所述蛋白或权利要求2或3所述核酸分子或权利要求4所述的重组载体、表达盒、重组菌或重组病毒在培育抗逆性改变的转基因植物中的应用；

所述植物为小麦或拟南芥，所述植物为小麦时，所述抗逆性为抗旱性、耐盐性或抗寒性；所述植物为拟南芥时，所述抗逆性为耐盐性。

6.一种培育抗逆性提高的转基因植物的方法，包括抑制受体植物中权利要求1所述蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的抗逆性高于所述受体植物；所述植物为小麦或拟南芥，所述植物为小麦时，所述抗逆性为抗旱性、耐盐性或抗寒性；所述植物为拟南芥时，所述抗逆性为耐盐性。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述抑制受体植物中权利要求1所述蛋白质的表达量和/或活性的方法为：将抑制权利要求1所述蛋白质表达的物质导入受体植物中，得到转基因植物，所述转基因植物的抗逆性高于所述受体植物。